CN110105376A - 一种荧光素衍生物及其合成方法和应用 - Google Patents

一种荧光素衍生物及其合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荧光素衍生物及其合成方法和应用，所述衍生物的中文名称为3‑氧代‑3'‑(4‑(5‑(2‑氧代六氢‑1H‑噻吩并[3,4‑d]咪唑‑4‑基)戊酰基)哌嗪‑1‑基)‑3H‑螺[异苯并呋喃‑1,9'‑黄嘌呤]‑6'‑基丙烯酸酯，命名为Ac。本发明提供了一种荧光素衍生物Ac对半胱氨酸检测的方法，在pH 7.4的PBS溶液中，通过荧光分光光度计定量检测半胱氨酸的含量。该检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。本发明的荧光素衍生物Ac可通过激光共聚焦荧光成像技术检测内源性和外源性的半胱氨酸，并且可以应用到区分正常细胞和癌细胞，在生物分子检测领域具有应用前景。

Description

一种荧光素衍生物及其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及荧光探针，特别涉及一种荧光素衍生物及其合成方法，以及该衍生物在检测半胱氨酸并实现区分正常细胞和癌细胞中的应用。
背景技术
癌症的治疗已经受到广泛关注，设计和合成能够区分正常细胞和癌细胞的荧光探针很有必要。经了解，生物素可以靶向癌细胞过表达的生物素受体，生物素(Biotin)为B族维生素之一，又称维生素H、维生素B7、辅酶R(Coenzyme R)等，它可以作为靶向癌细胞的基团以增强探针对癌细胞的特异性。而且，研究表明半胱氨酸的含量异常会引起很多疾病的产生，比如半胱氨酸缺乏与发育迟缓、脑损伤、水肿、肝脏受损、虚弱风湿性关节炎、帕金森病、阿尔茨海默病等有关。同时，半胱氨酸在人体中含量水平的升高，可能导致严重的神经毒性和心血管疾病。因此，开发有效的方法监测半胱氨酸并且实现区分不同细胞具有重要研究意义，对于生物研究和临床诊断起着至关重要的作用。
目前，大部分荧光探针可以实现半胱氨酸的检测，但既能检测半胱氨酸并且区分癌细胞和正常细胞的荧光探针少之又少。因此研究开发一种检测半胱氨酸并且实现区分癌细胞和正常细胞的探针显得尤为重要。
在本发明中，合成了一种基于荧光素的化合物，通过半胱氨酸和化合物在亲核取代反应前后荧光变化，实现半胱氨酸的检测，并且通过生物素和过表达的生物素受体结合，实现不同细胞的区分。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作方便，选择性好，溶解度好，灵敏度高的检测半胱氨酸并可实现区分癌细胞和正常细胞的荧光素衍生物及其合成方法和应用。
本发明提供的一种荧光素衍生物，中文名称为3-氧代-3'-(4-(5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰基)哌嗪-1-基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-黄嘌呤]-6'-基丙烯酸酯，英文名称为3-oxo-3'-(4-(5-(2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanoyl)piperazin-1-yl)-3H-spiro[isobenzofuran-1,9'-xanthen]-6'-ylacrylate命名为Ac。结构式为：
Ac的合成方法，步骤如下：
1)在冰水浴的条件下，将哌嗪荧光素2.00g溶解在10mL N,N-二甲基甲酰胺中，随后，在氩气保护的条件下，在该体系中加入生物素和4-二甲氨基吡啶，然后将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解在5mL无水的N,N-二甲基甲酰胺中，用恒压滴液漏斗将其缓慢滴加到反应体系中，在室温下搅拌反应12h；反应完成后，将反应体系倒入到冰水中，有黄色固体析出，抽滤得到黄色粉末状固体，经柱色谱分离得化合物A：4-(5-(4-(3'-羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-6'-基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊基)四氢1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-2(3H)-酮；
2)在冰水浴的条件下，将步骤1)所得化合物A 0.47g溶解在25mL二氯甲烷中，然后，在该体系中加入三乙胺0.30g，将反应体系搅拌10min，随后，用恒压滴液漏斗将丙烯酰氯0.09g缓慢滴加到反应体系中，将反应体系在室温下搅拌约24h；体系减压蒸干溶剂得到粗产品，经柱色谱分离，纯化得目标固体Ac。
所述的荧光素衍生物Ac可在半胱氨酸检测中应用。
一种检测半胱氨酸的方法，步骤为：
(1)、配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制20mM的半胱氨酸水溶液，配置5mM的Ac的乙腈溶液；
(2)、取2mL的pH 7.4的PBS溶液加到一个荧光比色皿中，0.8μL Ac的乙腈溶液加入到上述体系中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样半胱氨酸的加入,550nm处的荧光强度逐渐增强；
