CN110168646A - 预测抗癌途径的验证 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用数字计算机验证受试者实体肿瘤中途径的预测途径活性的方法，该方法包括：a)从受试者获得肿瘤相关样品；b)从(a)中获得的肿瘤相关样品中获取组学数据；c)将在(b)中获得的组学数据应用于带有途径分析引擎编程的数字计算机中，所述途径分析引擎被配置为在计算机中产生预测的肿瘤细胞途径活性，以提供有效治疗受试者的肿瘤的一种或多种药学活性抗癌化合物的预测；d)从受试者获得富集的活肿瘤细胞，并使富集的活肿瘤细胞访问与至少一种已知的与(c)预测的一种或多种肿瘤细胞途径的途径元素相互作用的药学活性化合物，以测试所述至少一种药学活性化合物相对于受试者的富集的活肿瘤细胞的抗癌活性。
Description
技术领域
本发明的领域是验证基于基因组和/或组学(omics)信息进行的预测药物反应的系统和方法。
背景技术
背景描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者具体或隐含地引用的任何出版物是现有技术。
本文中的所有出版物和专利申请均通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。如果并入的引用中术语的定义或用法与本文提供的术语的定义不一致或相反，则适用该术语在本文中的定义，并且该术语在该引用中的定义不适用。
用于预测抗癌疗法中抗癌药物成功的途径的计算建模的各种系统和方法是本领域已知的。例如，使用基因组模型上的数据整合的途径识别算法(PARADIGM)(Vaske等，US20120041683和Vaske等，US20120158391)和Drug Intervention Response Predictionswith PARADIGM(DIRPP)(Brubaker et al,2014,Pac Symp Biocomput.:125–135and VaskeCJ,et al.2010,Bioinf.26:i237–i247)是使用组学数据来计算细胞中的信号传导途径应用的生物信息学系统。PARADIGM还旨在评估药物在特定情况下有效的可能性。DIRPP代表了将PARADIGM用于计算机(in silico)药物敏感性预测的特定任务的一种方法。这是当前研究的一个非常活跃的领域，其他研究小组已经发表了其他关于抗癌药物敏感性的概率预测方法。例如，Costello et al，2014，Nature Biotechnology，32(12)：1202-1212报道了一项研究，该研究比较了多个研究组采用不同方法预测乳腺癌细胞系药物敏感性的强度。
分析和预测性组学分析方法，例如PARADIGM，用于标记从受试者(例如，个体癌症患者)获得的癌细胞类型，或多或少可能对给定的抗癌疗法敏感，并且识别癌细胞中的遗传参数可能有助于确定特定癌症可能的药物反应。然而，应该清楚的是，这些方法是概率性的，并没有得到真实世界临床数据的验证。
因此，本领域仍需要通过用关于受试癌细胞对特定抗癌治疗方法和/或媒介(agents)的响应的临床数据验证先前的概率方法来进一步改进针对个体受试者和癌症类型的抗癌疗法的优化方法。
发明内容
因此，本发明提供了用于验证个体受试者中存在的癌细胞的预测药物敏感性或治疗方案选择的方法。特别地，本发明提供了一种用数字计算机验证受试者的实体肿瘤中的途径的预测途径活性的方法，该方法包括：
a)从受试者获得肿瘤相关样品；
b)从(a)中获得的肿瘤相关样品中获取组学数据；
c)将在(b)中获得的组学数据应用于带有途径分析引擎编程的数字计算机中，所述途径分析引擎被配置为在计算机中产生预测的肿瘤细胞途径活性，以提供有效治疗受试者的肿瘤的一种或多种药学活性抗癌化合物的预测；
d)从受试者获得富集的活肿瘤细胞，并使富集的活肿瘤细胞访问(interrogating)与至少一种已知的与(c)预测的一种或多种肿瘤细胞途径的途径元素相互作用的药学活性化合物，以测试所述至少一种药学活性化合物相对于受试者的富集的活肿瘤细胞的抗癌活性。
该方法还包括：
e)通过将至少一种药学活性化合物导致的抗癌活性与由(c)预测的肿瘤细胞途径抗癌活性进行比较，产生验证度量；和
f)提出验证度量以考虑针对实体肿瘤的治疗计划并且作为至少一种药学活性化合物的函数。
在一个实施方案中，来自受试者的肿瘤相关样品是以下一种或多种：
(a)从受试者中提取的肿瘤的活检(biopsy)样本，
