CN110095516B - 相转变溶菌酶修饰的碳纳米碗共价固定化cpo生物传感器及其检测三氯乙酸的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种相转变溶菌酶修饰的碳纳米碗共价固定化CPO生物传感器及其检测三氯乙酸的应用，所述的生物传感器是在表面修饰相转变溶菌酶的多孔碳纳米碗上交联氯过氧化物酶后，与离子液体混合共同修饰玻碳电极。本发明生物传感器上氯过氧化物酶(CPO)的固载量高且稳定性好、活性高，对三氯乙酸(TCA)具有良好的电化学催化性能，可采用循环伏安法和计时‑电流法Amperometric i‑t两种检测手段检测TCA，检测的线性范围较宽，检出限低，选择性、抗干扰性、重复使用性以及稳定性好，可用于自来水样中TCA含量的检测，具有良好的应用前景。

Description

相转变溶菌酶修饰的碳纳米碗共价固定化CPO生物传感器及 其检测三氯乙酸的应用
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种相转变溶菌酶修饰的碳纳米碗共价固定化CPO生物传感器及其电化学检测三氯乙酸的应用。
背景技术
三氯乙酸(TCA)是常见的毒性化学试剂，广泛用于有机合成以及医药、化学试剂、杀虫剂等的合成。但TCA也是一种氟氯碳有机污染物，对工业、农业和公共健康等领域造成了极大的危害，已经成为重要的环境问题。因此，近些年来对TCA浓度的精确测定以及定期检测已受到研究者的广泛关注。
常见检测TCA的方法有超高效液相色谱-串联质谱法、气相色谱-质谱法、气相色谱-电子捕获法、气相色谱-原子发射光谱法、离子色谱法、电化学酶生物传感器检测等。其中电化学酶生物传感器是一种将电化学分析技术与酶生物技术相结合的生物传感器，它既具有酶的分子识别和选择性催化功能，又具有电化学传感器的灵敏高、响应快以及操作方便的特点，在工业、农业、环境监测以及医学检测等领域受到了广泛的关注。
目前，检测TCA的电化学酶生物传感器已有不少研究，如：2018年，Eguílaz等人构筑了nafion离子涂层多壁碳纳米管(MWCNTs)和介孔二氧化硅纳米颗粒的血红蛋白(Hb)酶生物传感器(GCE/MWCNTs-MCM41-Hb)，其电子转移速率常数(k)和电活性的表面覆盖率(ΓHb)分别为5.2s-1和4.7×10-10mol·cm-2，通过I-t检测方法对TCA进行检测，检测限为3μmol·L-1，检测范围为0.05～27mmol·L-1(M.Eguílaz,R.Villalonga,G.Rivas.Electrochemical biointerfaces based on carbon nanotubes-mesoporoussilica hybrid material:Bioelectrocatalysis of hemoglobin and biosensingapplications[J].Biosens.Bioelectron.,2018,111:144-151.)。2018年，Zhan等人通过简单的水热处理和随后的煅烧回收工艺，制备了石墨烯和Co2Al双层氢氧化物纳米片组装修饰的石墨化氮化碳纳米颗粒的三维混合材料，以碳离子液体电极(CILE)为基底电极构筑了导电复合材料/壳聚糖(CTS)/血红蛋白(Hb)生物传感器，并用于TCA的检测。该生物传感器的线性检测范围0.2～36.0mmol·L-1，检出限为0.05mmol·L-1(T.Zhan,Z.Tan,X.Wang,W.Hou.Hemoglobin immobilized in g-C3N4 nanoparticle decorated 3D graphene-LDHnetwork:Direct electrochemistry and electrocatalysis to trichloroacetic acid[J].Sens.Actuat.B-Chem.,2018,255:149-158.)