CN110157690A - 飞蝗过氧化物还原酶及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种过氧化物还原酶基因PRX6的dsRNA及其制备方法与应用。本发明首先从飞蝗中克隆了飞蝗过氧化物还原酶基因LmPRX6，并对飞蝗过氧化物还原酶基因LmPRX6设计引物，合成了用于飞蝗过氧化物还原酶基因LmPRX6的dsRNA，且运用注射法将dsRNA导入飞蝗对飞蝗过氧化物还原酶基因LmPRX6进行RNAi。结果表明：通过干扰飞蝗过氧化物还原酶基因LmPRX6可调控飞蝗滞育。本发明为更深入理解飞蝗滞育机制、创制新的生物农药制剂提供理论基础。
Description
技术领域
本发明属于生物防治技术领域，具体涉及飞蝗过氧化物还原酶及其编码基因与应用。
背景技术
过氧化物还原酶家族(Peroxiredoxins)代表一类硫醇依赖的过氧化物酶家族，广泛分布在大多数真核和原核生物细胞中。PRX6是其家族成员之一，属于1-Cys过氧化物还原酶，也是哺乳动物中唯一的1-Cys蛋白。研究表明，PRX6是一种具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的蛋白，其功能是减少组织中过氧化氢、烷基氢过氧化物和过氧硝酸盐的含量，负责还原过氧化氢和磷脂过氧化物等。
人体中的PRX6是抗氧化蛋白家族中的一员，主要存在于细胞质中，不仅有抗氧化性，还参与细胞的增殖、分化和细胞信号转导。PRX6是机体中清除ROS的重要过氧化物还原酶，在大脑组织中大量表达。多余的ROS会与大脑中的脂质发生过氧化反应，导致丙二醛(malondialdehyde，MDA)等过氧化产物增多。因此，机体通过上调大脑中PRX6的表达来清除多余的ROS，从而保护脑组织免受ROS的攻击。此外，鮸鱼Prx6基因的cDNA序列全长为909bp；其中5’端不翻译区(Untranslated Regions，UTR)为19bp，3’UTR为224bp，开放阅读框(OpenReading Frame，ORF)为663bp，可以编码220个氨基酸。对其进行同源性分析发现，鮸鱼Prx6含有1-Cys。鮸鱼Prx6二级结构经过氨基酸序列分析发现含有五个α螺旋、九个β折叠。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何防治害虫。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种过氧化物还原酶。
本发明提供的过氧化物还原酶来源于飞蝗(Locusta migratoria)，其名称为飞蝗过氧化物还原酶LmPRX6，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述c)中的蛋白质LmPRX6，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质LmPRX6可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c)中的蛋白质LmPRX6的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了与LmPRX6蛋白质相关的生物材料。
本发明提供的与LmPRX6蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：
A1)编码LmPRX6蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。
上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码LmPRX6蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码LmPRX6蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码LmPRX6蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的LmPRX6的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码LmPRX6且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了LmPRX6蛋白质或上述生物材料的新用途。
本发明提供了LmPRX6蛋白质或上述生物材料在如下a1)-a6)中任一种中的应用：
a1)调控昆虫滞育；
a2)制备调控昆虫滞育的产品；
a3)防治害虫；
a4)制备防治害虫的产品；
a5)降低昆虫滞育率；
a6)制备降低昆虫滞育率的产品。