(3)、在11个比色皿中，各加入2mL的pH 7.4的PBS溶液，分别加入半胱氨酸溶液的体积为0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40μL，40min后在荧光光谱仪上测定550nm处荧光强度为42.37、1121、1872、2511、2985、3465、3796、4163、4445、4690、4830，以半胱氨酸浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制图，得到半胱氨酸浓度的工作曲线；线性回归方程为：F＝14.62c+620.53，c的单位为10-6mol/L；
(4)、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得半胱氨酸的浓度。
所述的荧光素衍生物Ac可以在细胞成像中应用，特别是其可以在区别癌细胞和正常细胞中应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
1、所述荧光素衍生物的合成简单，操作方便；
2、所述检测方法能实现半胱氨酸的检测，显示了高的灵敏性和极好的选择性和好的水溶性；
3、所述检测方法首次实现区分正常细胞与癌细胞，并且检测半胱氨酸，其在半胱氨酸病理学检测中具有实用价值；
4、检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪即可实现；
4、检测信号明显，为开启型荧光信号；
5、通过生物学应用，探针可成为研究不同细胞，并且实现半胱氨酸的检测的良好传感器，也为疾病的诊断和治疗提供了新的途径。
附图说明
图1实施例1制备的Ac的核磁氢谱图
图2实施例1制备的Ac的核磁碳谱图
图3实施例1制备的Ac的质谱图
图4实施例2Ac与半胱氨酸作用的荧光发射图
图5实施例3Ac与各种分析物的荧光柱状图
图6实施例4Ac测定半胱氨酸的工作曲线
图7实施例5Ac测定样品的荧光发射图
图8实施例6Ac在四种不同细胞的细胞成像图
图9实施例7Ac与共培养细胞的细胞成像图
图10实施例8Ac检测内外源半胱氨酸的细胞成像图
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1
Ac的制备和表征
1)在冰水浴的条件下，将哌嗪荧光素(2.00g，5.00mmol)溶解在10mL N,N-二甲基甲酰胺中，随后，在氩气保护的条件下，在该体系中加入生物素和4-二甲氨基吡啶，然后将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解在5mL无水的N,N-二甲基甲酰胺中，用恒压滴液漏斗将其缓慢滴加到反应体系中，在室温下搅拌反应12h；反应完成后，将反应体系倒入到冰水中，有黄色固体析出，抽滤得到黄色粉末状固体，经柱色谱分离得化合物A：4-(5-(4-(3'-羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-6'-基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊基)四氢1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-2(3H)-酮。
2)在冰水浴的条件下，将步骤1)所得A(0.47g，0.80mmol)溶解在25mL二氯甲烷中，然后，在该体系中加入三乙胺(0.30g，3.00mmol)，将反应体系搅拌10min，随后，用恒压滴液漏斗将丙烯酰氯(0.09g，0.99mmol)缓慢滴加到反应体系中，将反应体系在室温下搅拌约24h；体系减压蒸干溶剂得到粗产品，经柱色谱分离，纯化得目标固体Ac。
1H NMR(600MHz,DMSO)δ(ppm):11.96(s,2H),8.03(d,J＝10.1Hz,1H),7.81(dt,J＝10.1,5.4Hz,1H),7.75(t,J＝7.4Hz,1H),7.38-7.26(m,1H),7.22(s,0H),6.96(dd,J＝8.7,2.3Hz,0H),6.91(dd,J＝8.6,2.2Hz,1H),6.87-6.77(m,2H),6.64-6.53(m,1H),6.46-6.33(m,2H),6.19(d,J＝11.2Hz,1H),4.37-4.28(m,1H),4.19-4.09(m,1H),3.59(s,2H),3.47-3.38(m,1H),3.10(s,1H),2.82(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.58(d,J＝12.3Hz,1H),2.41-2.24(m,3H),1.91(s,2H),1.66-1.22(m,7H),1.06(d,J＝7.0Hz,1H),0.91-0.77(m,2H)(图1).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ(ppm):172.71,171.33,169.53,169.22,164.40,163.34,153.12,152.91,152.49,152.18,151.97,136.43,134.84,130.98,129.78,129.16,128.01,126.53,125.47,124.71,118.63,117.45,112.87,110.93,108.50,101.82,82.74,61.66,59.80,56.66,56.11,48.13,32.69,28.93,25.43,21.74,19.20(图2).HR-MS m/z:[M+H]+Calcd 681.2377,Found 681.2376(图3).