。2016年，Zhan等人通过原位还原氧化石墨烯(GO)和氧化石墨烯(ELDH)的组装，制备了一种Co2Al层状双氢氧化物(ELDH)和石墨烯(GR)组成的三明治状纳米复合材料。以CILE为基底电极构筑了一种ELDH-GR纳米复合材料/CTS/Hb生物传感器，并用于TCA的传感。Hb修饰电极通过循环伏安法对TCA的检测范围为5～360mmol/L，检测限为1.506mmol/L(T.Zhan,X.Wang,X.Li,et al.Hemoglobin immobilizedin exfoliated Co2Al LDH-graphene nanocomposite film:Direct electrochemistryand electrocatalysis toward trichloroacetic acid[J].Sens.Actuat.B-Chem.,2016,228:101-108.)。
氯过氧化物酶(CPO)是一种从海洋真菌Caldariomyces fumago中提取出来的血红素糖蛋白酶。CPO分子的活性中心具有独特的结构，使得CPO同时具备过氧化物酶、过氧化氢酶和细胞色素P450等多种酶的催化活性，目前被认为是过氧化物酶家族中催化活性最广泛的酶。但是氯过氧化物酶的活性中心深埋于酶分子的内部，所以难以实现CPO与电极之间的直接电子转移，且酶对反应条件较为敏感，极易失活，不易固定在电极表面。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有良好的选择性、灵敏度和稳定性的相转变溶菌酶修饰的碳纳米碗共价固定化CPO生物传感器，并为该生物传感器提供一种新的应用。
解决上述技术问题所采用的生物传感器是在表面修饰相转变溶菌酶的多孔碳纳米碗上交联氯过氧化物酶后，与离子液体混合共同修饰玻碳电极。
上述表面修饰相转变溶菌酶的多孔碳纳米碗的制备方法为：将多孔碳纳米碗分散于蒸馏水中，然后向其中加入相转变溶菌酶溶液，搅拌50～80min后，离心分离并用蒸馏水清洗，所得固体在室温下真空干燥，得到表面修饰相转变溶菌酶的多孔碳纳米碗。
上述表面修饰相转变溶菌酶的多孔碳纳米碗的制备方法中，所述相转变溶菌酶溶液的制备方法为：将溶菌酶溶于pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液中，配制成1～10mg·mL-1的溶菌酶溶液；将三(2-羧乙基)膦溶于pH＝7.4Tris-HCl缓冲溶液中，配制成20～100mmol·L-1的三(2-羧乙基)膦溶液，并用5mol·L-1的NaOH水溶液调节其pH＝4.0～6.0；然后将溶菌酶溶液与pH＝4.0～6.0的三(2-羧乙基)膦溶液按体积比为1:1混合，得到相转变溶菌酶溶液。
上述表面修饰相转变溶菌酶的多孔碳纳米碗的制备方法中，所述多孔碳纳米碗与溶菌酶的质量比为1:3～10。
上述交联氯过氧化物酶的方法为：将表面修饰相转变溶菌酶的多孔碳纳米碗加入pH＝6.0～7.0的PBS缓冲溶液，超声10～20min，然后加入质量浓度为30％～60％的戊二醛水溶液，在恒温振荡器中振荡3～5h后，离心分离，并用pH＝6.0～7.0的PBS缓冲溶液清洗除去多余的戊二醛，将所得固体加入pH＝4.0～6.0的PBS缓冲液中，超声分散均匀后加入氯过氧化物酶溶液，在恒温振荡器中振荡10～12h，离心分离，并用pH＝4.0～6.0的PBS缓冲液清洗除去多余的氯过氧化物酶。
