CN110161093A - 一种检测组蛋白乙酰转移酶活性的光电化学生物传感器及其制备方法 - Google Patents

一种检测组蛋白乙酰转移酶活性的光电化学生物传感器及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110161093A
CN110161093A CN201910501021.4A CN201910501021A CN110161093A CN 110161093 A CN110161093 A CN 110161093A CN 201910501021 A CN201910501021 A CN 201910501021A CN 110161093 A CN110161093 A CN 110161093A
Authority
CN
China
Prior art keywords
electrode surface
histone acetyltransferase
smcc
preparation
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910501021.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110161093B (zh
Inventor
殷焕顺
陈燕
李菲
周云雷
艾仕云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Agricultural University
Original Assignee
Shandong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Agricultural University filed Critical Shandong Agricultural University
Priority to CN201910501021.4A priority Critical patent/CN110161093B/zh
Publication of CN110161093A publication Critical patent/CN110161093A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110161093B publication Critical patent/CN110161093B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3271—Amperometric enzyme electrodes for analytes in body fluids, e.g. glucose in blood

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测组蛋白乙酰转移酶活性的光电化学生物传感器及其制备方法。所述光电化学生物传感器，包括：ITO电极，依次修饰在电极表面的剥离的WS2、聚多巴胺、SMCC、辅酶A、phos‑tag‑biotin、streptavidin。本发明利用WS2良好的生物兼容性和导电性，以及特异性识别的亲和素和生物素，实现光电信号的猝灭，提高组蛋白乙酰转移酶的检测灵敏度。利用SMCC中的马来酰亚胺对CoA中的巯基的特异结合和识别作用，提高组蛋白乙酰转移酶活性检测的特异性。本发明的检测方法简单，实现了仪器小型化，且易于操作，仅对ITO电极表面进行简单的处理，即可实现对组蛋白乙酰转移酶活性的检测。

Description

一种检测组蛋白乙酰转移酶活性的光电化学生物传感器及其 制备方法
技术领域
本发明涉及光电化学分析技术领域，具体涉及一种检测组蛋白乙酰转移酶的光电化学生物传感器及其制备方法。
背景技术
在真核染色质中，组蛋白和DNA可以构成其基本组成部分。组蛋白在组蛋白乙酰转移酶(HATs)的存在下可以乙酰化，它不仅是表观遗传系统中必不可少的调控机制，而且控制着染色质的转录和结构状态。乙酰化反应在基因组稳定性、组蛋白沉积、DNA复制修复、营养代谢等许多基本生物学过程中起着至关重要的作用。组蛋白上的赖氨酸残基是一种重要的乙酰化位点，HATs可以使其乙酰化。这种现象影响染色质结构和基因表达。
研究表明许多临床疾病，如癌症、HIV感染、神经系统疾病、炎症等，其发病机制具有较强的局限性，与HATs的异常活动相关。这些临床疾病已经将HATs作为重要的生物标志物，HATs抑制剂也对化疗和抗癌药物的发现做出了贡献。检测HATs活性及其抑制剂筛选的可靠、可行、灵敏的方法对HATs相关生化研究和临床诊断具有重要意义。
目前，关于组蛋白乙酰转移酶的检测，主要依赖于检测组蛋白乙酰转移酶催化生成的乙酰化的肽或者乙酰化生成的辅酶A，主要技术有放射性标记法、酶联免疫分析、液相色谱、质谱等。放射性技术存在放射性污染的危害，对操作者的健康也有危害。酶联免疫分析则受制于抗体的有效性和假阳性，且抗体试剂比较昂贵。色谱和质谱技术则需要昂贵的大型仪器，样品前处理繁琐，需要专业的操作人员。因此，亟需建立简单、快捷、具有高灵敏性和高选择性的检测组蛋白乙酰转移酶活性的方法。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测组蛋白乙酰转移酶活性的光电化学生物传感器及其制备方法，实现了对组蛋白乙酰转移酶活性的快速、灵敏检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种检测组蛋白乙酰转移酶活性的光电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将剥离的硫化钨修饰到预处理后的电极表面；
