CN110157706B - 蛋白c在肝门脉高压治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及蛋白C在肝门脉高压治疗中的应用。本申请涉及蛋白C与门脉高压症的相关性研究,还涉及蛋白C抑制剂,包括miRNA。蛋白C抑制剂(miRNA)能够抑制肝细胞的增殖,并促进肝细胞的凋亡,这样能够使肝窦增生组织减小,以致门脉血流通畅,降低门脉压。这为门脉高压症(尤其是门静脉海绵样变)的治疗开拓了新的研究前景,为miRNA药物的深度开发和临床治疗提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域,具体涉及蛋白C在肝门脉高压相关疾病治疗中的应用。
背景技术
门静脉压力相对于体循环血压升高超过5mmHg时即被定义为门脉高压症(portalhypertension,PH),其又称为门静脉高血压、门静脉血压过高、门脉高压。PH的基本病理、生理特征是门静脉系统血流受阻和/或血流量增加,门静脉及其属支血管内静水压持续升高并伴侧支循环形成。各种原因所致的肝硬化为其最常见的病因。临床主要表现为食管胃静脉曲张(gastroesophageal varices,GOV)、食管胃静脉曲张破裂出血(esophagogastricvariceal bleeding,EVB)、腹水及肝性脑病等,其中PH致死率最高的并发症为EVB,1/3的GOV患者至少出现过一次急性出血,为消化内科常见急症。PH的治疗基础旨在预防EVB。
门脉高压症可分为肝前型、肝内型和肝后型3类,肝内型在中国最常见,占95%以上。在肝内型里,按病理形态的不同又可分为窦前阻塞、肝窦和窦后阻塞两种。肝窦和窦后阻塞的常见病因是肝炎后肝硬化,主要病变是肝小叶内纤维组织增生和肝细胞再生,由于增生纤维索和再生肝细胞结节的挤压,使肝小叶内肝窦变窄或闭塞,以致门脉血不易流入肝小叶的中央静脉或小叶下静脉,血流淤滞,门脉压就增高。
门静脉海绵样变(cavernous transformation of the portal vein,CTPV),是指肝门部或肝内门静脉分支慢性部分性或完全性阻塞后,导致门静脉血流受阻,引起门静脉压力增高。门静脉内不规则排列的增生的小静脉即门静脉海绵窦样变、门静脉主干完全或部分血栓或癌栓形成引起门静脉闭塞,后导致肝外型门静脉高压症,肝门区或门体间形成大量侧支循环血管丛。
总体而言,目前门脉高压症的发病成因和治疗机制还缺乏深入的研究。本发明探索了蛋白C在肝门脉高压相关疾病(尤其是门静脉海绵样变)治疗中所起的作用,通过相关性miRNA的施用,能够抑制肝细胞的增殖,促进其凋亡,从而使肝窦增生组织减小,以致门脉血流通畅,降低门脉压。这为门脉高压症的治疗开拓了新的研究前景,为miRNA药物的深度开发和临床治疗提供了新的思路。
发明内容
本发明提供了一种miRNA,其正义链的核苷酸序列选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11,其反义链的核苷酸序列选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12。
本发明提供了一种miRNA,其正义链和反义链的核苷酸序列选自如下的组:1和2、3和4、5和6、7和8、9和10、11和12。
本发明提供了一种载体,其包含所述的miRNA。
在一个方面中,所述载体选自质粒、脂质体、病毒或其它合适类型的载体;优选的,所述质粒选自真核细胞质粒;所述脂质体选自lipofectamin;所述病毒选自慢病毒或逆转录病毒。
本发明提供了一种宿主细胞,其包含所述的miRNA,或所述的载体。
在一个方面中,所述宿主细胞选自肝细胞;优选的,所述宿主细胞选自人肝细胞。
本发明提供了一种药物组合物,其包含所述的miRNA、所述的载体或所述的宿主细胞,以及药学上可接受的辅料。
在一个方面中,所述药物组合物可根据常规方法制成药物制剂。制剂过程中,将所述miRNA、所述载体或所述宿主细胞与药学上可接受的辅料混合或用辅料稀释。当辅料作为稀释剂时,其可以为液体。制剂选自混悬剂、乳剂、溶液剂、注射用溶液等形式。
本发明提供了所述的miRNA、所述的载体或所述的宿主细胞在制备用于治疗肝门脉高压相关疾病的药物中的用途。
在一个方面中,所述肝门脉高压相关疾病选自门静脉海绵样变
本发明提供了蛋白C抑制剂在制备用于治疗肝门脉高压相关疾病的药物中的用途。
在一个方面中,所述肝门脉高压相关疾病选自门静脉海绵样变
在一个方面中,所述蛋白C抑制剂为降低蛋白C核酸或蛋白表达的化合物;优选的,所述蛋白C抑制剂选自miRNA。
在一个方面中,所述miRNA,其正义链的核苷酸序列选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11,其反义链的核苷酸序列选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12。
在一个方面中,所述miRNA,其正义链和反义链的核苷酸序列选自如下的组:1和2、3和4、5和6、7和8、9和10、11和12。