上述交联氯过氧化物酶的方法中，所述表面修饰相转变溶菌酶的多孔碳纳米碗与戊二醛、氯氧化物酶的用量比为1g:5～20g:100～300U；所述氯过氧化物酶溶液中氯过氧化物酶的浓度为500～3000U·L-1，其采用pH＝3.0～5.5的PBS缓冲溶液配制。
上述修饰玻碳电极的方法为：将离子液体溶解于pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，并加入所述交联氯过氧化物酶后的多孔碳纳米碗，分散均匀，使所得分散液中离子液体的体积浓度为5％～20％、交联氯过氧化物酶后的多孔碳纳米碗的浓度为1.0～5.0mg·mL-1；然后将所得分散液滴加到预处理后的玻碳电极上，在室温下晾干。
上述的离子液体为溴化1-乙基-3-甲基咪唑离子液体、溴化1-辛基-3-甲基咪唑离子液体、溴化1-癸基-3-甲基咪唑离子液体、氯化1-辛基-3-甲基咪唑离子液体中的任意一种。
本发明生物传感器在电化学检测三氯乙酸中的应用，具体检测方法为：以所述生物传感器为工作电极、甘汞电极为参比电极、铂片电极为对电极组成三电极体系，采用循环伏安法检测电压随三氯乙酸标准品浓度变化的标准曲线或采用计时-电流法Amperometrici-t检测电流随三氯乙酸标准品浓度变化的标准曲线，然后采用相同的方法测试三氯乙酸待测样品，根据待测样品对应的电压或电流，结合标准曲线的线性方程，即可实现待测样品中三氯乙酸的定量检测。
本发明具有的有益效果如下：
1、本发明生物传感器采用的多孔碳纳米碗比表面积大、生物相容性好、电导率高，增加了CPO的固载量；其表面修饰的相转变溶菌酶具有羟基、巯基、羧基氨基、酰胺键等众多官能团，可通过戊二醛交联结合CPO，提高了生物传感器的重复使用性；且所使用的离子液体具有良好的生物相容性，同时可以打开CPO活性中心的通道，实现电极与酶活中心的直接电子转移(DET)。
2、本发明生物传感器对TCA具有良好的电化学催化性能，可采用循环伏安法和计时-电流法Amperometric i-t两种检测手段检测TCA，检测的线性范围较宽，检出限低，选择性、抗干扰性、重复使用性以及稳定性好，可用于自来水样中TCA含量的检测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是多孔碳纳米碗(a)、FITC修饰的PTL-CNB(b)以及FITC-PTL-CNB@RhB-CPO(c)的激光共聚显微镜图。
图2是GC、CNB-GC、PTL-CNB-GC、PTL-CNB/IL-GC、CPO-GC、CPO@PTL-CNB/IL-GC在含0.1mol·L-1KCl的5.0×10-3mol·L-1[Fe(CN)6]3-/4-水溶液中的电化学阻抗谱(插图为GC、CNB-GC、PTL-CNB-GC、PTL-CNB/IL-GC的阻抗图和等效电路图)。
图3是GC、CNB-GC、PTL-CNB-GC、PTL-CNB/IL-GC、CPO@PTL-CNB/IL-GC和CPO-GC在含0.1mol·L-1KCl的5.0×10-3mol·L-1[Fe(CN)6]3-/4-水溶液中的CV图。
图4是实施例1制备的CPO@PTL-CNB/IL-GC在扫描速度范围为20～500mV·s-1(pH＝5)的循环伏安曲线。
图5是实施例1制备的CPO@PTL-CNB/IL-GC的峰值电流与扫描速度(ν)关系图。
图6是实施例1制备的CPO@PTL-CNB/IL-GC在含不同浓度TCA的0.1mol·L-1pH＝3.0的PBS缓冲溶液中的循环伏安图。
图7是实施例1制备的CPO@PTL-CNB/IL-GC对不同浓度TCA的CV曲线图(插图是TCA浓度在33μmol·L-1～39mmol·L-1与还原峰电流之间的线性关系图)。
图8是实施例1制备的CPO@PTL-CNB/IL-GC对不同浓度TCA的Amperometric i-t曲线图(插图为低浓度的TCA的Amperometric i-t曲线)。
