CN110140052A - 平板气-液界面暴露模块和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于将气‑液界面处的多个细胞暴露于纳米微粒的平板气‑液界面暴露模块，该平板气‑液界面暴露模块包括加湿区段、暴露区段、和气溶胶管道。进一步提供了相关系统和方法。

Description

平板气-液界面暴露模块和方法
技术领域
本发明涉及一种用于模拟天然肺环境的测试系统。进一步提供了用于确定纳米微粒对细胞的影响的方法以及用于基于纳米微粒对细胞的影响进行筛选的方法。
背景技术
用于纳米毒性测试的许多现有技术方法遭受显著的缺点的影响。例如，以浸没式培养为特征的体外系统涉及液体中的纳米微粒和细胞，这不对应于肺的生理环境。
为了克服浸没式纳米毒性测试的缺陷(如由Paur等人评述的(气溶胶科学杂志(J.Aerosol Sci.)，2011年,42668-692))，已经开发了若干体外系统以用于将气-液界面(ALI)处的细胞暴露于雾化的纳米微粒(NP)，从而允许肺细胞和NP之间更真实的相互作用、限制NP的物理化学属性的改变，并且提供更准确的剂量确定。文献中所描述的大多数方法是内部(in-house)系统，例如ALICE(Lenz等人发表于微粒和纤维毒理学报，2009年,632)和ALIDA，但也存在商业上可获得的系统，如具有已证实的有效性的CULTEX(Cultex实验室有限公司)和(VITROCELL系统有限公司)暴露技术。
大多数ALI实验是基于作为其中沉积通常相当低的沉积机制的扩散和/或重力沉降的(Aufderheide,M.发表于实验与毒理病理学期刊(Exp.Toxicol Pathol.)，2008年,60(2-3),163-180；Bitterle等人发表于臭氧层期刊(Chemosphere)，2006年,65(10),1784-1790；Diabate等人发表在2008年,36(3),285-298；Rothen-Rutishauser等人发表于环境科学与技术杂志(J.EnvironSci.Technol.)，2009年,43(7),2634-2640，Steinritz等人发表于Chem Biol.Interact.期刊，2013年,206(3),479-490))。
而且，其中纳米微粒借助于雾沉积在肺细胞上的气-液界面也不对应于肺中的自然环境。仍然不同的系统涉及对引导式空气流的使用，这不幸地导致了秸秆效应和纳米微粒在气-液界面上回弹。
US2008/0047825公开了一种用于将靶材料暴露于带电微粒的微粒暴露系统。该微粒暴露系统包括具有上壁、下壁以及一个或多个侧壁的暴露腔室，该上壁、下壁以及一个或多个侧壁一起限定用于容纳靶材料并且在使用期间接收微粒的暴露腔室。暴露腔室包括被安装到暴露腔室下壁的基座，其中第一电极被纳入到基座的上部中。第一电极可以采用板、网格、线圈等形式。大致平坦的靶材料层被设置在电极的上表面上并且被暴露给暴露腔室。从电极的下表面，突起可以延伸到基座材料的其余部分中。第二电极与从上壁延伸的第一电极间隔开。暴露腔室在下壁中包含一个或多个出口，用于排出被供应到腔室的气体或气体/微粒混合物，以此方式使得指向靶材料中心的气流可以容易地流经并且流到靶材料的侧面和基座。第二电极可以在朝向和背离第一电极的方向上是可移动的。
WO2010/040473公开了一种用于细胞和/或细菌培养的培养/暴露设备，其包括用于设置在基体中的各个个体培养容器的容座、具有旨在将培养容器暴露于测试大气的入口的导流器。测试大气可以是携带微粒的气态介质，例如气溶胶。该设备包括多个模块，这些模块以使得它们易于彼此卸离的方式彼此连接。样品容座模块被连接到气溶胶引导模块，在该气溶胶引导模块上放置有预备模块。预备模块可以例如被形成为充电器，在该实例中，测试大气被例如以静电方式带电。如果对测试大气的预处理不是必需的，则该模块可以用加湿器(其中测试大气被加湿)或者用简单的入口适配器来代替。
Lenz Anke Gabriele等人在微粒和纤维技术期刊(Particl and fibertechnology，英国伦敦Biomed Central，第6卷第1号，2009年12月16日，第32页)上公开了一种用于液体中的纳米微粒的气-液界面细胞暴露系统。该设备利用振动膜雾化器生成致密的液滴云，并且利用组合的云沉降和单微粒沉降以供在气-液界面处高效地递送纳米微粒。
鉴于以上所述，存在对接近地模拟体内暴露于纳米微粒的体外气-液界面暴露系统的明确需要。
发明内容
本发明人已经开发出平板气-液界面暴露模块或系统，其克服了现有技术设备的一个或多个缺点。更具体而言，本文中所描述的模块和系统基于模拟人肺的流体动力学的近层流态。另外，对双极或单极带电微粒使用静电沉淀确保了纳米微粒的高效沉积。
本文中提供了一种平板气-液界面暴露模块，其包括加湿区段、暴露区段、和气溶胶管道，该气溶胶管道被配置成用于顺序地引导带电纳米微粒通过加湿区段和暴露区段。平板气-液界面暴露模块的特征进一步在于：暴露区段包括包含金属板的用于确保电场的装置，该金属板包括从金属板突出到暴露区段中的多个短截线。
在特定实施例中，暴露区段进一步包括金属上部组件。在这些实施例中，用于确保电场的装置包括金属板和金属上部组件。在这些实施例中，短截线在金属上部组件的方向上从金属板突出。
在本文中所提供的平板气-液界面暴露模块的特定实施例中，加湿区段包括水浴。
本文中所提供的平板气-液界面暴露模块尤其适合与倒转孔(inverted well)设置(其可以被放置在短截线上)一起使用。相应地，在平板气-液界面暴露模块的特定实施例中，暴露区段进一步包括包含一个或多个倒转孔的倒转孔细胞培养设置，每个倒转孔包括多孔膜以用于支持气-液界面处的多个细胞，倒转孔被定位在金属板的短截线上。
在特定实施例中，平板气-液界面暴露模块进一步包括在暴露区段中的绝缘壳体，其中该绝缘壳体至少包括被放置在倒转孔培养设置上的绝缘盖。更具体而言，绝缘盖包括多个孔洞，其中这些孔洞与倒转孔对准。在特定实施例中，绝缘盖是可移除的。在特定实施例中，绝缘壳体由塑料或其他绝缘材料制成。在特定实施例中，绝缘壳体还包围金属板。
在本文中所提供的平板气-液界面暴露模块的特定实施例中，暴露区段进一步包括温度控制器。在特定实施例中，温度控制器包括一个或多个帕尔贴元件和散热器，这些帕尔贴元件被热耦合到散热器。在特定实施例中，暴露区段借助于热绝缘壳体与散热器热隔离。
在特定实施例中，本文中所提供的平板气-液界面暴露模块进一步包括重量分析传感器、温度传感器、和湿度传感器中的一者或多者。
在特定实施例中，本文中所提供的平板气-液界面暴露模块进一步包括在加湿区段和暴露区段之间的桥。
本申请还提供了一种气-液界面暴露系统，其包括如本文中所描述的纳米微粒充电设备、流体系统、高电压源以及平板气-液界面暴露模块。更具体而言，气-液界面暴露系统的纳米微粒充电设备被配置成用于使包括不带电的纳米微粒的气溶胶中的纳米微粒带电，从而获得包括带电纳米微粒的气溶胶，气-液界面暴露系统的流体系统被配置成用于引导包括带电纳米微粒的气溶胶通过平板气-液界面暴露模块，并且高电压源被连接到金属板以确保电场。