上述应用中，所述调控为降低；所述昆虫或害虫为飞蝗；所述降低昆虫滞育率为降低子代蝗卵滞育率。具体的，在短光照条件下，与PRX6基因正常表达的飞蝗相比，PRX6基因被干扰的飞蝗子代卵滞育率下降。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种降低飞蝗滞育率的方法。
本发明提供的降低飞蝗滞育率的方法包括降低昆虫中过氧化物还原酶的表达量和/或活性的步骤，从而实现降低昆虫滞育率。
进一步的，所述降低昆虫中过氧化物还原酶的表达量和/或活性的方法是将抑制昆虫中过氧化物还原酶的编码基因表达的物质导入昆虫；
所述抑制昆虫中过氧化物还原酶的编码基因表达的物质为抑制昆虫中过氧化物还原酶的编码基因表达的dsRNA。
更进一步的，所述过氧化物还原酶为上述LmPRX6蛋白质；抑制昆虫中所述LmPRX6蛋白质的编码基因表达的dsRNA为由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。
上述方法中，所述导入的方式为注射。
上述方法中，所述昆虫为飞蝗；所述降低昆虫滞育率为降低子代蝗卵滞育率。
上述方法在防治害虫中的应用也属于本发明的保护范围。
为了解决上述问题，本发明还提供了抑制LmPRX6蛋白质的编码基因表达的物质。
本发明提供的抑制LmPRX6蛋白质的编码基因表达的物质为上述dsRNA。
编码上述dsRNA的DNA分子或含有编码上述dsRNA的DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系也均属于本发明的保护范围。
所述编码上述dsRNA的DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列3。
为了解决上述问题，本发明最后提供了上述抑制LmPRX6蛋白质的编码基因表达的物质或编码上述dsRNA的DNA分子或含有编码上述dsRNA的DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系的新用途。
本发明提供了上述抑制LmPRX6蛋白质的编码基因表达的物质或编码上述dsRNA的DNA分子或含有编码上述dsRNA的DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下b1)-b7)中任一种中的应用：
b1)防治害虫；
b2)制备防治害虫的产品；
b3)降低昆虫滞育率；
b4)制备降低昆虫滞育率的产品；
b5)抑制飞蝗过氧化物还原酶基因PRX6表达；
b6)制备抑制飞蝗过氧化物还原酶基因PRX6表达的产品；
b7)作为过氧化物还原酶抑制剂。
上述应用或方法中，所述昆虫或害虫为飞蝗。
本发明首先从飞蝗中克隆了飞蝗过氧化物还原酶基因LmPRX6全长及其片段，并对飞蝗过氧化物还原酶基因LmPRX6片段设计引物，合成了用于飞蝗过氧化物还原酶基因LmPRX6的dsRNA，且运用注射法将dsRNA导入飞蝗对飞蝗过氧化物还原酶基因LmPRX6进行RNAi。结果表明：飞蝗过氧化物还原酶LmPRX6可调控飞蝗滞育。本发明为更深入理解飞蝗滞育机制、创制新的生物农药制剂提供理论基础。
附图说明
图1为PCR筛选阳性克隆电泳图。
图2为短日照条件下飞蝗过氧化物还原酶基因LmPRX6干扰效率。
图3为RNAi飞蝗过氧化物还原酶基因LmPRX6后蝗卵滞育率检测。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的供试虫源：飞蝗卵采集于山东泰安，在实验室连续饲养多代。飞蝗卵在智能人工气候箱中孵化，温度30℃，相对湿度60％。饲养条件：滞育诱导条件，光周期L：D＝10h：14h，温度28℃；非滞育条件，光周期L：D＝16h：8h，28℃。喂食小麦幼苗。
下述实施例中的主要试剂及试剂：RNA分离试剂(invitrogen原装)，RNAspin column(全式金)，胶回收试剂盒(Axygen)，EX Taq DNA聚合酶(Takara)，T4DNA连接酶(Takara)，pGEM-T Easy Vector Systems(Promega)，无水乙醇、异丙醇、丙三醇等试剂均为国产分析醇。
下述实施例中的主要仪器：超净工作台(上海博讯实业有限公司)、东胜龙ETC-811PCR仪(北京东胜创新生物科技有限公司)、德国Sigma 3K15冷冻离心机(德国希格玛离心机有限公司)、NanoPhotometer微量分光光度计(德国IMPLEN公司)、HPX-9052MBE数显电热培养箱(上海博讯实业有限公司)、THZ-D台式恒温振荡器(华美生化仪器厂)、漩涡振荡器QL-901(海门市其林贝尔仪器制造)、高压灭菌锅YXQ-LS-50SII(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、电转化仪(Eppendorf)、高速冷冻离心机(Sigma)、分析天平(Sartorius)、恒温培养箱ZHWY-103B(上海智城)。
下述实施例中的培养基的配方：
