CN110108887B - Mff在心衰中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了MFF在心衰中的应用，更具体的涉及MFF在制备治疗、检测心衰疾病药物中的应用。本发明提供的数据显示，在多个舒张性心衰大鼠中MFF表达量的变化（上升）与舒张性心衰正相关，并且MFF蛋白通过促进线粒体分裂导致细胞凋亡，MFF还可以应用于舒张性心衰的临床检测，同时MFF还可以应用于心衰药物的开发，为舒张性心衰的治疗提供新的方法和方案。

Description

MFF在心衰中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及用作舒张性心衰的标志物的MFF及其在临床检测舒张性心衰中的应用。
背景技术
由于环境和遗传风险因素的复杂相互作用，HFpEF(射血分数保留性心衰)的死亡率逐年上升。心力衰竭根据射血分数的变化可以分为：射血分数降低的心衰以及射血分数保留的心衰。近些年来射血分数保留的心力衰竭患者的死亡率呈现上升的趋势。射血分数保留的心力衰竭临床表现为左心室的舒张功能障碍，左心室的舒张压升高以及局部收缩功能受损。其病理生理变化与许多决定因素有关，包括细胞外基质的异常、线粒体动态平衡、炎症、心肌细胞僵硬度等等。虽然很多分子通路都能够导致生物在器官或者组织水平产生变化，但是由于基因调控网络的复杂性，目前仍然缺乏成功的治疗方法。临床舒张性心衰病人心脏组织中线粒体分裂相关蛋白表达显著高于正常人心脏组织，因此表明线粒体分裂蛋白可能在舒张性心衰的形成中发挥重要作用，然而在舒张性心衰中相关蛋白的具体变化原因及如何变化并不清楚。
MFF蛋白也叫线粒体裂变因子，在线粒体和过氧化物酶体裂变中发挥重要的作用。它能够促进裂变介质Drp1蛋白聚集到线粒体表面。也可以通过将Drp1聚集到含有网格蛋白的囊泡中，来进一步参与突触小泡膜动力学的调节。
发明内容
本发明目的是：提供了MFF在心衰中的应用，特别是MFF在制备、检测和治疗舒张性心衰药物中的应用。
本发明的第一个技术方案是：MFF在心衰中的应用，MFF在制备治疗心衰疾病药物中的应用。
本发明的第二个技术方案是：MFF在心衰中的应用，MFF在制备检测心衰疾病药物中的应用。
优选的，所述心衰为舒张性心衰。
优选的，所述MFF作为舒张性心衰治疗靶点。
优选的，MFF下调通过减少线粒体裂变及提高线粒体融合，抑制舒张性心衰。
在这项研究中，发明人证明舒张性心衰的形成过程需要MFF蛋白参与。大鼠心脏组织做蛋白质谱分析发现MFF蛋白表达显著上调，MFF上调通过增加线粒体裂变及降低线粒体融合，导致线粒体结构和功能受损。裂变的线粒体活性氧(ROS)增加，介导细胞色素C(Cyto-C)释放并促进线粒体依赖性细胞凋亡通路激活，心肌细胞的凋亡导致心功能降低，最终形成舒张性心衰。
在这项研究中，通过对射血分数保留性心衰以及对照组的老鼠的基因表达蛋白进行对比检测(蛋白质谱+western blot)，发明人证明在射血分数保留性心衰的老鼠MFF蛋白的表达明显的上升，可以作为舒张性心衰的治疗靶点。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1为样本模型的超声(EF；E/A)以及室内压的数据对比图；
图2为样本模型的免疫荧光的心肌细胞染色效果图；
图3为样本模型的凋亡细胞的占比的统计表；
图4为来自David NIH网页的数据库的GO结果；
图5为通过ImageJ软件处理得到的WB(western blot)结果；
图6为通过ImageJ软件对图4中的条带强度进行统计分析。
具体实施方式
以下结合附图描述本发明具体实施方式。
一、材料
1、实验动物或材料来源及处理
动物是来自维通利华公司(Beijing Vital River Laboratory AnimalTechnology Co.,Ltd)的盐敏感Dahl-SS(Salt Sensitive)大鼠。
实验组：喂养8％的高盐饲料；对照组：喂养0.3％的低盐饲料。
将实验组和对照组的盐敏感大鼠喂养7周，买来7周的老鼠养到14周。盐敏感大鼠通过喂养高盐饲料，喂养7周时产生射血分数保留性心衰。
2、药品和试剂：
一抗是Abcam品牌；二抗是Abcam品牌；TUNEL试剂购自Roche公司(用来染色的)；Hoechst试剂购自索莱宝公司(用来染色的)。
3仪器
confocal显微镜购自尼康公司；shotgun proteomics试剂盒购自Abcam品牌；FUJIFILM VisualSonics Inc超声购自日本富士公司；多道生理记录仪MP150是BioPAC品牌；LTQ-Orbitrap Velos Pro质谱仪购自杭州纽蓝科技有限公司。
二、试验方法及结果分析
1、对样本模型的心脏进行超声测量及血压测量：
让大鼠吸入5％异氟烷来麻醉，在拍超声图的时候用2％异氟醚维持麻醉。使用由彩色多普勒超声扫描仪(FUJIFILM VisualSonics Inc.)操作的MS-250换能器在21MHz下获得图像。基于M模式描记，根据美国超声心动图学会前沿规则测量形态测量参数。基于五次测量对这些参数进行平均。此外，EF(％)由测量参数计算为