本申请还提供了用于使用本文中所描述的气-液界面暴露系统，且更具体地是平板气-液界面暴露模块来将体外多个细胞暴露于气溶胶中所包括的纳米微粒的方法。这些方法尤其适合于纳米毒性测试。在这些方法中，细胞被提供在平板气-液界面暴露模块中，并且包括带电纳米微粒的气溶胶被允许通过平板气-液界面暴露模块；另外，电场在平板气-液界面暴露模块的暴露区段中被生成，以便将带电纳米微粒气溶胶引导到细胞。在特定实施例中，细胞选自包括气道上皮细胞和肺泡上皮细胞的列表。
附图说明
以下对本文中所描述的方法和仪器的具体实施例的附图的描述本质上仅仅是示例性的，而并不意图限制本发明教导、其应用或用途。
图1示出了根据本发明的包括气-液暴露模块(2)的气-液界面暴露系统(1)的实施例。
图2示出了本体材料(更具体而言是如由NTA测定的CuO-NP分散体(A)以及所生成的气溶胶(B)，其被表示为在使用SMPS的暴露腔室的入口和排气处的微粒大小分布之间的差异)的物理化学特性。
图3示出了根据本发明的一实施例的如通过摄影成像捕捉的在1h内沉积在倒转孔上的材料的空间分布。
图4示出了关于在20小时后暴露温育之后相对于清洁空气(CA)的NFκB-luc细胞的％细胞活力与细胞培养基(CCM)中沉积的Cu总量的散点图(A)；每位置的沉积在膜(M)上、或存在于CCM中的Cu总量、和％细胞活性(B)；每位置的在CCM中沉积的离子和非离子Cu的量和％细胞活性(C)；关于在20小时后暴露温育之后NFκB-luc细胞的细胞活性和在CCM中沉积的离子(空心圆、实线回归线)和非离子(空心方块、虚线回归线)Cu的量的散点图(D)。
图5示出了3次独立生物学重复(R1-R3)的处于ALI或CA暴露的pIL8-luc(上图)和NFκB-luc(下图)A549细胞在1小时暴露于CuO纳米气溶胶之后的细胞活力(如与清洁空气(CA)相比的％)。箱形图表示对整个托盘(A)、列3和4(B)以及行‘B’的各个个体位置(C)的分析。在A和B中，每个箱形图表示每次重复的托盘中12比6细胞培养插入物的活力数据的分布。在C中，每个箱形图表示每个位置(托盘的B1至B4位置)3次独立重复实验的活力数据的分布；*p<0.05；**p≤0.01；O:出口。
图6示出了针对3次独立生物实验(浅(重复1)、中(重复2)和深灰(重复3))的供分析整个托盘(A)和列3和4(B)的与清洁空气(CA)暴露相比在1小时暴露于CuO纳米气溶胶之后pIL8-lucA549细胞的IL-8启动子活性(上图)和NFκB-lucA549细胞的NFκB活性(下图)。在(C)中执行了针对％细胞活力的启动子活性的标准化以分析整个托盘。O：出口。
图7示出了根据本发明的一实施例(2)的平板气-液界面暴露模块(2)的进一步细节，其包括包含具有短截线(24)的金属板(5)的暴露区段(28)和加湿区段(29)。
图8示出了根据本发明的特定实施例的平板气-液界面暴露模块(2)，其包括倒转孔(8)和包括绝缘盖(9)的绝缘壳体。
在全部附图中，遵循以下编号：1-气-液界面暴露系统；2-平板气-液界面暴露模块；3-水腔室；4-桥；5-不锈钢板；6-石英晶体微量天平；7-细胞培养基；8-倒转孔细胞培养设置；9-绝缘盖；10-气溶胶流指示器；11-盒体；12a-雾化器；12b-扩散干燥器；13-过滤器；14-电晕喷射充电器；15-质量流控制器；16-排气；17-电晕喷射充电器的高电压源；18-用于平板气-液界面暴露模块的高电压源；19-扫描迁移率微粒分析仪；20-凝聚微粒计数器；21-排气；22-入口；23-出口；24-短截线；25-细胞；26-绝缘壳体；27-板腔室；28-暴露区段；29-加湿区段。
具体实施方式
在描述本发明的系统和方法之前，应理解本发明不限于所描述的特定系统和方法或组合，因为这些系统和方法及组合当然可以变化。还应理解，本文中所使用的术语不旨在是限制性的，因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限制。
如本文中所使用，单数形式“一”、“一个”和“该”包括单数和复数指示物两者，除非上下文另有明确说明。
如本文中所使用的术语“包括”和“由……组成”与“包含”或““含有”同义，并且是包含性的或开放式的且不排除附加的、未列举的成员、要素或方法步骤。应当领会，如本文中所使用的术语“包括”和“由……组成”包括术语“组成要素为……”和“由……构成”。
由端点表述的数值范围包括被归入相应范围内的所有数字和分数，以及所列举的端点。
当提及诸如参数、量、时间历时等可测量值时，如本文中所使用的术语“约”或“近似”意味着包括指定值或根据指定值的±10％或更小，优选地±5％或更小，更优选地±1％或更小，且仍更优选地±0.1％或更小的变化，只要此类变化适合于执行所公开的发明。应当理解，修饰语“约”或“近似”所指的值本身也被具体地且优选地公开。
尽管术语“一个或多个”或“至少一个”(诸如一组成员中的一个或多个或者至少一个成员)本身是清楚的，但借助于进一步的范例，该术语尤其涵盖对所述成员中的任意一者、或对所述成员中的任意两个或更多个的引用，诸如举例而言，所述成员中的任意≥3、≥4、≥5、≥6或≥7等，并且直至所有所述成员。
本说明书中引用的所有参考文献都通过援引被整体地并入本文。具体而言，本文中具体提及的所有参考文献的教导均通过援引被并入。
除非另外定义，否则用于公开本发明的所有术语(包括技术和科学术语)具有如本发明所属领域中的普通技术人员之一所通常理解的含义。借助于进一步的指导，术语定义被包括在内以便更好地领会本发明的教导。
在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非有明确的相反指明，否则如此定义的每个方面可以与任何其他一个或多个方面相组合。具体而言，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其他一个或多个特征相组合。
贯穿本说明书对“一个实施例”或“实施例”的引用意指结合该实施例描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施例中。因而，短语“在一个实施例中”或“在实施例中”贯穿本说明书在各个地方的出现并不一定都指同一实施例，但是可以指同一实施例。此外，在一个或多个实施例中，特定特征、结构或特性可以以任何合适的方式被组合，如本领域技术人员将从本公开中显而易见的。此外，尽管本文中所描述的特定实施例包括其他实施例中所包括的一些特征但不包括其他实施例中所包括的其他特征，但是不同实施例的特征的组合旨在落在本发明的范围内，并且形成如将由本领域技术人员所理解的不同实施例。例如，在所附权利要求中，任何所要求保护的实施例均可以以任何组合来被使用。
在本发明的当前描述中，参考形成该描述的一部分的附图，并且仅通过说明的方式示出了可以实践本发明的具体实施例。应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以利用其他实施例并且可以作出结构上或逻辑上的改变。因此，以下详细描述不应按照限制的意义来理解，并且本发明的范围由所附权利要求限定。
