CN110063364A - 一种植物免疫诱抗剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种植物免疫诱抗剂及其应用，该植物免疫诱抗剂的有效成分包括2‑氨基‑3,5‑二氯苯甲酸、磺胺氯哒嗪和壳聚糖。由此，在采后柑橘中使用上述成分的植物免疫诱抗剂，可诱导采后柑橘免疫青霉病的发生，有效地抑制青霉病对于采后柑橘品质的破坏作用，延长采后柑橘的防腐保鲜期；且该植物免疫诱抗剂无毒无公害，可直接作用于采后柑橘上，无农药残留；也可有效防治采后芒果炭疽病。
Description
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，具体涉及一种植物免疫诱抗剂及其应用。
背景技术
柑橘青霉病是采后柑橘在贮藏和运输阶段中最有危害性和发生频率最高的病害，其病原是Penicillium italicum Wehmer；属于子囊菌亚门，不整囊菌纲，散囊菌目，散囊菌科，青霉属。该病经伤口侵入柑橘果实，或通过病健果接触而感染，会导致大量烂果。该病传染性极高，在全世界范围内频繁的发生，每年有大约20％的柑橘感染青霉病而给水果生产基地和销售企业带来巨大损失。
为了抑制柑橘青霉病的巨大破坏力，人们使用以杀菌为作用原理的化学农药，如多菌灵、甲基托布津、噻苯达唑、苯甲酰等苯并咪唑类化学药品以及咪鲜胺、伊马唑等咪唑类药物，这些农药大量长期使用会影响人体健康和危害环境，同时也使得青霉病菌耐药性增强。更为重要的是这些农药无法作为采后柑橘的防腐保鲜剂大量使用，原因在于喷施到柑橘后很难通过有效手段洗涤去除，导致柑橘含有过多的农药残留。况且，国家近期对于化学保鲜剂的使用量和残留量做了严格的限制(食品安全国家标准食品中农药最大残留限量，GB 2763-2016)，减少了这类杀菌保鲜剂的使用，但同时也加剧了采后柑橘青霉病的爆发。而如果使用常用的物理方法，例如低温冷藏保鲜和热处理保鲜方法需要消耗大量的能源和设备，运输不便，气调保鲜和包装保鲜则需要专门耗费CO2和包装材料，大大提高了柑橘的生产和销售成本。
因此寻找无毒、节能、环保的方法防治采后柑橘青霉病对于提高我国食品安全，减少柑橘相关企业成本，延长柑橘防腐保鲜期有着重要意义。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本发明的第一个目的在于提出一种植物免疫诱抗剂，该植物免疫诱抗剂可有效防治采后柑橘青霉病，延长采后柑橘的防腐保鲜期，也可有效防治采后芒果炭疽病。
本发明的第二个目的在于提出一种植物免疫诱抗剂的应用。
在本发明的第一方面中，本发明提出了一种植物免疫诱抗剂，其有效成分包括：2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、磺胺氯哒嗪和壳聚糖。由此，通过三个植物免疫激发子分别开启了柑橘表皮细胞的不同免疫信号转导途径，在采后柑橘中同时使用上述成分的植物免疫诱抗剂，会加强柑橘表皮细胞免疫信号，最大程度激发柑橘表皮免疫病害能力，可诱导采后柑橘免疫青霉病的发生，有效地抑制青霉病对于采后柑橘品质的破坏作用，延长采后柑橘的防腐保鲜期；且2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、磺胺氯哒嗪和壳聚糖均是植物免疫激发子，经鉴定，该植物免疫诱抗剂在大鼠急性经口毒性和大鼠急性经皮毒性LD50均大于5000mg/kg，无毒无公害，可直接作用于采后柑橘上，无农药残留；也可有效防治采后芒果炭疽病。
另外，根据本发明上述实施例提出的一种植物免疫诱抗剂，还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明实施例，按重量百分数计，有效成分包括0.002～0.004％的2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、0.002～0.004％的磺胺氯哒嗪和0.1～0.3％的壳聚糖。
根据本发明实施例，按重量百分数计，有效成分包括0.003％的2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、0.002％的磺胺氯哒嗪和0.3％的壳聚糖。
根据本发明实施例，按重量百分数计，还包括0.005％的印楝素、0.09％的平平加O和0.1％的茶籽粉。
根据本发明实施例，所述植物免疫诱抗剂通过以下步骤制备的：
将所述2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、磺胺氯哒嗪、壳聚糖、印楝素、平平加O和茶籽粉混合，并通过颗粒机制成颗粒，装袋，以便获得所述植物免疫诱抗剂。
