CN110108232B

CN110108232B - 一种三模态数字全息显微成像系统

Info

Publication number: CN110108232B
Application number: CN201910388720.2A
Authority: CN
Inventors: 张玉珍; 张祖鑫; 左超; 陈钱; 孙佳嵩; 卢林芃; 李加基; 张佳琳; 顾国华
Original assignee: Nanjing University of Science and Technology
Current assignee: Nanjing University of Science and Technology
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2020-12-04
Anticipated expiration: 2039-05-10
Also published as: CN110108232A

Abstract

本发明公开了一种三模态数字全息显微成像系统，包括He‑Ne激光器、光纤分束器、汞灯、白光LED、毛玻璃片、第一扩束准直镜、第二扩束准直镜、第三扩束准直镜、第一分光棱镜、第二分光棱镜、显微物镜、镜筒透镜、激发滤色镜、滤色镜转盘、吸收滤色镜与相机，所述的滤色镜转盘切换全息、荧光及明场三种不同的模态。本发明巧妙地利用滤色片将荧光显微、明场显微以及数字全息显微模态集于一体，系统利用率高；且不同模态下，该系统观测到的样品区域具有一致性，便于横向信息和轴向信息的合成；所得到的合成图像可以同时包含明场图像信息，荧光图像信息以及样品的相位信息。

Description

一种三模态数字全息显微成像系统

技术领域

本发明属于光学测量、成像技术，特别是一种三模态数字全息显微成像系统。

背景技术

数字全息作为一种新型相干测量与成像技术，其最大的优势在于能够同时独立地获取物体的定量振幅信息和相位信息，并且当对生物细胞等几乎透明的物体进行定量测量时，相位信息显得尤为重要。发明专利《基于远心光学结构的透射式数字全息显微成像装置》(申请号：201510631831.3)虽然已经大大提高了系统的成像质量，但由于采用的相干光的照明方式，使得系统的横向成像效果远不如以非相干光为照明方式的传统显微镜，因此一般的数字全息显微镜其横向成像清晰度较低而备受生物医学研究者们的诟病。

而荧光显微镜采用的是相干光为照明方式，其横向成像清晰度较数字全息显微镜高，但是其无法观测到样品轴向的厚度信息，因此无法观测到生物细胞形态的生长状况，是干瘪还是饱满。另外，荧光显微镜可以用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等，而数字全息显微镜所采用的相位测量技术则无法将物质定位化显示。但是，数字全息显微镜却可以真实的反应当前细胞形态上的生长状况。可以说，数字全息显微镜和荧光显微镜相辅相成，将二者成像效果相结合可以得到更加丰富有用的样品信息。然而倒置荧光显微镜和数字全息显微镜不仅价格昂贵，仪器体积也相当庞大。同时，在倒置荧光显微镜下获得样品的明场和荧光信息后，很难再在数字全息系统中找到完全一致的样品区域，这就对横向强度信息和轴向厚度信息的合成带来了难度，而且如果在两台系统中分别进行观测，工作的时效性非常低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种兼顾荧光与明场的三模态数字全息显微成像系统，将采集到的横向强度信息，即荧光和明场信息准确地结合于样品的轴向厚度信息，得到更为贴近于样品外观的三维图像信息。