本文中提供了气-液界面暴露系统以及适于供在其中使用的平板气-液界面暴露模块。暴露系统和模块被用于将气-液界面处的多个细胞暴露于纳米微粒。在特定实施例中，暴露系统是多组件平板暴露设备。本文中所描述的系统允许实现模拟人肺的流体动力学的近层流态和双极或单极带电微粒的静电沉淀，并且允许纳米微粒的改善的沉积效率。
本文中所提供的气-液界面暴露系统包括平板气-液界面暴露模块，其通常包括加湿区段、暴露区段以及允许空气从加湿区段流到暴露区段的气溶胶管道。在正常使用期间，该模块在不需要放大的空气流的情况下通过以下来允许将细胞暴露于纳米微粒：在倒转孔细胞培养设置中培养的细胞上使用水平气溶胶流，并且在细胞上静电沉积纳米微粒。
一般而言，平板气-液界面暴露模块的操作可被描述为如下。包括带电纳米微粒的气溶胶通过加湿区段中的入口被移动到加湿区段中。在加湿区段中，将包括带电纳米微粒的气溶胶加湿以使气溶胶的相对湿度达到生理条件，诸如举例而言在人肺中发现的生理条件。包括带电纳米微粒的气溶胶(其被加湿)接着被移动到暴露区段。在暴露区段中，借助于电场将带电纳米微粒静电地拉向细胞。所得气溶胶(至少部分地耗尽了纳米微粒)接着通过出口被排出。
本平板气-液界面暴露模块允许接近地模拟其中活体细胞与液体和气相接触的细胞的自然环境，诸如在人肺中，甚至是对于长时间测量(例如长达16小时)。在本系统和设备中，纳米微粒的物理化学属性的改变是受限的，并且可以准确地确定被施用于细胞的纳米微粒的剂量。因而，经由通过平板气-液界面暴露模块提供适当的流速以对应于人肺的给定流模式(即，在一代内)，可以模拟纳米微粒的沉积。相应地，本文中所提供的设备和方法的诸用途之一是提供肺细胞和纳米微粒之间相互作用的真实模拟。另一用途是快速且准确地评估与人肺中的空气传播的纳米微粒相关的物理和免疫效应。
如本文中所提供的平板气-液界面暴露模块包括加湿区段、暴露区段、和气溶胶管道，该气溶胶管道允许空气从加湿区段流到暴露区段。
如本文中所提供的平板气-液界面暴露模块的暴露区段通常包括板腔室，诸如培养板，其允许对系统进行定位，在该系统上可以在一环境中提供细胞，该环境至少在所需暴露时间期间确保了细胞的存活。更具体而言，本文中所提供的模块的暴露区段被设计成与倒转孔细胞培养设置一同起作用。本文中所提供的平板气-液界面暴露模块的暴露区段包括金属板，该金属板包括多个短截线。在特定实施例中，金属板包括总共6-18个，优选地12个短截线，即板的从金属板延伸到暴露区段中的分立区域，特别是板的在朝上方向上或垂直地从金属板延伸的分立区域。短截线的大小和形状被调整，使得倒转孔可被定位在短截线上。短截线可以增强在倒转孔上生长的细胞上的纳米微粒沉积，这些倒转孔可被定位在短截线上，如下面将更详细地解释的。
本文中所提供的平板气-液界面暴露模块进一步包括加湿区段。加湿区段确保穿过它的空气流被加湿。优选地，加湿区段包括水浴。替代地，加湿区段包括锁水材料，诸如凝胶或布(诸如毛毡)。加湿区段允许对包括带电纳米微粒的气溶胶进行加湿，同时最小化纳米微粒损耗。与使用例如用于加湿的毛毡的系统对比，使用水浴尤其允许降低纳米微粒损耗。在正常使用期间，水浴通常填充有去离子水以加湿流经它的气溶胶流。
在特定实施例中，平板气-液界面暴露模块包括在加湿区段和暴露区段之间的桥。该桥是加湿区段和暴露区段之间的基本上垂直的结构。这增强了通过平板气-液界面暴露模块的空气流。
本文中所提供的平板气-液界面暴露模块进一步包括气溶胶管道，即，以最小湍流顺序地引导空气流通过加湿和暴露区段的系统。更具体而言，气溶胶管道引导包括带电纳米微粒的气溶胶顺序地通过加湿区段和暴露区段。通常，气溶胶管道由定位在平板气-液界面暴露模块一端所处的入口(在加湿区段中)和定位在平板气-液界面暴露模块的相对端处的出口(在暴露区段中)来确保。
优选地，当多个倒转孔被置于暴露区段中时，气溶胶管道在这些倒转孔上水平地引导包括带电纳米微粒的气溶胶。这允许在倒转孔上的包括带电纳米微粒的气溶胶的层流，这增强了纳米微粒沉积。而且，在特定实施例中，气溶胶管道的流可被调整，使得细胞可以在宽流速范围内与气溶胶接触。
如本文中所使用的术语“水平”包括偏离水平面小于10°，优选地小于5°，更优选地小于1°的取向。
在特定实施例中，气溶胶管道包括加湿区段中的气溶胶隧道。在特定实施例中，隧道由半透性塑料膜制成。隧道允许最小化空气流的湍流。
在特定实施例中，气溶胶管道不包括加湿区段中的隧道。
在特定实施例中，暴露区段的板腔室被配置成用作水浴。这有利于暴露腔室中的温度控制。在替代实施例中，板腔室不包括水。
在特定实施例中，暴露区段包括温度控制器。这允许准确地控制暴露区段内的诸条件。优选地，温度控制器包括一个或多个(优选地约10个)帕尔贴元件和散热器。帕尔贴元件被热耦合到散热器。相应地，可根据需要来将热添加到暴露区段或从暴露区段移除热。
在特定实施例中，每个帕尔贴元件的功率在50和150W之间，优选地在75和125W之间，更优选地约95W。
优选地，帕尔贴元件均匀地分布在暴露区段的顶侧和底侧上。这可以增强暴露区段中的温度均匀性。
在特定实施例中，平板气-液界面暴露模块包括多个传感器。这些传感器可以包括重量分析传感器(如石英晶体微量天平，例如灵敏度低至ng范围的石英晶体微量天平)、温度传感器、和湿度传感器。
在特定实施例中，平板气-液界面暴露模块包括一个或多个温度传感器，以用于监视平板气-液界面暴露模块中的内部温度。该一个或多个温度传感器可以被可操作地耦合到控制器，该控制器被配置成用于将一个或多个所测量的温度与预设温度进行比较。当所测量的温度低于预设温度时，平板气-液界面暴露模块可以借助于一个或多个帕尔贴元件来被加热，直到达到预设温度。当所测量的温度高于预设温度时，平板气-液界面暴露模块可以借助于一个或多个帕尔贴元件来被冷却，直到达到预设温度。
在特定实施例中，平板气-液界面暴露模块由包括恒流控制器的电源提供。恒流控制器可以实现目标温度的微调，这可以最小化电磁噪声。电磁噪声可能是标准控制器的问题。最小化电磁噪声允许消除与内置传感器的信号接口干扰。
平板气-液界面暴露模块可进一步包括重量分析传感器(如石英晶体微量天平，举例而言，灵敏度低至ng范围的石英晶体微量天平)和/或湿度传感器中的一者或多者。在特定实施例中，传感器被用于监视平板气-液界面暴露模块内的空气质量和/或用于监视纳米微粒沉积。在特定实施例中，传感器被定位在暴露区段和用于从暴露区段排出纳米微粒耗尽的气溶胶的出口之间。传感器可以帮助确保平板气-液界面暴露模块内的环境参数可以被最佳地测量，使得细胞可以被最佳地维持。另外，传感器允许监视在沉积区域之后的不同运行内的再现性，从而确保纳米微粒被充分地沉积在细胞上。
在特定实施例中，一个或多个重量分析传感器被配置成用于监视纳米微粒直接沉积到细胞培养基中。这是一种非常高效的监视方法。具体而言，这比诸如电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等更精细的技术高效得多。
在特定实施例中，平板气-液界面暴露模块进一步包括底盘，优选地金属底盘，更优选地阳极化铝底盘。底盘可以为平板气-液界面暴露模块的各种组件提供机械支持。