(2)将聚多巴胺修饰于步骤(1)处理后的电极表面；
(3)将(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)修饰于步骤(2)处理后的电极表面；
(4)在乙酰辅酶A存在的条件下，组蛋白乙酰转移酶催化底物肽发生乙酰化反应，得到含有辅酶A的催化反应液；
(5)将含有辅酶A的催化反应液滴加到步骤(3)处理后的电极表面，利用SMCC的马来酰亚胺与辅酶A的巯基之间的特异性结合作用，将催化反应液中的辅酶A修饰到电极表面；
(6)利用辅酶A中的磷酸根与phos-tag-biotin之间的特异结合作用，将phos-tag-biotin修饰到步骤(5)处理后的电极表面；
(7)利用phos-tag-biotin与链霉亲和素(streptavidin)之间的特异结合作用，将streptavidin修饰到步骤(6)处理后的电极表面，制备得到检测组蛋白乙酰转移酶活性的光电化学生物传感器。
优选的，步骤(1)中，将剥离的硫化钨修饰到预处理后的电极表面的方法为：
将剥离的硫化钨加入到二次水中，超声分散，制成浓度为0.5-5mg/mL的硫化钨分散液；将硫化钨分散液滴加到预处理后的电极表面，红外灯下照射干燥。
更优选的，所述剥离的硫化钨由如下方法制备得到：
将硫化钨和聚丙烯酸溶解在水中，超声分散，得到分散体；将分散体在2000-10000rpm离心5-30min，收集上清液；将上清液在5000-10000rpm离心5-30min，所得沉淀用去离子水洗涤，真空干燥。
优选的，步骤(2)中，将聚多巴胺修饰于步骤(1)处理后的电极表面的方法为：
将聚多巴胺加入到二次水中，超声分散，制成浓度为0.5-5mg/mL的聚多巴胺分散液；将聚多巴胺分散液滴加到步骤(1)处理后的电极表面，红外灯下照射干燥。
优选的，步骤(3)中，将SMCC修饰于步骤(2)处理后的电极表面的方法为：
将SMCC用DMSO溶解制成0.5-5mg/mL的SMCC溶液；将SMCC溶液滴加到步骤(2)处理后的电极表面，室温和潮湿条件下反应1.5-4小时。
优选的，步骤(4)中，反应的温度为20-50℃，反应的时间为1-5h。
优选的，步骤(4)中，所述底物肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二方面，提供上述方法制备的光电化学生物传感器。
上述光电化学生物传感器在检测组蛋白乙酰转移酶活性的应用也是本发明的保护范围。
本发明的第三方面，提供一种利用上述光电化学生物传感器检测组蛋白乙酰转移酶活性的方法，包括以下步骤：
以上述光电化学生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，Pt丝为辅助电极，组成三电极系统进行光电化学信号检测，含有5-20mM Na2HPO4和5-20mM NaH2PO4的PBS缓冲溶液(pH为5.4-8.5)为检测液，建立光电流强度与组蛋白乙酰转移酶浓度之间的关系，对样品中组蛋白乙酰转移酶含量进行检测。
优选的，所用检测方法为电流-时间法，应用电位为-0.5–0.5V。
优选的，所述PBS缓冲溶液的浓度为0.1-2M。
需要说明的是，上述光电化学生物传感器及其检测组蛋白乙酰转移酶活性的方法可以为非疾病诊断方法。在非疾病诊断方面，可以通过检测组蛋白乙酰转移酶的活性，发现相关的靶向药物，为新药物的开发提供新的方法。
本发明的有益效果：
(1)本发明利用剥离的硫化钨良好的光电活性以及亲和素和生物素的特异性识别作用，实现光电信号的猝灭，提高组蛋白乙酰转移酶活性的检测灵敏度。
(2)利用组蛋白乙酰转移酶催化底物肽和乙酰辅酶A生成的辅酶A的巯基与SMCC的马来酰亚胺的共价反应，提高HATs检测的特异性。
(3)本发明的检测方法简单，实现了仪器小型化，且易于操作，仅对ITO电极表面进行简单的处理，即可实现对HATs的检测。
(4)本发明是基于HATs催化乙酰辅酶A和底物肽生成辅酶A，具有很高的检测选择性。
附图说明
图1：本发明光电化学生物传感器构建和组蛋白乙酰转移酶活性检测的原理图。
图2：不同浓度的HATs的光电化学响应曲线；曲线a-k代表的浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200、500nM的HATs。
图3：光电流强度与HATs浓度的对数值的线性拟合曲线。
图4：不同酶条件下的光电化学响应变化的柱状图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明中的“室温”的范围为20-30℃。
本发明中的“潮湿条件”为湿度大于90％；优选的湿度为95-99％。
本发明中所使用的清洗液的成分为：3-15mM Tris-HCl和20-60mM KCl，pH 7.4。