1)YPD培养基：20g蛋白胨，10g酵母粉，20g葡萄糖，加H2O定容至1L，115℃高压灭菌20min(固体培养基每升需要加15g琼脂粉)。
2)1M D-山梨醇：182g D-山梨醇，加H2O定容至1L，121℃高压灭菌20min。
3)MD平板(100mL)：80mL水中加入琼脂糖2g(20g/L)，121℃灭菌20分钟，待温度低于60℃，在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4g/L)，10×葡萄糖10mL(20g/L)，500×生物素0.2mL(4×10-4g/L)。
4)BMGY(1L)：10g酵母提取物，20g蛋白胨，3g K2HPO4，11.8g KH2PO4，加水至890mL，121℃灭菌20分钟，待温度低于60℃以后在超净台上加入10×YNB100mL(13.4g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甘油10mL。
5)BMMY(1L)：10g酵母提取物，20g蛋白胨，3g K2HPO4，11.8g KH2PO4，加水至890mL，121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃以后在超净台上加入10×YNB100mL(13.4g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甲醇5mL。
实施例1、飞蝗过氧化物还原酶基因LmPRX6全长及片段的获得
一、飞蝗过氧化物还原酶基因LmPRX6全长的获得
1、飞蝗总RNA的提取
用RNA分离试剂提取飞蝗组织样品的RNA，具体步骤如下：
1)2ml匀浆器放于烘箱中，160℃，3个小时，冷却至室温备用。
2)将匀浆器置于冰上，加入1mLRNA分离试剂和100-200mg飞蝗组织，研磨。
3)将匀浆液转移至1.5mL离心管中，室温静置5min。4℃，13000r离心5min。
4)将上清转移至干净的1.5mL离心管中，加入200μL氯仿，漩涡震荡15s。室温放置5min。4℃，13000r离心10min。
5)吸取400μL上清转移至新的1.5mL离心管中，加入200μL氯仿，漩涡震荡30s。室温放置5min。4℃，13000r离心10min。
6)吸取300μL上清，加入300μL异丙醇，漩涡震荡30s，转移至RNA spin column中，冰上静置10min。
7)4℃，13000r离心2min，弃滤液。
8)加入600μL RNA washsolution，吸打使沉降物洗涤，4℃，13000r离心2min，弃滤液。再次加入600μL RNA washsolution，吸打使沉降物洗涤，4℃，13000r离心2min，弃滤液。4℃，13000r空离3min，除去多余乙醇，空气吹干3min。
9)更换一个新的收集管，向RNA spin column中加入50μL 65℃预热的RNase-free-water，余热下热置5min，4℃，13000r离心3min。
10)收集滤出液，用NanoPhotometer微量分光光度计检测RNA浓度和OD260/280值，确认RNA质量。同时，取2μL提取的RNA，琼脂糖凝胶电泳检测，剩余RNA储存于-20℃备用。
2、反转录
用PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒反转录获得cDNA，具体步骤如下：
1)配置10μL体系：Oligo dT Primer(50μM)1μL、dNTP Mixture(10mM each)1μL、total RNA<5μL、RNase Free dH2O补足体系至10μL。
2)65℃保温5min后，冰上迅速冷却。
3)配置20μL反应液：5×PrimeScript Buffer 4μL、RNase Inhibitor(400U/μL)0.5μL(20units)、PrimeScript RTase(200U/μL)1μL(200units)、RNase Free dH2O补足体系至20μL。
4)缓慢混匀。
5)42℃保温30-60min。
6)95℃保温5min，使酶失活，冰上放置，-20℃保存cDNA。
3、飞蝗过氧化物还原酶PRX6及其编码基因的获得
1)引物设计
根据前期测得的飞蝗转录组得到PRX6基因序列，利用DNAMAN8设计PRX6基因全长引物。设计的引物如下：
PRX6-0F：5'-CGCGGATCCGATGAAGCTCGAGAGCATCGTC-3'；
PRX6-0R：5'-ACGCGTCGACGTAGTCAGTGGTGGTGCGC-3'。
2)PCR反应
以飞蝗cDNA为模板，以引物PRX6-1F/PRX6-1R进行PCR扩增，得到PCR产物。
PCR反应体系如下(总体积50μL)：cDNA模板1μL、dNTP 4μL、10×Buffer 5μL、前引物1μL、后引物1μL、Taq酶0.25μL、ddH2O 38μL。