图9是实施例1制备的CPO@PTL-CNB/IL-GC对浓度为33μmol·L-1～98mmol·L-1TCA与电流之间的线性关系图。
图10是实施例1制备的CPO@PTL-CNB/IL-GC在三氯乙酸定量检测中的抗干扰性能图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
下面实施例中所用的多孔碳纳米碗(CNB)根据文献“High electrocapacitiveperformance of bowl-like monodispersed porous carbon nanoparticles preparedwith an interfacial self-assembly process[J].Journal of Colloid and InterfaceScience 2017,496:35-43”中公开的方法制备，其BET为1255m2·g-1。
下面实施例中所用的相转变溶菌酶溶液的制备方法为：将0.2mg溶菌酶溶于100mL10mmol·L-1pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，配制成浓度为2mg·mL-1的溶菌酶溶液；将1.433g三(2-羧乙基)膦溶于100mL 10mmol·L-1pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，配制成浓度为50mmol·L-1的三(2-羧乙基)膦溶液，并用5mol·L-1的NaOH水溶液调节其pH＝5.8；然后将100mL溶菌酶溶液和100mL pH＝5.8的三(2-羧乙基)膦溶液混合，得到相转变溶菌酶溶液。
下面实施例中所用的预处理的玻碳电极的制备方法为：将直径为3mm的玻碳电极(GC)依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光成镜面，再将电极依次用超纯水、乙醇、超纯水各超声清洗5min，用N2吹干，然后将玻碳电极置于10mL含有0.1mol·L-1 KCl的2mmol·L-1 K3Fe(CN)6水溶液中，在0～0.8V下采用循环伏安法扫描至氧化峰与还原峰电位差值小于80mV，取出用蒸馏水冲洗，室温晾干，得到预处理的玻碳电极。
实施例1
将20mg多孔碳纳米碗(CNB)分散于10mL蒸馏水中，然后向其中加入100mL相转变溶菌酶(PTL)溶液，搅拌1h后，将混合液离心分离，并用蒸馏水清洗三次，所得固体在室温下真空干燥12h，得到表面修饰相转变溶菌酶的多孔碳纳米碗(记为PTL-CNB)。然后将5mg PTL-CNB加入2mL离心管中，向其中加入1mL pH＝7.0的PBS缓冲溶液，超声分散15min，再向其中加入100μL质量分数为50％的戊二醛水溶液，在恒温振荡器中振荡4h后，离心分离，并用pH＝7.0的PBS缓冲溶液清洗3次除去多余的戊二醛，再向离心管中加入1.2mL pH＝5.0的PBS缓冲溶液，超声分散均匀后加入300μL 2000U·L-1的CPO溶液(由pH＝5.0的PBS缓冲溶液配制)，于恒温振荡器中振荡12h，离心分离并用pH＝5.0的PBS缓冲溶液清洗除去多余的CPO，得到固定CPO的多孔碳纳米碗(记为CPO@PTL-CNB)。将1mL溴化1-乙基-3-甲基咪唑离子液体(IL)加入9mL pH＝7.0的PBS缓冲溶液中，然后加入25mg CPO@PTL-CNB，震荡以混合均匀，得到CPO@PTL-CNB/IL悬浮液，用移液枪取10μL CPO@PTL-CNB/IL悬浮液分两次滴在预处理的玻碳电极表面，于室温下自然风干2h，得到相转变溶菌酶修饰的碳纳米碗共价固定化CPO生物传感器(记为CPO@PTL-CNB/IL-GC)。