本发明中所使用的检测液为：5-20mM Na2HPO4、5-20mM NaH2PO4的PBS缓冲溶液(pH为5.4-8.5)。
本发明中所使用的底物肽的氨基酸序列如下：
RGKGGKGLGKGGAKA(SEQ ID NO.1)。
本发明所使用的phos-tag-biotin与链霉亲和素(streptavidin)均可通过商业渠道购买得到；例如：phos-tag-biotin为生物素结合(功能化)的phos-tagTM，上海西宝生物科技有限公司有售。
正如背景技术部分所介绍的，现有技术中组蛋白乙酰转移酶的检测方法存在一定的不足，基于此，本发明构建了一种用于检测组蛋白乙酰转移酶活性的光电化学生物传感器。
本发明的光电化学生物传感器构建和检测的原理图见图1。本发明的光电化学生物传感器以ITO电极为基体电极，将剥离的硫化钨和聚多巴胺分别修饰到电极表面(图1中a)。再利用SMCC的羟基琥珀酰亚胺(NHS酯)与聚多巴胺的氨基作用，将SMCC修饰到电极表面，利用SMCC的马来酰亚胺与生成的辅酶A的巯基的特异性反应，将乙酰化生成的辅酶A修饰在电极表面。利用辅酶A的磷酸根与phos-tag-biotin的特异性识别，将phos-tag-biotin修饰在电极表面。通过streptavidin与phos-tag-biotin的特异性识别，将streptavidin修饰在电极表面，得到制备的传感器(图1中b)。其中：剥离的硫化钨是一种优良的光电材料；聚多巴胺本身做电子供体，促进电子的转移，增大光电流，并且将SMCC修饰在电极表面，从而引入了辅酶A，阻碍了光生电子的迁移。而当phos-tag-biotin和streptavidin修饰到电极表面后，光电流会明显降低，这主要是由于phos-tag-biotin和streptavidin大的分子结构，阻碍了光生电子的迁移。而phos-tag-biotin和streptavidin的修饰量由辅酶A的浓度决定的，也就是由HATs的浓度决定。因此，利用HATs的浓度与光电流强度的线性关系，可实现对HATs的检测。
在本发明的一个实施方案中，给出的光电化学生物传感器的构建过程为：
(1)催化反应液的制备：将20-50μL不同浓度的组蛋白乙酰转移酶、20-50μL的底物肽(浓度为10-40μM)、10-40μL乙酰辅酶A(浓度为100-300μM)混合均匀。然后将混合液在20-50℃下温育1-5小时。得到的溶液标记为催化反应液。
(2)剥离硫化钨的制备：称量50-300mg WS2和50-300mg聚丙烯酸溶解在20-60mL水中，超声2-6h。将绿色分散体在2000-10000rpm离心5-30min，收集上清液5000-10000rpm离心5-30min，所得沉淀用去离子水洗涤数次以除去残余物，最后在真空下干燥。
(3)聚多巴胺的制备：溶解100-200mg多巴胺盐酸盐于50-100mL去离子水中，剧烈搅拌下，取500-1000μL1-3mol/L的NaOH溶液在20-60℃的情况下加入上述溶液中。观察到随着NaOH溶液的加入，溶液变为淡黄色然后逐渐变黑。陈化1-5h后，1000-5000rpm离心，收集悬浮液，4000-10000rpm离心，所得沉淀用去离子水水洗3-5次后，60℃下干燥。
(4)剥离硫化钨分散液的制备：称取2-10mg步骤(2)制备的剥离硫化钨，加入到2-10mL去离子水中，超声分散1-3小时。
(5)聚多巴胺分散液的制备：称取2-10mg聚多巴胺，加入到2-10mL去离子水中，超声分散1-3小时。
(6)ITO电极预处理：将ITO导电玻璃分割成5×1cm2，分别用丙酮、1-4M NaOH的醇水溶液(V无水乙醇：V二次水＝1：1-1：6)、去离子水将ITO电极超声处理15-60min，然后用二次水冲洗，自然晾干，待用。
(7)剥离硫化钨的固定：将25-80μL硫化钨分散液滴加到预处理的ITO电极表面，红外灯照射干燥。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为WS2/ITO。
(8)聚多巴胺的固定：将20-60μL聚多巴胺分散液滴加到WS2/ITO电极表面，红外灯照射干燥。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为PDA/WS2/ITO。
(9)SMCC固定：将24-55μL 0.5-5mg/mL的(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)溶液滴加到PDA/WS2/ITO电极表面，室温和潮湿条件下反应1.5-4小时。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为SMCC/PDA/WS2/ITO。
(10)催化反应液中辅酶A的修饰：将10-50μL催化反应液滴加到SMCC/PDA/WS2/ITO电极表面，25-45℃和潮湿条件下反应0.5-3小时。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为CoA/SMCC/PDA/WS2/ITO。