(b)从受试者的血液或体液中提取的富集的循环肿瘤细胞(CTCs)，和
(c)从受试者的血液或体液中分离的受试者的肿瘤脱落的RNA、DNA或无细胞RNA分子。
在进一步的实施方案中，预测的途径活性由途径分析引擎根据概率途径模型产生，例如因子图模型、使用基因组模型上的数据整合的途径识别算法(PARADIGM)模型和/或PARADIGM(DIRPP)模型的药物干预反应预测。
例如，预测的途径活性包括组成型活性途径、上调途径、下调途径和/或中断途径。另外，步骤(c)的途径元素包含DNA、RNA和/或蛋白质中的至少一种。
在另一个实例中，富集的活肿瘤细胞是以下中的至少一种：
(a)从受试者的血液中分离的循环肿瘤细胞(CTCs)，和
(b)从受试者分离并移植到受照射的小鼠中的肿瘤细胞。
从受试者的血液或体液获得富集的CTCs的步骤包括使受试者的血液或体液经受介电电泳、亲和分离、质量分离、FACS、LCI和/或微流体细胞分选中的一种或多种。分选能够根据本领域已知的方法进行，并且能够包括优先选择表达特定表面标志物的CTCs。从受试者分离的肿瘤细胞也能够例如从外科活检样品中获得。
一旦获得富集的活肿瘤细胞，可以使用富集的活肿瘤细胞来产生位于受试者外部的肿瘤模型。可以使用或适应任何用于该目的的本领域已知的肿瘤模型。例如，肿瘤模型包括体外组织培养模型、体内斑马鱼模型、体内小鼠模型和/或体外细胞培养模型。在某些实施方案中，肿瘤模型是3D人造肿瘤、细胞培养物和/或HLA替代培养(HLA surrogateculture)中的一种或多种。在某些实施方案中，药学活性化合物是激酶抑制剂、抗体和/或DNA修复抑制剂。
在某些其他实施方案中，访问富集的活肿瘤细胞的步骤包括将富集的活肿瘤细胞暴露于至少一种已知的与途径元素相互作用的第二药学活性化合物中。该方法能够包括，例如，用第一和第二药学活性化合物彼此独立地，和/或相互组合地访问富集的活肿瘤细胞。
在本发明的方法中，用任何本领域已知的测定法测试导致的抗癌活性，包括ELISA测定法和/或在将富集的活肿瘤细胞暴露于至少一种药学活性化合物后量化的任何其他生理参数。测试生理参数的其他方法包括，例如，化学参数、代谢参数、增殖参数、密度参数、和/或生存能力参数中的一个或多个，例如通过LCI、质谱和/或FISH、FACS、TS相成像。
该方法进一步预期了推测第二途径元素对药学活性化合物的预测灵敏度的步骤，例如包括相对于未修饰的途径模型增加或降低的灵敏度。在某些实施方案中，本发明方法还包括将预测的灵敏度与预测的治疗结果相关联。在某些实施方案中，预测的途径活性模型与至少一种癌细胞表面标志物相关。
任选地，本发明的方法包括对照组活性与预测的途径活性进行比较的步骤。优选地，验证度量的生成是控制组活性比较的函数。
另外，验证度量能够包括单个值度量，例如，标量值度量、分数，多值度量，例如，多值度量表示多个值的平均值，和/或计算作为预测的灵敏度的函数。在另一实施方案中，验证度量包括建议和/或预测结果。
除非另有说明，否则将使用下面列出的术语并且旨在如所定义的那样定义。在整个说明书中可以出现其他术语的定义。除非另有说明，否则所有单数术语也包括术语的复数，主动时态和过去时形式。
本领域所理解的，术语“肿瘤”和“癌症”是重叠的术语。广泛认为“肿瘤”是生物体中发现的块或生长。肿瘤细胞是源自这种块的细胞。肿瘤可以是良性的或癌性的。癌症肿瘤或“癌症”是组织生长，其能够失控并侵入其他组织，或者在血癌的情况下，压倒体内其他地方的循环系统和/或种子癌症(seed cancers)。癌细胞是源自癌症的细胞。出于本发明的目的，术语“肿瘤细胞”和“癌细胞”可互换使用，应理解两者均指在肿瘤或癌症中发现的或源自肿瘤或癌症并从肿瘤或癌症培养的哺乳动物细胞，并且异常复制，没有分化的哺乳动物细胞表现出的限制。
还应该理解，为了方便起见，在本申请中使用诸如“一个”，“一种”和“该”的单数形式，然而，除非上下文或明确的陈述另有说明，否则单数形式预期的包括复数。此外，应该理解的是，本文提及的每篇期刊文章，专利，专利申请，出版物等均通过引用整体并入本文并用于所有目的。
应该将所有数值范围理解为包括数值范围内的每个数值点，并且应该被解释为单独地叙述每个和每个数值点。针对相同组件或属性的所有范围的端点都是包含性的，并且旨在可独立组合。
如本文所用，术语“约”意指在报告的数值的10％内，或优选在报告的数值的5％内。
从以下对附图的描述和本发明的详细描述中，本发明主题的各种目的，特征，方面和优点将变得更加明显。