根据本发明实施例，所述颗粒呈直径为3mm，高度为5mm的柱状结构。
根据本发明实施例，所述植物免疫诱抗剂通过以下步骤制备的：
将所述2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、磺胺氯哒嗪、壳聚糖、印楝素、平平加O和茶籽粉溶解在水中，以便获得所述植物免疫诱抗剂。
在本发明的第二方面中，本发明提供了上述方案所述的植物免疫诱抗剂在防治采后柑橘青霉病中的应用。由此，通过植物免疫诱抗剂可有效防治采后柑橘青霉病，延长采后柑橘的防腐保鲜期，也可有效防治采后芒果炭疽病。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明：
图1为本发明实施例的PCR扩增鉴定图；
图2为本发明实施例的30种植物免疫激发子施用于采后柑橘的效果图；
图3为本发明实施例的9种植物免疫激发子和印楝素对青霉菌落的影响；
图4为本发明实施例的9种植物免疫激发子和印楝素施用于采后柑橘上，并接种柑橘青霉病病菌五天的可滴定酸含量；
图5为本发明实施例的9种植物免疫激发子和印楝素施用于采后柑橘上，并接种柑橘青霉病病菌五天维生素C含量；
图6为本发明实施例的效果图。
具体实施方式
为了更好的理解上述技术方案，下面将更详细地描述本发明的示例性实施例，应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明通过建立植物免疫激发子库，筛选了大量植物免疫激发子，其中包括了水杨酸类、亚胺培林类、磺胺类、己二酸类、茉莉酸类、多胺类、多糖类以及病原微生物的病程相关诱发物等有机类激发子，同时还包括了钙、硫氢化钠、一氧化氮供体和过氧化氢等无机类激发子。最终提出了一种植物免疫诱抗剂，其有效成分包括：2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、磺胺氯哒嗪和壳聚糖。具体而言，按重量百分数计，有效成分包括0.002～0.004％的2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、0.002～0.004％的磺胺氯哒嗪和0.1～0.3％的壳聚糖。优选地，按重量百分数计，有效成分包括0.003％的2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、0.002％的磺胺氯哒嗪和0.3％的壳聚糖。由此，在采后柑橘中使用上述成分的植物免疫诱抗剂，并控制其含量，可诱导采后柑橘免疫青霉病的发生，有效地抑制青霉病对于采后柑橘品质的破坏作用，延长采后柑橘的防腐保鲜期；且2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、磺胺氯哒嗪和壳聚糖均是植物免疫激发子，经鉴定，该植物免疫诱抗剂在大鼠急性经口毒性和大鼠急性经皮毒性LD50均大于5000mg/kg，无毒无公害，可直接作用于采后柑橘上，无农药残留，也可有效防治采后芒果炭疽病。
另外，通过在上述有效成中加入0.005％的印楝素、0.09％的平平加O和0.1％的茶籽粉，作为辅助成分；由此，通过印楝素抑制虫害对植物免疫诱抗剂作用区域的破坏而引起的感染，通过平平加O作为侵染剂有利于植物免疫激发子的附着，并且通过茶籽粉作为辅助成分用于洗去水果潜在农残提高水果品质；使得植物免疫诱抗剂与印楝素、平平加O和茶籽粉在防治采后柑橘青霉病中协同增效的起作用。
其中，该植物免疫诱抗剂可通过以下步骤制备：将所述2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、磺胺氯哒嗪、壳聚糖、印楝素、平平加O和茶籽粉混合，并通过颗粒机制成呈直径为3mm，高度为5mm的柱状结构的颗粒，装袋，以便获得所述植物免疫诱抗剂。也可以直接将所述2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、磺胺氯哒嗪、壳聚糖、印楝素、平平加O和茶籽粉溶解在水中，以便获得所述植物免疫诱抗剂。
需要说明的是，2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、磺胺氯哒嗪、壳聚糖、印楝素、平平加O和茶籽粉均来源于市售的高纯度商业化药品。
实施例1植物免疫激发子的筛选
分离并通过PCR扩增18S rDNA序列鉴定了采后柑橘的青霉病病原，证实分离出的病菌为青霉属真菌，结果如图1所示，分离严重感染青霉病特征的柑橘组织块到土豆培养基进行培养，经过多次继代纯化以后，在培养板上分离到了单株病原。通过PCR扩增病原18SrDNA后获得大约1500个碱基片段，并通过测序获得了这些碱基序列。再经过NCBI数据库的比对证实分离到的病菌为青霉属真菌。
