CN110095438A - 一种光磁效应实时检测病毒dna浓度的装置及方法 - Google Patents

一种光磁效应实时检测病毒dna浓度的装置及方法 Download PDF

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Abstract

本发明是一种光磁效应实时检测病毒DNA浓度的装置及方法，包括光电单元、励磁单元、LAMP反应单元和数据处理单元；所述光电单元包括激光器、光电探测器；所述LAMP反应单元包括密闭的透光容器，透光容器上端装有输液管，输液管另一端装有自动输液装置，透光容器底面装有恒温加热器；激光器发射的光束穿过透光容器后被光电探测器接收，光束方向与磁场方向垂直；所述数据处理单元包括与光电探测器连接的数据采集器和装有处理软件的计算机，计算机与交流电源连接，所述处理软件控制交流电源的输出频率，光电探测器将光信号转为电信号输出到数据采集器再通过处理软件处理后输出并实时记录在计算机内；本发明检测速度快、精度高，有效避免假阳性问题。

Description

一种光磁效应实时检测病毒DNA浓度的装置及方法
技术领域
本发明涉及一种利用光磁效应检测病毒DNA浓度的技术领域，具体是一种光磁效应实时检测病毒DNA浓度的装置及方法。
背景技术
2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，即环介导等温扩增技术LAMP(Loop-mediated isothermalamplification)，受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注。短短几年，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中。在2009年甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学株式会社接受WHO的邀请完成了H1N1环介导等温扩增法检测试剂盒的研制，通过早期快速诊断对防止该病症的快速蔓延起到积极作用。
目前国内基因诊断常采用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)方法，这种方法是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，涉及到专用的PCR设备。国内条件比较好的实验室可采用荧光定量PCR方法，该方法技术含量高，必须使用荧光定量PCR仪，价格比较昂贵，通常会达到20～70万人民币。
LAMP与以往的核酸扩增方法相比，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，甚至只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行，不需要特殊的试剂及仪器。该扩增方法快速高效，不需要预先对双链DNA热变性，避免了温度循环而造成的时间损失。核酸扩增在1小时内可完成，添加环状引物后时间还可以节省一半，产物可以扩增至109倍。由于LAMP扩增是链置换合成，不能进行长链DNA的扩增。而且由于灵敏度高，极易受到污染而产生假阳性结果。在研发过程中由于涉及引物的选择，引物浓度的调整，及反应温度和时间的优化，需要用一种量化的方式去帮助研究者分析选择数据。因此，在很多微生物反应条件下，需要定量检测扩增后DNA的浓度。
为了准确检测反应DNA浓度，人们发明了非接触式的场效应(Field Effect)传感器、巨磁阻(GMR)传感器、表面增强拉曼光谱(SERS)传感器等。这些传感器一般基于液体表面，即实际测量值为反应液体表面的浓度。但是，LAMP扩增后的产物到表面时间受到液体分子扩散运动的限制，获得精确测量数据可能需要几十分钟到几个小时。因此，这些检测方法实用性并不强。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述现有针对LAMP反应物浓度检测存在的问题提供一种快速、准确DNA浓度的传感装置，具体是一种光磁效应实时检测病毒DNA浓度的装置及方法。
本发明的具体方案是：一种光磁效应实时检测病毒DNA浓度的装置，包括光电单元、励磁单元、LAMP反应单元和数据处理单元；所述光电单元包括激光器、光电探测器；所述励磁单元包括交流电源和分别与交流电源连接的一对电磁线圈；所述LAMP反应单元包括密闭的透光容器，透光容器上端装有输液管，输液管另一端装有自动输液装置，透光容器底面装有恒温加热器用于给容器内液体加热至恒定温度；所述一对电磁线圈设置在透光容器的左右两侧，所述激光器位于透光容器的前侧，所述光电探测器位于透光容器的后侧，激光器发射的光束穿过透光容器后被光电探测器接收，光束方向与磁场方向垂直；所述数据处理单元包括与光电探测器连接的数据采集器和装有处理软件的计算机，计算机与交流电源连接，所述处理软件控制交流电源的输出频率，光电探测器将光信号转为电信号输出到数据采集器再通过处理软件处理后输出二次谐波电压值并实时记录在计算机内。