附图说明
图1是从US20120158391复制的示意图，其通过引用并入本文，以便说明PARADIGM动态途径图分析中的现有技术的一个方面。
图2示出了本发明的一个示例性操作。在图2中，“EVTC”表示富集的活肿瘤细胞，“TAS”表示肿瘤相关样品。
具体实施方式
本发明提供了用于验证个体受试者中存在的癌细胞的预测药物敏感性的方法。特别地，本发明提供了验证受试者实体肿瘤中抗癌药物敏感途径的预测途径活性的方法。该方法包括：
a)从受试者获得肿瘤相关样品；
b)从(a)中获得的肿瘤相关样品中获取组学数据；
c)将在(b)中获得的组学数据应用于途径分析引擎，所述途径分析引擎被配置为在计算机中产生预测的肿瘤细胞途径活性，以提供有效治疗受试者的肿瘤的一种或多种药学活性抗癌化合物的预测；
d)优选在应用一种或多种药学活性抗癌化合物进行治疗之前，从受试者的血液中获得富集的活肿瘤细胞，并使富集的活肿瘤细胞访问至少一种已知的与(c)预测的一种或多种途径的途径元素相互作用的药学活性化合物，以测试所述至少一种药学活性化合物相对于受试者的活肿瘤细胞的抗癌活性。
该方法还包括：
e)通过将至少一种药学活性化合物导致的抗癌活性与由(c)预测的肿瘤细胞途径活性进行比较，产生验证度量；和
f)提出验证度量以考虑针对实体肿瘤的治疗计划并且作为至少一种药学活性化合物的函数。
发明过程的概述
参考图2，本发明的方法包括从受试者获得样品(201)。例如，样品能够是疑似肿瘤的活检样品，或受试者中与疑似含有肿瘤相关的DNA、RNA或循环肿瘤细胞的血液样品。在一个实施方案中，如果样品是活检样品，并且确认样品包括恶性细胞，则从活检样品中分离细胞以获得富集的活肿瘤细胞(图2中的“EVTC”)。或者，代替活检源，富集的活肿瘤细胞是CTCs。富集的活肿瘤细胞在体外和/或体内环境中生长并用于验证测试。
在另一个实施方案中，对肿瘤相关样品(图2中的“TAS”)，包括从受试者的肿瘤细胞，或从受试者的血液或体液中提取的DNA、RNA和/或蛋白质，进行详细分析，如BamBam分析(203)。203处的其他类型的数据分析包括基因组学数据(例如，来自全基因组测序、全外显子组测序、部分测序、基因拷贝数、等位基因特异性信息等数据)，转录组学数据(例如，RNAseq数据替代拼接(splice)数据等)，蛋白质组学数据(蛋白质活性数据、定量蛋白质数据等，例如，由MS或SRM-MS方法等提供的)，代谢组学数据(能量负荷、NAD/NADH比率、代谢物的定量数据等)，免疫组学数据(例如，细胞因子状态，趋化因子状态，检查点抑制状态等)等。然后将表征癌细胞(221)的组学数据和/或其他数据导入途径分析引擎(211)中。途径分析引擎(211)还可以从癌细胞数据库(209)导入数据。
途径分析引擎的输出(219)报告体外(205)和体内(207)从受试者获得的富集的活肿瘤细胞的测试。从受试者获得的富集的活肿瘤细胞暴露于临床相关浓度和抗癌药物的持续时间，其通过途径预测引擎被鉴定为具有成功治疗受试者的癌症的有用概率。
CTCs在体外(205)和体内(207)测试的结果(217)报告应用一种或多种被证实对受试者的癌症(213)具有活性的抗癌药物治疗受试者的临床决定。将定量结果(215)与途径预测引擎提供的结果进行比较，以生成验证度量，例如，预测和验证结果之间的差异的数值描述。
任选地，监测受试者的临床治疗，并且如果存在癌症已经变得对所选抗癌药物或药物组合具有抗性的临床指征，则可以重复该过程以进一步优化抗癌药物方案。例如，获取任何再生肿瘤的进一步活检样品，进行基因组分析，对获得的组学数据进行预测途径分析，并且受试者的富集的活肿瘤细胞再次受到预测的抗癌药物或药物组合的验证。
此外，在对所选抗癌药物方案具有抗性的情况下，不进行进一步的活检，但是从受试者中取出肿瘤相关样品，例如来自循环肿瘤细胞或来自循环RNA或DNA的肿瘤相关样品，如临床反应所示，用于验证、修改和/或优化原始抗癌方案。
从活检样品中获得肿瘤细胞
可以使用本领域已知的方法从活检样品中富集或分离肿瘤细胞，例如由Affymetrix，USB(ThermoFisher Scientific的子公司)销售的癌症分离试剂盒(CancerIsolation Kit)。
基因组/组学分析(Genomic/Omic分析)