(11)phos-tag-biotin固定：16-55μL 2-10μM phos-tag-biotin缓冲液(5-10mMTris,0.1-1M NaCl,0.1-1mM Zn(NO3)2,0.1-1％Tween-20)滴加到CoA/SMCC/PDA/WS2/ITO电极表面，15-40℃在潮湿条件下反应0.5-3小时。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为phos-tag-biotin/CoA/SMCC/PDA/WS2/ITO。
(12)streptavidin的固定：将20-60μL 2-10μM streptavidin的PBS缓冲液滴加到phos-tag-biotin/CoA/SMCC/PDA/WS2/ITO电极表面，25-55℃和潮湿条件下反应0.5-3.5小时。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。氮气吹干。制备的电极标记为streptavidin/phos-tag-biotin/CoA/SMCC/PDA/WS2/ITO。
上述光电化学传感器的构建过程中，各步骤相辅相成，顺序是严格限定的，每一步都为下一步的固定修饰服务，缺少上一步，可能会导致后面的修饰失败。固定修饰在ITO电极表面的材料可以是市售产品，也可自行制备得到，只要性能上满足使用要求即可，本发明不做特别的限定。
在本发明的另一个实施方案中，给出了采用上述光电化学生物传感器检测HATs的过程为：
(1)以不同浓度HATs制备的streptavidin/phos-tag-biotin/CoA/SMCC/PDA/WS2/ITO电极作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极、Pt丝为辅助电极组成三电极系统进行光电化学信号检测，光源为可见光，应用电位为-0.5-0.5V，在检测液(5-20mM Na2HPO4、5-20mMNaH2PO4的PBS缓冲溶液，pH为5.4-8.5)中记录光电流。
(2)建立光电流强度与组蛋白乙酰转移酶浓度之间的关系，利用该关系式对待测样品中的HATs的含量进行检测。
随着HATs浓度的增加，电极表面CoA数量也随之增加，导致固定时间内固定的streptavidin和phos-tag-biotin增加，从而引起光电信号降低。根据HATs浓度与光电流强度的线性关系，可实现对HATs的检测。
采用本发明的光电化学生物传感器对HATs的检测范围为0.01-500nM，检测限为3.33pM。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：组蛋白乙酰转移酶催化底物肽乙酰化
将20μL 50nM的组蛋白乙酰转移酶、20μL的底物肽(浓度为20μM)、20μL乙酰辅酶A(浓度为100μM)混合均匀。然后将混合液在37℃下温育1小时。得到的溶液标记为催化反应液。
实施例2：剥离硫化钨的制备
称量50mg WS2和300mg聚丙烯酸溶解在60mL水中，超声6h。将绿色分散体在3000rpm离心10min，收集上清液5000rpm离心15min，所得沉淀用去离子水洗涤数次以除去残余物，最后在真空下干燥。
实施例3：聚多巴胺的制备
溶解150mg多巴胺盐酸盐于50mL去离子水中，剧烈搅拌下，取600μL 1mol/L的NaOH溶液在30℃的情况下加入上述溶液中。观察到随着NaOH溶液的加入，溶液变为淡黄色然后逐渐变黑。陈化2h后，3000rpm离心，收集悬浮液，10000rpm离心，所得沉淀用去离子水水洗3次后，60℃下干燥。
实施例4：剥离硫化钨分散液的制备
称取4mg剥离得到的硫化钨，加入到3mL去离子水中，超声分散1小时。
实施例5：聚多巴胺分散液的制备
称取4mg聚多巴胺，加入到3mL去离子水中，超声分散1小时。
实施例6：ITO电极预处理
将ITO导电玻璃分割成5×1cm2，分别用丙酮、2M NaOH的醇水溶液(V无水乙醇：V二次水＝1：4)、去离子水将ITO电极超声处理20min，然后用二次水冲洗，自然晾干，待用。
实施例7：剥离硫化钨的固定
将40μL硫化钨分散液滴加到预处理的ITO电极表面，红外灯照射干燥。然后，将电极用清洗液清洗3次。氮气吹干。制备的电极标记为WS2/ITO。
实施例8：聚多巴胺的固定
将40μL聚多巴胺分散液滴加到WS2/ITO电极表面，红外灯照射干燥。然后，将电极用清洗液清洗3次。氮气吹干。制备的电极标记为PDA/WS2/ITO。
实施例9：SMCC固定
将40μL 1mg/mL SMCC溶液滴加到PDA/WS2/ITO电极表面，室温和潮湿条件下反应3小时。然后，将电极用清洗液清洗3次。氮气吹干。制备的电极标记为SMCC/PDA/WS2/ITO。
实施例10：催化反应液的修饰
将40μL催化反应液滴加到SMCC/PDA/WS2/ITO电极表面，25℃在潮湿条件下反应1.5小时。然后，将电极用清洗液清洗3次。氮气吹干。制备的电极标记为CoA/SMCC/PDA/WS2/ITO。
实施例11：phos-tag-biotin固定
40μL 5μM phos-tag-biotin缓冲液(5mM Tris,0.1M NaCl,0.2mM Zn(NO3)2,0.1％Tween-20)滴加到CoA/SMCC/PDA/WS2/ITO电极表面，25℃在潮湿条件下反应1.5小时。然后，将电极用清洗液清洗3次。氮气吹干。制备的电极标记为phos-tag-biotin/CoA/SMCC/PDA/WS2/ITO。