本发明的积极效果包括:本发明的几种miRNA(miR-204-5p、miR-211-5p、miR-218-5p、miR-802、miR-124-3p、miR-506-3p)与蛋白C(PROC)基因具有靶向关系,能够调控PROC核酸或蛋白表达。miR-506与miR-124能够抑制肝细胞的增殖,并促进肝细胞的凋亡。相应地,这样能够使肝窦增生组织减小,以致门脉血流通畅,降低门脉压。蛋白C与相关miRNA的应用为肝门脉高压相关疾病(尤其是门静脉海绵样变)的治疗开拓了新的研究前景,为miRNA药物的深度开发和临床治疗提供了新的思路。
附图说明
图1:各组血液中活化蛋白C(PROC)的相对含量。**p<0.01,p=0.00004。Healthykids:对照组,正常儿童的全血样本;Sick kids:实验组,门静脉海绵样变Rex手术后蛋白C水平低的患儿全血样本。
图2:各组血浆中miR-204-5p、miR-211-5p、miR-218-5p、miR-802、miR-124-3p、miR-506-3p和PROC mRNA的相对含量。*P<0.05,**P<0.01。Healthy kids、Sick kids的含义与前述一致。
图3:荧光素酶报告基因实验检测miR-506与miR-124对PROCwt和PROCmut的影响。**p<0.01vs.NC mimics+Luc-PROCwt。##p<0.01,#p<0.05vs.NC mimics+Luc-PROCmut。
图4:CCK8检测0h及48h各组细胞增殖率变化。**p<0.01vs.NC。
图5:qRT-PCR检测PROC mRNA表达水平。**p<0.01vs.NC。
图6:Western Blot检测各组细胞中PROC、COX-2、VEGF、Bcl-2、Bax、HIF1α蛋白表达结果。
图7:各组细胞凋亡统计结果。**p<0.01vs.NC。
图8:各组细胞凋亡流式图。
具体实施方式
下述实验方法中所用的实验材料如无特别说明,均可容易地从商业公司获取。在不背离本发明精神的情况下,本领域技术人员结合公知技术,可以对本发明做出诸多修改,这样的修改也落入本发明的保护范围之内。
实施例1、检测活化蛋白C(PROTEIN C,PROC)相对含量。
一、实验分组
对照组:6例正常儿童的全血样本
实验组:6例门静脉海绵样变Rex手术后蛋白C水平低的患儿全血样本
二、ELISA实验
分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔(不加样本、酶标试剂及生物素标记的抗PROTEIN C抗体,其余步骤操作相同),标准孔分别加标准品50μL,待测样品孔加待测样品400μL,然后加生物素标记的抗MCP3抗体10μL,轻轻震荡混匀。按照ELISA实验操作规程进行各项实验步骤。用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。
三、实验结果
图1显示了各组血液中活化蛋白C(PROC)的相对含量。由图中可知,与正常儿童血液组相比,门静脉海绵样变Rex手术后蛋白C水平低的患儿的血液中活化蛋白C(PROC)相对含量显著降低。
实施例2、检测miRNA和PROC mRNA的相对含量
一、引物设计
表1引物序列
二、RNA的提取
1、使用TRI REAGENT BD试剂盒抽提血浆中的RNA,加入0.25mL血浆和1~4μL聚丙烯酰胺载体至TRI试剂中,充分混匀后室温下放置5min。
2、每TRI试剂加入0.2mL氯仿或0.1mL BCP,摇匀15s,室温静置2-5min,4℃,12000g离心15min,吸取上层水相。
3、每TRI试剂加入0.5mL异丙醇混匀,室温放置5-10min,4℃,12000g离心10min,弃上清,RNA沉于管底。
4、每TRI试剂加入1mL 75%乙醇,振荡离心管,悬浮沉淀,4℃,7500g离心5min,弃上清,室温晾干。
5、可用50μL ddH2O或TE buffer溶解RNA样品,55-60℃,5~10min。
6、取溶解后的RNA 1μL用DEPC水稀释200倍后,用紫外分光光度计测定OD260、OD280以及OD260/OD280值,计算RNA的纯度和浓度。
7、根据OD260/OD280比值,估测RNA质量,比值在1.8~2.0之间满足实验要求。根据吸光光度值按下列公式计算样品RNA的浓度:总RNA浓度(μg/μL)=OD260×40×200×10-3,将总RNA放于-80℃冰箱内保存以备用。
三、逆转录反应
取一定量的的RNA(0.1ng~5μg),1μL oligo(dT)或者miRNA特异性反转引物加入到RNase free的管子中,并加入一定量的DEPC水,使得终体积为12μL。将管子置于65℃温水中,温浴5min。温浴结束后,将管子快速置于冰上。往管子中加入4μL5×reaction buffer,2μL 10mM dNTP mix,1μL RNA酶抑制剂以及1μL逆转录酶,轻轻地混匀,置于37℃水浴锅中温浴1h,然后置于70℃水浴锅中灭活5min。最后保存于-80℃冰箱中。
四、qPCR反应
1、配制以下反应体系进行实时荧光定量PCR反应。反应条件:95℃,3min变性;95℃,12s;62℃,40s;40次循环。