在一个方面，对从受试者获得的肿瘤相关样品进行基因组分析以获得一组组学数据和/或确定相同受试者的肿瘤细胞和健康细胞之间的差异。组学分析可以通过任何本领域已知的方法进行，包括，例如Sanborn等在US20120059670和/或US20120066001的方法。如US20120059670和/或US20120066001中详细描述的，该方法包括，例如，对癌症细胞的基因组DNA和正常(种系)细胞的基因组DNA进行测序，并通过总结针对癌症细胞核正常细胞的每个基因组位置的数据来顺序比较结果，并且然后将所得结果结合起来进行分析。
基因序列机器的输出被称为“BAM”文件，并且非常大(千兆字节到太字节(terabyte))。为了避免在单个中央处理单元中处理两个不同BAM文件所需的时间和存储器成本，优选使用BamBam方法。根据US20120059670，“BamBam方法同时从两个文件读取，不断地保持每个BAM文件与另一个文件同步，并且将两个文件之间的每个共同基因组位置重叠的基因组读取堆积起来。对于每对堆积物，在丢弃堆积物之前，BamBam运行上面列出的一系列分析，并移动到下一个共同的基因组位置。通过使用这种方法处理这些巨大的BAM文件，计算机的RAM使用率很低，并且处理速度主要受文件系统读取两个文件的速度的限制。”因此，只生成一个显示差异的文件。
来自途径分析引擎(PARADIGM)的预测途径活性
然后将从受试者的活检癌细胞获得的上述获得的基因组和/或其他组学数据用于途径分析引擎中以产生在肿瘤中预测的途径活性，这将使治疗药物的报告选择成为可能。
途径分析利用个体癌细胞系的一个或多个数据库。一个有用的数据库将包括例如，癌症类型、包括基因表达和拷贝数数据的基因组序列数据(组学数据)，以及含有的每一种癌细胞系的抗癌药物敏感性数据。数据库包括，例如，癌症基因组计划(the cancergenome project)或CGP，Garnett MJ等，2012，Nature，483(7391)：570-5，癌细胞系百科全书(the cancer cell line encyclopedia)或CCLE，Barretina J等，Nature，483(7391)：603-7，癌症药物敏感性基因组学(the Genomics of Drug Sensitivity in Cancer)(GDSC)，Yang等，2014Nucleic acids research 2013；41；数据库问题(Database issue)；D955-61PUBMED：23180760；PMC：3531057；DOI：10.1093/nar/gks1111(GDSC也可通过由Wellcome Trust，Sanger Institute维护的网站链接获得更新形成(目前，URL的网址为wwwdot cancerrxgene dot org)。
US20120158391举例说明了PARADIGM途径分析的一个实施方案。图。为了清楚起见，从US20120158391复制的图1中，示出了途径分析生态系统100。参考图1，如US20120158391所解释的那样：
生态系统100能够包括通路元件数据库120，其优选地存储多个通路元件125A至125N，统称为通路元件125。每一个通路元件125能够以其所涉及的一个或多个途径来表征。元件125可以被认为是可单独管理的，包括描述元件特征的一个或多个属性或值的数据对象。在一些实施方案中，元件125可以被认为是属性或值的n元组，其中一个元件125元组的每个属性成员可以与其他元件元组中的其他属性成员进行比较、分析、对比或以其他方式评估。
修改引擎110可能通过网络链路(例如，LAN、WAN、因特网、VPN等)与途径元件数据库120通信耦合。在一些实施方案中，途径元件数据库120可以是修改引擎110的本地，而在其他实施例中，途径元件数据库120可以远离修改引擎110。例如，途径元件数据库120可以通过National Lambda Rail(参见URL www.nlr.net)或互联网访问。此外，用户可以通过网络访问修改引擎110或生态系统100，可能需要交换费用。
修改引擎110从途径元件数据库120获得一个或多个元件125以进行分析。优选地，修改引擎110将元件125中的至少一个(例如，元件125A)与至少一个先前的已知属性133相关联。此外，修改110还将另一元件，例如元件125N，与假定属性137相关联。在一些实施方案中，修改引擎110可以基于推理规则、程序指令或其他技术自动进行关联。例如，已知属性137可以从已知研究中获得，而假定属性137可以根据属性参数化的空间被映射出来，其中修改引擎110串行地，或并行地遍历假定的属性空间。在其他实施方案中，用户可以根据需要通过一个或多个用户界面(未示出)手动关联属性133或137，可能通过HTTP服务器或其他合适的接口技术操作。修改引擎110使用已知属性133和假定属性137进一步对一个或多个途径的途径元件125进行交叉相关。此外，修改引擎110将一个或多个影响级别(influencelevels)145分配给元件125。通过交叉相关和影响级别145的分配，修改引擎110构建概率途径模型140，概述途径如何受到假定属性137或其他因素的影响。