实现本发明目的的技术解决方案为：一种三模态数字全息显微成像系统，包括He-Ne激光器、光纤分束器、汞灯、白光LED、毛玻璃片、第一扩束准直镜、第二扩束准直镜、第三扩束准直镜、第一分光棱镜、第二分光棱镜、显微物镜、镜筒透镜、激发滤色镜、滤色镜转盘、吸收滤色镜与相机，所述的滤色镜转盘切换全息、荧光及明场三种不同的模态；其中，第一光纤头、第一扩束准直镜以及第一分光棱镜同轴；汞灯、第二扩束准直镜以及激发滤色镜同轴，滤色镜转盘与激发滤色镜呈顺时针45°夹角；白光LED、毛玻璃片以及第二分光棱镜同轴；第二光纤头、第三扩束准直镜、第二分光棱镜、样片、显微物镜、镜筒透镜、吸收滤色镜、第一分光棱镜以及相机同轴；He-Ne激光器发出的激光耦合进光纤分束器，由光纤分束器引出的第一光纤头位于第一扩束准直镜的前焦面上；汞灯放置于第二扩束准直镜的前焦面上；光纤分束器引出的第二光纤头位于第三扩束准直镜的后焦面上；样片位于显微物镜的后焦面上；显微物镜的前焦面与镜筒透镜的后焦面重合；相机位于镜筒透镜的前焦面上。激光器打开时，滤色镜转盘转到632nm带通滤色镜时，系统为数字全息显微模态；当白光LED亮起时，滤色镜转盘转到632nm带阻滤色镜时，系统为白光照明显微模态；当汞灯打开，激光器关闭和白光LED熄灭，滤色镜转盘转到二向滤色镜时，系统为荧光显微模态。

本发明与现有技术相比，其显著优点为：(1)巧妙地利用滤色片将荧光显微、明场显微以及数字全息显微模态集于一体，系统利用率高。(2)且不同模态下，该系统观测到的样品区域具有一致性，便于横向信息和轴向信息的合成。(3)所得到的合成图像可以同时包含明场图像信息，荧光图像信息以及样品的相位信息。

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

附图说明

图1为三模态数字全息显微系统的主视图。

图2为三模态数字全息显微系统的结构图。

图3(a)至图3(f)为利用三模态数字全息显微系统对萌发花粉进行多模态成像的结果：图3(a)是数字全息显微模态下拍摄到的原始干涉图；图3(b)是在数字显微模态下解算得到的花粉细胞相位图(只含样品轴向厚度信息)；图3(c)是明场显微模态下拍摄到的花粉细胞(只含横向样品信息)；图3(d)是荧光显微模态下拍摄到的花粉细胞(只含横向样品信息)；图3(e)是将萌发花粉的明场图3(c)与相位图3(b)相结合的图像；图3(f)是将萌发花粉的三种模态的图像相结合的图像。

具体实施方式

结合图1和图2，本发明兼顾荧光与明场的三模态数字全息显微系统，包括He-Ne激光器1、光纤分束器2、汞灯3、白光LED4、毛玻璃片5、第一扩束准直镜6.1、第二扩束准直镜6.2、第三扩束准直镜6.3、第一分光棱镜7.1、第二分光棱镜7.2、显微物镜9(可切换不同倍率)、镜筒透镜10、激发滤色镜11、滤色镜转盘12(在滤色镜转盘12上设置二向滤色镜、632nm带阻滤色镜或/和632nm带通滤色镜)、吸收滤色镜13与相机14，所述的He-Ne激光器1、白光LED4以及汞灯3可以同时打开，可以通过调节滤色镜转盘12来切换全息、荧光及明场三种不同的模态。其中，除荧光显微模态下，需要关闭He-Ne激光器1、白光LED4；数字全息模态以及白光明场显微模态，He-Ne激光器1、白光LED4以及汞灯3可以保持常亮，这使得汞灯3可以保持常亮，保证了汞灯3的使用寿命。