筛选植物免疫激发子，其中包括苯并噻二唑、激活蛋白、壳聚糖、磺胺氯哒嗪、2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、间氯苯甲酸、水杨酸、水杨酸甲酯、Flg22、海水、海带多糖、磺胺嘧啶、草酸、茉莉酸甲酯、5-氯水杨酸、壳寡糖、2-氯基异丁酸、3,5-二氯水杨酸、4-氯水杨酸、香菇多糖、磺胺吡啶、茉莉酸、磺胺苯甲酰、DL-3-氨基丁酸、磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲恶唑、超敏蛋白等。在常温下施用这些植物免疫激发子至采后柑橘上后，接种分离到的柑橘青霉病到植物免疫激发子免疫后的柑橘上；结果如图2所示，其中，图中的数值代表感染率；经过7天的接种观察后发现，壳聚糖、磺胺氯哒嗪、2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、间氯苯甲酸、Flg22、香菇多糖、磺胺吡啶、DL-3-氨基丁酸和磺胺-5-甲氧嘧啶的九种植物免疫激发子施用后使柑橘青霉病发生率降低到50％以下，说明它们可以诱导采后柑橘免疫青霉病的发生。
进一步地，将3g/L壳聚糖、20mg/L磺胺氯哒嗪、30mg/L 2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、20mg/L间氯苯甲酸、30mg/L Flg22、3g/L香菇多糖、20mg/L磺胺吡啶、1g/L DL-3-氨基丁酸和20mg/L磺胺-5-甲氧嘧啶的九种植物免疫激发子以及驱虫剂印楝素分别加入柑橘青霉病病菌接种的培养基中，观察其对柑橘青霉病病菌的生长有何影响。结果如图3所示，2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、印楝素、Flg22、磺胺氯哒嗪和磺胺吡啶对柑橘青霉病病菌无抑制病菌生长的作用，因此它们主要以诱导采后柑橘产生青霉病的免疫为机理。
为了进一步研究这九种不同植物免疫激发子和驱虫作用的印楝素对于采后柑橘品质的影响，在常温下按照上述浓度施用这些植物免疫激发子以及50mg/L印楝素至采后柑橘上后，接种分离到的柑橘青霉病到植物免疫激发子免疫后的柑橘上，测量柑橘青霉病病菌接种后五天的可滴定酸和维生素C(VC)的含量，借此衡量植物免疫激发子对于维护采后柑橘的品质的作用。结果如图4和图5所示，2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、磺胺氯哒嗪和壳聚糖可以有效抑制柑橘青霉病对于采后柑橘品质的破坏作用。
最后，确定以2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、磺胺氯哒嗪和壳聚糖作为主要的有效成分的采后柑橘青霉病免疫植物免疫激发子。
实施例2植物免疫诱抗剂中各成分含量的确定
在常温下，分别将20mg/L、30mg/L、40mg/L的2-氨基-3,5-二氯苯甲酸和30mg/L的2-氨基-3,5-二氯苯甲酸加填料施用于采后柑橘上，进行免疫，再将分离到的柑橘青霉病接种在免疫的柑橘上，设置对照是没有施用植物免疫激发子和无病菌侵染的柑橘。
在常温下，分别将0mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L的磺胺氯哒嗪和30mg/L的磺胺氯哒嗪加填料施用于采后柑橘上，进行免疫，再将分离到的柑橘青霉病接种在免疫的柑橘上，设置对照是没有施用植物免疫激发子，有病菌侵染的柑橘。
在常温下，分别将0mg/L、1g/L、2g/L、3g/L的壳聚糖和2g/L的壳聚糖加填料施用于采后柑橘上，进行免疫，再将分离到的柑橘青霉病接种在免疫的柑橘上；设置对照是用填料施用于柑橘和有病菌侵染的柑橘。
在常温下，分别将A配方、B配方、C配方、D配方以及E配方施用于采后柑橘上，进行免疫，再将分离到的柑橘青霉病接种在免疫的柑橘上。其中，A配方是30mg/L的2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、20mg/L的磺胺氯哒嗪和填料；B配方是30mg/L的2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、3g/L的壳聚糖和填料；C配方是20mg/L的磺胺氯哒嗪、3g/L的壳聚糖和填料；D配方是30mg/L的2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、20mg/L的磺胺氯哒嗪、3g/L的壳聚糖和填料；E配方是30mg/L的2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、20mg/L的磺胺氯哒嗪和3g/L的壳聚糖。
