CN110105352B - 一种小檗碱-360a偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小檗碱‑360A偶联物及其制备方法和应用。本发明的小檗碱‑360A偶联物具有荧光检测和可诱导形成和稳定双倍体G‑四链体结构的功能，可应用于双倍体G‑四链体结构检测探针和特异性结合或/和稳定双倍体G‑四链体结构领域中。小檗碱‑360A偶联物对肿瘤细胞具有很好的抑制活性，具有抗肿瘤作用，尤其是宫颈癌细胞和肝癌细胞，可用于与抗肿瘤药物的制备领域。

Description

一种小檗碱-360A偶联物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及有机化合物领域，更具体地，涉及一种小檗碱-360A偶联物及其制备方法和应用。
背景技术
G-四链体(G-qμadrμplex)是一种特殊的DNA二级结构，人类基因组中很多富含鸟嘌呤(G)区域具有形成这一结构的能力，包括端粒末端鸟嘌呤重复序列，以及多种基因的启动子区域，如c-kit、c-myc、c-myb、bcl-2、PDGF、kRAS、VEGF、Rb和胰岛素基因等。G-四链体结构的形成对于体内的一系列生理过程都存在调控作用，研究表明某些启动子区域的G-四链体结构会显著影响基因的转录和翻译水平，因此G-四链体结构被认为是起到分子开关的功能，其形成和拆散可能涉及到信号传导、细胞凋亡和细胞增殖等一系列体内重要的生理过程。所以在体内或者体外试验中，能够荧光检测和特异性地结合或诱导形成G-四链体结构，对于开发以G-四链体结构为靶点的同步检测和治疗的双功能抗癌药物具有非常重要的作用。人端粒DNA是染色体末端由DNA重复序列TTAGGG组成的双螺旋区，其末端是含有100-200nt(核苷酸)的富G碱基的单链悬突。虽然它们大多数是趋向于形成单倍体G-四链体，但是仍有少数趋向于形成更复杂的，TTA碱基序列连接的双倍体或多倍体G-四链体结构，而且多倍体G-四链体的形成仅出现在人端粒DNA和与渐冻人症(ALS)相关的r(GGGGCC)n的RNA重复序列中。近些年来，对双倍体或多倍体G-四链体结合剂和荧光探针的研究逐渐成为热点，但具备同步检测和特异性结合多倍体G-四链体的结合剂报道较少。
现有技术公开聚醚链接的双小檗碱化合物(Ber)2(CN105218536A；Org.Biomol.Chem.2017,15,10221-10229；Org.Biomol.Chem.2016,14,191-197)(如式Ⅰ)，具有良好的双倍体荧光检测活性，但对G-四链体的热稳定性较差。360A二聚体(360A)2(如式Ⅱ)和(360A)2A(如式Ⅲ)(Chem.Commun.2018,54,1897-1900)，虽然具有优良的双倍体G-四链体结合选择性和热稳定性，但不具备荧光检测活性。现有技术CN105218536A公开了一种免标记荧光探针及其在检测双倍体G-四链体结构中的应用，该技术中只是公开了一种小檗碱衍生物荧光探针，可用于检测G-四链体结构，且不影响其构象和热稳定性，对于如何开发G-四链体的小檗碱结合剂并未有相关涉及。
Figure BDA0002032612500000021
因此提供一种小檗碱-360A偶联物，既具有荧光检测性又具有稳定、选择性结合G-四链体DNA的功能，对于G-四链体结合剂和荧光剂的研究具有非常重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有小檗碱化合物结合G-四链体的缺陷和不足，提供一种小檗碱-360A偶联物。
本发明的另一目的在于提供小檗碱-360A偶联物的制备方法。
本发明的又一目的在于提供小檗碱-360A偶联物在作为双倍体G-四链体结构检测探针中的应用。
本发明的又一目的在于提供小檗碱-360A偶联物在作为双倍体G-四链体结构特异性结合剂或/和稳定剂中的应用。
本发明的又一目的在于提供小檗碱-360A偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种小檗碱-360A偶联物，所述小檗碱-360A偶联物的结构式如下：
Figure BDA0002032612500000031
其中X为负一价阴离子。
优选地，X为对甲基苯磺酸根、F-、I-、Br-、Cl-或NO3 -。
本发明的化合物中的小檗碱部分荧光检测G-四链体，360A化合物具有选择性结合和稳定G-四链体DNA，两者的偶联物达到荧光检测和选择性结合双倍体G-四链体DNA的双重功能。