为了证明PTL成功修饰以及PTL-CNB成功固定CPO，事先用FITC标记的溶菌酶相转变后修饰CNB，得到FITC修饰的PTL-CNB，清洗后用于固定事先标记罗丹明(RhB)的CPO，将固定后的材料冲洗除去表面的酶后进行激光共聚焦显微镜的表征，结果见图1。从图1a中可以看出，CNB本身未出现荧光，而图1b中出现了明显的FITC绿色，说明溶菌酶成功修饰在CNB的表面，另外，图1c出现了红色，说明标记了红色RhB的CPO被成功固定在CNB的表面，以上实现证明了PTL成功修饰以及PTL-CNB成功固定CPO。
以所得C作为工作电极、铂片电极作为对电极、甘汞电极作为参比电极，并以裸玻碳电极(GC)、碳纳米碗修饰的玻碳电极(CNB-GC)、PTL-CNB修饰的玻碳电极(PTL-CNB-GC)和CPO修饰的玻碳电极(CPO-GC)作为对比电极，在室温下，于含0.1mol·L-1KCl的5.0×10- 3mol·L-1[Fe(CN)6]3-/4-水溶液中，把开路电压设为偏电位，记录电化学阻抗谱图(EIS)曲线，结果见图2。EIS可以为电极表面修饰前后阻抗的变化提供信息，典型的法拉第阻抗谱包含一段半圆部分和一段直线部分，分别出现在交流频率较高和较低的两种极限情况。阻抗图谱中的半圆部分受电子转移速率控制，而直线部分受扩散控制。依据Randle和Eresheler理论，对于一个电解池，可以模拟出如图2插图所示的一个等效电路，该回路等效于溶液电阻Rs和Warburg阻抗Zw，一个双层电容Cd和一个电子转移阻抗Ret。通过谱图的拟合，可以算出他们的电子转移阻抗(Ret)分别是138.1Ω、40.79Ω、159.5Ω、113.8Ω、389.8Ω和939.3Ω，说明CNB具有优异的电子传递能力，PTL-CNB-GC电阻有所增加，这是因为相转变溶菌酶属于生物大分子，对电子传递具有一定阻碍作用，因此其较CNB-GC阻抗增大，但增加幅度较小，也说明了PTL的成功修饰，溴化1-乙基-3-甲基咪唑(IL)引入后的PTL-CNB/IL-GC的阻抗值较PTL-CNB-GC阻抗减小，这是由于溴化1-乙基-3-甲基咪唑离子液体具有优异的电子传输性能，CPO@PTL-CNB/IL-GC的阻抗较CPO-GC大大减小了，得益于PTL-CNB和溴化1-乙基-3-甲基咪唑离子液体具有好的电子传输能力，正是这种优异的性质，有利于实现CPO的直接电子转移。并以GC、CNB-GC、PTL-CNB-GC、PTL-CNB/IL-GC、CPO@PTL-CNB/IL-GC和CPO-GC分别为工作电极，铂片电极作为对电极、甘汞电极作为参比电极，在含0.1mol·L-1KCl的5.0×10- 3mol·L-1[Fe(CN)6]3-/4-水溶液中进行循环伏安扫描，结果见图3，更进一步证实了以上结论。
以CPO@PTL-CNB/IL-GC为工作电极、铂片电极作为对电极、甘汞电极作为参比电极，在室温下于30mL 0.1mol L-1pH＝5的PBS缓冲溶液中，在扫描速度范围为20～500mV·s-1下进行循环伏安法测试，结果见图4和5。由图4和图5可以看出随着扫描速度不断增加，峰电流也不断增大，且随着扫速的增大，CPO的氧化峰电流(Ip)、还原峰电流(Ipc)都增大。CPO在电极表面的表面覆盖率Гc可通过Faraday’s law-公式(1)算出：
Figure BDA0002071250780000071
其中，A为电极真实的表面积(0.071cm2)，n为电子转移数，F为法拉第常数，R为摩尔气体常数，T为温度，Ip为峰电流，Гc为表面覆盖率。经计算，CPO在电极表面覆盖率Гc为4.9×10-10mol·cm-2，这个值比电极表面单分子层分布的理论值2.86×10-12mol·cm-2大，说明PTL-CNB/IL复合材料大大增加了固载CPO的活性位点，说明PTL-CNB对CPO具有较好的固载能力，这得益于PTL-CNB高比表面积、稳定的固载CPO能力和优异的电子传输性能。