在一些实施方案中，概率途径模型140能够被存储在途径模型数据库150内以用于存档目的，或者用于如所指示的分析。与元件125一样，概率途径模型140也能够被存储为具有描述模型特征的属性或值的不同的可管理数据对象，可能作为n元组。可以根据任何期望的模式存储模型145，或者甚至元件125。可用于构造元件数据库120或模型数据库140的示例合适的数据库包括MySQL、PostgreSQL、Oracle或其他合适的数据库。在一些实施方案中，数据对象(例如，元件125、概率途径模型145等)可以通过其属性或值以允许容易搜索或检索的方式被多重索引。
生态系统100优选地包括分析引擎160，其被配置为关于实际数据进一步分析概率途径模型150。在所示的示例中，分析引擎160可能在用户或研究者的指导下获得概率途径模型150，以导出动态途径模型165。优选地，通过比较来自具有与概率途径模型140相关的属性的患者样本提取的一个或多个测试属性173来导出动态途径模型160。因此，分析引擎160寻求修改，更新、校正或以其他方式验证概率途径模型140以形成动态途径模型165。一旦完成，动态途径模型165可以存储在模型数据库中。在更优选的实施方案中，分析引擎160可以配置一个或多个输出设备(例如，显示器、打印机、网络服务器等)以呈现动态途径模型165。
在某些实施方案中，预测的途径活性包括组成型活性途径、上调途径、下调途径和/或中断途径。另外，步骤(c)的途径元件包含DNA、RNA和/或蛋白质中的至少一种。
根据本发明，“组成型活性途径”是不管环境条件或生理需求(例如底物或产物的浓度)而始终活跃的途径。这种上调通常是由于参与信号传导的蛋白质的突变导致的。例如，EGFR的细胞外结构域中的某些点突变导致组成型活性EGFR蛋白质，其在没有合适的EGFR配体的情况下发出信号。Ranganathane et al，2011，Nature Reviews Cancer 11：338-351；DOI：10.1038/nrc3035，已经报道了实体肿瘤中Notch信号传导的类似效果。应当理解，这种组成型活性途径可能不再受其他方式存在的调节机制的影响，并且这些途径可能含有可受一种或多种药物影响的途径元件。
根据本发明，“上调途径”是相对于“正常”状态至少暂时激活的途径。这种上调可能是由于途径元件和/或活化受体配体的数量的增加。例如，在存在Fas信号传导激活的信号转导和转录激活因子3(STAT3)的情况下，Fascin表达在某些癌细胞(相对于非癌细胞)中上调，Al-Alwan et al，2011，PloS ONE6(11)e27339；Carpenter et al，2014，Cancer，6：897-925；doi：10.3390/cancer6020897。类似地，应当理解，这种上调的途径可能不再受其他方式存在的调节机制的影响，并且这些途径可能含有可受一种或多种药物影响的途径元件。
根据本发明，“下调途径”是其中组分的浓度响应于外部刺激而降低的途径。因此，下调途径是相对于“正常”状态至少暂时不太活跃的途径。这种下调可能是由于途径元件和/或抑制性调节配体的受体的数量的减少。例如，核受体结合蛋白1(NRBP1)在乳腺癌中下调，Wei et al，2015，OncoTargets and Therapy 8：3721-3730。应当理解，这种下调的途径可能不再有助于对正常细胞功能至关重要的过程，并且这种途径可能含有可被一种或多种药物刺激的途径元件，从而重新激活该途径。
根据本发明，“间断途径”是其中单个或多个组分已被外部原因干扰或灭活的途径。例如，它是缺少至少一个途径元件的途径，使得通过该途径的信号流被中断。