Figure BDA0002048515300000031
多普勒模式描记：在心尖四腔视图中通过E/E'和E/A比评估舒张功能。通过二尖瓣之间的脉冲波多普勒模式测量E波(早期充盈)和A波(心房充盈)。通过组织多普勒模式在二尖瓣环的的隔角处测量E'波和A'波。
EDP测量方法：经右侧颈总动脉插管，进入左心室，压力导管连接压力感受器，利用多道生理记录仪MP150测量左心室内压。因为心衰与高血压的表型有关，体现在EDP值上。
对实验组的对照组的超声分析及血压分析，参考附图1，我们得到了实验组大鼠的EF分数(心脏的射血分数)升高，E/A(心衰)降低，EDP(end diastolic pressure室内舒张压)升高。
2、对样本模型的心脏进行生理切片：
取出左心室，用来制作石蜡切片，TUNEL染色组织学评价：在14周龄时分别终止动物用于组织学分析(即，HS喂养或LS喂养7周)。在提取心脏后，从左心室的不同位置提取心肌组织栓塞的部位。将这些部位在室温下在4％多聚甲醛(PFA)/PBS溶液中固定过夜，然后进行石蜡切片处理。
根据制造商的推荐(原位细胞死亡检测试剂盒，荧光素，目录号11684795910，Roche)进行Tunel染色。
附图2是样本模型的免疫荧光的心肌细胞染色，左边的表示低盐的大鼠，右边的是高盐的大鼠，图中蓝色的是正常的，白色箭头绿色的是凋亡细胞；附图3是对样本模型的凋亡细胞所占百分比的统计表。结果我们发现HFpEF大鼠的心肌细胞的体积增大和凋亡率增高，同时面积比也增加，这表示心脏组织存在舒张功能障碍，心脏的收缩功能受损以及心肌细胞的复极化延长。
3、对样本模型的心脏进行分子蛋白的检测：
分别将实验组与对照组的大鼠的心脏组织进行离体，取出左心室进行研磨，离心提取上清液进行分子蛋白的检测。将等量蛋白质量(100μg)在上样缓冲液中在100℃中煮沸5分钟，并在10％的SDS-聚丙烯酰胺中进行。电泳后，将凝胶电转移到PVDF膜上，在室温下用含有5％脱脂奶粉的TBST(Tris缓冲盐水)封闭1小时，并按照标准商业说明在4℃下与一抗孵育过夜，Gapdh作为内参统计Mff表达量，参考附图5、6。
结合附图3：GO基因库来自网址https://david.ncifcrf.gov/.图4显示使用DavidNIH网站的差异表达微阵列的GO分析，GO分析了465个重要的下调基因和142个上调的基因，其鉴定炎症反应，先天免疫应答和免疫应答的调节作为上调的生物过程，G蛋白偶联受体作为下调的生物过程。
在玻璃匀浆器中使用RIPA裂解缓冲液和PMSF(Applygene)从收获的心脏组织中提取蛋白质。在均一化后，我们取12000g的心脏组织在4℃下离心20分钟，收集上清液进行Shotgun proteomics分析。使用BCA蛋白质测定试剂盒评估上清液的蛋白质浓度。用0.05MTCEP还原200μg蛋白质，再用碘乙酰胺烷基化，最后用4μg胰蛋白酶进行消化。使用配备有Nanospray Flex离子源(Thermo Fisher Scientific，USA)的LTQ-Orbitrap Velos Pro质谱仪的纳流HPLC仪器(Easy-nLC II)用于LC-MS/MS分析。使用MaxQuant软件针对UniProt大鼠的蛋白质数据库搜索来自LC-MS/MS谱的每种肽。通过数据拟合，利用具有经验贝叶斯调节的t-统计检验的线性模型来鉴定差异表达的蛋白质。
我们验证了在射血分数保留性心衰大鼠上MFF蛋白的显著变化。
4、结果分析
MFF蛋白异常是心肌细胞凋亡率增加的危险因素，而多种途径则是HFpEF发生过程中心肌和肌细胞硬化的原因之一。发明人第一次证明MFF蛋白是一种心衰相关蛋白，大鼠心脏组织做蛋白质谱分析发现Mff蛋白表达显著上调，Mff上调通过增加线粒体裂变及降低线粒体融合，导致线粒体结构和功能受损。裂变的线粒体活性氧(ROS)增加，介导细胞色素C(Cyto-C)释放并促进线粒体依赖性细胞凋亡通路激活，心肌细胞的凋亡导致心功能降低，最终形成舒张性心衰。
发明人的研究证明，MFF蛋白具有在治疗、检测心衰疾病药物中的应用；MFF还可以应用于舒张性心衰的临床检测，同时MFF还可以应用于心衰药物的开发，为舒张性心衰的治疗提供新的方法和方案。MFF下调通过减少线粒体裂变及提高线粒体融合，抑制舒张性心衰病情恶化。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明的。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明的所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (1)

1.MFF在制备检测心衰疾病药物中的应用，其特征在于：所述MFF为心脏组织中MFF蛋白，所述心衰为射血分数保留性心衰，所述MFF为调控线粒体形态和功能的线粒体外膜受体蛋白。
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