2、点样:将步骤1)中反应体系加入孔板中。
3、PCR反应:将步骤2)中已点好样的管板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。
4、反应条件:95℃,3min变性;95℃,12s;62℃,40s;40次循环。
五、采用2-△△Ct法分析
1、分别得到内参和目的基因的Ct;
Ct=Ct(目的基因)-Ct(内参基因);
2、以对照组的△Ct作为基础,△△Ct=△Ct(实验组△Ct)-△Ct(对照组的△Ct);
3、-△△Ct为各组△△Ct的相反数;
4、将-△△Ct作为2的指数幂进行计算。
六、采用统计学分析
差异显著性分析:利用SPSS 21.0软件,组间比较采用T检验,P<0.05为差异有统计学意义。
Pearson相关性分析:利用SPSS 21.0软件,对患病儿童组的PROC和miR-204-5p,miR-211-5p,miR-218-5p,miR-802,miR-124-3p,miR-506-3p,miR-124-3p的表达进行Pearson相关性分析,当P<0.05时,为有统计学意义。
七、实验结果
图2显示了各组血浆中miR-204-5p,miR-211-5p,miR-218-5p,miR-802,miR-124-3p,miR-506-3p和PROC mRNA的相对含量。由图中可知,与正常儿童血液组相比,门静脉海绵样变Rex手术后蛋白C水平低的患儿的血液中miR-124-3p,miR-506-3p的mRNA的相对含量显著升高,PROC相对含量显著降低。
表2显示了各miRNA分别与PROC的Pearson相关性分析结果。其中PearsonCorrelation为相关系数,相关系数的绝对值越大,相关性越强,相关系数越接近1或者-1,相关度越强,sig(Significance)为P值(<0.05为有显著性意义),N为样本量。由表中可知,门静脉海绵样变Rex手术后蛋白C水平低的患儿组的儿童血浆中miR-211-5p,miR-802,miR-124-3p,miR-506-3p与PROC有显著相关性。
表2各miRNA分别与PROC的Pearson相关性分析结果
*Correlation is significant at the 0.05level(bilateral)
**Correlation is significant at the 0.01level(bilateral)
实施例3、验证PROC靶基因的双荧光素酶实验
一、实验分组
(1)NC mimics+Luc-PROCwt。(2)miR-506mimic+Luc-PROCwt。(3)miR-124mimic+Luc-PROCwt。(4)NC mimics+Luc-PROCmut。(5)miR-506mimic+Luc-PROCmut。(6)miR-124mimic+Luc-PROCmut。
将miRNA mimics和萤火虫荧光酶以及作为对照的海肾荧光素酶质粒共转染293T细胞48h后,进行Luciferase活性检测。
二、实验步骤
1、弃去培养基,使用1x PBS清洗,弃去PBS。
2、每孔加入100μL 1x PLB(1体积5X Passive Lysis Buffer加上4体积双蒸水),室温下置于摇床上震荡15min。
3、待细胞充分裂解后,将裂解液加入96孔板,每个样品加样20μL。
4、每孔待测样品中加入100μL LAR II(使用Luciferase Assay Buffer II重悬Luciferase Assay Substrate)。
5、上机检测萤火虫萤光素酶反应的荧光强度。
7、在以海肾荧光素酶为内参的情况下,用萤火虫荧光素酶测定得到的RLU值除以海肾荧光素酶测定得到的RLU值(Fluc/Rluc)。根据得到比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。
三、实验结果
图3显示了各组细胞双荧光素酶报告基因检测结果。由图中可以看出,与NC+Luc-PROCwt组相比,miR-506+Luc-PROCwt组与miR-124+Luc-PROCwt组的荧光素酶活性明显降低(p<0.01)。与NC+Luc-PROCmut组相比,miR-506+Luc-PROCmut组的荧光素酶活性明显降低(p<0.01),miR-124+Luc-PROCmut组的荧光素酶活性升高(p<0.05)。
由结果可知,1)miR-506可以调控带有PROC 3’UTR的luciferase的表达(p<0.01),在结合位点突变后,这种调控关系依然存在,但荧光素酶活性下降的趋势明显减少,这说明除预测位点之外,miR-506与PROC基因还存在其他结合位点;2)miR-124可以调控带有PROC3’UTR的luciferase的表达(p<0.01),在结合位点突变后,这种调控趋势消失,则miR-124通过该结合位点调控luciferase的表达,证实miR-124与PROC基因具有靶向关系。
实施例4、验证PROC靶基因的细胞转染实验
一、实验分组