根据本发明，“途径元件”或途径组分是在细胞代谢或遗传调节途径中以一系列连锁化学反应转化的化学物质。如WO2013062505和US20120158391中所述，在PARADIGM分析中，这些包括例如，在因子图中的元件的途径元件(概率模型中的“实体”)。以简单的形式，US20120158391，其全部内容通过引用并入本文，描述了该公开文本的图2中的元件，以及相关的段落[0010]至[0016]，并且特别是段落[0010]例示了途径元件包括，例如“途径元件，例如选自由受体、激素结合蛋白、激酶、转录因子、甲基化酶、组蛋白乙酰化酶和组蛋白脱乙酰基酶组成的组的蛋白质或选自由基因组调节序列、调节RNA和反式激活序列组成的组的核酸。”
途径分析导致一种或多种抗癌药物将有效治疗癌症的概率的预测评估，其以肿瘤相关样品和/或活肿瘤细胞，或从受试者获得的其他癌细胞或癌组织为代表。
获得富集的循环肿瘤细胞(CTCs)或活检肿瘤细胞
从受试者的血液或体液中获得富集的CTCs的步骤包括将受试者的血液或体液经受介电电泳、亲和分离、质量分离、荧光激活细胞分选(FACS)、活细胞干涉测量法(LCI)和/或微流体细胞分选中的一种或多种。分选可以根据本领域已知的方法进行，并且可以包括优先选择表达特定表面标志物的CTCs。循环肿瘤细胞可以通过任何合适的本领域已知方法从受试者的循环血液或体液中富集。例如，如Thomas的US20160223557中所述，通过密度梯度离心，可以从血液样品的第一血沉棕黄层(first buffy coat layer)中富集CTCs。如Fuchs等在US8921102中所述，通过在，标记有捕获部分，例如EpCAM、E-钙粘蛋白、粘蛋白-I，细胞角蛋白8、EGFR和白细胞相关受体(LAR)的二维阵列微流体装置中捕获CTCs，使得CTCs也可以从全血中富集。
一旦从受试者获得活肿瘤细胞，所述癌细胞即可用于产生位于受试者外部的肿瘤模型。可以使用或适应任何本领域已知的肿瘤模型用于该目的。例如，肿瘤模型包括体外组织培养模型、体内斑马鱼模型，体内小鼠模型和/或体外细胞培养模型。在某些实施方案中，肿瘤模型是3D人造肿瘤、细胞培养物和/或HLA替代培养中的一种或多种。在某些其他实施方案中，药学活性化合物是激酶抑制剂、抗体和/或DNA修复抑制剂。在更进一步的实施方案中，活的肿瘤细胞(例如，循环的肿瘤细胞或来自二次活检或外科手术)也可以直接暴露于至少一种已知与该途径的途径元件相互作用的药学活性化合物中，以获得活性结果。这种直接暴露通常使用确定的培养基条件或模拟肿瘤内营养物和气体分压的培养基在体外进行。
访问从受试者获得的富集的活体肿瘤细胞
广泛地，术语“访问”是指分析和测试感兴趣的组合物(例如癌细胞)的性质的任何方法。
药物敏感性验证可行肿瘤细胞的访问
对于体外测试，可以通过任何本领域已知的方法测试来自受试者的富集的活肿瘤细胞的药物敏感性。例如，根据US5356793的教导，可以在胶原凝胶底物中培养时测试富集的活肿瘤细胞。例如，可以根据US9389220的教导，当在肝脏和骨髓细胞层上培养时测试富集的活肿瘤细胞。还可以根据US5455161和/或US6448030教导的方法在培养时测试活肿瘤细胞。
此外，富集的活肿瘤细胞还预期在合适的本领域已知的3D组织培养系统中，例如，如US20150065359所述，或在由共同拥有的US20160108358(2016年4月21公开)和共同拥有的US20160083682(2016年3月24日公开)教导的培养系统中进行访问。由上述专利文献教导的这些组织培养系统包括，例如，连续培养装置，其包括(a)由具有规则间隔的互连生长表面的基质形成的支架，和(b)在生长区域的入口和出口处的流体分配器。所设置的间距和定义允许定向流均匀地通过和围绕生长表面。在生长区域的入口和出口处的流体分配装置允许到每个生长表面的足够流动。使用计算流体动力学和关键代谢物利用分析来分析流体分布，以确保细胞不受有害生长条件的影响。更详细地，3D系统可选地包括以下组件。
由共同拥有的US20160108358和/或共同拥有的US20160083682教导的支架包括3D晶格形状的生长表面，其形成沿着x，y和z笛卡尔轴(Cartesian axes)排布(spaced)并且平行于x，y和z笛卡尔轴的互连正交生长表面的矩阵，生长表面形成平行于x，y和z笛卡尔轴的排列的立方开放空间矩阵。支架可由任何本领域已知的生物相容性材料制成，例如聚己内酯、聚环氧乙烷-对苯二甲酸酯、聚酰胺、聚-L-乳酸、聚乙醇酸、胶原、纤连蛋白、羟基磷灰石等。
在一个实际的优选实施方案中，培养装置还包括无菌密封的壳体，其可在培养期结束时拆卸。所述无菌外壳可包括密封的可移除盖，入口分配器，可选的出口分配器，以及定位和固定培养装置中的生长表面所需的必要支撑器。
