CN110089519B - 一种微生物腐蚀抑制剂及其使用方法 - Google Patents

一种微生物腐蚀抑制剂及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明的一种微生物腐蚀抑制剂及其使用方法,抑制剂是浓度为50‑1000ppm的儿茶精水合物溶液。使用方法步骤为:配制儿茶精水合物溶质浓度为50‑1000ppm的儿茶精水合物溶液,向微生物腐蚀材料中投加抑制剂后,培养14天,完成腐蚀抑制,所述的微生物菌种浓度为104~107CFU mL‑1。采用本发明的儿茶精水合物,在50‑1000ppm较低浓度下对各类细菌发挥明显有效地抗菌、抗生物膜及抗腐蚀性能。此外,儿茶精水合物作为微生物抑制剂具有极低的毒性,可作为绿色环保型杀菌剂及腐蚀抑制剂。

Description

一种微生物腐蚀抑制剂及其使用方法
技术领域:
本发明属于技术领域,具体涉及一种微生物腐蚀抑制剂及其使用方法。
背景技术:
微生物腐蚀(Microbiologically influenced corrosion,MIC)是指微生物自身的生命活动及其代谢产物直接或间接地加速材料腐蚀的过程。据统计,中国的年腐蚀成本已高达2万多亿元,2014年我国的腐蚀成本约占当年GDP的3.34%。在各种腐蚀环境,尤其海洋环境中,材料表面生物膜的形成是导致微生物腐蚀的主要原因之一。生物膜下材料的物理化学环境发生改变,如溶解氧,离子浓度、pH值等,同时伴随着微生物对电化学反应的催化过程,最终导致材料的严重腐蚀。因此,在细菌附着的可逆阶段加以控制,抑制稳定存在的生物膜进一步形成是腐蚀与防治的切实有效的手段。
长期以来,杀菌剂被认为是可以有效杀死溶液中游离细菌,甚至附着细菌的有效物质。但长时间大量使用不仅使菌种产生极强的抗药性,并且对环境保护及生物健康造成极大的损害。近年来,研究者一直致力于寻找绿色环境友好型杀菌物质作为替代产品。
发明内容:
本发明的目的是克服上述现有技术存在的不足,提供一种微生物腐蚀抑制剂及其使用方法,本发明中的儿茶精水合物(catechin hydrate),可以从绿色植物中提取,为天然绿色无污染杀菌型物质。其不仅具有良好的抗菌的性能,抗生物膜性能,还具备优良的抗腐蚀性能,所以本发明中的微生物腐蚀抑制剂具有优良微生物腐蚀抑制能力。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种微生物腐蚀抑制剂,所述的抑制剂为儿茶精水合物溶液,所述的儿茶精水合物溶液中儿茶精水合物的浓度为50-1000ppm,所述的儿茶精水合物的化学式为:
Figure BDA0002053024040000011
所述的1ppm指该溶质占溶液总质量的百万分之一。
所述的微生物包括铜绿假单胞菌、硫酸盐还原菌、硝酸盐还原菌、产酸菌、产甲烷菌和铁氧化细菌。
所述的硫酸盐还原菌包括脱硫脱硫弧菌。
所述的硝酸盐还原菌地衣芽孢杆菌。
所述的产酸菌包括醋化醋杆菌。
所述的产甲烷菌包括马氏甲烷球菌。
所述的腐蚀材料包括Q235、X52、X80、304、304L、316、316L、2205和S32654等钢材料。
所述的微生物腐蚀抑制剂的使用方法,包括以下步骤:
步骤1,腐蚀抑制剂配制:
配制儿茶精水合物溶质浓度为50-1000ppm的儿茶精水合物溶液,作为抑制剂备用;
步骤2,抑制腐蚀:
向微生物腐蚀材料中投加抑制剂后,进行培养,培养时间为14天,完成腐蚀抑制,其中,所述的微生物菌种浓度为104~107CFU mL-1
所述的步骤1中,儿茶精水合物来自市场购买或由植物成分提取获得。