实施例12：streptavidin的固定
将40μL 5μM streptavidin的PBS缓冲液滴加到phos-tag-biotin/CoA/SMCC/PDA/WS2/ITO电极表面，25℃在潮湿条件下反应1小时。然后，将电极用清洗液清洗3次。氮气吹干。制备的电极标记为streptavidin/phos-tag-biotin/CoA/SMCC/PDA/WS2/ITO。
实施例13：光电化学检测
以电化学工作站为信号采集仪器，500W氙灯为可见光光源(加装滤除紫外的镜片)，streptavidin/phos-tag-biotin/CoA/SMCC/PDA/WS2/ITO电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂柱电极为对电极，含有5mM Na2HPO4、5mM NaH2PO4的PBS缓冲溶液(p H7.4)缓冲液为检测液，以-0.3V电压为工作电压，采用i-t技术进行待测物的检测研究，建立光电流强度与HATs浓度之间的关系(图2和图3)。
实施例14：检测选择性实验
为了研究构建的传感器的特异性，将20μL 50nM的组蛋白乙酰转移酶(或者100unit/mL蛋白激酶A、100unit/mL的PKA、100unit/mL的HRP、100unit/mL的ALP、0.1mg/mL的牛血清白蛋白)、20μL的底物肽(浓度为20μM)、20μL乙酰辅酶A(浓度为100μM)混合均匀。然后将混合液在37℃下温育1小时。得到不同的催化反应液。对比不同酶参与构建的传感器的光电流变化值(ΔI＝I1-I2，I1是SMCC/PDA/WS2/ITO的电流值，I2是SMCC/PDA/WS2/ITO经过不同酶处理后的电极继续经phos-tag-biotin和streptavidin处理后的电极的光电流值)。结果表明，对比试剂参与构建传感器电流值变化明显低于HATs，表明构建的传感器具有很好的特异性(图4)。
实施例15：稳定性实验
采用相同的方法制备7支streptavidin/phos-tag-biotin/CoA/SMCC/PDA/WS2/ITO电极(HATs浓度为50nM)，在检测液中检测光电流。得到光电流的相对标准偏差为1.54％，说明该方法有很好的重现性。将streptavidin/phos-tag-biotin/CoA/SMCC/PDA/WS2/ITO传感器连续测量7个周期，在检测液中检测光电化学信号，得到光电流的标准偏差为1.1％，说明该方法有很好的稳定性。
实施例16：抑制性实验
为了研究重金属镉对构建的传感器的抑制性，将20μL 50nM的组蛋白乙酰转移酶、20μL的底物肽(浓度为20μM)、20μL乙酰辅酶A(浓度为100μM)以及不同浓度的重金属镉混合均匀。在PBS检测液中检测streptavidin/phos-tag-biotin/CoA/SMCC/P DA/WS2/ITO电极的光电流，IC50(50％抑制率的浓度)为8.2μm，说明重金属镉对组蛋白乙酰化具有一定的抑制作用。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 一种检测组蛋白乙酰转移酶活性的光电化学生物传感器及其制备方法
<130> 2019
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 底物肽(substrate peptide)
<400> 1
Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys Ala
1 5 10 15

Claims (10)

1.一种检测组蛋白乙酰转移酶活性的光电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将剥离的硫化钨修饰到预处理后的电极表面；
(2)将聚多巴胺修饰于步骤(1)处理后的电极表面；
(3)将SMCC修饰于步骤(2)处理后的电极表面；
(4)在乙酰辅酶A存在的条件下，组蛋白乙酰转移酶催化底物肽发生乙酰化反应，得到含有辅酶A的催化反应液；
(5)将含有辅酶A的催化反应液滴加到步骤(3)处理后的电极表面，利用SMCC的马来酰亚胺与辅酶A的巯基之间的特异性结合作用，将催化反应液中的辅酶A修饰到电极表面；
(6)利用辅酶A中的磷酸根与phos-tag-biotin之间的特异结合作用，将phos-tag-biotin修饰到步骤(5)处理后的电极表面；
(7)利用phos-tag-biotin与streptavidin之间的特异结合作用，将streptavidin修饰到步骤(6)处理后的电极表面，制备得到检测组蛋白乙酰转移酶活性的光电化学生物传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将剥离的硫化钨修饰到预处理后的电极表面的方法为：
将剥离的硫化钨加入到二次水中，超声分散，制成浓度为0.5-5mg/mL的硫化钨分散液；将硫化钨分散液滴加到预处理后的电极表面，红外灯下照射干燥。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述剥离的硫化钨由如下方法制备得到：