一种小檗碱-360A偶联物的制备方法，包括如下步骤：
S1.合成化合物1，化合物1的结构式如下：
Figure BDA0002032612500000032
其中Ts表示对甲苯磺酰基；
S2.合成化合物2，化合物2的结构式如下：
Figure BDA0002032612500000041
其中X为对甲基苯磺酸根；
S3.合成小檗碱-360A偶联物：将化合物2进行甲基化反应或将甲基化反应产物通过阴离子交换树脂得到含相应阴离子的小檗碱-360A偶联物。
本发明的S3中甲基化反应产物通过阴离子交换树脂得到含相应阴离子的小檗碱-360A偶联物，阴离子为对甲基苯磺酸根、F-、Br-、Cl-或NO3 -。
优选地，S1.中所述化合物1的合成方法为：将N，N’-双喹啉-2，6-二酰胺-4-羟基吡啶与1,8-二(对甲基苯磺酸)-三甘油醇醚在混合均匀，反应得到化合物1。
优选地，S1.中所述N，N’-双喹啉-2，6-二酰胺-4-羟基吡啶与1,8-二(对甲基苯磺酸)-三甘油醇醚的摩尔用量比为1:1～4。
优选地，S1.中反应温度为80～100℃，反应时间1～4h。
其中，本发明S1.中将N，N’-双喹啉-2，6-二酰胺-4-羟基吡啶与1,8-二(对甲基苯磺酸)-三甘油醇醚溶解混合均匀的溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈和二甲基亚砜中的一种或几种。
优选地，S1.中所述反应体系中还含有碱，所述碱的摩尔用量为N，N’-双喹啉-2，6-二酰胺-4-羟基吡啶的0.8～1.2倍。其中，所述碱可以为碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠或氢氧化钾。
S1.中对反应后的反应产物进行纯化处理，纯化的具体操作为：除去反应液溶剂，将固体物质进行硅胶柱层析，用二氯甲烷先进行洗脱，至小极性杂质出完后，替换为甲醇：二氯甲烷体积比为1:60的洗脱液进行洗脱，收集甲醇：二氯甲烷体积比为1:60的洗脱液，将所得洗脱液除去甲醇和二氯甲烷得到化合物1。
优选地，S2.中所述纯化的优选地，S2中所述化合物2的合成方法为：将化合物1和小檗红碱混合均匀，反应得到化合物2。
优选地，S2.中所述化合物1和小檗红碱的摩尔用量比为1:0.5～2。
优选地，S2.中反应温度为90～110℃，反应时间为10～14h。
其中，S2.中将化合物1和小檗红碱溶解混合均匀的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、无水乙醇、乙腈和二甲基亚砜中的一种或多种。
S2.中反对应后的反应产物进行纯化处理，纯化的具体操作为：除去反应液溶剂，将固体物质进行硅胶柱层析，用甲醇:二氯甲烷体积比为1:60的洗脱液先进行洗脱，至化合物2和其它杂质出完后，替换为甲醇:二氯甲烷体积比为1:20的洗脱液进行洗脱，收集甲醇:二氯甲烷体积比为1:20的洗脱液，将所得洗脱液除去甲醇和二氯甲烷得到化合物2。
其中，本发明S3中所述甲基化反应试剂可以为CH3I。
优选地，S3中所述反应温度为35～45℃，反应时间20～28h。
S3.中同样对反应后的反应产物进行纯化处理，纯化的具体操作为：将反应产物中加入乙醚，减压抽滤得固体，洗涤干燥，得到所述小檗碱-360A偶联物。
其中，S3.中的反应体系溶剂为N,N-二甲基甲酰胺和/或二甲基亚砜。
一种小檗碱-360A偶联物在双倍体G-四链体结构检测探针中的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，本发明的双倍体G-四链体结构为5’-A(GGGTTA)7G3-3’序列构成的双倍体G-四链体结构。
小檗碱-360A偶联物检测双倍体G-四链体结构的方法为：将待测DNA溶液中加入小檗碱-360A偶联物溶液，混匀，检测混合液的荧光强度
具体检测应用中，操作步骤如下：
1)测定待测DNA溶液中DNA的浓度；
2)往待测DNA溶液中加入小檗碱-360A偶联物，混匀，检测混合液的荧光强度；
3)将上步测得的荧光强度和所述衍生物检测双倍体G-四链体结构的标准荧光光谱进行比对，即可判断待测DNA中是否含有双倍体G-四链体结构，并确定具体含有哪种双倍体G-四链体结构。
其中，检测荧光强度时的激发波长为355nm，发射波长为530nm。
待测DNA溶液的溶剂为含Na+的pH 6.0～8.0的Tris-HCl缓冲液。