PCR反应条件如下：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃1min30s，35个循环；72℃10min；4℃保存。
3)PCR产物回收、克隆、测序
3-1)将PCR产物在TAE配制的1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，当目标带分离较好时，用刀片切下目标带所在的胶块放入无菌的离心管中。再用胶回收试剂盒(Axygen)回收纯化目标带，回收纯化过程参照试剂盒说明书进行。
3-2)PCR产物回收后连接pGEM-T Easy载体，得到重组载体。连接体系如下：T4 DNAligase 1μL、2×buffer 5μL、pGEM-T Easy 1μL、PCR回收产物3μL。连接条件：室温下连接6个小时。
3-3)感受态细胞的制备与转化
在1.5mL离心管中，加入33.3μL Trans1-t1感受态细胞，冰上放置15min，42℃水浴90s，冰上放置10min。在每个1.5mL离心管中加入500μL的液体LB培养液，37℃，200rpm摇菌2h。摇菌后，吸取100μL菌液至1‰AMP LB固体培养基中，37℃培养过夜。挑选单菌落于2mL的离心管中，管中有1mL的1‰AMP LB液体培养基。37℃，200rpm摇菌3-6h，观察生长情况。
3-4)菌液PCR
对3-3)中的菌液进行PCR验证，PCR筛选阳性克隆电泳图结果如图1所示。菌液PCR反应体系(总体积50μL)如下：菌液1μL、dNTP 4μL、10×Buffer 5μL、前引物1μL、后引物1μL、Taq酶0.25μL、ddH2O 38μL。
反应条件如下：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃1min30s，35个循环；72℃10min；4℃保存。
将阳性克隆菌株送到北京梓熙生物科技有限公司进行序列测定并对测序结果进行分析。
测序结果表明：PCR扩增得到大小为663bp的DNA片段，其核苷酸序列如序列1所示，将序列1所示的基因命名为LmPRX6，其编码的完整开放阅读框氨基酸序列如序列2所示，将序列2所示的飞蝗过氧化物还原酶命名为LmPRX6。
二、飞蝗过氧化物还原酶基因LmPRX6片段的获得
按照步骤一中的方法，采用PRX6-1F和PRX6-1R进行PCR扩增，得到PCR产物，即为LmPRX6基因片段。引物序列如下：
PRX6-1F：ACGTAGTTGTTGCCGGAG；
PRX6-1R：CGCTACAGAGAGAAGTCTACA。
对PCR产物进行测序。测序结果表明：PCR扩增得到大小为672bp的DNA片段，其核苷酸序列如序列3所示。
实施例2、飞蝗过氧化物还原酶基因PRX6的dsRNA及其在防治飞蝗中的应用
一、dsRNA的合成
采用T7 RiboMAXTM Express RNAi System试剂盒合成dsRNA。具体步骤如下：
1)dsRNA引物的合成
根据已克隆出的LmPRX6基因片段设计引物，扩增目的片段为600bp左右，在引物的5'端引入T7启动子。引物序列如下：
PRX6-2F：5’-TAATACGACTCACTATAGGACGTAGTTGTTGCCGGAG-3’；
PRX6-2R：5’-TAATACGACTCACTATAGGCGCTACAGAGAGAAGTCTACA-3’。
2)DNA模板的制备
用试剂盒提取菌液质粒，以含基因片段的质粒(实施例1中的重组载体)为模板，采用PRX6-2F和PRX6-2R进行PCR扩增，得到含有T7启动子序列的目的片段。
PCR反应体系如下(总体积50μl)：质粒1μL、dNTP 4μL、10×Buffer 5μL、前引物1μL、后引物1μL、Taq酶0.25μL、ddH2O 38μL。
PCR反应条件如下：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃保存。
回收PCR产物，并用NanoPhotometer微量分光光度计检测目标DNA浓度，回收浓度需大于150ng/μL。
3)dsRNA的合成
采用T7 RiboMAXTM Express RNAi System试剂盒将回收的DNA体外转录合成飞蝗过氧化物还原酶基因LmPRX6的dsRNA，并用NanoPhotometer微量分光光度计检测dsRNA浓度，将dsRNA浓度调整为1000ng/μL，得到dsRNA溶液(溶剂为Nucleause free water)。
本发明获得的飞蝗过氧化物还原酶基因LmPRX6的dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列4，其反义链的核苷酸序列为序列4的反向互补序列。
上述飞蝗过氧化物还原酶基因LmPRX6的dsRNA也可通过人工合成的方法获得。将飞蝗过氧化物还原酶基因LmPRX6的dsRNA命名为dsPRX6。