将硫化钨和聚丙烯酸溶解在水中，超声分散，得到分散体；将分散体在2000-10000rpm离心5-30min，收集上清液；将上清液在5000-10000rpm离心5-30min，洗涤，真空干燥。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，将聚多巴胺修饰于步骤(1)处理后的电极表面的方法为：
将聚多巴胺加入到二次水中，超声分散，制成浓度为0.5-5mg/mL的聚多巴胺分散液；将聚多巴胺分散液滴加到步骤(1)处理后的电极表面，红外灯下照射干燥。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将SMCC修饰于步骤(2)处理后的电极表面的方法为：
将SMCC用DMSO溶解制成0.5-5mg/mL的SMCC溶液；将SMCC溶液滴加到步骤(2)处理后的电极表面，室温和潮湿条件下反应1.5-4小时。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，反应的温度为20-50℃，反应的时间为1-5h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述底物肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
8.权利要求1-7任一项所述的方法制备的光电化学生物传感器。
9.权利要求8所述的光电化学生物传感器在检测组蛋白乙酰转移酶活性的应用。
10.一种利用权利要求8所述的光电化学生物传感器检测组蛋白乙酰转移酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以权利要求8所述的光电化学生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，Pt丝为辅助电极，组成三电极系统进行光电化学信号检测，含有5-20mM Na2HPO4和5-20mMNaH2PO4的PBS缓冲溶液(pH为5.4-8.5)为检测液，建立光电流强度与组蛋白乙酰转移酶浓度之间的关系，对样品中组蛋白乙酰转移酶含量进行检测；
优选的，所用检测方法为电流-时间法，应用电位为-0.5–0.5V；
优选的，所述PBS缓冲溶液的浓度为0.1-2M。
CN201910501021.4A 2019-06-11 2019-06-11 一种检测组蛋白乙酰转移酶活性的光电化学生物传感器及其制备方法 Expired - Fee Related CN110161093B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910501021.4A CN110161093B (zh) 2019-06-11 2019-06-11 一种检测组蛋白乙酰转移酶活性的光电化学生物传感器及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910501021.4A CN110161093B (zh) 2019-06-11 2019-06-11 一种检测组蛋白乙酰转移酶活性的光电化学生物传感器及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110161093A true CN110161093A (zh) 2019-08-23
CN110161093B CN110161093B (zh) 2020-03-24

Family

ID=67628283

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910501021.4A Expired - Fee Related CN110161093B (zh) 2019-06-11 2019-06-11 一种检测组蛋白乙酰转移酶活性的光电化学生物传感器及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110161093B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114295699A (zh) * 2021-12-30 2022-04-08 山东农业大学 基于硫化铋-MXene的光电化学传感器检测5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106188590A (zh) * 2016-07-14 2016-12-07 复旦大学 金属有机骨架结构改性的聚合物杂化质子交换膜及其制备方法
CN107101997A (zh) * 2017-04-25 2017-08-29 青岛大学 一种用于乙酰转移酶活性检测的电化学发光传感器的构建
CN107831151A (zh) * 2017-10-25 2018-03-23 首都师范大学 钼基杂多酸修饰的稀土荧光纳米材料在谷胱甘肽检测中的应用
CN109613093A (zh) * 2019-01-21 2019-04-12 宁波大学 基于dna纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用