小檗碱-360A偶联物溶液的溶剂为含Na+的pH 6.0～8.0的Tris-HCl缓冲液，优选Tris-HCl缓冲液含95～105mMNa+，待测DNA与小檗碱-360A偶联物的摩尔比为1～10:1。
若上述3)中检测的待测DNA溶液的荧光强度增强了至少110倍，则说明待测DNA中含有反平行双倍体G-四链体结构。
本发明的小檗碱-360A偶联物还可以用于检测细胞中G-四链体结构，其方法为：将细胞与所述衍生物共孵2.5～3.5h后，在倒置荧光显微镜下对细胞进行荧光检测，若细胞产生明显的荧光，说明细胞中含有G-四链体结构。
小檗碱-360A偶联物在作为双倍体G-四链体结构特异性结合剂或/和稳定剂中的应用也在本发明的保护范围之内。
小檗碱-360A偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用也在本发明的保护范围之内。本发明的小檗碱-360A偶联物对肿瘤细胞具有较高的抑制活性，可以抑制宫颈癌细胞、乳腺癌、肺癌和肝癌等肿瘤细胞，尤其是宫颈癌细胞和肝癌细胞具有很好的抑制活性，同时对正常干细胞毒性较小。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一种小檗碱-360A偶联物，小檗碱-360A偶联物中小檗碱部分荧光检测G-四链体，360A化合物具有选择性结合和稳定G-四链体DNA，两者的偶联物达到荧光检测和选择性结合双倍体G-四链体DNA的双重功能，可应用于双倍体G-四链体结构检测探针和特异性结合或/和稳定双倍体G-四链体结构领域中；
(2)本发明的小檗碱-360A偶联物对肿瘤细胞具有很好的抑制活性，对肿瘤细胞的IC50值远低于正常人体肝细胞，具有抗肿瘤作用，尤其是宫颈癌细胞和肝癌细胞。
附图说明
图1为探针I对不同构型DNA在紫外灯下的发光情况及荧光强度柱状图。
图2为探针I(1.0μM)加入不同浓度不同构型DNA时在530nm的荧光强度变化图。
图3为单倍体G-四链体G1和双倍体G-四链体G2T1滴定探针I的荧光光谱和结合常数计算图，(a)单倍体反平行G1滴定探针I(1.0μM)；(b)单倍体混合型G1滴定探针I(1.0μM)；(c)反平行双倍体G2T1滴定探针I(1.0μM)；(d)混合型双倍体G2T1滴定探针I(1.0μM)，实验条件：λex/λem＝355/530nm。
图4为探针I(1.0μM)对反平行G1(0～0.8μM，a)和反平行G2T1(0～0.4μM，b)的灵敏度检测图。
图5为未退火的双倍体G-四链体DNA溶液(5.0μM)中含不同浓度的小檗碱-360A偶联物时的圆二色谱曲线图，图中曲线依次表示所述小檗碱-360A偶联物浓度为0、5.0μM、10.0μM、20.0μM和40.0μM的圆二色谱曲线。
图6为反平行双倍体G-四链体DNA溶液(10.0μM)中含浓度为0、5.0μM、10.0μM、15.0μM、20.0μM、30.0μM和40.0μM的所述小檗碱-360A偶联物时的圆二色谱与解链温度关系的曲线图。
图7为反平行单倍体G-四链体DNA溶液(20.0μM)中含浓度为0和30μM的所述小檗碱-360A偶联物的圆二色谱与解链温度关系的曲线图。
图8为双链DNA溶液(5.0μM)中含浓度为0和15μM的所述小檗碱-360A偶联物的圆二色谱与解链温度关系的曲线图。
图9为Hela活细胞中加入Hoechst 33342、加入探针、细胞明场图和三者叠加的荧光倒置显微镜细胞成像图。
图10为Hela固定细胞中加入DAPI(a、e和i)、加入探针I(b、f和i)、Hela癌细胞明场图(c、g和k)和三者叠加(d、h和l)的荧光倒置显微镜细胞成像图。图a～d、e～h和i～l分别代表空白癌细胞(Control)、加了DNA消化酶的癌细胞(DNase I)和加了RNA消化酶的癌细胞(RNase A)的荧光倒置显微镜细胞成像图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
实施例1小檗碱-360A偶联物I的合成
一种小檗碱-360A偶联物的制备方法，包括如下步骤：
S1.合成化合物1：称取N，N’-双喹啉-2，6-二酰胺-4-羟基吡啶(176mg，0.4mmol)、1,8-二(对甲基苯磺酸)-三甘油醇醚(562mg,1.2mmol)和无水碳酸钾(56mg,0.4mmol)于200mL圆底烧瓶中，加入乙腈(100mL)，90℃搅拌反应，2.5h后反应完全，减压蒸发溶剂，将固体物质进行硅胶柱层析，用二氯甲烷先进行洗脱，至小极性杂质出完后，替换为甲醇：二氯甲烷体积比为1:60的洗脱液进行洗脱,收集甲醇：二氯甲烷体积比为1:60的洗脱液，将所得洗脱液除去甲醇和二氯甲烷得到白色固体化合物1(170mg，收率59％)；