入口流体分配装置连接到支架的输入侧并且具有公共流体入口，该公共流体入口与多个入口分配管道流体连接，输入流体通过所述入口分配管道输送并且通过支架的开放空间分配。
出口流体收集装置连接到支架的输出侧并且具有多个出口管道，所述出口管道与公共流体出口流体连接，以从支架的开放空间收集输出流体。
壳体连接到入口流体分配装置和出口流体收集装置，并且容纳支架、入口流体分配装置和出口流体收集装置。
其中，所述壳体、支架、入口流体分配装置和出口流体收集装置包括单个工件。
预期的使用本领域已知的方法培养富集的活肿瘤细胞，包括在上述装置和方法中培养，或在3D组织系统中的用于培养肿瘤细胞的类似设备和方法中培养。在这样的系统中，接种活肿瘤细胞形成3D体外模型肿瘤，并且在一系列浓度，持续时间和组合中，通过途径分析预测，一种或多种药物被验证对活肿瘤细胞有效。然后，通过体外测试验证的最佳抗癌药物或药物组合、剂量和/或持续时间被认为是获得癌细胞的受试者的临床治疗的基础。
对于体内测试，可以在任何合适的动物异种移植模型中测试活肿瘤细胞的药物敏感性，即对药学活性抗癌化合物的敏感性，包括体内斑马鱼模型和/或体内小鼠模型。例如，如US20160166713所述，可以将活肿瘤细胞移植到免疫受损的斑马鱼中，或者例如，如US6107540所述，可以将活肿瘤细胞移植到免疫缺陷的裸鼠模型中。任选使用本领域已知的其他合适的非人动物模型，包括例如US20140047570所述的大鼠、仓鼠或其他啮齿动物；兔、猪、豚鼠或狗。
将获得的活肿瘤细胞注射到测试动物的肌肉、内脏和/或其他组织中，然后通过本领域已知的方法进行肿瘤生长。一旦异种移植的肿瘤块达到可测量的大小，在一系列浓度、持续时间和组合中，通过途径分析预测对富集的癌细胞有效的一种或多种药物被验证。然后，将验证的最佳抗癌药物或药物组合，剂量和/或持续时间视为获得富集的癌细胞的受试者的临床治疗的基础。
在某些其他实施方案中，访问活肿瘤细胞的步骤包括将活肿瘤细胞或从那些活肿瘤细胞发展的人工肿瘤暴露于已知与途径元件相互作用的至少第二药学活性化合物中。该方法可包括，例如，彼此独立地和/或组合地用第一和第二药学活性化合物访问培养的活肿瘤细胞。
在本发明方法中，由此产生的活性可通过任何本领域已知的方法测定，包括ELISA测定法或在将癌细胞暴露于至少一种药学活性化合物后定量的任何其他可测试的生理参数。测试生理参数例如，化学参数、代谢参数、增殖参数、密度参数和/或生存力参数中的一个或多个的其他方法包括，例如通过LCI、质谱和/或FISH、FACS、TS相成像。
该方法还考虑了推断第二途径元件对药学活性化合物的预测灵敏度的步骤，例如包括相对于未修饰的途径模型增加或降低的灵敏度。在某些实施方案中，本发明方法还包括将预测的灵敏度与预测的治疗结果相关联。在某些实施方案中，预测的途径活性模型与至少一种癌细胞表面标志物相关。
任选地，本发明方法包括将对照组活性与预测的途径活性进行比较的步骤。优选地，验证度量的生成是控制组活性比较的函数。
另外，验证度量可以包括单个值度量，例如，标量值度量、分数、多值度量，例如，多值度量表示多个值的平均值，和/或计算作为预测灵敏度的函数。在另一实施方案中，验证度量包括建议和/或预测结果。
Claims (29)
1.一种用数字计算机验证受试者实体肿瘤中途径的预测途径活性的方法，该方法包括：
a)从受试者获得肿瘤相关样品；
b)从(a)中获得的肿瘤相关样品中获取组学数据；
c)将在(b)中获得的组学数据应用于带有途径分析引擎编程的数字计算机中，所述途径分析引擎被配置为在计算机中产生预测的肿瘤细胞途径活性，以提供有效治疗所述受试者的肿瘤的一种或多种药学活性抗癌化合物的预测；
d)从所述受试者获得富集的活肿瘤细胞，并使所述富集的活肿瘤细胞访问与至少一种已知的与(c)预测的一种或多种肿瘤细胞途径的途径元素相互作用的药学活性化合物，以测试至少一种药学活性化合物相对于所述受试者的富集的活肿瘤细胞的抗癌活性。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤：
e)通过将至少一种药学活性化合物的测试的抗癌活性与由(c)预测的肿瘤细胞途径活性进行比较，产生验证度量；和
f)提出验证度量以考虑针对实体肿瘤的治疗计划并且作为至少一种药学活性化合物的函数。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述富集的活肿瘤细胞至少是以下之一：
(a)从所述受试者的血液中分离的循环肿瘤细胞(CTCs)，和