实施例2
采用实施例1制备的CPO@PTL-CNB/IL-GC在三氯乙酸检测中的应用。
1、电极对TCA的电流响应
以CPO@PTL-CNB/IL-GC为工作电极、铂片电极作为对电极、甘汞电极作为参比电极，在室温下，分别于30mL含不同浓度TCA(33μmol·L-1～39mmol·L-1)的PBS缓冲溶液(0.1mol/L pH＝3)中，扫描速度为100mV·s-1的条件下进行循环伏安扫描。结果见图6和图7。
由图6可见，TCA浓度为0.5mM和1.0mM时，CV曲线的还原电流从-0.5V之后开始陡然增大，同时氧化电流减小，这是由于修饰的玻碳电极上的CPO对TCA的电催化作用。由图7可见，随着TCA的浓度增大，还原电流不断增加，并在33μmol·L-1～23mmol·L-1浓度范围内呈线性关系：I(μA)＝-1.6322×10-3CTCA(mmol·L-1)-1.079，R2＝0.9991(n＝32)。
2、安培检测TCA
以CPO@PTL-CNB/IL-GC为工作电极、铂片电极作为对电极、甘汞电极作为参比电极，在氮气氛围下，向不断搅拌的30mL 0.1mol·L-1pH＝3.0的PBS缓冲溶液中，使用移液枪先后注射100μL 0.1mol·L-1TCA、30μL 1.0mol·L-1TCA、90μL1.0mol·L-1TCA、60μL5.0mol·L-1TCA、120μL 5.0mol·L-1TCA，通过安培检测加入不同浓度TCA的电流-时间曲线，结果见图8和图9。
由图8和图9可见，当加入TCA时，还原电流骤然增大，说明其对TCA电流响应速度非常快速，且电流与TCA浓度在33μmol·L-1～98mmol·L-1范围内呈线性关系：I(μA)＝-1340.69CTCA (mol·L-1)-1.079，R2＝0.9987(n＝103)，检测限为5.9μM(σ＝3)。Km值为0.22mmol·L-1，说明CPO在电极上与TCA有较好的亲和力。
发明人进一步对实施例1制备的CPO@PTL-CNB/IL-GC电化学检测TCA的稳定性、重现性和抗干扰性进行了测试，具体试验如下：
(1)稳定性
将CPO@PTL-CNB/IL-GC于含有0.5mmol·L-1TCA的0.1mol·L-1pH＝3的PBS缓冲溶液中以0.1V·s-1的速度连续扫描150圈后，其电流的变化值为3.5％，说明该电极具有较好的操作稳定性；另外，将该电极在4℃的冰箱中放置30天，期间每隔5天取出于含0.5mmol·L-1TCA的0.1mol·L-1pH＝3的PBS缓冲溶液中测其对TCA响应电流值，其电流响应值变化小于6.0％，说明该生物传感器具有较好的稳定性和较长的使用寿命。
(2)重现性
按实施例1方法修饰相同的5支玻碳电极得到CPO@PTL-CNB/IL-GC，将CPO@PTL-CNB/IL-GC于含0.5mmol·L-1TCA的0.1mol·L-1pH＝3的PBS缓冲溶液中以0.1V·s-1的扫描速度进行循环伏安扫描，测得5只电极对0.5mmol·L-1TCA的电流响应，测定结果的RSD为4.0％，证明用该生物传感器检测TCA具有较好的重现性。
(3)抗干扰性
用计时-电流法Amperometric i-t法考察了检测TCA的抗干扰性能，选取了两种农药污染物异丙隆(a)、甲磺隆(b)；两种抗生素污染物左氧氟沙星(c)、诺氧氟沙星(d)以及无机盐AgNO3(e)、CuSO4(f)、FeCl3(g)、MgCl2(h)和NaCO3(i)作为干扰物样品，结果见图10，其中干扰物浓度为1.0mmol·L-1，TCA浓度为0.2mmol·L-1。由图10可见，CPO@PTL-CNB/IL-GC检测TCA的抗干扰性能较好。