本发明所述透光容器底部设有排液管，排液管底端连接一收集瓶，排液管上装有止液阀。
本发明所述激光器输出波长400-420nm，功率100-150mW，所述光电探测器的探测波长350nm-1100nm，带宽为10MHz，激光器与光电探测器之间的距离为110-120mm。
本发明所述透光容器是比色皿，比色皿顶端装有密封帽，所述输液管穿过密封帽伸入比色皿内，比色皿的透射波长范围190nm-2500nm，光程长度10mm。
本发明所述所述自动输液装置是自动泵注射器。
本发明所述电磁线圈之间的距离为20mm，磁感应强度为16mT，所述透光容器置于两电磁线圈的中间。
本发明所述激光器、电磁线圈、透光容器和光电探测器的外侧设置有一遮光盒以确保检测过程不受其他光源的干扰。
本发明采用上述装置检测病毒DNA浓度的方法包括以下步骤：1)、将LAMP反应的预反应溶液与直径50nm磁纳米颗粒溶液混合后放入自动输液装置中，关闭止液阀；2)、设置参数，将混合物按照一定速率沿着输液管输入到透光容器中，使恒温加热器将温度控制在65℃；3)、温度达到设定值后，使激光器、光电探测器、电磁线圈和数据处理器开始工作，当数据处理器检测到二次谐波电压值达到最大值后即完成检测，打开止液阀排出反应溶液到收集瓶内。
本发明的工作原理如下：在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与LAMP反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀；本发明以纳米或微米级的磁性颗粒为载体，利用结合于磁性颗粒表面所提供的特异的亲和特性，加上磁场的定向控制，通过亲和吸附，LAMP的反应物焦磷酸镁沉淀与磁纳米颗粒可以紧密结合。
光磁测量原理基于磁性纳米颗粒的旋转动力学和动态光散射理论。当对磁纳米颗粒以一定频率施加交流正弦磁场时，磁性纳米颗粒具有剩余磁矩。颗粒跟随磁场取向旋转，形成链状结构。在磁场方向反转时的主要弛豫机制是颗粒的物理旋转，这也称为布朗弛豫。布朗松弛动力学的特征频率是
其中kBT是热能，η是动态粘度，Vh是弛豫实体的流体动力学体积(例如，单个磁性纳米颗粒)。动态磁性能可以分别用实部和虚部和磁化率来描述。在低频率下，磁性纳米颗粒能够旋转并跟随磁场，并且响应与施加的场同相，达到最大值。在较高频率下，磁性纳米颗粒的旋转开始滞后于施加的场。这导致异相分量的增加和同相分量的相应减少，异相分量在布朗弛豫频率fB处达到其最大值。当以频率f施加AC正弦磁场时，磁性纳米颗粒在物理上旋转以跟随磁场取向并且还可以形成链状结构。在磁场方向反转时，磁性纳米颗粒链将由于热搅动而倾向于破裂，并且因为磁扭矩作用在各个磁性纳米颗粒上。各个颗粒(不规则形状)的旋转、磁性纳米颗粒链的形成或破坏可以调制透射光强度。在两种情况下，动力学由各个颗粒的旋转行为决定，其遵循布朗松弛动力学。响应磁场激发磁感应强度B(t)＝B0sin(2πft)的透射光的时间依赖性强度可写为
V(t)＝V0+VACsin2(2πft-φ)
其中是响应相对于磁场激励的相位滞后。正值意味着当磁场大时透射光的强度更大，负值意味着对于磁场大时传输光的强度较低。由于方程式中的平方依赖性，差模信号放大时使用频率锁定技术，可能观察不到一次谐波信号，而应考虑二次谐波信号。具有同相分量和异相分量的复杂二次谐波信号可以分别计算为
根据进一步的推导，光磁响应可以与复磁化率响应函数χ＝χ′-iχ″＝|χ|(cosφ-isinφ)关联为
其中VAC(0)是VAC当f→0的值，我们定义χ0为f→0时纳米磁颗粒的磁化率。
磁微粒的旋转行为遵循布朗动力学原理，单个颗粒的形状、旋转弛豫时间将对透射光强度进行调制。这样，在光电探测器端，通过计算机对调制的光电信号进行解调，使用快速傅里叶变换(FFT)锁定技术，根据二次谐波电压信号得出光强信号的相位变化情况，可以计算出磁性纳米颗粒混合物浓度。由于磁纳米颗粒均匀粘附在LAMP反应物上，通过磁性纳米颗粒浓度与反应物浓度的线性关系，即可计算LAMP反应物浓度的具体变化量，根据LAMP反应物浓度即可计算出病毒DNA的浓度。
本发明具有以下有益效果：1、相比传统测量方式成本更低，精度高，时间短，性能稳定，主要用于测量环介导等温扩增(LAMP)反应中靶DNA浓度，能够有效帮助研究者分析选择数据，从而获得针对某个病毒检测DNA扩增方案中引物的选择，引物浓度的调整，及反应温度和时间的优化参数；2、LAMP反应灵敏度高，一旦与外界空气接触，容易形成气溶胶污染，而目前国内大多数实验室不能严格分区，假阳性问题比较严重；本发明采用纳米磁颗粒作为载体，采用光磁法进行实施测量，安全准确。同时反应过程和测量过程都在封闭的透光容器中进行，隔绝空气污染，可以有效防止假阳性问题。
附图说明
图1是本发明检测装置的结构示意图；
图2是本发明50nm纳米磁颗粒与LAMP反应物结合后的扫描电子显微镜图；
图3是本发明二次谐波电压与LAMP反应物浓度关系曲线图；
图4是本发明不同种类的病毒LAMP反应时间与二次谐波电压关系曲线图；
图中：1-计算机，2-数据采集器，3-交流电源，4-激光器，5-电磁线圈，6-透光容器，7-恒温加热器，8-止液阀，9-排液管，10-收集瓶，11-输液管，12-