其中，第一光纤头2.1、第一扩束准直镜6.1以及第一分光棱镜7.1同轴；汞灯3、第二扩束准直镜6.2以及激发滤色镜11同轴，滤色镜转盘12与激发滤色镜11呈顺时针45°夹角；白光LED4、毛玻璃片5以及第二分光棱镜7.2同轴，毛玻璃片5与白光LED4间隔约5mm；第二光纤头2.2、第三扩束准直镜6.3、第二分光棱镜7.2、样片8、显微物镜9、镜筒透镜10、吸收滤色镜13、第一分光棱镜7.1以及相机14同轴。He-Ne激光器1发出的激光耦合进光纤分束2，由光纤分束器2引出的第一光纤头2.1位于第一扩束准直镜6.1的前焦面上；汞灯3放置于第二扩束准直镜6.2的前焦面上；光纤分束器2引出的第二光纤头2.2位于第三扩束准直镜6.3的后焦面上；样片8位于显微物镜9的后焦面上；显微物镜9的前焦面与镜筒透镜10的后焦面重合；相机14位于镜筒透镜10的前焦面上。另外，第一扩束准直镜6.1与第一分光棱镜7.1相对位置可调节，第二扩束准直镜6.2与激发滤色镜11相对位置可调节，第三扩束准直镜6.3与第二分光棱镜7.2相对位置可调节。

荧光显微模态下，将滤色镜转盘12切换到二向滤色镜构成荧光显微模态，关闭He-Ne激光器1和白光LED4，汞灯3发出的光线经过第二扩束准直镜6.2后，照射到激发滤色镜11上，产生的激发光到达滤色镜转盘12上的二向滤色镜，激发光被反射照射在样片8上，样片8的发射光透过二向滤色镜，再由吸收滤色镜13吸收多余的激发光，这一部分与传统荧光显微镜原理类似。荧光显微模态的操作过程：

第一步：打开汞灯3，关闭He-Ne激光器1和白光LED4。

第二步：将滤色镜转盘12转到二向色镜。

第三步：采集样片的荧光图像，如图3(d)所示。

用该三模态数字全息显微系统拍摄得到的全息图像、明场图像以及荧光图像观测的样品区域一致，可以直接进行信息合成。图3(e)与图3(f)就既包含了样品的横向信息又包含了图像的轴向信息，更为真实的反映了样品的形貌。

数字全息显微模态下，将滤色镜转盘12切换到632nm带通滤色镜，He-Ne激光器1打开、白光LED4以及汞灯3开关状态任意。He-Ne激光器1由光纤分束器2分成相同能量的两份，其中一路经过第一扩束准直镜6.1后穿过第一分光棱镜7.1后照射到相机14靶面上，这一路称为参考光；另外一路经过第三扩束准直镜6.3、第二分光棱镜7.2后照射到样片8上，携带着样片信息，依次穿过显微物镜9、镜筒透镜10、632nm带通滤色镜、吸收滤色镜13、第一分光棱镜7.1后照射到相机14靶面上，这一路称为物光。物光和参考光在相机14上形成干涉全息图Ⅰ。另外，汞灯3由激发滤色片11产生的激发光无法在632nm带通滤色镜上反射照射到样品上，且白光LED4将被滤色片滤除，这保证了数字全息显微模态下激光器1、白光LED4以及汞灯3同时打开的可行性。数字全息显微模态的操作过程：

第一步：打开He-Ne激光器1；

第二步：将滤色镜转盘转12到632nm带通滤色镜上；

第三步：选择合适与样品大小相适应的显微物镜，放置样片8，调节焦距。

第四步：采集干涉全息图Ⅰ，如图3(a)所示。

第五步：解算全息图，得到样品的轴向厚度信息，如图3(b)所示。

白光明场显微模态下，将滤色镜转盘12切换到632nm带阻滤色镜，白光LED4打开、He-Ne激光器1以及汞灯3开关状态任意。物光光路中的He-Ne激光被632nm带阻滤色镜吸收，参考光一路中的He-Ne激光为均匀恒定值，在相机14接受后在红色通道中减去。同时，汞灯3由激发滤色片11产生的激发光无法在632nm带阻滤色镜上反射照射到样品上，这保证了白光明场显微模态下激光器1、白光LED4以及汞灯3同时打开的可行性。如下，我们介绍了该系统观测萌发花粉的过程。白光明场显微模态的操作过程：