4)对照为双蒸水
二、dsRNA在防治飞蝗中的应用
1、实验方法
实验组：将10μL浓度为1000ng/μL的dsPRX6溶液注射入蝗虫体内。
对照组：将10μL双蒸水溶液注射入蝗虫体内。
具体步骤如下：分别在长光照(非滞育条件，光周期L：D＝16h：8h，28℃)和短光照(滞育条件，光周期L：D＝10h：14h)条件(温度28℃)下饲养飞蝗，用10μL的微量注射器分别吸取10μL浓度为1000ng/μL的dsPRX6溶液(实验组)和双蒸水溶液(对照组)，在飞蝗雌成虫羽化第一天分别注射进入飞蝗雌成虫腹部的第三和第四腹节之间的节间膜内，注射器的针头和腹部平行，避免损伤蝗虫的内部器官组织。长日照和短日照条件下，实验组和对照组分别注射25头雌成虫。注射36h后，每个处理随机取5头雌成虫，解剖获取飞蝗脂肪体组织。
2、实时荧光定量PCR
提取飞蝗脂肪体组织的总RNA，Takara反转录试剂盒合成cDNA，检测LmPRX6基因表达量。以actin基因作为内参基因。引物序列如下：
actin-F：GTTACAAACTGGGACGACAT；
actin-R：AGAAAGCACAGCCTGAATAG；
PRX6-3F：TGGAAAGGAAACTCGTGG；
PRX6-3R：TTGTCACAGGAGAGAGCCA。
结果如图2所示。从图中可看出：在短光照条件下，LmPRX6基因在实验组的飞蝗脂肪体中的相对表达水平与对照组有显著性差异(P＜0.05)，且低于对照组。在短光照条件下，dsPRX6实验组的飞蝗中的LmPRX6基因的表达量显著降低，说明dsPRX6成功干扰了飞蝗脂肪体中LmPRX6基因的表达。
3、飞蝗滞育率统计
分别取在长光照和短光照条件下注射dsPRX6或dsGFP的飞蝗产的卵(蝗卵)并置于27℃条件下孵化，统计孵化幼虫数D1，剩余卵置于4℃保存一个月，目的是解除滞育，然后32℃孵化，统计孵化幼虫数D2，剩余卵即为未受精卵或死卵，则蝗卵滞育率＝D2/(D1+D2)×100％。
结果如图3所示。从图中可看出：干扰飞蝗雌成虫LmPRX6基因后，短光照条件下飞蝗子代卵滞育率与对照组相比下降，且有显著差异(P＜0.05)。说明LmPRX6基因参与调控飞蝗滞育，LmPRX6基因转录水平下降时，飞蝗卵滞育率下降。
序列表
<110>中国农业科学院植物保护研究所
<120>飞蝗过氧化物还原酶及其编码基因与应用
<160>4
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>663
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
atgaagctcg agagcatcgt ccccaacttc aaggcgccct ctacacaggg gcctctcgaa 60
ttctacaaat ggaaaggaaa ctcgtggtgt gtcctgtttt cgcaccctgc cgacttcact 120
ccagtgtgca ccacagagct gggacgcatc gccgtccaca acccggagtt ccagaagcga 180
ggagtcaagc tgctggctct ctcctgtgac aagctcaagg accacgttga ctgggtcaat 240
gacatcaagt cgtactgcaa ggacattccc ggcgacttcc cgtaccccat cgtgtccgac 300
gagacgcgcg agctggccgt caagctggac atgatcgacg agcgcgacaa ggacaacgtg 360
gagaaggcga tgacggtgag ggccatgtac gtcatcgggc ccgacaaccg gctccgcctc 420
tccatggtgt accccgcgtc ctgcggccgt aacgtcgatg agctgctgcg cgtcatcgac 480
tccctgcagc tgacggaccg gctcaaggtg gtggcgacgc cggccaactg gacgcccggc 540
accaaggtga tgatcctgcc gcacgtgccg gactcagatc tccccaaact cttccctgga 600
ggagttgagc gcgtctccat gccctccggc aacaactacg tgcgcaccac cactgactac 660
tga 663
<210>2
<211>220
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
Met Lys Leu Glu Ser Ile Val Pro Asn Phe Lys Ala Pro Ser Thr Gln
1 5 10 15