S2.合成化合物2：称取化合物1(144mg,0.2mmol)和小檗红碱(82mg,0.2mmol)于25mL圆底烧瓶中，加入乙腈15mL，100℃搅拌反应，12h后反应完全，减压蒸发溶剂，将固体物质进行硅胶柱层析，用甲醇：二氯甲烷体积比为1:60的洗脱液先进行洗脱，至化合物2和其它杂质出完后，替换为甲醇：二氯甲烷体积比为1:20的洗脱液进行洗脱，收集甲醇：二氯甲烷体积比为1:20的洗脱液，将所得洗脱液除去甲醇和二氯甲烷得到黄色固体化合物2(108mg，收率52％)；
S3.合成小檗碱-360A偶联物：称取化合物2(52mg，0.05mmol)于10mL圆底烧瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺0.5mL，40℃搅拌溶解后，加入碘甲烷1.5mL，40℃搅拌反应，24h后停止反应，在反应液中加入乙醚8mL，减压抽滤得到黄色固体。乙醚洗涤两次，丙酮洗涤两次，阴离子交换树脂(甲醇:水＝1:1)交换得到阴离子为氯离子的淡黄色固体，即为小檗碱-360A偶联物1(46mg,收率92％)。
对化合物1、化合物2和小檗碱-360A偶联物的结构进行鉴定，具体数据如下：
化合物1：
1H NMR(400MHz,DMSO):δ11.40(s,2H),9.38(s,2H),8.98(s,2H)，8.07(s,2H),8.05(s,2H),7.95(s,2H),7.79(d,J＝7.6Hz,2H),7.74(t,J＝7.2Hz,2H),7.65(t,J＝7.6Hz,2H),7.46(t,J＝7.6Hz,2H),4.46(s,2H),4.13(s,2H),3.83(s,2H),3.60(s,4H),3.51(s,2H),2.40(s,3H)。
13C NMR(100MHz,DMSO):δ168.0,162.6,150.9,146.4,145.2,132.8,132.1,130.5,129.1,128.9,128.4,128.1,128.0,127.7,124.8,112.0,70.4,70.3,70.1,68.9,68.9,68.4,21.5。
化合物1分子式为C38H35N5O8S，分子量为721.22，ESI-MS：m/z 722.55([M+H]+)和744.49([M+Na]+)，HR-MS实验值：722.2277，计算值：722.2279([M+H]+)。
化合物2：
1H NMR(400MHz,DMSO):δ11.30(s,2H),9.68(s,1H),9.36(s,2H),8.90(s,2H),8.77(s,1H),8.05(d,J＝8.0Hz,2H),8.04(d,J＝9.2Hz,1H),8.02(d,J＝8.0Hz,2H),7.91(d,J＝9.2Hz,1H),7.74(t,J＝7.6Hz,2H),7.74(s,2H),7.65(t,J＝7.6Hz,2H),7.53(s,1H),7.48(d,J＝8.0Hz,2H),7.11(d,J＝8.0Hz,2H),6.91(s,1H),6.02(s,2H),5.75(s,1H),4.89(t,J＝5.6Hz,2H),4.35(s,4H),3.99(s,3H),3.84(s,2H),3.82(s,2H),3.70(s,2H),3.69(s,2H),3.18(t,J＝5.6Hz,2H),2.28(s,3H)。
13C NMR(100MHz,DMSO):δ167.7,162.3,150.9,150.5,150.1,147.9,146.3,146.0,145.6,145.1,142.8,138.1,137.6,133.2,132.0,130.7,129.0,128.9,128.3,128.0,127.6,126.6,125.9,124.8,123.9,122.1,120.5,111.7,108.6,105.5,102.4,73.5,70.5,69.9,69.8,68.8,57.2,55.8,31.1,26.7,21.2。
化合物2分子式为C57H50N6O12S，分子量为1042.32，ESI-MS：m/z 871.45([2-C7H3O1S]+)，HR-MS实验值：871.3085，计算值：871.3086([2-C7H3O1S]+)。