如以上所指出，本文中所提供的平板气-液界面暴露模块和气-液界面暴露系统尤其适合与倒转孔培养设置一起使用。相应地，在特定实施例中，并且具体而言在本文中所提供的本气-液界面暴露系统和模块的正常使用期间，暴露区段包括倒转孔细胞培养设置。倒转孔细胞培养设置包括多个倒转孔。每个倒转孔包括用于支持多个细胞的多孔膜。如本文中所提供的供使用的一种合适类型的倒转孔是Transwell渗透性支持件(康宁公司)。在特定的实施例中，倒转孔包括被定位在倒转孔的膜的顶部上的细胞。
为了将细胞暴露于气溶胶，倒转孔被定位在平板气-液界面暴露模块的暴露区段中的金属板的短截线上，使得每个倒转孔配合在短截线上。在正常操作期间，包括具有短截线的钢板的板腔室设置有生长培养基，使得生长培养基抵达多孔膜，这允许细胞在膜上的生长。
平板气-液界面暴露模块的暴露区段被配置成保持电场。更具体而言，该模块包括用于确保电场的装置。在特定实施例中，该装置包括被连接到高电压源的金属板。电场将存在于暴露区段中的空气流中的带电纳米微粒引导朝向倒转孔上的多孔膜。在进一步的特定实施例中，除了金属板之外，用于确保电场的装置还包括第二组件，该第二组件是位于气溶胶管道上方的上部金属组件；在特定实施例中，该上部组件是金属板。相应地，在这些实施例中，电场借助于底部金属板来生成，该底部金属板被连接到电压源和位于气溶胶管道上方的金属上部组件(例如，绝缘的上部电极或金属盖)。在特定实施例中，金属上部组件被接地，例如，借助于接地的对电极。在进一步的特定实施例中，接地的对电极被集成到上部组件中。在替代实施例中，上部金属组件被连接到正或负HV，并且底部金属板被接地。
在特定实施例中，被定位在气溶胶管道上方的金属上部组件是金属顶盖。
在这些实施例中，在底部金属板和放置在气溶胶管道上方的金属组件之间生成电势差，电势的梯度对应于电场，并且电场致使对带电纳米微粒的静电力。该静电力将带电纳米微粒引导朝向金属板且因此朝向细胞。
本文中所提供的气-液界面暴露系统通常被用来检测纳米微粒沉积对细胞的影响。优选地，使纳米微粒带正电。相应地，纳米微粒可以被高效地引导到在多孔膜上生长的细胞。这允许优异的沉积速率，该沉积速率允许与包括相对低浓度的纳米微粒的气溶胶一起工作。
本发明人可以证明，电场不会在气-液界面处生长的细胞(例如肺细胞系A549的细胞)中诱导应激反应。
在特定实施例中，暴露区段被配置成确保金属上部组件(例如顶盖)和底部金属板之间的电压，例如-1kV的电压。在特定实施例中，金属板被电连接到电压源。通常，相对于金属上部组件使金属板处于负电势，使得带正电的纳米微粒被静电吸引到金属板。替代地，相对于金属上部组件使金属板处于正电势，使得带负电的纳米微粒被吸引到金属板。然而，极性应与纳米微粒的电荷相一致：当纳米微粒被带正电时，金属板应相对于金属上部组件处于负电势。当纳米微粒被带负电时，金属板应相对于金属上部组件处于正电势。
优选地，被连接到金属板的高电压单元被接地，并且被定位在气溶胶管道上方的金属上部组件(例如，金属顶盖或上部金属栅格)充当接地的对电极。这降低了电击的风险。
在特定实施例中，金属板和被定位在气溶胶管道上方的金属组件之间的电势差由高电压源来提供，该高电压源与主电源在通电方面分离开。
相应地，暴露区段配备有用于将带电纳米微粒引导到液-气界面处的多个细胞的电场。倒转孔的多孔膜下方的金属板的短截线可以用于将电场线集中在多孔膜上，这增强了在多孔膜上生长的细胞上的纳米微粒沉积。
在特定实施例中，平板气-液界面暴露模块进一步包括至少部分地封闭金属板的绝缘壳体。这改善了热行为和稳定性，并且其可以增强暴露区段中的温度控制。壳体通常包括至少一个底部区段，该底部区段装配在金属板周围。
附加地或替代地，壳体封闭具有倒转孔细胞培养设置的金属板的顶部部分，诸如通过绝缘盖的方式。绝缘盖可以是或者可以不是绝缘壳体的一部分。绝缘盖包括多个孔洞，并且可以被定位在金属板上，使得绝缘盖中的这些孔洞与金属板上的短截线对准。优选地，孔洞的数目等于短截线的数目。这允许更高效地将纳米微粒引导至细胞并且减少对金属板本身的损耗。在特定实施例中，绝缘盖中孔洞的直径为12至15mm。在特定实施例中，绝缘壳体由聚苯乙烯或其他绝缘材料制成。在特定实施例中，绝缘盖是可移除的。这允许轻松进入金属板和倒转孔细胞培养设置。
在特定实施例中，绝缘壳体是完全闭合的，这增强了金属板的电绝缘。绝缘壳体在金属板和平板气-液界面暴露模块的其他部分(例如，加湿区段中的水浴和/或平板气-液界面暴露模块的壳体)之间提供电绝缘。在特定实施例中，绝缘覆盖包括塑料。优选地，绝缘覆盖由具有足够高的介电常数的绝缘材料制成。在特定实施例中，绝缘覆盖由聚苯乙烯制成。
在特定实施例中，平板气-液界面暴露模块包括盒体，该盒体至少覆盖暴露区段，但通常覆盖暴露区段和加湿区段两者。优选地，盒体由绝缘材料制成。
系统(模块、流体系统、纳米微粒充电设备)
本文中进一步提供了一种气-液界面暴露系统，其包括以上所描述的平板气-液界面暴露模块。通常，气-液界面暴露系统附加地包括纳米微粒充电设备和流体系统。纳米微粒充电设备被配置成用于接受包括不带电的纳米微粒的气溶胶，并且用于使这些纳米微粒带电以便生成包括带电纳米微粒的气溶胶。流体系统被配置成用于将包括带电纳米微粒的气溶胶引导至平板气-液界面暴露模块。一般而言，流体系统被配置成用于将包括带电纳米微粒的气溶胶引导至加湿区段中的入口。另外，流体系统通常被配置成用于在气溶胶已经通过平板气-液界面暴露模块并且已经(至少部分地)借助于其中的电场耗尽了纳米微粒之后经由出口将气溶胶从暴露区段排出。
在特定实施例中，纳米微粒充电设备包括碰撞型雾化器、干燥器、空气过滤器、和电晕充电器。碰撞型雾化器可以通过纳米微粒悬浮液馈给。在特定实施例中，纳米微粒悬浮液通过在超声处理设备中的超声处理来制备。碰撞型雾化器可被用于雾化以上提到的纳米微粒悬浮液，并因而用于产生可保留大量水分的带有纳米微粒的空气流。在特定实施例中，例如借助于扩散或Nafion干燥器来干燥带有纳米微粒的空气流。经干燥的带有纳米微粒的空气流可以与电离空气流混合。在特定实施例中，电离空气流通过电晕充电器来被电离，并且在电离之前借助于活性炭过滤器和HEPA过滤器被纯化。通过将经干燥的带有纳米微粒的空气流和电离空气流混合，获得被馈给至平板气-液界面暴露模块的包括带电纳米微粒的气溶胶。
在特定实施例中，平板气-液界面暴露模块的排气被可操作地连接到扫描迁移率微粒分析仪，其可包括凝聚微粒计数器、中和器和动态迁移率分析器。这允许优异地监视平板气-液界面暴露模块的操作。
附加地或替代地，暴露模块的排气被顺序地连接到连接至质量流控制器(MFC)的泵。
相应地，在特定实施例中，气-液界面暴露系统包括本文中所描述的平板气-液界面暴露模块、包括碰撞型雾化器的纳米微粒充电设备、干燥器、空气过滤器、和电晕充电器、被连接到金属板的高电压单元、用于控制温度和相对湿度的控制单元、扫描迁移率微粒分析仪(SMPS)以及被连接到连接至质量流控制器(MFC)的泵的排气。
方法
本文中进一步提供了用于将体外多个细胞暴露于纳米微粒的方法。本方法尤其允许层流纳米微粒沉积在生长于倒转孔上的细胞上。