所述的步骤2中,另外取与步骤2同等微生物腐蚀材料,未添加任何微生物抑制剂,作为空白对照组,添加儿茶精水合物抑制剂溶液的作为实验组,将实验组与对照组同时培养14天后,经检测,实验组的微生物腐蚀材料表面生物膜厚度为对照组腐蚀材料表面生物膜厚度的0.2~0.9倍。
所述的步骤2中,抑制剂添加量以使微生物腐蚀材料完全浸入抑制剂为准。
所述的步骤2中,培养过程在37℃下进行。
所述的步骤2中,经检测,加入儿茶精水合物抑制剂溶液,微生物腐蚀材料的腐蚀抑制率为90.8%~99.8%。
本发明的有益效果:
儿茶精水合物是一种天然的黄烷-3-醇类物质,具有大量的优良性能,如抗氧化、抗炎及抗癌等生物特性,本发明通过研究,以更好地利用天然活性环保型杀菌物质进行抗菌、抗生物膜和抗腐蚀性,具有十分重要的意义。
儿茶精水合物在50-1000ppm较低浓度下对各类细菌发挥明显有效地抗菌、抗生物膜及抗腐蚀性能。此外,儿茶精水合物作为微生物抑制剂具有极低的毒性,可作为绿色环保型杀菌剂及腐蚀抑制剂。
具体实施方式:
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
以下结合实施例对本发明作进一步说明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的实验试剂,如无特殊说明,均为常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量实验,均设置三次重复实验,以避免实验错误。1ppm指该溶质占溶液总质量的百万分之一。
以下实施例将利用多种方法分别检测儿茶精水合物的抗菌、抗生物膜性能以及对金属腐蚀的抑制作用:
以下实施例中所采用的微生物抑制剂儿茶精水合物溶液配制过程为:通过市购儿茶精水合物(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA),与DMSO有机溶剂(纯度100%)混合,使儿茶精水合物完全溶于DMSO后,加入水,混合均匀,配制成浓度为50-1000ppm的儿茶精水合物溶液,该儿茶精水合物溶液中DMSO体积百分含量为2%;
以下实施例中所采用的腐蚀材料为304L不锈钢钢材样品(mass%):0.02C,1.11Si,1.36Mn,7.93Ni,18.95Cr,Fe为余量,钢材样品尺寸为:直径1cm,厚3mm;
首先将微生物抑制剂儿茶精水合物溶液,进行体外细胞毒性试验,对其毒性进行检测,使用浓度范围为15.6-1000ppm,使用细胞为MC3T3-E1细胞,结果显示,使用15.6-1000ppm的儿茶素二水化合物对MC3T3-E1细胞无毒。
实施例1
本实施例所述微生物为铜绿假单胞菌株(Pseudomonas aeruginosa):MCCC1A00099(厦门,中国);
本实施例中采用的培养基为2216E培养基,成分为:NaH2PO4 5.0g/L,Na2SO4 1.8g/L,CaCl2 0.55g/L,KCl 0.16g/L,Na2CO3 0.08g/L,KBr 0.034g/L,SrCl2 0.08g/L,SrBr20.022g/L,H3BO3 0.004g/L,NaSiO3 0.0024g/L,NaF 0.0016g/L,NH4NO3 0.008g/L,蛋白胨1.0g/L,柠檬酸铁0.1g/L,酵母提取物0.1g/L。
1.抗菌实验:
最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)是衡量抗菌性能的重要指标。本发明采用微量稀释法对儿茶精水合物的MIC和MBC的值进行测定。结果显示:儿茶精水合物对MC3T3-E1细胞无毒;儿茶精水合物对于104~107CFU mL-1铜绿假单胞菌菌液的最小抑菌浓度为50-200ppm,最小杀菌浓度为300-800ppm,其中:
儿茶精水合物对于104CFU mL-1铜绿假单胞菌菌液的最小抑菌浓度为50ppm;
儿茶精水合物对于107CFU mL-1铜绿假单胞菌菌液的最小抑菌浓度为200ppm;
儿茶精水合物对于104CFU mL-1铜绿假单胞菌菌液的最小杀菌浓度为300ppm;
儿茶精水合物对于107CFU mL-1铜绿假单胞菌菌液的最小杀菌浓度为800ppm;
2.抗生物膜性能实验:
将钢材样品(面积1cm2)放入106CFU mL-1铜绿假单胞菌菌液中,平行四组实验,各自培养三天,以待材料生物膜成熟完整后,取一组作为空白实验对照组,其余三组作为实验组分别加入最小抑菌浓度(125ppm)、二倍最小抑菌浓度(250ppm)、最小杀菌浓度(500ppm)的儿茶精水合物溶液,将四组继续分别培养120min,最后利用激光共聚焦显微镜观察四组生物膜情况。结果显示:实验组钢材表面随培养时间的增加,死亡的细菌数量增加,生物膜厚度分别为对照组(只含细菌)的0.8、0.4、0.2倍。
3.金属腐蚀抑制实验:
取钢材样品,将钢材样品进行冷镶后,作为电极,加入含有2倍最小抑菌浓度(250ppm)儿茶精水合物抑制剂溶液的106CFU mL-1菌液中,同时设置对照组,对照组为与实验组同种的电极放入不含儿茶精水合物抑制剂溶液的106CFU mL-1铜绿假单胞菌菌液中,实验组与对照组均培养14天,使用三电极体系,利用电化学工作站对儿茶精水合物的抗腐蚀性能进行检测,测试钢材在儿茶精水合物抑制剂溶液存在和不存在时的腐蚀电流密度,经检测icorr=6.65μA cm-2,i’corr=0.01μA cm-2。统计结果显示:加入儿茶精水合物抑制剂的溶液(250ppm),其腐蚀抑制率为99.8%(利用公式2计算)。
公式2:
Figure BDA0002053024040000041
其中,icorr和i’corr分别为钢材电极在儿茶精水合物抑制剂不存在和存在时的腐蚀电流密度。
实施例2
本实施例中的脱硫脱硫弧菌(中国普通微生物菌种保藏管理中心,CGMCC)。
本实施例中采用的培养基成分为:MgSO4 5g/L,Na3C6H5O7,12.5g/L,CaSO4 2.5g/L,NH4Cl 2.5g/L,K2HPO4 2.5g/L,NaC3H5O3 8.75g/L,酵母提取物2.5g/L,20mL 5%(wt%)(NH4)2Fe(SO4)2
1.抗菌实验:
最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)是衡量抗菌性能的重要指标。采用微量稀释法测定儿茶精水合物对脱硫脱硫弧菌的MIC和MBC的值进行测定。结果显示:儿茶精水合物对于104~107CFU mL-1脱硫脱硫弧菌菌液的最小抑菌浓度为100-300ppm,最小杀菌浓度为500-1000ppm,其中:
儿茶精水合物对于104CFU mL-1脱硫脱硫弧菌菌液的最小抑菌浓度为100ppm;
儿茶精水合物对于107CFU mL-1脱硫脱硫弧菌菌液的最小抑菌浓度为300ppm;
儿茶精水合物对于104CFU mL-1脱硫脱硫弧菌菌液的最小杀菌浓度为500ppm;
儿茶精水合物对于107CFU mL-1脱硫脱硫弧菌菌液的最小杀菌浓度为1000ppm;
2.抗生物膜性能实验:
将钢材样品(面积1cm2)放入106CFU mL-1脱硫脱硫弧菌菌液中,平行四组实验,各自培养三天,以待材料生物膜成熟完整后,取一组作为空白实验对照组,其余三组作为实验组,分别加入最小抑菌浓度(250ppm)、二倍最小抑菌浓度(500ppm)、最小杀菌浓度(1000ppm)的儿茶精水合物溶液,将四组继续分别培养120min,最后利用激光共聚焦显微镜观察生物膜情况。结果显示:实验组钢材表面随培养时间的增加,死亡的细菌数量增加,生物膜厚度分别为对照组(只含细菌)的0.9、0.5、0.2倍。