CN109856212A (zh) * 2019-01-21 2019-06-07 宁波大学 一种同时检测HAT和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106188590A (zh) * 2016-07-14 2016-12-07 复旦大学 金属有机骨架结构改性的聚合物杂化质子交换膜及其制备方法
CN107101997A (zh) * 2017-04-25 2017-08-29 青岛大学 一种用于乙酰转移酶活性检测的电化学发光传感器的构建
CN107831151A (zh) * 2017-10-25 2018-03-23 首都师范大学 钼基杂多酸修饰的稀土荧光纳米材料在谷胱甘肽检测中的应用
CN109613093A (zh) * 2019-01-21 2019-04-12 宁波大学 基于dna纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用
CN109856212A (zh) * 2019-01-21 2019-06-07 宁波大学 一种同时检测HAT和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114295699A (zh) * 2021-12-30 2022-04-08 山东农业大学 基于硫化铋-MXene的光电化学传感器检测5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的方法
CN114295699B (zh) * 2021-12-30 2022-10-21 山东农业大学 一种检测5-甲酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的光电化学生物传感器及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110161093B (zh) 2020-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Photoelectrochemical immunosensor for methylated RNA detection based on g-C3N4/CdS quantum dots heterojunction and Phos-tag-biotin
Miao et al. Electrogenerated chemiluminescence. 72. Determination of immobilized DNA and C-reactive protein on Au (111) electrodes using tris (2, 2 ‘-bipyridyl) ruthenium (II) labels
Lu et al. Coupling photoelectrochemical and electrochemical strategies in one probe electrode: Toward sensitive and reliable dual-signal bioassay for uracil-DNA glycosylase activity
Heo et al. Electrochemical biosensor for nucleic acid amplification-free and sensitive detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA via CRISPR/Cas13a trans-cleavage reaction
Li et al. A label-free electrochemiluminescence aptasensor for thrombin based on novel assembly strategy of oligonucleotide and luminol functionalized gold nanoparticles
Cao et al. Ultrasensitive luminol electrochemiluminescence for protein detection based on in situ generated hydrogen peroxide as coreactant with glucose oxidase anchored AuNPs@ MWCNTs labeling
US6391558B1 (en) Electrochemical detection of nucleic acid sequences
US7682788B2 (en) Method and apparatus for improved luminescence assays using microparticles
Liu et al. A highly sensitive electrochemiluminescence assay for protein kinase based on double-quenching of graphene quantum dots by G-quadruplex–hemin and gold nanoparticles