小檗碱-360A偶联物1：
1H NMR(400MHz,DMSO):δ12.54(s,2H),10.65(s,2H),9.87(s,2H),9.70(s,1H),8.94(s,1H),8.53(d，J＝8.8Hz,2H),8.44(d，J＝8.8Hz,2H),8.21(t,J＝7.6Hz,2H),8.03(t,J＝7.6Hz,2H),7.99(s,2H),7.72(s,2H),7.57(s,1H),6.87(s,1H),5.96(s,2H),4.92(t,J＝5.6Hz,2H),4.77(s,6H),4.40(s,2H),4.33(s,2H),3.98(s,3H),3.87(s,4H),3.73(s,2H),3.72(s,2H),3.18(t,J＝5.6Hz,2H)。
13C NMR(100MHz,DMSO):δ167.6,162.8,150.8,149.8,149.8,147.7,145.5,142.8,137.3,135.7,135.1,134.4,133.1,133.0,130.7,130.6,130.4,129.3,126.6,124.2,122.0,120.8,120.4,119.4,112.5,108.5,105.5,102.4,73.5,70.5,70.0,69.9,69.0,68.9,57.3,55.7,54.8,54.8,54.7,46.5,26.8,20.2。
小檗碱-360A偶联物1的分子式为C52H49Cl3N6O9，分子量为1006.26，ESI-MS：m/z468.84([I-2Cl-]2+)和301.18([I-3Cl-]3+)，HR-MS实验值：468.1615和300.4512，计算值：468.1619([I-2Cl-]2+)和300.4515([I-3Cl-]3+)。
实施例2
将实施例1所得小檗碱-360A偶联物1分别用阴离子交换树脂对其中的Cl-进行离子交换，从而制得被F-、Br-、NO3 -取代Cl-的小檗碱-360A偶联物。
结果检测
(1)小檗碱-360A偶联物1的活性检测
样品制备
DNA样品：DNA样品购自上海生物生工技术有限公司，将适量DNA溶于相应的缓冲溶液，9℃加热10min后缓慢降至室温，4℃孵育过夜，最后在SMA1000上测量260nm处的吸光度，根据朗伯比尔定律计算DNA的浓度。
DNA样品包括：
ds DNA：5’-CAATCGGATCGAATTCGATCCGATTG-3’+5’-GTTAGCCTAGCTTAAGCTAGGCTAAC-3’，双链DNA；
CT DNA：双链线性DNA；
c-kit 1：5’-(CG3)2(CG)2(AG3)2T-3’，分子内平行单倍体G-四链体DNA；
c-kit 2:5’-G3CG3(CG)2(AG3)2G-3’，分子内平行单倍体G-四链体DNA；
c-myc:5’-TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA-3’，分子内平行单倍体G-四链体DNA；
G1(K+)：5’-A(G3TTA)3G3-3’，分子内混合型单倍体G-四链体DNA；
G1(Na+)：5’-A(G3TTA)3G3-3’，分子内反平行单倍体G-四链体DNA；
G2T1(K+)：5’-A(GGGTTA)7G3-3’，分子内混合型双倍体G-四链体DNA；
G2T1(Na+)：5’-A(GGGTTA)7G3-3’，分子内反平行双倍体G-四链体DNA。
将实施例1～2所制备的小檗碱-360A偶联物溶解在DMSO中得到母液，该母液中小檗碱-360A偶联物的浓度为10.0mM，用相应缓冲溶液溶解，得到小檗碱-360A偶联物溶液。
(2)检测
1)紫外灯下肉眼观察
将探针I(实施例1制备得到的小檗碱-360A偶联物1)溶液与待测样品混合，混合后探针I的浓度为2.0μM，样品双倍体G4-DNA的浓度为4.0μM，其它DNA浓度为8.0μM，将混合液放在紫外灯下，肉眼观察。如果荧光没有明显增强，则可判断为非双倍体G4-DNA结构；如果体系的荧光明显增强，则可判断待测样品为双倍体G4-DNA结构；针对荧光明显增强的DNA样品，荧光最强的可判断样品为反平行双倍体G-四链体G2T1结构。