在本文中所提供的方法中，在气溶胶中包括纳米微粒，并且该方法涉及使用如本文中所提供的平板气-液界面暴露模块。如以上所指出，平板气-液界面暴露模块包括加湿区段和暴露区段。暴露区段被配置成供与倒转孔细胞培养设置一起使用，该倒转孔细胞培养设置包括用于支持气-液界面处的细胞的倒转孔。倒转孔被定位在金属板的短截线上。板腔室填充有直至倒转孔的细胞膜的培养基。这确保了细胞被定位在气-液界面处。
本文中所提供的方法通常包括使包括带电纳米微粒的气溶胶通过平板气-液界面暴露模块中的气溶胶管道，以及在暴露区段中施加电场，以使细胞暴露于纳米微粒。
当执行该方法时，包括带电纳米微粒的气溶胶首先被移动到加湿区段中。在加湿区段中，包括带电纳米微粒的气溶胶被加湿。相应地，获得包括带电纳米微粒的加湿气溶胶。随后，包括带电纳米微粒的加湿气溶胶被移动到暴露区段。在暴露区段中，电场被用来将带电纳米微粒引导至气-液界面处的多个细胞。带电纳米微粒被存在于气-液界面处的倒转孔上的多个细胞拦截。
(至少部分地)耗尽了纳米微粒的加湿气溶胶接着被排出该模块。尽管上述方法被描述为连贯的步骤序列，但是应该领会，该方法实际上是作为连续过程被执行的。
如其他地方所解释，倒转孔被定位在金属板的短截线上。倒转孔通常包括细胞可以在其上生长的多孔膜。在板腔室中提供培养基，使得液平面对应于多孔膜的水平。相应地，在多孔膜上生长的细胞可以借助于培养基来被提供营养物，而这些细胞可以被并发地暴露于暴露区段中的含纳米微粒的空气。
在特定实施例中，这些细胞是选自包括气道上皮细胞和肺泡上皮细胞的列表的细胞。电场不会针对某些肺细胞(诸如细胞系A549的细胞)引起应激反应。
优选地，以预定电场强度保持电场，该电场强度取决于需要被沉积的纳米微粒的直径。一般而言，对于相同沉积速率，纳米微粒越小，则电场强度越大。在特定实施例中，平板气-液界面暴露模块被配置成借助于金属板和放置在气溶胶管道上方的金属组件之间的电势差来生成电场，该电势差在0和2kV之间，优选地在0.50和1.5kV之间，该电势差更优选地约为1.0kV。
一般而言，被施加到纳米微粒的电荷取决于纳米微粒的大小。更具体而言，与具有较大表面积的较大微粒对比，较小的电荷通常被施加于具有较小表面积的较小微粒。在特定实施例中，对小于1μm的纳米微粒施加在1和100nC之间的电荷；参见例如Telko MJ(2009)的干粉吸入器中静电充电现象及其对沉积的影响的研究；北卡罗来纳大学博士论文。
优选地，包括纳米微粒的空气流的流速被调整至所研究的沉积方案。在特定实施例中，流速小于0.001cm/s。这允许研究肺泡流中的沉积。在特定实施例中，流速约为40cm/s。这允许研究支气管流中的沉积.
本方法允许简单、快速地检测纳米微粒的物理和体外免疫效应。在特定实施例中，该方法包括确定存在于气溶胶中的纳米微粒对细胞活力的影响。在特定实施例中，向细胞提供报告基因，并且基于细胞的发光来评估活力。
相应地，本申请提供了用于确定纳米微粒对细胞的影响的方法，该方法涉及使细胞与如上文中所描述的纳米微粒接触并随后分析这些细胞的步骤。通常将该细胞同没有与纳米微粒接触的细胞进行比较。本申请进一步提供了用于标识能够减轻纳米微粒对细胞的影响的化合物的方法，该方法涉及在存在或不存在所述化合物的情况下使细胞与如上文中所描述的纳米微粒接触及随后分析这些细胞的步骤。
本文中所提供的系统提供了用于确定纳米微粒对哺乳动物肺(诸如人肺)的影响的模型系统。因而，在特定实施例中，这些方法和设备可被用来确定经雾化的纳米微粒对肺细胞的影响。
示例
示例1：根据本发明的一实施例的气-液界面暴露系统
在第一示例中，对图1作出参考。图1示出了围绕平板气-液界面暴露模块(2)构建的气-液界面暴露系统(1)的特定实施例。
纳米微粒使用碰撞型雾化器(12a)来被生成，并且在它们作为气溶胶被带进平板气-液界面暴露模块(2)中之前被带电。具体而言，离开雾化器的纳米微粒使用扩散干燥器(11)来被干燥。纳米微粒接着通过与通过碳和HEPA过滤器(13)的经压缩空气混合而被带电，并且在电晕喷射充电器(14)中被带电。该系统进一步包括质量流控制器(15)、以及排风(16)。纳米微粒充电设备的工作方式在别处被更详细地解释。
该实施例中的平板气-液界面暴露模块(2)包括水浴(3)、桥(4)、不锈钢板(5)、和石英晶体微量天平(6)。不锈钢板(5)包括从金属板向上突出的多个短截线，并且支持为在不锈钢板(5)的短截线上方的倒转孔(8)的多孔膜上生长的细胞提供营养的细胞培养基(7)。包括多个孔洞的聚苯乙烯盖(9)被提供以除细胞在倒转孔的多孔膜上生长的地方之外覆盖包括倒转孔细胞培养设置的培养基。用于平板气-液界面暴露模块的高电压源在不锈钢板(5)和盒体(11)(其被接地)之间提供1kV。该配置允许纳米微粒在细胞上的有效静电沉积。
在气溶胶已通过平板气-液界面暴露模块(2)之后，其耗尽了纳米微粒，大多数纳米微粒被沉积在细胞上。纳米微粒耗尽了的气溶胶随后被引导到扫描迁移率微粒分析仪(19)和凝聚微粒计数器(20)以供进一步表征。接着，纳米微粒耗尽了的气溶胶经由排风(21)被排出。
示例2：根据本发明的一实施例的气-液界面暴露系统的实现
雾化设置
使用包含50mlCuO悬浮液和HEPA过滤的加压空气(5巴)的碰撞型雾化器生成了纳米气溶胶。22-25nm的合成CuO-NP(NanologicaAB)与MilliQ水相混合以制备CuO-NP悬浮液(4g/l)。遵照NanoValid联盟所开发的标准操作规程(SOP)“用于毒理学测试的NNV-011(CuO)纳米微粒悬浮液分散体”对悬浮液进行超声处理。经超声处理的悬浮液被直接用于雾化。使用扩散干燥器对离开雾化器(4升每分钟(lpm))的含NP的空气流进行干燥。1lpm加压空气的第二空气流通过碳和HEPA过滤器(HEPA/C)以及电离器(电晕喷射充电器(CC)，+2.5kV处)。两股气流在混合腔室中合并，其中气溶胶流中的微粒与经过滤的清洁空气所携带的正离子相混合。使用T-分接头(T-split)，带电气溶胶流的0.3lpm进入暴露腔室，同时使用被连接到质量流控制器(MFC)的泵将4.7lpm引入通风橱的排气中。暴露腔室的排气被连接到扫描迁移率微粒分析仪(SMPS)，其包括在0.3lpm的样品流处操作的凝聚微粒计数器(CPC)。
暴露系统
平板气-液界面暴露模块的原型(长45cm、宽11cm、高5.5cm)由阳极氧化铝底盘构造。通过在平板气-液界面暴露模块的顶侧和底侧上的十个均匀分布的帕尔贴元件(PE)实现了温度控制。这些PE元件经由带有内置温度传感器的外部控制器而要么在加热模式要么在冷却模式中被操作。为了确保稳定的热条件(36-37℃)，平板气-液界面暴露模块被嵌入到仅允许PE元件与外部安装的散热器接触的加固式聚乙烯壳体中。顶板可被移除以便易于进入倒转孔细胞培养设置和水浴。平板气-液界面暴露模块的内部包括三个隔室：气溶胶入口之后的第一隔室表示填充有Milli-Q水的水浴，以加湿通过半透膜引导的气溶胶隧道的气溶胶流，该半透膜引导的气溶胶隧道在其前部、侧面和尾部边缘与平板气-液界面暴露模块的内壁良好地配合以确保气溶胶的层流；第二隔室被设计成容纳包含细胞培养基(CCM)的不锈钢(SS)12孔板；朝向平板气-液界面暴露模块的出口，重量分析传感器(石英晶体微量天平(QCM))连同温度和湿度传感器一起被装配到金属底盘中，以监视平板气-液界面暴露模块内部的空气质量。温度、相对湿度(rH)、和质量数据经由基于Arduino的软件接口被记录到外部计算机。