3.金属腐蚀抑制实验:
取钢材样品,将钢材样品进行冷镶后,作为电极,加入含有2倍最小抑菌浓度(500ppm)儿茶精水合物抑制剂溶液的106CFU mL-1脱硫脱硫弧菌菌液中,同时设置对照组,对照组为实验组同种的电极放入不含儿茶精水合物抑制剂溶液的106CFU mL-1脱硫脱硫弧菌菌液中,实验组与对照组均培养14天,使用三电极体系,利用电化学工作站对儿茶精水合物的抗腐蚀性能进行检测,测试钢材在儿茶精水合物抑制剂溶液存在和不存在时的腐蚀电流密度,经检测icorr=30.57μA cm-2,i’corr=1.23μA cm-2。统计结果显示:加入儿茶精水合物抑制剂的溶液,其腐蚀抑制率为95.9%(利用公式2计算)。
实施例3
本实施例中的地衣芽孢杆菌(中国普通微生物菌种保藏管理中心,CGMCC)。
本实施例中采用的基础培养基成分:蔗糖10g/L,K2HPO4 13.9g/L,K2HPO4 2.7g/L,NaCl 1g/L,酵母提取物1g/L,NaNO3 1g/L,MgSO4 0.25g/L.微量元素溶液10mL;微量元素溶液成分:MnCl2·4H2O 18mg/L,CoCl2·6H2O 27mg/L,H3BO3 5.0mg/L,CuCl2·2H2O 2.4mg/L,NaMoO4·2H2O 2.3mg/L,ZnCl2 1.9mg/L。
1.抗菌实验:
最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)是衡量抗菌性能的重要指标。采用微量稀释法测定儿茶精水合物对地衣芽孢杆菌的MIC和MBC的值进行测定。结果显示:儿茶精水合物对于104~107CFU mL-1地衣芽孢杆菌菌液的最小抑菌浓度为50-200ppm,最小杀菌浓度为300-800ppm,其中:
儿茶精水合物对于104CFU mL-1地衣芽孢杆菌菌液的最小抑菌浓度为50ppm;
儿茶精水合物对于107CFU mL-1地衣芽孢杆菌菌液的最小抑菌浓度为200ppm;
儿茶精水合物对于104CFU mL-1地衣芽孢杆菌菌液的最小杀菌浓度为300ppm;
儿茶精水合物对于107CFU mL-1地衣芽孢杆菌菌液的最小杀菌浓度为800ppm;
2.抗生物膜性能实验:
将钢材样品(面积1cm2)放入106CFU mL-1地衣芽孢杆菌菌液中,平行四组实验,各自培养三天,以待材料生物膜成熟完整后,取一组作为空白实验对照组,其余三组作为实验组,分别加入最小抑菌浓度(125ppm)、二倍最小抑菌浓度(250ppm)、最小杀菌浓度(500ppm)的儿茶精水合物溶液,将四组继续分别培养120min,最后利用激光共聚焦显微镜观察生物膜情况。结果显示:实验组钢材表面随培养时间的增加,死亡的细菌数量增加,生物膜厚度分别为对照组(只含细菌)的0.8、0.5、0.2倍。
3.金属腐蚀抑制实验:
取钢材样品,将钢材样品进行冷镶后,作为电极,加入含有2倍最小抑菌浓度(250ppm)儿茶精水合物抑制剂溶液的106CFU mL-1地衣芽孢杆菌菌液中,同时设置对照组,对照组为实验组同种的电极放入不含儿茶精水合物抑制剂溶液的106CFU mL-1地衣芽孢杆菌菌液中,实验组与对照组均培养14天,使用三电极体系,利用电化学工作站对儿茶精水合物的抗腐蚀性能进行检测,测试钢材在儿茶精水合物抑制剂溶液存在和不存在时的腐蚀电流密度,经检测icorr=2.68μA cm-2,i’corr=0.02μA cm-2。统计结果显示:加入儿茶精水合物抑制剂的溶液,其腐蚀抑制率为99.2%(利用公式2计算)。
实施例4