(1)NC mimics。(2)miR-506mimics。(3)miR-124mimcs。(4)miR-506inhibitor。(5)miR-124inhibitor。
按上述分组将miRNA mimics或者inhibitor瞬转HL-7702细胞48h,用于后续实验。
二、实验步骤
1、转染前一天,细胞接种六孔板,每孔约3×105个。
2、配制溶液A:1.5ml EP管加入50ng mimic或者inhibitor+250微升无血清1640;配制溶液B:1.5mL EP管加入6微升LIPO2000+250微升无血清1640。
3、室温孵育5分钟,将溶液B滴入溶液A,混匀后孵育20分钟。
4、弃掉培养液,用无血清1640清洗,然后每孔加入1.5mL无血清1640。
5、将500μL混合物滴加入上述细胞中,终体积为2mL。
6、孵育6小时后移去转染液,换成2mL 1640完全培养基。
7、各组细胞备用,继续后续各种实验。
实施例5、验证PROC靶基因的CCK-8实验
一、实验分组
(1)NC mimics。(2)miR-506mimics。(3)miR-124mimcs。(4)miR-506inhibitor。(5)miR-124inhibitor
二、实验方法
各个分组的细胞,接种于96孔板,每孔180μL,5×103个/孔。置于37℃、5%CO2培养使细胞贴壁,在各个待测时间点之前1-4小时,加入20μL CCK solution,继续孵育1-4小时,使用酶标仪测定450nm处的吸光度。
三、实验结果
图4显示了CCK-8检测各组细胞活性变化结果。由图中可知,0h时,各组细胞增殖变化无明显差异(p>0.05)。48h时,与NC组相比,miR-506组、miR-124组细胞增殖率明显降低(p<0.01),inhibitor-506组、inhibitor-124组细胞增殖率明显升高(p<0.01)。
由结果可知,miR-506与miR-124能够抑制HL-7702细胞增殖,miR-506与miR-124被抑制后能够促进HL-7702细胞增殖。
实施例6、验证PROC靶基因的RT-PCR实验
一、实验分组
(1)NC mimics。(2)miR-506mimics。(3)miR-124mimcs。(4)miR-506inhibitor。(5)miR-124inhibitor。
二、RNA的提取
采用实施例2中的方法提取细胞中的RNA。
三、逆转录反应
采用实施例2中的方法逆转录RNA。
四、qPCR反应
采用实施例2中的方法进行qPCR反应。
五、实验结果
图5显示了qRT-PCR检测各组细胞中PROC mRNA表达水平。由图中可知,与NC组相比,miR-506组、miR-124组细胞中PROC mRNA表达水平明显降低(p<0.01),inhibitor-506组、inhibitor-124组细胞中PROC mRNA表达水平明显升高(p<0.01)。
由结果可知,miR-506与miR-124在转录水平上能够下调PROC基因的表达,inhibitor-506与inhibitor-124在转录水平上能够上调PROC基因的表达。
实施例7、验证PROC靶基因的Western Blot实验
一、实验分组
(1)NC mimics。(2)miR-506mimics。(3)miR-124mimcs。(4)miR-506inhibitor。(5)miR-124inhibitor。
二、实验方法
采用常规的Western Blot方法进行实验。
三、实验结果
图6显示了Western Blot检测各组细胞中PROC、COX-2、VEGF、Bcl-2、Bax、HIF1α蛋白表达结果。由图中可知,与NC组相比,miR-506与miR-124组中,PROC与Bcl-2蛋白表达水平下调,COX-2、VEGF、Bax、HIF1α蛋白表达水平上调;inhibitor-506与inhibitor-124组中,PROC与Bcl-2蛋白表达水平上调,COX-2、VEGF、Bax、HIF1α蛋白表达水平下调。
由结果可知,miR-506与miR-124能够下调PROC与Bcl-2蛋白表达水平,上调COX-2、VEGF、Bax、HIF1α蛋白表达水平;miR-506与miR-124被抑制后,PROC与Bcl-2蛋白表达水平上调,COX-2、VEGF、Bax、HIF1α蛋白表达水平下调。
实施例8、验证PROC靶基因的细胞凋亡实验
一、实验分组
(1)NC mimics。(2)miR-506mimics。(3)miR-124mimcs。(4)miR-506inhibitor。(5)miR-124inhibitor。
二、实验方法
1、细胞转染48h后进行检测。
2、消化待测的各组细胞,并用预冷的PBS洗涤,500g,4℃离心5min,收集细胞,加入100μL预冷的1xbuffer,重悬细胞。
3、加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI,轻轻混匀,室温避光反应15min。
4、加入400μL PBS,混匀,流式上机检测。
三、实验结果