为了使带正电的CuO纳米气溶胶静电场辅助地沉积到倒转transwell细胞插入物上，SS12孔板被连接到高电压(HV)源(-1kV，0A)。接地电极被安装在12孔板正上方的顶盖中。为了与水浴和铝壳体电绝缘，SS12孔板被放入聚苯乙烯(PS)盆中。为了将包含CCM的SS12孔板与带电CuO纳米气溶胶屏蔽，使用具有十二个15mm孔洞的PS顶盖。
纳米气溶胶表征
扫描迁移率微粒分析仪(SMPS)被用来测量雾化的CuO-NP的大小分布。所使用的型号3936包括静电分类器型号3080、包括氪-85源(370MBq)的中和器型号3077、长微分迁移率分析仪(DMA)型号3081、和基于丁醇的凝聚微粒计数器(CPC)型号3025A，所有都来自美国TSI公司。SMPS根据物品迁移率直径，之后通过使用CPC测量浓度来组合微粒大小分类，该CPC基于以下原理操作：借助于凝聚技术来放大小的微粒以形成足够大以至于被光学地检测到的液滴。CPC被调整至15nm和661nm之间的大小范围、100秒的扫描时间、15秒的回扫时间和2分钟复发间隔。
细胞系
使用了两种A549(人肺泡上皮肺癌)报告细胞系，其具有在白细胞介素(IL-8)启动子调控下或在四拷贝核因子κB(NFκB)响应元件的调控下的荧光素酶报告基因。这些细胞系的建立已在Oostingh,G.J.；Schmittner,M.；Ehart,A.K.；Tischler,U.；Duschl,A.发表在体外毒理学期刊(Toxicol In Vitro.2008,22522(5),1301-1310)上的文章中被详细描述。
细胞培养条件
在37℃的含有5％CO2的加湿温育箱中对所有细胞进行培养。将转染的细胞系pIL8-lucA549培养于RPMI1640(补充有1％L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素(全都来自Gibco)、10％胎牛血清(FBS，金血清，Biochrom)和作为选择抗生素的1％G418硫酸盐(500μg/ml，Invivogen))中。NFκB-lucA549转染细胞购自Panomics(Affymetrix公司)并根据经销商的说明书在Dulbecco改良Eagle培养基中进行培养，所述培养基含有L-谷氨酰胺且不含丙酮酸钠(Gibco)，补充有100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10％FBS和100μg/ml205潮霉素B(Roche)。在接种之前，细胞以磷酸盐缓冲盐水(PBS，Gibco)冲洗一次，通过胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶-EDTA，Gibco)脱离，并且计数。将ThinCert24孔细胞培养插入物(1μm孔隙大小，PET膜；Greiner)倒置在皮氏培养皿中，并且将50μl细胞悬浮液(2x105个细胞/ml，即1.0x104个细胞/插入物)放在插入物的膜上。覆盖皮氏培养皿，并且在37℃含有5％CO2的加湿温育箱中温育插入物。在2.5小时之后，用PBS(含钙2+和镁2+)小心地洗涤膜，并将插入物置于正常悬挂位置的24-孔板中。将A549培养基添加到下部(800μl)和上部(100μl)隔室中，并且使细胞在浸没条件下生长2天以形成融合单层。
转移至气-液界面(ALI)以暴露于纳米微粒。
在由12个用于倒转孔的位置(即技术重复)组成的内置构造的不锈钢(SS)12孔板中加入100ml A549培养基。在ALI处将十二个插入物(即，倒转孔)以倒转的位置(倒置)放置在板上。补充12孔板中的培养基(20ml)，避免在插入物上溢出，并关闭平板气-液界面暴露模块。对于各种分析(即，使用ICP-MS的Cu定量、细胞活力、促炎潜力)，将12孔插入物暴露于洁净空气(阴性对照)，暴露于12ppm NO2(针对细胞活力的阳性对照)，以及暴露于4g/lCuO-NP暴露时长为1小时(0.3lpm，+2.5kV电晕充电器，-1.0kVHV)。监测暴露期间的温度和相对湿度(rH)，并且发现在36-37℃和99％rH时稳定。在1小时暴露之后，进行生物学终点测量和Cu定量。使用不同代的细胞系和新鲜制备的CuO-NP悬浮液进行三次独立生物学试验。
每个生物学试验中包括了至少3个温育对照。为此，将插入物置于加湿温育箱中，在含有5.5ml/孔的12-孔板中倒置1小时。使用相同的设置在至少3个其他插入物的培养基中添加肿瘤坏死因子α(TNF-232α，Roche；pIL8luc为250ng/ml，pNFκB-luc细胞为25ng/ml)作为荧光素酶报告基因(LUC)测定的阳性对照。
细胞活力
使用细胞活力测定试剂盒(Promega)评估细胞活力。该测定基于活细胞将蓝色氧化还原染料刃天青转化为荧光化合物试卤灵的能力，而非活细胞不产生任何荧光信号。对于该测定，在24-孔板中的含有试剂的450μl A549培养基中，对所有12个插入物进行后温育(浸没)20小时。同时，还在插入物中添加50μl的该试剂。在加湿温育箱中温育20小时后，混合两种试剂，并将120μl转移至白色96孔板(一式三份)。使用读板器(Fluoroscan Ascent)在544/590nm处记录了荧光。
免疫效果
使用两种稳定转染的A549细胞系评估促炎潜力，如Oostingh,G.J.；Schmittner,M.；Ehart,A.K.；Tischler,U.；Duschl,A.发表在体外毒理学期刊(Toxicol InVitro.2008,22522(5),1301-1310)上的文章中先前描述的。对于LUC测定，在加湿培养箱中的含有A549培养基(下部隔室中800μl，上部隔室中50μl)的24孔板中对插入件进行2.5小时的后温育(浸没)。在后温育之后，剩余的培养基被移除。通过在每个孔中添加350μl报告裂解缓冲液(Promega)来裂解细胞，并且在悬挂的插入物中添加50μl报告裂解缓冲液。在室温下摇动板25分钟之后，将板冷冻(-80℃)最少1小时、最多1周。在室温下解冻板之后，将报告裂解缓冲液(孔+插入物中)混合，并且将40μl加到白色96孔板(一式三份)。在将等量的荧光素酶试剂(Promega)注入每个孔中之后，使用光度计(Luminoskan)测量发光5秒。
统计分析
应用具有重复测量的双向ANOVA来测试清洁空气和CuO-NP暴露之间以及清洁空气和NO2暴露之间的统计差异。该模型考虑了针对三种独立生物学试验和每个被试条件(＝全板分析)的SS板上的12个不同的插入物(即技术重复)。这也被称为“对象内处理”设计，其中清洁空气、CuO-NP和NO2作为处理，而12个插入物则作为对象。选择该方法是因为12个插入物的位置对于所得细胞活力结果是决定性的。