检测结果如图1所示，图1为530nm处，4.0μM或8.0μM不同构型DNA样品加入2.0μM的探针I中荧光颜色变化情况及荧光强度，从中可以看出，不同构型DNA样品加入探针I的在紫外光下的荧光强度各不相同，其中无G-四链体结构的ds-DNA和CT DNA与空白对照组(Blank)一样，几乎没有荧光；而含有单倍体G-四链体结构的c-kit 1、c-kit 2、c-myc、G1(K+)和G1(Na+)组有较弱的荧光，不明显；而含有双倍体G-四链体结构的G2T1具有明显的荧光，荧光增强了至少50倍，尤其是反平行G2T1组的荧光增强幅度最为明显。
上述结果说明本发明荧光探针I可以特异性检测双倍体G-四链体结构，若待测样品加入探针I后，其荧光增加至少110倍，即可判定该DNA中含有反平行双倍体G-四链体结构。
2)荧光光谱测定
探针I的浓度为1.0μM，往探针I溶液里滴加不同的待测DNA样品溶液，吹打均匀后，用荧光光谱测定体系的荧光发射，将等色点355nm设定为激发波长。图2为1.0μM探针I加入不同浓度(0～4.0μM)不同构型的DNA中时，在530nm处的荧光强度变化图，图2进一步证实了图1的结果：随着DNA浓度的不断增大，ds DNA和CT DNA组仍几乎没有荧光，含单倍体G-四链体结构的c-kit 1、c-kit 2、c-myc、混合型G1(K+)和反平行G1(Na+)的荧光略有增强但不明显，而双倍体G-四链体结构G2T1中的荧光显著增强，尤其是反平行G2T1的荧光增强幅度最为明显。
上述结果说明，本发明荧光探针1发出的荧光强度与双倍体G-四链体的浓度存在明显的剂量关系，进一步说明荧光探针1可以特异性检测双倍体G-四链体结构。
进一步的，在图3的荧光变化光谱的基础上，根据下式：
Figure BDA0002032612500000111
公式中F和F0分别为探针I在存在和不存在DNA时530nm处的荧光强度；常数P＝Fmax/F0，Fmax是加入DNA后530nm处的饱和荧光强度，Fmax是F的最大值；M＝1/(Ka·C)，Ka为结合常数，C为探针I的浓度；x＝nCDNA/C，CDNA为DNA浓度，n为可调整的常数。以F/F0对CDNA进行线性拟合，得到结合常数Ka。
由图3得到探针I与反平行G2T1、混合型G2T1、反平行G1和混合型G1的结合常数分别为：(19.6±6.0)μM-1、(11.1±3.3)μM-1、(1.1±0.2)μM-1和(1.2±0.7)μM-1。
上述实验结果说明：小檗碱-360A偶联物I对双倍体G-四链体结合能力显著高于单倍体G-四链体，其中对反平行双倍体G2T1的选择性结合能力最强。
3)探针I对G-四链体DNA结构的灵敏度检测
检测限实验在荧光仪上测试。
取1.0μM探针I溶液，以355nm作为激发波长测定溶液的荧光光谱，激发和发射缝宽均为10nm，扫描范围为365-700nm，连续测量5次溶液的吸光度值，然后算出标准差δ。根据荧光滴定的数据，选取前一段数据进行直线拟合，检测限是3δ/slope(slope为直线的斜率)。
实验结果如图4所示，计算结果显示探针I对反平行单倍体G1检测灵敏度为21nM，对反平行双倍体G2T1检测灵敏度为2.4nM，说明探针I对双倍体G2T1具有更高的荧光检测灵敏度。
4)用CD光谱检测本发明所述小檗碱-360A偶联物1可否诱导形成双倍体G-四链体结构
将人端粒寡聚核苷酸G2T1溶于10mM Tris-HCl，pH 7.0缓冲溶液中，得到5.0μM的未褪火的G2T1溶液，在CD光谱仪上检测G2T1的CD光谱的变化，比色皿宽1mm，反应液为300μL，扫描范围为200-500nm；向含有5.0μM G2T1溶液中，分别不加和加入1.5μL、3.0μL、4.5μL和6.0μL的1mM小檗碱-360A偶联物溶液，使小檗碱-360A偶联物浓度分别为0、5.0μM、10.0μM、15.0μM和20.0μM，测定五种混合溶液的CD光谱，最后上述五种溶液的CD光谱图用Origin8.0软件处理，实验结果如图5中的所示。
由图5可以看出，随着小檗碱-360A偶联物浓度的不断增大，250nm单链DNA的CD信号峰逐渐降低，反平行双倍体G-四链体的特征CD信号峰(295nm处的正峰和265nm处的负峰)出现，说明小檗碱-360A偶联物可诱导形成反平行双倍体G-四链体结构。
5)用CD-melting实验检验本发明小檗碱-360A偶联物对双倍体G-四链体DNA的热稳定性