使用自来水作为实际样品，采用加标回收的方法检测其中的TCA含量，检测情况如表1所示，结果表明该检测方法具有较好的回收率，说明该方法的可实用性。
表1 实际样品中的TCA检测
Figure BDA0002071250780000091

Claims (7)

1.一种相转变溶菌酶修饰的碳纳米碗共价固定化CPO生物传感器，其特征在于：所述的生物传感器是在表面修饰相转变溶菌酶的多孔碳纳米碗上交联氯过氧化物酶后，与离子液体混合共同修饰玻碳电极；
上述表面修饰相转变溶菌酶的多孔碳纳米碗的制备方法为：将多孔碳纳米碗分散于蒸馏水中，然后向其中加入相转变溶菌酶溶液，搅拌50～80min后，离心分离并用蒸馏水清洗，所得固体在室温下真空干燥，得到表面修饰相转变溶菌酶的多孔碳纳米碗；
上述交联氯过氧化物酶的方法为：将表面修饰相转变溶菌酶的多孔碳纳米碗加入pH=6.0～7.0的PBS缓冲溶液，超声10～20min，然后加入质量浓度为30%～60%的戊二醛水溶液，在恒温振荡器中振荡3～5h后，离心分离，并用pH=6.0～7.0的PBS缓冲溶液清洗除去多余的戊二醛，将所得固体加入pH=4.0～6.0的PBS缓冲液中，超声分散均匀后加入氯过氧化物酶溶液，在恒温振荡器中振荡10～12h，离心分离，并用pH=4.0～6.0的PBS缓冲液清洗除去多余的氯过氧化物酶；
上述修饰玻碳电极的方法为：将离子液体溶解于pH=7.4的PBS缓冲溶液中，并加入所述交联氯过氧化物酶后的多孔碳纳米碗，分散均匀，使所得分散液中离子液体的体积浓度为5%～20%、交联氯过氧化物酶后的多孔碳纳米碗的浓度为1.0～5.0mg·mL-1；然后将所得分散液滴加到预处理后的玻碳电极上，在室温下晾干。
2.根据权利要求1所述的相转变溶菌酶修饰的碳纳米碗共价固定化CPO生物传感器，其特征在于所述相转变溶菌酶溶液的制备方法为：将溶菌酶溶于pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液中，配制成1～10mg·mL-1的溶菌酶溶液；将三(2-羧乙基)膦溶于pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液中，配制成20～100mmol·L-1的三(2-羧乙基)膦溶液，并用5mol·L-1的NaOH水溶液调节其pH=4.0～6.0；然后将溶菌酶溶液与pH=4.0～6.0的三(2-羧乙基)膦溶液按体积比为1:1混合，得到相转变溶菌酶溶液。
3.根据权利要求2所述的相转变溶菌酶修饰的碳纳米碗共价固定化CPO生物传感器，其特征在于：所述多孔碳纳米碗与溶菌酶的质量比为1:3～10。
4.根据权利要求1所述的相转变溶菌酶修饰的碳纳米碗共价固定化CPO生物传感器，其特征在于：所述表面修饰相转变溶菌酶的多孔碳纳米碗与戊二醛、氯过 氧化物酶的用量比为1g:5～20g:100～300U。
5.根据权利要求1所述的相转变溶菌酶修饰的碳纳米碗共价固定化CPO生物传感器，其特征在于：所述氯过氧化物酶溶液中氯过氧化物酶的浓度为500～3000U·L-1，其采用pH=3.0～5.5的PBS缓冲溶液配制。
6.根据权利要求1所述的相转变溶菌酶修饰的碳纳米碗共价固定化CPO生物传感器，其特征在于：所述的离子液体为溴化1-乙基-3-甲基咪唑离子液体、溴化1-辛基-3-甲基咪唑离子液体、溴化1-癸基-3-甲基咪唑离子液体、氯化1-辛基-3-甲基咪唑离子液体中的任意一种。
7.权利要求1所述的相转变溶菌酶修饰的碳纳米碗共价固定化CPO生物传感器在电化学检测三氯乙酸中的应用。
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