本实施例中的马氏甲烷球菌(中国普通微生物菌种保藏管理中心,CGMCC)。
本实施例中采用的基础培养基成分:KH2PO4 1.06g/L,NaHPO4·12H2O 4.34g/L,NaNO3 1.70g/L,K2SO4 0.34g/L,MgSO4·7H2O 0.074g/L,FeSO4·7H2O 0.024g/L,CuSO4·5H2O 1.25mg/L,酵母提取物5.0g/L,蛋白胨10g/L,NaCl 5.0g/L,微量元素溶液4mL;微量元素溶液成分:ZnSO4·7H2O 0.287mg/L,MnSO4·7H2O 0.223mg/L,H3BO3 0.062mg/L,NaMoO4·2H2O 0.048mg/L,CoCl2·6H2O 0.048mg/L,KI 0.083mg/L,CaCl2·2H2O 3.5mg/L。
1.抗菌实验:
最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)是衡量抗菌性能的重要指标。采用微量稀释法测定儿茶精水合物对马氏甲烷球菌的MIC和MBC的值进行测定。结果显示:儿茶精水合物对于104~107CFU mL-1马氏甲烷球菌菌液的最小抑菌浓度为50-200ppm,最小杀菌浓度为500-1000ppm,其中:
儿茶精水合物对于104CFU mL-1马氏甲烷球菌菌液的最小抑菌浓度为50ppm;
儿茶精水合物对于107CFU mL-1马氏甲烷球菌菌液的最小抑菌浓度为200ppm;
儿茶精水合物对于104CFU mL-1马氏甲烷球菌菌液的最小杀菌浓度为500ppm;
儿茶精水合物对于107CFU mL-1马氏甲烷球菌菌液的最小杀菌浓度为1000ppm;
2.抗生物膜性能实验:
将钢材样品(面积1cm2)放入106CFU mL-1马氏甲烷球菌菌液中,平行四组实验,各自培养三天,以待材料生物膜成熟完整后,取一组作为空白实验对照组,其余三组作为实验组,分别加入最小抑菌浓度(200ppm)、二倍最小抑菌浓度(400ppm)、最小杀菌浓度(800ppm)的儿茶精水合物溶液,将四组继续分别培养120min,最后利用激光共聚焦显微镜观察生物膜情况。结果显示:实验组钢材表面随培养时间的增加,死亡的细菌数量增加,生物膜厚度分别为对照组(只含细菌)的0.8、0.4、0.2倍。
3.金属腐蚀抑制实验:
取钢材样品,将钢材样品进行冷镶后,作为电极,加入含有2倍最小抑菌浓度(400ppm)儿茶精水合物抑制剂溶液的106CFU mL-1马氏甲烷球菌菌液中,同时设置对照组,对照组为实验组同种的电极放入不含儿茶精水合物抑制剂溶液的106CFU mL-1马氏甲烷球菌菌液中,实验组与对照组均培养14天,使用三电极体系,利用电化学工作站对儿茶精水合物的抗腐蚀性能进行检测,测试钢材在儿茶精水合物抑制剂溶液存在和不存在时的腐蚀电流密度,经检测icorr=3.15μA cm-2,i’corr=0.05μA cm-2。统计结果显示:加入儿茶精水合物抑制剂的溶液,其腐蚀抑制率为98.5%(利用公式2计算)。
实施例5
本实施例中的醋化醋杆菌(中国普通微生物菌种保藏管理中心,CGMCC)。
本实施例中采用的基础培养基:葡萄糖40g/L,酵母提取物5.0g/L,KH2PO4 1.0g/L,(NH4)2SO4 3.3g/L,MgSO4·7H2O 0.25g/L,微量元素溶液1.0mL;微量元素溶液成分:CuSO4·5H2O 0.078mg/L,MnSO4H2O 1.01mg/L,ZnSO4·7H2O 1.78mg/L,Na2MoO4·2H2O 0.234mg/L,FeSO4·7H2O 3.66mg/L,CaCl2·2H2O 14.57mg/L。
1.抗菌实验:
最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)是衡量抗菌性能的重要指标。采用微量稀释法测定儿茶精水合物对醋化醋杆菌的MIC和MBC的值进行测定。结果显示:儿茶精水合物对于104~107CFU mL-1醋化醋杆菌菌液的最小抑菌浓度为50-200ppm,最小杀菌浓度为300-1000ppm,其中:
儿茶精水合物对于104CFU mL-1醋化醋杆菌菌液的最小抑菌浓度为50ppm;
儿茶精水合物对于107CFU mL-1醋化醋杆菌菌液的最小抑菌浓度为200ppm;
儿茶精水合物对于104CFU mL-1醋化醋杆菌菌液的最小杀菌浓度为300ppm;
儿茶精水合物对于107CFU mL-1醋化醋杆菌菌液的最小杀菌浓度为1000ppm;
2.抗生物膜性能实验:
将钢材样品(面积1cm2)放入106CFU mL-1醋化醋杆菌菌液中,平行四组实验,各自培养三天,以待材料生物膜成熟完整后,取一组作为空白实验对照组,其余三组作为实验组,分别加入最小抑菌浓度(200ppm)、二倍最小抑菌浓度(400ppm)、最小杀菌浓度(800ppm)的儿茶精水合物溶液,将四组继续分别培养120min,最后利用激光共聚焦显微镜观察生物膜情况。结果显示:实验组钢材表面随培养时间的增加,死亡的细菌数量增加,生物膜厚度分别为对照组(只含细菌)的0.8、0.5、0.3倍。
3.金属腐蚀抑制实验:
取钢材样品,将钢材样品进行冷镶后,作为电极,加入含有2倍最小抑菌浓度(400ppm)儿茶精水合物抑制剂溶液的106CFU mL-1醋化醋杆菌菌液中,同时设置对照组,对照组为实验组同种的电极放入不含儿茶精水合物抑制剂溶液的106CFU mL-1醋化醋杆菌菌液中,实验组与对照组均培养14天,使用三电极体系,利用电化学工作站对儿茶精水合物的抗腐蚀性能进行检测,测试钢材在儿茶精水合物抑制剂溶液存在和不存在时的腐蚀电流密度,经检测icorr=3.24μA cm-2,i’corr=0.3μA cm-2。统计结果显示:加入儿茶精水合物抑制剂的溶液,其腐蚀抑制率为90.8%(利用公式2计算)。

Claims (2)

1.一种微生物腐蚀抑制剂的使用方法,其特征在于,所述的抑制剂适用于微生物为铜绿假单胞菌,所述的抑制剂为儿茶精水合物溶液,所述的儿茶精水合物溶液中儿茶精水合物的浓度为50~500ppm,所述抑制剂用于降低金属表面已经形成的生物膜的厚度,所述抑制剂用于抑制微生物对金属的腐蚀,所述金属为304L钢材料,所述的儿茶精水合物的化学式为:
Figure FFW0000022898560000011
所述的使用方法包括以下步骤:
步骤1,腐蚀抑制剂配制:
配制儿茶精水合物溶质浓度为50~500ppm的儿茶精水合物溶液,作为抑制剂备用;
步骤2,抑制腐蚀:
向铜绿假单胞菌菌液腐蚀304L钢材料中投加抑制剂后,进行培养,培养时间为14天,完成腐蚀抑制,其中,所述的铜绿假单胞菌菌液浓度为104~107CFU mL-1,经检测,加入儿茶精水合物抑制剂溶液,微生物腐蚀材料的腐蚀抑制率为99.8%,儿茶精水合物对于104~107CFU mL-1铜绿假单胞菌菌液的最小抑菌浓度为50~200ppm,最小杀菌浓度为300~800ppm;另外取与步骤2同等微生物腐蚀材料,未添加任何微生物抑制剂,作为空白对照组,添加儿茶精水合物抑制剂溶液的作为实验组,将实验组与对照组同时培养14天后,经检测,实验组的微生物腐蚀材料表面生物膜厚度为对照组腐蚀材料表面生物膜厚度的0.2~0.9倍。
2.根据权利要求1所述的微生物腐蚀抑制剂的使用方法,其特征在于,所述的步骤2中,培养过程在37℃下进行。
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