将寡聚核苷酸G2T1用10mM Tris-HCl和100mM NaCl(pH 7.0)的缓冲溶液稀释到100μM，95℃加热10min后缓慢降至室温，4℃孵育过夜。CD-melting实验中，缓冲液中含有300μL 10.0μM G2T1，采集20℃～95℃温度范围内295nm处的CD值，Origin8.0软件处理数据，求出G2T1DNA本身的熔点TDNA；向上述浓度的DNA溶液中加入1.5μL、3.0μL、4.5μL、6.0μL、9.0μL和12.0μL的1mM小檗碱-360A偶联物溶液，使小檗碱-360A偶联物浓度分别为0、5.0μM、10.0μM、15.0μM、20.0μM、30.0μM、和40.0μM，采集溶液在20℃～95℃温度范围内295nm处的CD值，Origin 8.0软件处理数据，求出加入小檗碱-360A偶联物后DNA的熔点Tm；根据TDNA和Tm的值，计算DNA熔解温度的变化值ΔTm＝Tm-TDNA。
其实验结果如图6，随着小檗碱-360A偶联物的加入和浓度的不断增大，其ΔTm呈浓度依赖关系，ΔTm最大可达到26.2℃，可以判断本发明小檗碱-360A二聚体偶联物对双倍体G-四链体DNA具优良的热稳定性。
6)用CD-melting实验检验本发明小檗碱-360A偶联物1对单倍体G-四链体DNA和双链DNA的热稳定性
将寡聚核苷酸G1溶于10mM Tris-HCl和100mM NaCl(pH 7.0)的缓冲溶液稀释到100μM，95℃加热10min后缓慢降至室温，4℃孵育过夜。CD-melting实验中，缓冲液中含有300μL 20.0μM的G1，采集20℃～95℃温度范围内295nm处的CD值，Origin8.0软件处理数据，求出G1-DNA本身的熔点TDNA；向上述浓度的DNA溶液中加入9μL的1mM的小檗碱-360A偶联物溶液，配制含小檗碱-360A偶联物浓度为30.0μM的G1混合溶液，采集溶液在20℃～95℃温度范围内295nm处的CD值，Origin 8.0软件处理数据，求出加入小檗碱-360A偶联物后DNA的熔点Tm；根据TDNA和Tm的值，计算DNA熔解温度的变化值ΔTm＝Tm-TDNA。其实验结果如图7，小檗碱-360A偶联物加至G1溶液中，其ΔTm(Tm-TDNA)为3.6℃。
将1mM双链ds DNA用10mM Tris-HCl(pH＝7.59)、50mM NaCl、1mM EDTA溶液95℃褪火10分钟后缓慢降至室温，4℃孵育过夜。CD-melting实验中，缓冲液中含有300μL 5.0μM的ds DNA，采集20～95℃温度范围内263nm处的CD值，Origin8.0软件处理数据，求出ds DNA本身的熔点TDNA；向上述浓度的DNA溶液中加入4.5μL的1mM的小檗碱-360A偶联物溶液，配制含小檗碱-360A偶联物浓度为15.0μM的ds DNA混合溶液，采集溶液在20℃～95℃温度范围内263nm处的CD值，Origin 8.0软件处理数据，求出加入小檗碱-360A偶联物后DNA的熔点Tm；根据TDNA和Tm的值，计算DNA熔解温度的变化值ΔTm＝Tm-TDNA。其实验结果如图8，小檗碱-360A偶联物加至ds DNA溶液中，其ΔTm为-0.9℃。
由上述实验结果说明：小檗碱-360A偶联物对双倍体G-四链体DNA的热稳定性明显强于单倍体G4-DNA和双链DNA。
7)探针I对细胞内G-四链体的检测
活细胞染色实验：将3×105个Hela细胞接种于3cm的培养皿，在37℃，5％CO2的恒温培养箱中孵育过夜，弃去培养基并用PBS洗2次；细胞用2mL含10μM探针I的培养基孵育12h，弃去含化合物的培养基并用PBS洗3次；细胞再用2mL含5μg/mL Hoechst 33342的培养基孵育20min，弃去含Hoechst 33342的培养基并用PBS洗3次，加入2mL培养基，使用倒置荧光显微镜进行拍照观察，20倍目镜，实验重复3次。实验结果如图9所示，说明探针I可以染色Hela活细胞。
DNA消化酶和RNA消化酶实验：将2×105个Hela细胞接种于六孔板，在37℃，5％CO2的恒温培养箱中孵育过夜，弃去培养基并用PBS洗2次；细胞用1mL 4％多聚甲醛的PBS溶液固定15min，弃去固定液并用PBS洗3次；细胞再用1mL 0.3％Triton X-100的PBS溶液处理30min来提高细胞膜的通透性，弃去含Triton X-100的PBS溶液并用PBS洗3次；接着，细胞分别用1mL 100units/mL RNase-free DNase I的PBS溶液、1mL 100units/mL DNase andProtease-free RNase A的PBS溶液或者1mL PBS溶液孵化3h，弃去溶液并用PBS洗3次；最后，细胞用1mL含5μM探针I的PBS溶液染色1h，弃去含化合物的溶液并用PBS洗3次；细胞再用1mL含5μg/mL DAPI的PBS溶液作用30min，弃去含DAPI的溶液并用PBS洗3次，加入1mL PBS溶液，使用倒置荧光显微镜进行拍照观察，20倍目镜，实验重复3次。