第一步：打开白光LED4；

第二步：将滤色镜转盘转12到632nm带阻滤色镜上；

第三步：采集样品的明场图像，如图3(c)所示。

第四步：若此时激光器打开，则需要将采集到的图像的红色通道减去一个常数项，R'(x,y)＝R(x,y),-C。其中，x表示图像像素点的横向坐标，y表示图像像素点的纵向坐标，R表示矫正前图像红色通道的数值，R'表示矫正后图像红色通道的数值，C为全息模式中参考光路的均匀光在红色通道的数值。

Claims

1.一种三模态数字全息显微成像系统，其特征在于包括He-Ne激光器(1)、光纤分束器(2)、汞灯(3)、白光LED(4)、毛玻璃片(5)、第一扩束准直镜(6.1)、第二扩束准直镜(6.2)、第三扩束准直镜(6.3)、第一分光棱镜(7.1)、第二分光棱镜(7.2)、显微物镜(9)、镜筒透镜(10)、激发滤色镜(11)、滤色镜转盘(12)、吸收滤色镜(13)与相机(14)，所述的滤色镜转盘(12)切换全息、荧光及明场三种不同的模态；其中，第一光纤头(2.1)、第一扩束准直镜(6.1)以及第一分光棱镜(7.1)同轴；汞灯(3)、第二扩束准直镜(6.2)以及激发滤色镜(11)同轴，滤色镜转盘(12)与激发滤色镜(11)呈顺时针45°夹角；白光LED(4)、毛玻璃片(5)以及第二分光棱镜(7.2)同轴；第二光纤头(2.2)、第三扩束准直镜(6.3)、第二分光棱镜(7.2)、样片(8)、显微物镜(9)、镜筒透镜(10)、吸收滤色镜(13)、第一分光棱镜(7.1)以及相机(14)同轴；He-Ne激光器(1)发出的激光耦合进光纤分束器(2)，由光纤分束器(2)引出的第一光纤头(2.1)位于第一扩束准直镜(6.1)的前焦面上；汞灯(3)放置于第二扩束准直镜(6.2)的前焦面上；光纤分束器(2)引出的第二光纤头(2.2)位于第三扩束准直镜(6.3)的后焦面上；样片(8)位于显微物镜(9)的后焦面上；显微物镜(9)的前焦面与镜筒透镜(10)的后焦面重合；相机(14)位于镜筒透镜(10)的前焦面上。

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于将滤色镜转盘(12)切换到二向滤色镜构成荧光显微模态，关闭He-Ne激光器(1)和白光LED(4)，汞灯(3)发出的光线经过第二扩束准直镜(6.2)后，照射到激发滤色镜(11)上，产生的激发光到达滤色镜转盘(12)上的二向滤色镜，激发光被反射照射在样片(8)上，样片(8)的发射光透过二向滤色镜，再由吸收滤色镜(13)吸收多余的激发光。

3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于将滤色镜转盘(12)切换到632nm带通滤色镜构成数字全息显微模态，He-Ne激光器(1)打开、白光LED(4)以及汞灯(3)开关状态任意，He-Ne激光器(1)由光纤分束器(2)分成相同能量的两份，其中一路为参考光，经过第一扩束准直镜(6.1)后穿过第一分光棱镜(7.1)后照射到相机(14)靶面上；另外一路为物光，经过第三扩束准直镜(6.3)、第二分光棱镜(7.2)后照射到样片(8)上，携带着样片(8)信息，依次穿过显微物镜(9)、镜筒透镜(10)、632nm带通滤色镜、吸收滤色镜(13)、第一分光棱镜(7.1)后照射到相机(14)靶面上；物光和参考光在相机(14)上形成干涉全息图Ⅰ。

4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于将滤色镜转盘(12)切换到632nm带阻滤色镜构成白光明场显微模态，白光LED(4)打开、He-Ne激光器(1)以及汞灯(3)开关状态任意，物光光路中的He-Ne激光被632nm带阻滤色镜吸收，参考光光路中的He-Ne激光为均匀恒定值，在相机(14)接受后在红色通道中减去。