实施例2
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制5mM Ac乙腈溶液，配制20mM半胱氨酸水溶液；取2mL的PBS溶液、0.8μL Ac的乙腈溶液加到荧光比色皿中，分别加入半胱氨酸溶液的体积为0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40μL，40min后在荧光光谱仪上测定550nm处荧光强度为42.37、1121、1872、2511、2985、3465、3796、4163、4445、4690、4830，荧光强度逐渐增强。荧光发射图见图4。
实施例3
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制5mM Ac的乙腈溶液，配制20mM的半胱氨酸水溶液(2-Cys)，分别配制0.2M 3-Lys,4-Arg,5-Asn,6-Asp,7-Glu,8-Gly,9-Leu,10-Phe,11-Pro,12-Thr,13-Trp,14-Tyr,15-Val,28-GSH,29-Hcy,16-Ca2+,17-Na+,18-K+,19-Mg2+,20-Cl-,21-Br-,22-HSO3 -,23-SO3 2-24-SO4 2-,25-S2O3 2-,26-NO3 -,27-Zn2+,30-S2-的水溶液；在30个荧光比色皿中，各加入2mL的PBS溶液和0.8μL Ac的乙腈溶液，以及40μL以上配制的各种分析物：及40μL的Cys,在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析物对应的550nm处荧光强度柱状图(图5)。半胱氨酸使得检测体系在550nm处荧光强度明显升高，其它的分析物基本没有引起检测体系荧光强度的变化。
实施例4
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，并用乙腈配制5mM Ac的溶液，配制20mM半胱氨酸水溶液；在6个比色皿中，各加入2mL的PBS溶液、0.8μL Ac的乙腈溶液，分别加入半胱氨酸溶液的体积为0、4、8、12、16、20μL，40min后在荧光光谱仪上测定550nm处荧光强度为42.37、1121、1872、2511、2985、3465，以半胱氨酸浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制图6，得到半胱氨酸浓度的工作曲线；线性回归方程为：F＝14.62c+620.53，c的单位为10- 6mol/L；
实施例5
配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，并用乙腈配制5mM Ac的溶液，配制20mM半胱氨酸水溶液；把0.8μL Ac的乙腈溶液加入到含有2mL PBS的荧光比色皿中，取半胱氨酸的溶液16μL，用微量进样器加到此比色皿中，同时在荧光光谱仪上测定550nm荧光强度为2985，通过实施例5的线性回归方程，求得c＝161.73×10-6mol/L。偏差为1.1％。见图7。
实施例6
利用活的RAW264.7细胞，B16细胞，NIH-3T3细胞，Hela细胞来进行细胞内成像实验。配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制5mM Ac的乙腈溶液，用PBS缓冲溶液配制20mM半胱氨酸溶液，用PBS缓冲溶液配制1mM NEM(N-乙基-马来酰胺，硫醇清除剂)溶液，用DMSO配制2mM Hoechst染料溶液。
把0.8μL Ac的乙腈溶液加入到2mL的PBS中；将探针溶液加入四种不同的细胞培养液中，使得其浓度约为2μM，与四种细胞在37℃条件下，孵育30min，体系在荧光成像仪下显示不同的细胞中有黄色荧光产生，我们观察到探针Ac在不同细胞中发光情况不同(图8)，据此推断在Hela细胞中，探针Ac的表达最高，B16细胞中的表达水平较低，探针Ac未在RAW264.7，NIH-3T3细胞中表达。
我们进一步试验了将Hela细胞与RAW264.7细胞，NIH-3T3细胞共培养(图9)。首先，将RAW264.7细胞，NIH-3T3细胞用1μM Hoechst染料(1μL，2mM)在37℃条件下孵育15min。然后将它们用PBS洗涤三次，然后将提前消化的Hela细胞与它们共培养24h。随后，将浓度约为2μM Ac添加在共培养的细胞中，在37℃条件下，孵育30min。在荧光成像仪下的结果显示，探针Ac在Hela细胞中发出黄色荧光，而在RAW264.7，NIH-3T3细胞中未有黄色荧光出现。表明探针Ac可以进入Hela细胞，而这种现象可能是由于在细胞表面上过表达生物素受体。使得探针Ac更容易进入Hela细胞，从而实现了正常细胞和癌细胞之间的区别。这也有助于我们进一步研究其与药物相关的体系，并改善癌症的治疗。