(b)从所述受试者分离并移植到受照射的小鼠中的肿瘤细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，来自所述受试者的肿瘤相关样品选自由以下组成的组：
(a)从所述受试者中提取的肿瘤的活检样本，
(b)从所述受试者的血液或体液中提取的富集的循环肿瘤细胞(CTCs)，和
(c)从所述受试者的血液或体液中分离的所述受试者的肿瘤脱落的RNA、DNA或无细胞RNA分子。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述预测的途径活性由途径分析引擎根据概率途径模型产生。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述预测的途径活性包括选自由以下组成的组的途径：组成型活性途径、上调途径、下调途径和中断途径。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述途径元件包含DNA、RNA和蛋白质中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，获得所述富集的活肿瘤细胞的步骤包括介电电泳、亲和分离、质量分离、FACS、LCI和微流体细胞分选中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，还包括在患者体外产生包含所述富集的活肿瘤细胞的肿瘤模型的步骤。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所产生的抗癌活性是通过将所述富集的活肿瘤细胞暴露于至少一种药学活性化合物后，量化生理参数来测得的。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所产生的抗癌活性由LCI、质谱、FISH、FACS、TS-相成像或ELISA中的一个或多个测定。
12.根据权利要求1所述的方法，还包括修改所述预测的途径活性模型的步骤。
13.根据权利要求1所述的方法，还包括推测第二途径元件对所述药学活性化合物的预测的灵敏度的步骤。
14.根据权利要求1所述的方法，还包括将对照组活性与预测的途径活性进行比较的步骤。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，访问所述富集的活肿瘤细胞的步骤还包括将富集的活肿瘤细胞暴露于至少一种已知的与所述途径元件相互作用的第二药学活性化合物中。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，获得所述富集的活肿瘤细胞的步骤还包括优选地选择表达特定表面标志物的活肿瘤细胞。
17.根据权利要求2所述的方法，其中，所述验证度量是作为所述预测的灵敏度的函数计算得到的。
18.根据权利要求14所述的方法，其中，所述验证度量的生成是对照组活性比较的函数。
19.根据权利要求2所述的方法，其中，所述验证度量包括单值度量或多值度量。
20.根据权利要求2所述的方法，其中，所述验证度量包括建议或预测的结果。
21.根据权利要求2所述的方法，其中，所述预测的途径活性模型与至少一种癌细胞表面标志物相关。
22.根据权利要求5所述的方法，其中，所述概率途径模型选自由以下组成的组：因子图模型、PARADIGM模型或具有PARADIGM(DIRPP)模型的药物干预反应预测。
23.根据权利要求9所述的方法，其中，所述肿瘤模型包括选自由以下组成的组的模型：体外组织培养模型、体内斑马鱼模型、体内小鼠模型、体外细胞培养模型、3D人造肿瘤、肿瘤细胞培养和HLA替代培养。
24.根据权利要求15所述的方法，还包括用第一和第二药学活性化合物彼此独立地或相互组合地访问所述富集的活肿瘤细胞。
25.根据权利要求10所述的方法，其中，所述生理参数通过化学参数、代谢参数、增殖参数、密度参数、生存能力参数中的一个或多个测得。
26.根据权利要求13所述的方法，其中，所述预测的灵敏度是相对于未修饰的途径模型的增加的灵敏度或者是相对于未修饰的途径模型的降低的灵敏度。
27.根据权利要求13所述的方法，还包括将预测的灵敏度与预测的治疗结果相关联。
28.根据权利要求18所述的方法，其中，所述单值度量是标量或分数。
29.根据权利要求18所述的方法，其中，所述多值度量是多个值的平均值，或者是多个值的范围的分布。
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