自动输液装置，13-光电探测器。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“左”、“右”
“前”、“后”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“安装”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
参见图1，本实施例包括光电单元、励磁单元、LAMP反应单元和数据处理单元；所述光电单元包括激光器4、光电探测器13；所述励磁单元包括交流电源3和分别与交流电源3连接的一对电磁线圈5；所述LAMP反应单元包括密闭的透光容器6，透光容器6上端装有输液管11，输液管11另一端装有自动输液装置12，透光容器6底面装有恒温加热器7用于给容器内液体加热至恒定温度；所述一对电磁线圈5设置在透光容器6的左右两侧，所述激光器4位于透光容器6的前侧，所述光电探测器13位于透光容器6的后侧，激光器4发射的光束穿过透光容器6后被光电探测器13接收，光束方向与磁场方向垂直；所述数据处理单元包括与光电探测器13连接的数据采集器2和装有处理软件的计算机1，计算机1与交流电源3连接，所述处理软件控制交流电源3的输出频率，光电探测器13将光信号转为电信号输出到数据采集器2再通过处理软件处理后输出二次谐波电压值并实时记录在计算机1内，计算机1运行Windows操作系统，通过Labview软件开发测试系统控制交流电源3的输出，并分析数据采集器2获得的数据，输出相位比对结果，数据采集器2由美国National Instruments公司生产，型号为NI USB-6341，数据采集器2能够将光电探测器13信号从模拟量转换为数字量，然后在计算机1中通过快速傅里叶变换(FFT)的锁定功能对其光谱信号进行处理；计算机1与数据采集器2通过数据线相连；数据采集器2与交流电源3通过电源线相连，数据采集器2同时与光电探测器13通过数据线相连；交流电源3与计算机1通过数据线相连，交流电源3同时通过电源线与电磁线圈5、激光器4相连。
本实施例所述透光容器6底部设有排液管9，排液管9底端连接一收集瓶10，排液管9上装有止液阀8。
本实施例所述激光器4输出波长400-420nm(本实施例具体是405nm)，功率100-150mW(本实施例具体是100mW)，所述光电探测器13采用美国Thorlabs,Inc.公司生产的型号为PDA36A的硅基可变增益探测器，探测波长350nm-1100nm，带宽为10MHz，激光器4与光电探测器13之间的距离为110-120mm(本实施例具体是115mm)。
本实施例所述透光容器6是比色皿，比色皿顶端装有密封帽，所述输液管11穿过密封帽伸入比色皿内，比色皿的透射波长范围190nm-2500nm，光程长度10mm。
本实施例所述所述自动输液装置12是自动泵注射器，由美国New Era PumpSystems,Inc.公司生产，型号为NE-300Just Infusion。
本实施例所述电磁线圈5之间的距离为20mm，磁感应强度为16mT，所述透光容器6置于两电磁线圈5的中间。
本实施例所述激光器4、电磁线圈5、透光容器6和光电探测器13的外侧设置有一遮光盒以确保检测过程不受其他光源的干扰。
采用本实施例检测装置检测病毒DNA浓度的方法具体包括以下步骤：1)参照美国New England Biolabs公司典型LAMP反应模板(M0374)建议，将LAMP反应的引物和DNA靶基因(如猪瘟病毒DNA样本、口蹄疫病毒DNA样本等)、DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)等按照一定比例配置预反应溶液，然后与直径50nm磁纳米颗粒(25mg/ml,产品号104-00-501,德国Micromod Partikeltechnologie GmbH公司生产)溶液混合，置入自动泵注射器中，关闭止液阀8；2)设置参数，将混合物按照50μl/min速率沿着输液管11输入比色皿中，恒温加热器7温度控制在65℃；3)加热30分钟后，打开交流电源3、激光器4和光电探测器13，电磁线圈5开始工作，同时打开计算机1中的Labview软件和数据采集器2，计算机1控制电磁线圈电流方向和磁感应强度，并通过数据采集器2记录分析光电探测器13的数据；计算机1检测到二次谐波电压最大值后即检测完成，打开止液阀8，LAMP反应物将最终流入收集瓶10中，根据计算机1记录的二次谐波电压最大值即可计算出LAMP反应物的浓度，根据LAMP反应物的浓度即可计算出病毒DNA的浓度；
为了确保在所有频率下恒定的场幅和相位，首先需要校正电磁线圈的自感；为确保不受其他光源的干扰，在测量过程中，需要用黑盒覆盖激光器4，电磁线圈5，比色皿和光电探测器13；此外，激光器4、光电探测器13、电磁线圈5和比色皿支架需要安装在光学平台上，以减少来自振动的测量噪声。
上述详细说明是针对本发明可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。