Gly Pro Leu Glu Phe Tyr Lys Trp Lys Gly Asn Ser Trp Cys Val Leu
20 25 30
Phe Ser His Pro Ala Asp Phe Thr Pro Val Cys Thr Thr Glu Leu Gly
35 40 45
Arg Ile Ala Val His Asn Pro Glu Phe Gln Lys Arg Gly Val Lys Leu
50 55 60
Leu Ala Leu Ser Cys Asp Lys Leu Lys Asp His Val Asp Trp Val Asn
65 70 75 80
Asp Ile Lys Ser Tyr Cys Lys Asp Ile Pro Gly Asp Phe Pro Tyr Pro
85 90 95
Ile Val Ser Asp Glu Thr Arg Glu Leu Ala Val Lys Leu Asp Met Ile
100 105 110
Asp Glu Arg Asp Lys Asp Asn Val Glu Lys Ala Met Thr Val Arg Ala
115 120 125
Met Tyr Val Ile Gly Pro Asp Asn Arg Leu Arg Leu Ser Met Val Tyr
130 135 140
Pro Ala Ser Cys Gly Arg Asn Val Asp Glu Leu Leu Arg Val Ile Asp
145 150 155 160
Ser Leu Gln Leu Thr Asp Arg Leu Lys Val Val Ala Thr Pro Ala Asn
165 170 175
Trp Thr Pro Gly Thr Lys Val Met Ile Leu Pro His Val Pro Asp Ser
180 185 190
Asp Leu Pro Lys Leu Phe Pro Gly Gly Val Glu Arg Val Ser Met Pro
195 200 205
Ser Gly Asn Asn Tyr Val Arg Thr Thr Thr Asp Tyr
210 215 220
<210>3
<211>672
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
tcgctacaga gagaagtcta caggcagcga catgaagctc gagagcatcg tccccaactt 60
caaggcgccc tctacacagg ggcctctcga attctacaaa tggaaaggaa actcgtggtg 120
tgtcctgttt tcgcaccctg ccgacttcac tccagtgtgc accacagagc tgggacgcat 180
cgccgtccac aacccggagt tccagaagcg aggagtcaag ctgctggctc tctcctgtga 240
caagctcaag gaccacgttg actgggtcaa tgacatcaag tcgtactgca aggacattcc 300
cggcgacttc ccgtacccca tcgtgtccga cgagacgcgc gagctggccg tcaagctgga 360
catgatcgac gagcgcgaca aggacaacgt ggagaaggcg atgacggtga gggccatgta 420
cgtcatcggg cccgacaacc ggctccgcct ctccatggtg taccccgcgt cctgcggccg 480
taacgtcgat gagctgctgc gcgtcatcga ctccctgcag ctgacggacc ggctcaaggt 540
ggtggcgacg ccggccaact ggacgcccgg caccaaggtg atgatcctgc cgcacgtgcc 600
ggactcagat ctccccaaac tcttccctgg aggagttgag cgcgtctcca tgccctccgg 660
caacaactac gt 672
<210>4
<211>672
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
ucgcuacaga gagaagucua caggcagcga caugaagcuc gagagcaucg uccccaacuu 60
caaggcgccc ucuacacagg ggccucucga auucuacaaa uggaaaggaa acucguggug 120
uguccuguuu ucgcacccug ccgacuucac uccagugugc accacagagc ugggacgcau 180