应用直接双向ANOVA模型来测试温育对照与清洁空气和TNFα暴露之间的统计差异，因为平板气-液界面暴露模块中的各位置之间不存在关联，并且只获得关于温育对照(至少3个插入物被试)的少量数据。为此，该模型仅将独立生物学试验和流信息纳入考虑。所有统计分析均使用R完成。
从ICP-MS测定发现，CuO-NP的沉积在SS板的后半部分中显著较少。出于这个原因，还针对板的前两个暴露的列测定了清洁空气和CuO-NP暴露之间的统计差异，以供比较。另外，针对板中部的行还注意到优选空气流，其示出上游到下游的高至低的Cu浓度。还针对该特定行‘B’运行了统计。
结果
利用根据本发明的一实施例的气-液界面暴露系统进行了一组原理证明试验。
具体而言，气-液界面暴露系统被用于确定对纳米气溶胶的生物学响应。作为促炎监测的原理证明，将两种人肺泡上皮A549报告细胞系暴露于CuO-NP的模型纳米气溶胶。来自层空气流的有效沉积由静电场介导，并且分析对细胞活力和促炎潜力的影响。
用于生成纳米气溶胶的CuO粉末的本体材料通过基于标准方案的一组物理化学方法来表征。该粉末含有亚微米大小的NP团聚物，其由表面积为28m2/g且纯度>99％(具有少量Ba和Ag污染物)的22-25nm的单一一级微粒组成。CuO粉末的标准化超声分散体(4g/l)遵循标准操作规程(SOP)来制备并且被用于雾化。在CuO分散体中观察到相同的一级微粒大小，ζ电势测量结果为+35.9±1.3mV，并且DLS给出154.5±1.7nm的z-平均直径以及0.157的多分散性指数。发现这与NTA所得的168.4±3.9nm的平均微粒大小良好地吻合(图2A)。
所生成的纳米气溶胶被带电并且被引导通过平板气-液界面暴露模块，以供静电场介导地沉积在细胞上。通过在纳米气溶胶进入腔室之前和之后的扫描迁移率微粒分析仪测量来间接地确定平板气-液界面暴露模块内部的微粒沉积。图2B示出了在施加和不施加EF的情况下暴露腔室的入口和排气处的微粒大小分布中的差异。平均电迁移率直径在入口处为89.1±3.3nm，不施加EF的情况下在排气处为122.0±4.7nm，施加EF的情况下在排气处为102.0±7.5nm。相比于排气处在没有EF的情况下6.7±1.5x105以及在具有EF的情况下1.3±0.5x105个微粒*cm-3的计数浓度，在入口处测得2.7±0.3x106个微粒*cm-3的计数浓度。因而，当施加EF时，沉积效率约为95％，而在不施加EF的情况下沉积在入口处的微粒约为75％。
在1小时暴露之后打开平板气-液界面暴露模块揭示了CuO在12个位置中有一定程度的空间变异性(图3A)。通过使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)的直接定量也证实了这一点(图3B)。最高总Cu浓度在气溶胶流首先达到的列处被测得(列4)。所有三行(A、B、C)随老化流而经历到降低的Cu浓度。对于中部的行注意到优选空气流，其在所有四个列(1-4)处示出最高的Cu浓度。扫描透射电子显微镜(STEM)图像证实了示出CuO-NP在膜上广泛沉积的这些测量。在撞击(impaction)之后形成或沉积了亚微米大小的CuO-NP团聚物，并且在栅格上发现了相当均匀的沉积。
作为打开平板气-液界面暴露模块以插入A549报告细胞的结果，温度和rH值在一定范围内变化。在细胞培养组装后，通常立即在平板气-液界面暴露模块的空气隔室中测得>33℃的最低温度值，而细胞培养基(CCM)和水浴保持在约37℃，因此，空气隔室中的温度在关闭之后迅速地调整。在关闭平板气-液界面暴露模块约30分钟之后，达到了99.9％的rH值。采用以下试验暴露条件：在ALI处的1小时微粒沉积(倒转孔细胞培养设置)，之后是在浸没条件下在细胞温育箱中的暴露后温育(20小时对于细胞活力，2.5小时对于促炎潜力)。
当将细胞暴露于CuO纳米气溶胶流时，观察到NFκB-luc细胞的细胞活力降低，这与如由ICP-MS确定的沉积CuO材料量增加强相关(R2＝0.88；图4A)。在20小时后温育之后，发现倒转孔膜(M)上沉积的总Cu浓度(μg/cm2)低于CCMCu浓度(图4B)。这表明细胞上大量沉积的CuO未被细胞吸收，而是在其细胞膜处被吸附并且在后温育期间被转移至CCM。图4C中呈现了由纳米-CuO释放到CCM中的Cu离子的量。增加的总Cu浓度导致了CCM中Cu离子浓度增加。无法从图4C和D中所示的数据确定Cu离子是否比非离子Cu更大程度地降低细胞活力。值得注意的是，在降低的细胞活力和离子与非离子Cu浓度的相关性中存在细微但可忽略的差异。
如预期的那样(数据未示出)，与清洁空气暴露相比，温育对照的细胞活力无显著不同(对于全托盘和半托盘分析分别为p＝0.52和p＝0.47)。图5A示出了针对3次独立生物学重复的pIL8-luc细胞在ALI处暴露于CuO-NP或清洁空气1小时之后的细胞活力百分比比较。每个箱形图表示每次重复的托盘中12个细胞培养插入物的活力数据的分布。一致地观察到，当3次重复一起被分析时，与清洁空气暴露相比，CuO-NP暴露显著(p<0.01)降低了细胞活力。对于单独的重复，观察到细胞活力最多降低约85％。在暴露于作为阳性对照的12ppmNO2之后观察到细胞活力的同样降低(p<0.01)(数据未示出)。图3示出了列3和4中较高的CuO沉积以及行‘B’中的优选空气流。相比于全托盘分析，半托盘分析(图5B)显示在CuO-NP暴露下的三次重复的细胞活力变异性较低(p<0.01)。在图5C中，每个箱形图表示行B中每个位置3次独立重复的活力数据的分布。在所有B位置中，与清洁空气暴露相比，观察到降低的细胞活力，这在位置B2(p＝0.04)处是显著的且在位置B3(p＝0.02)和B4(p＝0.01)处最高。
对NFκB-lucA549细胞采用相同的测定和分析办法。再次如预期的那样，与清洁空气暴露相比，温育对照的细胞活力无显著不同(对于全托盘和半托盘分析分别为p＝0.83和p＝0.90)。图5D示出了与细胞活力降低最大为约50％的清洁空气暴露相比，CuO-NP暴露显著(p<0.01)降低了细胞活力。在NO2暴露之后也观察到这一点(p<0.01)，其中细胞活力最大降低约90％(数据未示出)。与完全托盘分析相比，对列3和4的评估得到了每个箱形图中数据的较小变异性(p<0.01)(图5E)。在图5F中，与清洁空气暴露相比，所有B位置示出了显著降低的细胞活力。
示例3：对纳米气溶胶暴露的促炎响应
在该示例中，我们描述了在根据本发明的一实施例的平板气-液界面暴露模块中对纳米气溶胶暴露的促炎监测。本平板气-液界面暴露模块可被用于基于使用稳定的报告细胞读出来监测促炎和其他生物学响应，测试了展示相关促炎响应(即，NFκB活化和IL-8启动子诱导)的两种良好表征的稳定细胞系。