Claims (8)

1.一种光磁效应实时检测病毒DNA浓度的装置，其特征是：包括光电单元、励磁单元、LAMP反应单元和数据处理单元；所述光电单元包括激光器、光电探测器；所述励磁单元包括交流电源和分别与交流电源连接的一对电磁线圈；所述LAMP反应单元包括密闭的透光容器，透光容器上端装有输液管，输液管另一端装有自动输液装置，透光容器底面装有恒温加热器用于给容器内液体加热至恒定温度；所述一对电磁线圈设置在透光容器的左右两侧，所述激光器位于透光容器的前侧，所述光电探测器位于透光容器的后侧，激光器发射的光束穿过透光容器后被光电探测器接收，光束方向与磁场方向垂直；所述数据处理单元包括与光电探测器连接的数据采集器和装有处理软件的计算机，计算机与交流电源连接，所述处理软件控制交流电源的输出频率，光电探测器将光信号转为电信号输出到数据采集器再通过处理软件处理后输出二次谐波电压值并实时记录在计算机内。
2.根据权利要求1所述的一种光磁效应实时检测病毒DNA浓度的装置，其特征是：所述透光容器底部设有排液管，排液管底端连接一收集瓶，排液管上装有止液阀。
3.根据权利要求1所述的一种光磁效应实时检测病毒DNA浓度的装置，其特征是：所述激光器输出波长400-420nm，功率100-150mW，所述光电探测器的探测波长350nm-1100nm，带宽为10 MHz，激光器与光电探测器之间的距离为110-120mm。
4.根据权利要求3所述的一种光磁效应实时检测病毒DNA浓度的装置，其特征是：所述透光容器是比色皿，比色皿顶端装有密封帽，所述输液管穿过密封帽伸入比色皿内，比色皿的透射波长范围190nm-2500nm，光程长度10mm。
5.根据权利要求1所述的一种光磁效应实时检测病毒DNA浓度的装置，其特征是：所述自动输液装置是自动泵注射器。
6.根据权利要求1所述的一种光磁效应实时检测病毒DNA浓度的装置，其特征是：所述电磁线圈之间的距离为20mm，磁感应强度为16mT，所述透光容器置于两电磁线圈的中间。
7.根据权利要求1所述的一种光磁效应实时检测病毒DNA浓度的装置，其特征是：所述激光器、电磁线圈、透光容器和光电探测器的外侧设置有一遮光盒以确保检测过程不受其他光源的干扰。
8.一种采用权利要求1-7任一项所述装置检测病毒DNA浓度的方法，其特征是：包括以下步骤：1)、将LAMP反应的预反应溶液与直径50nm磁纳米颗粒溶液混合后放入自动输液装置中，关闭止液阀；2)、设置参数，将混合物按照一定速率沿着输液管输入到透光容器中，使恒温加热器将温度控制在65℃；3)、温度达到设定值后，使激光器、光电探测器、电磁线圈和数据处理器开始工作，当数据处理器检测到二次谐波电压值达到最大值后即完成检测，打开止液阀排出反应溶液到收集瓶内。
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