基于上述研究，我们还对Hela细胞中的探针Ac对半胱氨酸的检测进行了研究。如图10所示，在图10-a中，我们对活的Hela细胞没有做任何孵育处理，使其在37℃条件下生长。从图10-b中我们可以看到，当活的Hela细胞用浓度为2μM Ac在37℃条件下孵育30min后，在荧光成像仪下的黄色通道中显示出明亮的黄色荧光。并且，在图10-c中，当活的Hela细胞在37℃条件下用浓度为500μM NEM孵育20min，然后用2μM Ac孵育30min后。在荧光成像仪下的黄色通道中未观察到荧光。为了测试探针Ac对硫醇的选择性，我们在37℃条件下依次孵育浓度为500μM NEM，400μM Cys，20μM Hcy，1mM GSH和2μM Ac。在荧光成像仪下的结果(图10-d/e/f)显示外源性Cys导致比内源性Cys更强的黄色荧光。这些数据表明，荧光探针Ac具有很强的细胞膜通透性。它不仅可以响应活Hela细胞中的Cys，更重要的是，可以标记癌细胞以区分正常细胞和癌细胞。因此，从以上结果，我们提出Ac可能是实现区分癌细胞并且检测细胞内半胱氨酸的良好候选者。

Claims (6)

1.一种荧光素衍生物Ac，名称为3-氧代-3'-(4-(5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰基)哌嗪-1-基)-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-黄嘌呤]-6'-基丙烯酸酯，结构式为：
2.如权利要求1所述的一种荧光素衍生物Ac的合成方法，其特征在于，步骤如下：
1)在冰水浴的条件下，将哌嗪荧光素2.00g溶解在10mL N,N-二甲基甲酰胺中，随后，在氩气保护的条件下，在该体系中加入生物素和4-二甲氨基吡啶，然后将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解在5mL无水的N,N-二甲基甲酰胺中，用恒压滴液漏斗将其缓慢滴加到反应体系中，在室温下搅拌反应12h；反应完成后，将反应体系倒入到冰水中，有黄色固体析出，抽滤得到黄色粉末状固体，经柱色谱分离得化合物A：4-(5-(4-(3'-羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-呫吨]-6'-基)哌嗪-1-基)-5-氧代戊基)四氢1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-2(3H)-酮；
2)在冰水浴的条件下，将步骤1)所得化合物A0.47g溶解在25mL二氯甲烷中，然后，在该体系中加入三乙胺0.30g，将反应体系搅拌10min后，用恒压滴液漏斗将丙烯酰氯0.09g缓慢滴加到反应体系中，将反应体系在室温下搅拌约24h；体系减压蒸干溶剂得到粗产品，经柱色谱分离，纯化得目标固体Ac。
3.如权利要求1所述的荧光素衍生物Ac在半胱氨酸检测中的应用。
4.一种检测半胱氨酸的方法，包括如下步骤：
(1)、配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液，配制20mM的半胱氨酸水溶液，配置5mM的Ac的乙腈溶液；
(2)、取2mL的pH7.4的PBS溶液加到一个荧光比色皿中，0.8μL Ac的乙腈溶液加入到上述体系中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样半胱氨酸的加入,550nm处的荧光强度逐渐增强；
(3)、在11个比色皿中，各加入2mL的pH7.4的PBS溶液，分别加入半胱氨酸溶液的体积为0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40μL，40min后在荧光光谱仪上测定550nm处荧光强度为42.37、1121、1872、2511、2985、3465、3796、4163、4445、4690、4830，以半胱氨酸浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制图，得到半胱氨酸浓度的工作曲线；线性回归方程为：F＝14.62c+620.53，c的单位为10-6mol/L；
(4)、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得半胱氨酸的浓度。
5.如权利要求1所述的荧光素衍生物Ac在细胞成像中的应用。
6.如权利要求1所述的荧光素衍生物Ac在细胞成像区别癌细胞和正常细胞中的应用。
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