实验结果如图10所示，其中图10a～d分别为Hela宫颈癌细胞加DAPI、加探针I、明场和前三个图谱叠加的倒置荧光细胞成像图，这个共染色实验说明探针I对细胞具有显著的荧光显色反应。由于细胞核中的细胞仁是rDNA转录为rRNA的区域，换句话说，是rDNA中的G-四链体存在区域，为了进一步确认探针I荧光显色的靶点是否是细胞仁，我们又做了如下的脱氧核糖核酸和核糖核酸消化实验。检测结果如图10所示，其中图10e～h为Hela癌细胞经DNase I处理过的加DAPI、加探针I、明场和前三个图谱叠加。从图10e：由于DNase I的加入，细胞核中的荧光显色明显消失；从图10f和10h可以看出：细胞质中的荧光显色不受DNase I消化酶的影响，说明探针I可进入细胞质，可能对G-四链体RNA结构进行荧光检测。图10i～l为Hela癌细胞经RNase A消化酶处理过的加DAPI、加探针I、明场和前三个图谱叠加的共聚焦荧光成像图，从图10j可以看出：细胞核中的荧光显色很微弱，上述实验结果说明：探针I进入细胞核比较困难。由此得到如下结论：探针I可进入细胞对G-四链体RNA结构进行荧光检测，由于化合物本身结构带正电，可能是进入细胞核比较困难的原因。
8)抗肿瘤活性
选择实施例1和2制备的化合物，采用MTT法，对四种肿瘤细胞Hela(宫颈癌细胞)、MCF7(乳腺癌)、A549(肺癌)、HepG2(肝癌)和人正常肝细胞L02进行了抗肿瘤活性测试，其IC50值如表1所示。
表1小檗碱-360A偶联物1的抗肿瘤活性的IC50值(96h)。
Figure BDA0002032612500000151
实验结果显示：本发明的小檗碱-360A偶联物具有抗肿瘤活性，特别是对宫颈癌细胞和肝癌细胞显示较高的细胞抑制活性，同时对正常干细胞毒性较小，表现出对癌细胞的选择性。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种小檗碱-360A偶联物，其特征在于，所述小檗碱-360A偶联物的结构式如下：
Figure FDA0003288066380000011
其中X为对甲基苯磺酸根、F-、I-、Br-、Cl-或NO3 -。
2.权利要求1所述小檗碱-360A偶联物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.合成化合物1，化合物1的结构式如下：
Figure FDA0003288066380000012
其中Ts表示对甲苯磺酰基；
S2.合成化合物2，化合物2的结构式如下：
Figure FDA0003288066380000013
其中X为对甲基苯磺酸根；
S3.合成小檗碱-360A偶联物：将化合物2进行甲基化反应或将甲基化反应产物通过阴离子交换树脂得到含相应阴离子的小檗碱-360A偶联物。
3.如权利要求2所述制备方法，其特征在于，S1中所述化合物1的合成方法为：将N，N’-双喹啉-2，6-二酰胺-4-羟基吡啶与1,8-二(对甲基苯磺酸)-三甘油醇醚混合均匀，反应得到化合物1。
4.如权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述N，N’-双喹啉-2，6-二酰胺-4-羟基吡啶与1,8-二(对甲基苯磺酸)-三甘油醇醚的摩尔用量比为1:1～4。
5.如权利要求2所述制备方法，其特征在于，S2.中所述化合物2的合成方法为：将化合物1和小檗红碱混合均匀，反应得到化合物2。
6.如权利要求5所述制备方法，其特征在于，S2.中所述化合物1和小檗红碱的摩尔用量比为1:0.5～2。
7.权利要求1所述小檗碱-360A偶联物在制备双倍体G-四链体结构检测探针中的应用。
8.权利要求1所述小檗碱-360A偶联物在制备双倍体G-四链体结构特异性结合剂或/和稳定剂中的应用。
9.权利要求1所述小檗碱-360A偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为宫颈癌、乳腺癌、肺癌和肝癌。
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