使用稳定转染的p-luc A549报告细胞分析了CuO纳米气溶胶的暴露对促炎细胞因子IL-8的基因启动子活化的影响。应用了与针对测定相同的分析办法，即，对全托盘的分析、仅对列3和4的分析以及仅对行‘B’的分析。如预期的那样(数据未示出)，与清洁空气暴露相比，温育对照的IL-8启动子活性无显著不同(对于全托盘和半托盘分析分别为p＝0.39和p＝0.55)。图6A示出了针对3次独立生物学重复在暴露于清洁空气或CuO-NP 1小时之后IL-8启动子活性的诱导的比较。每个箱形图表示每次重复的托盘中12个细胞培养插入物的启动子活性数据的分布。对重复1而言，在CuO-NP暴露之后IL8启动子活性降低，但是对于重复2和3则观察到增加，其最大诱导因子为约2.9。IL-8启动子活性在CuO-NP暴露之后的总体改变在统计学上显著(p＝0.04)不同于清洁空气暴露。作为阳性测定对照，对TNF-α(250ng/ml)进行平行测试，并且观察到与温育对照相比以>50倍诱导IL-8启动子(数据未示出)。与全托盘分析相比，对列3和4的评估(即6次技术重复)得到了数据的较小变异性(p＝0.21)(图6B)。对于所有B位置未观察到IL-8启动子活性改变(数据未示出)。
假设在20小时的暴露后温育之后仍然存活的细胞对于在2.5小时暴露后温育之后的IL-8启动子诱导贡献最大，我们针对细胞活力％来标准化IL-8启动子活性的数据。图6C示出了对于所有3次重复，与清洁空气相比，在CuO-NP暴露之后显著(p<0.01)增加的IL8启动子活性。
对NFκB-luc A549细胞应用相同的LUC测定和分析办法，这允许评估对NFκB响应元件的诱导的影响。如预期的那样，与清洁空气暴露相比，温育对照的NFκB活性无显著不同(对于全托盘和半托盘分析分别为p＝0.44和p＝0.08)。图6D示出了针对3次独立生物学重复的在1小时暴露于清洁空气或CuO-NP之后的NFκB活性比较。对于重复1，与清洁空气暴露相比，NFκB活性在CuO-NP暴露之后增加，但是对于重复2和3则观察到减小。NFκB活性在CuO-NP暴露之后的总体改变未显著(p＝0.44)不同于清洁空气暴露。与清洁空气相比，阳性对照TNF-α(25ng/ml)以>3倍诱导了NFκB(数据未示出)。与全托盘分析相比，对列3和4的评估得到了每个箱形图中数据的较小变异性(p＝0.77)(图6E)。对于所有B位置未观察到NFκB活性的改变(数据未示出)。此外在这里，针对(在20小时暴露后温育之后确定的)细胞活力％来将在2.5小时暴露后之后评估的NFκB活性标准化。图6F示出了增加的NFκB活性，尤其对于重复1。总体上，对于所有3次重复，发现了与清洁空气相比，在CuO-NP暴露之后显著增加的(p<0.01)NFκB活性。
示例12
在进一步的示例中，对图7和8作出参考。图7示出了如本文中所提供的平板气-液界面暴露模块(2)的数个非一次性组件。图8示出了包括数个一次性组件的相同平板气-液界面暴露模块。
具体而言，图7示出了平板气-液界面暴露模块(2)，其包括由盒体(11)包住并且由桥(4)分开的暴露区段(28)和加湿区段(29)。入口(22)被提供用于允许包括带电纳米微粒的气溶胶进入加湿区段(29)。另外，出口(23)被提供用于从暴露区段(28)排出耗尽了纳米微粒的气溶胶。暴露区段(28)包括不锈钢板(5)，该不锈钢板(5)进而包括从不锈钢板突出到暴露区段(28)中的多个短截线(24)。
在图8中，向加湿区段(29)提供水，从而形成用于对包括带电纳米微粒的气溶胶进行加湿的水浴(3)。暴露区段也提供有水(27)。借助于聚苯乙烯盆(26)将不锈钢板(5)与暴露区段中的水(27)屏蔽。倒转孔(8)被定位在金属板(5)的短截线(24)上方。倒转孔(8)支持细胞(25)。金属板供有细胞培养基(7)，以用于向细胞(25)提供营养物和水。细胞培养基(7)存在于各倒转孔(25)之间，以及金属板(5)和倒转孔(25)之间。进一步提供了包括多个孔洞的聚苯乙烯盖(9)。这些孔洞与细胞对准，使得聚苯乙烯盖(9)可以有效地帮助将带电纳米微粒引导至倒转孔(8)上的细胞(25)。

Claims (15)

1.一种平板气-液界面暴露模块，所述平板气-液界面暴露模块包括加湿区段、暴露区段、和气溶胶管道；
-所述暴露区段包括包含金属板的用于确保电场的装置，所述金属板包括从所述金属板突出到所述暴露区段中的多个短截线；
-所述气溶胶管道被配置成用于顺序地引导带电纳米微粒通过所述加湿区段和所述暴露区段。
2.根据权利要求1所述的平板气-液界面暴露模块，其特征在于，所述暴露区段进一步包括上部金属组件，其中用于生成电场的所述装置由所述金属板和所述上部金属组件形成，并且其中所述短截线从所述金属板朝向所述上部金属组件突出。
3.根据权利要求1或2所述的平板气-液界面暴露模块，其特征在于，所述加湿区段包括水浴。
4.根据前述权利要求中任一项所述的平板气-液界面暴露模块，其特征在于，所述暴露区段进一步包括包含一个或多个倒转孔的倒转孔细胞培养设置，每个倒转孔包括多孔膜以用于支持气-液界面处的多个细胞，所述倒转孔被定位在所述金属板的短截线上。
5.根据前述权利要求中任一项所述的平板气-液界面暴露模块，其特征在于，所述暴露区段进一步包括包含至少一个绝缘盖的绝缘壳体，所述绝缘盖包括多个孔洞，所述绝缘盖被定位在所述倒转孔细胞培养设置上方，并且所述孔洞与所述倒转孔对准。
6.根据权利要求5所述的平板气-液界面暴露模块，其特征在于，所述绝缘盖是可移除的。
7.根据权利要求5或6所述的平板气-液界面暴露模块，其特征在于，所述绝缘壳体还包围所述金属板。
8.根据前述权利要求中任一项所述的平板气-液界面暴露模块，其特征在于，所述暴露区段进一步包括温度控制器。
9.根据权利要求8所述的平板气-液界面暴露模块，其特征在于，所述温度控制器包括一个或多个帕尔贴元件和散热器，所述帕尔贴元件被热耦合到所述散热器。
10.根据前述权利要求中任一项所述的平板气-液界面暴露模块，其特征在于，进一步包括重量分析传感器、温度传感器、和湿度传感器。
11.根据前述权利要求中任一项所述的平板气-液界面暴露模块，其特征在于，进一步包括在所述加湿区段和所述暴露区段之间的桥。
12.一种气-液界面暴露系统，所述系统包括纳米微粒充电设备、流体系统、高电压源和根据权利要求1至11中任一项所述的平板气-液界面暴露模块，其特征在于：
-所述纳米微粒充电设备被配置成用于使包括不带电的纳米微粒的气溶胶中的纳米微粒带电，从而获得包括带电纳米微粒的气溶胶；
-所述流体系统被配置成用于将包括带电纳米微粒的所述气溶胶引导通过所述平板气-液界面暴露模块；以及
-所述高电压源被连接到所述金属板以确保电场。
13.根据权利要求12所述的气-液界面暴露系统，其特征在于，进一步包括以下一者或多者：用于控制所述平板气-液界面暴露模块内的温度和相对湿度的一个或多个控制单元、扫描迁移率微粒分析仪(SMPS)和/或被连接到连接至质量流控制器(MFC)的泵的排气口。
14.一种用于将体外多个细胞暴露于气溶胶中所包括的纳米微粒的方法，所述方法包括以下连贯步骤：
a.在根据权利要求1至11中任一项所述的平板气-液界面暴露模块中提供细胞，
b.允许包括带电纳米微粒的所述气溶胶通过所述平板气-液界面暴露模块；以及
c.在所述平板气-液界面暴露模块的暴露区段中生成电场，以便将所述带电纳米微粒气溶胶引导至所述细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述多个细胞包括选自包括气道上皮细胞和肺泡上皮细胞的列表的细胞。
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