Yang et al. A novel signal-on strategy for M. SssI methyltransfease activity analysis and inhibitor screening based on photoelectrochemical immunosensor
Li et al. A versatile cathodic “signal-on” photoelectrochemical platform based on a dual-signal amplification strategy
Zhao et al. Highly sensitive protein kinase activity assay based on electrochemiluminescence nanoprobes
Wang et al. Multiple signal amplification electrogenerated chemiluminescence biosensors for sensitive protein kinase activity analysis and inhibition
Yin et al. A sensitive electrochemical biosensor for detection of protein kinase A activity and inhibitors based on Phos-tag and enzymatic signal amplification
Zhang et al. DNAzyme-based highly sensitive electronic detection of lead via quantum dot-assembled amplification labels
CA2763842A1 (en) An electrochemical method and apparatus of identifying the presence of a target
Zhou et al. Photoelectrochemical detection of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA based on M. HhaI methyltransferase catalytic covalent bonding
CN109709170B (zh) 一种基于黑色二氧化钛的光电化学分析检测5-羟甲基胞嘧啶的方法
Chiku et al. Electrochemical detection of tyrosine derivatives and protein tyrosine kinase activity using boron-doped diamond electrodes
Wu et al. Electrochemical aptasensor for the detection of adenosine by using PdCu@ MWCNTs-supported bienzymes as labels
Deng et al. Target-induced aptamer release strategy based on electrochemical detection of staphylococcal enterotoxin B using GNPs-ZrO2-Chits film
Yin et al. Electrochemical biosensor for hydroxymethylated DNA detection and β-glucosyltransferase activity assay based on enzymatic catalysis triggering signal amplification
Guo et al. Single plasmonic nanoparticles for ultrasensitive DNA sensing: From invisible to visible
Zou et al. A novel electrogenerated chemiluminescence biosensor for histone acetyltransferases activity analysis and inhibition based on mimetic superoxide dismutase of tannic acid assembled nanoprobes
Xu et al. Electrochemical immunosensor for DNA methyltransferase activity assay based on methyl CpG-binding protein and dual gold nanoparticle conjugate-based signal amplification

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20200324