cgccguccac aacccggagu uccagaagcg aggagucaag cugcuggcuc ucuccuguga 240
caagcucaag gaccacguug acugggucaa ugacaucaag ucguacugca aggacauucc 300
cggcgacuuc ccguacccca ucguguccga cgagacgcgc gagcuggccg ucaagcugga 360
caugaucgac gagcgcgaca aggacaacgu ggagaaggcg augacgguga gggccaugua 420
cgucaucggg cccgacaacc ggcuccgccu cuccauggug uaccccgcgu ccugcggccg 480
uaacgucgau gagcugcugc gcgucaucga cucccugcag cugacggacc ggcucaaggu 540
gguggcgacg ccggccaacu ggacgcccgg caccaaggug augauccugc cgcacgugcc 600
ggacucagau cuccccaaac ucuucccugg aggaguugag cgcgucucca ugcccuccgg 660
caacaacuac gu 672
Claims (10)
1.蛋白质，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。
2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A8)中的任一种：
A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列1第75-1274位所示的cDNA分子或基因组DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的生物材料在如下a1)-a6)中任一种中的应用：
a1)调控昆虫滞育；
a2)制备调控昆虫滞育的产品；
a3)防治害虫；
a4)制备防治害虫的产品；
a5)降低昆虫滞育率；
a6)制备降低昆虫滞育率的产品。
5.一种降低昆虫滞育率的方法，包括降低昆虫中过氧化物还原酶的表达量和/或活性的步骤，从而实现降低昆虫滞育率。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述降低昆虫中过氧化物还原酶的表达量和/或活性的方法是将抑制昆虫中过氧化物还原酶的编码基因表达的物质导入昆虫；
或，所述抑制昆虫中过氧化物还原酶的编码基因表达的物质为抑制昆虫中过氧化物还原酶的编码基因表达的dsRNA；
或，所述过氧化物还原酶为权利要求1所述的蛋白质；
或，所述抑制昆虫中过氧化物还原酶的编码基因表达的dsRNA为由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA；
或，所述导入的方式为注射。
7.权利要求5或6所述的方法在防治害虫中的应用。
8.抑制权利要求1所述的蛋白质的编码基因表达的物质，其为权利要求6中所述的dsRNA；
或，编码权利要求6中所述的dsRNA的DNA分子，其核苷酸序列为序列表中序列3；
或，含有编码权利要求6中所述的dsRNA的DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
9.权利要求8所述的物质或DNA分子或表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下b1)-b7)中任一种中的应用：
b1)防治害虫；
b2)制备防治害虫的产品；
b3)降低昆虫滞育率；
b4)制备降低昆虫滞育率的产品；
b5)抑制飞蝗过氧化物还原酶基因PRX6表达；
b6)制备抑制飞蝗过氧化物还原酶基因PRX6表达的产品；
b7)作为过氧化物还原酶抑制剂。
10.根据权利要求4、7、9所述的应用或权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述昆虫或害虫为飞蝗。
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-
2019
- 2019-05-14 CN CN201910397111.3A patent/CN110157690B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王洁: "反式激活胰岛素信号调控飞蝗卵滞育", 《万方数据库》 * |
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|---|---|
| CN110157690B (zh) | 2021-08-17 |
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