图7与图8显示了流式检测各组细胞凋亡情况。由图中可知,与NC组相比,,与NC组相比,miR-506组、miR-124组中细胞凋亡水平明显升高(p<0.01),inhibitor-506组、inhibitor-124组中细胞凋亡水平明显降低(p<0.01)。
由结果可知,miR-506与miR-124促进HL-7702细胞凋亡,miR-506与miR-124被抑制后,HL-7702细胞凋亡受到抑制。
序列表
SEQ ID NO:1 miRNA正义链核苷酸序列
CGTTCCCTTT GTCATCCT
SEQ ID NO:2 miRNA反义链核苷酸序列
GTGCAGGGTC CGAGGT
SEQ ID NO:3 miRNA正义链核苷酸序列
CGTTCCCTTT GTCATCCT
SEQ ID NO:4 miRNA反义链核苷酸序列
GTGCAGGGTC CGAGGT
SEQ ID NO:5 miRNA正义链核苷酸序列
CGCGTTGTGC TTGATCTAA
SEQ ID NO:6 miRNA反义链核苷酸序列
GTGCAGGGTC CGAGGT
SEQ ID NO:7 miRNA正义链核苷酸序列
CGCAGTAACAAAGATTCAT
SEQ ID NO:8 miRNA反义链核苷酸序列
GTGCAGGGTC CGAGGT
SEQ ID NO:9 miRNA正义链核苷酸序列
CGTAAGGCAC GCGGTG
SEQ ID NO:10 miRNA反义链核苷酸序列
GTGCAGGGTC CGAGGT
SEQ ID NO:11 miRNA正义链核苷酸序列
CGTAAGGCAC CCTTCTG
SEQ ID NO:12 miRNA反义链核苷酸序列
GTGCAGGGTC CGAGGT
SEQ ID NO:13 PCR正向引物
CTGCACGCAT TACTGCCTAG A
SEQ ID NO:14 PCR反向引物
CCTCCCACAA GGGAACTTCA
SEQ ID NO:15 PCR正向引物
TGGTATGACAACGAATTTGG
SEQ ID NO:16 PCR反向引物
TCTACATGGCAACTGTGAGG
序列表
<110> 首都儿科研究所
<120> 蛋白C在肝门脉高压治疗中的应用
<130> 2019
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> homo sapiens
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<212> DNA
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<211> 18
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<211> 16
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<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 8
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 9
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<211> 16
<212> DNA
<213> homo sapiens
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<211> 20
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 16
tctacatggc aactgtgagg 20
Claims (4)
1.如以下所示的一种或多种产品在制备用于抑制肝细胞增殖的药物中的用途,
(1)miR-124-3p;
(2)载体,其包含miR-124-3p;
(3)宿主细胞,其包含miR-124-3p或(2)中所述的载体。
2.如以下所示的一种或多种产品在制备用于促进肝细胞凋亡的药物中的用途,
(1)miR-124-3p;
(2)载体,其包含miR-124-3p;
(3)宿主细胞,其包含miR-124-3p或(2)中所述的载体。
3.如权利要求1或2所述的用途,所述载体选自质粒、脂质体、病毒或其它合适类型的载体。
4.如权利要求3所述的用途,所述质粒选自真核细胞质粒;所述脂质体选自lipofectamin;所述病毒选自慢病毒或逆转录病毒。
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MiR-124 protects human hepatic L02 cells from H2O2-induced apoptosis by targeting Rab38 gene;Li Xiaohua等;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;20140526;第450卷(第1期);第148-153页 * |
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