其中，上述的填料是0.05g/L的印楝素、0.9g/L的平平加O和1g/L的茶籽粉。
经过单一植物免疫激发子以及多植物免疫激发子浓度的研究，结果如图6所示，经过7天的青霉病接种观察后发现，以10L水中含有2-氨基-3,5-二氯苯甲酸0.3g、磺胺氯哒嗪0.2g、壳聚糖30g、印楝素0.5g、平平加O 9g和茶籽粉10g的配比形成的植物免疫诱抗剂能最大程度的抑制采后柑橘青霉病发生，在常温下青霉病侵染后7天达到发病率最低。
另外，将10L水中含有2-氨基-3,5-二氯苯甲酸0.3g、磺胺氯哒嗪0.2g、壳聚糖30g、印楝素0.5g、平平加O 9g和茶籽粉10g的植物免疫诱抗剂配方经过专业检测机构鉴定，其大鼠急性经口毒性和大鼠急性经皮毒性LD50均大于5000mg/kg，属于实际无毒配方。
实施例3植物免疫诱抗剂与传统柑橘抗病保鲜手段比较
取2-氨基-3,5-二氯苯甲酸0.3g、磺胺氯哒嗪0.2g、壳聚糖30g、印楝素0.5g、平平加O 9g和茶籽粉10g的配比形成的植物免疫诱抗剂通过颗粒机制成柱状直径3毫米、高度5毫米的颗粒，通过包装机包装成一袋颗粒免疫诱抗剂，备用。
传统柑橘抗病保鲜手段采用低温13℃存储作为对比的传统物理抗病保鲜方式，并在常温环境选取了涂水果蜡、0.5g/L抑霉唑和0.5g/L甲基托布津处理作为用于对比的传统化学抗病保鲜方式；观察在接种了柑橘青霉病后，这些抗病保鲜方法在抑制病程发展中的效果。结果如表1所示，植物免疫诱抗剂防治效果优于打水果蜡的抗病保鲜方法，且与低温保鲜手段的效果持平。虽然植物免疫诱抗剂与杀菌为原理的抑霉唑和甲基托布津相比在抗病保鲜效果上略显不足，但是可以在节能的情况下充分延长柑橘的抗病保鲜贮运时间。
表1：
实施例4植物免疫诱抗剂与传统芒果抗病保鲜手段比较
取2-氨基-3,5-二氯苯甲酸0.3g、磺胺氯哒嗪0.2g、壳聚糖30g、印楝素0.5g、平平加O9g和茶籽粉10g的配比形成的植物免疫诱抗剂用10L水迅速溶解制成保鲜剂工作液，备用。
传统芒果抗病保鲜手段采用低温13℃存储作为对比的传统物理抗病保鲜方式，并在常温环境选取了涂水果蜡、0.5g/L抑霉唑和0.5g/L甲基托布津处理作为用于对比的传统化学抗病保鲜方式；观察在接种了芒果炭疽病后，这些抗病保鲜方法在抑制病程发展中的效果。结果如表2所示，植物免疫诱抗剂防治效果优于打水果蜡的抗病保鲜方法，且与低温保鲜手段的效果持平。虽然植物免疫诱抗剂与杀菌为原理的抑霉唑和甲基托布津相比在抗病保鲜效果上略显不足，但是可以在节能的情况下充分延长芒果的抗病保鲜贮运时间。
表2：
综上所述，本发明的植物免疫诱抗剂可有效防治采后柑橘青霉病，也可防治采后芒果炭疽病，延长采后柑橘、芒果等果实的防腐保鲜期，无毒无公害，方便直接施用于采后果实上且无农药残留。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (8)
1.一种植物免疫诱抗剂，其特征在于，有效成分包括：2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、磺胺氯哒嗪和壳聚糖。
2.如权利要求1所述的植物免疫诱抗剂，其特征在于，按重量百分数计，有效成分包括0.002~0.004%的2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、0.002~0.004%的磺胺氯哒嗪和0.1~0.3%的壳聚糖。
3.如权利要求2所述的植物免疫诱抗剂，其特征在于，按重量百分数计，有效成分包括0.003%的2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、0.002%的磺胺氯哒嗪和0.3%的壳聚糖。
4.如权利要求1所述的植物免疫诱抗剂，其特征在于，按重量百分数计，还包括0.005%的印楝素、0.09%的平平加O和0.1%的茶籽粉。
5.如权利要求3所述的植物免疫诱抗剂，其特征在于，所述植物免疫诱抗剂通过以下步骤制备的：
将所述2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、磺胺氯哒嗪、壳聚糖、印楝素、平平加O和茶籽粉混合，并通过颗粒机制成颗粒，装袋，以便获得所述植物免疫诱抗剂。
6.如权利要求4所述的植物免疫诱抗剂，其特征在于，所述颗粒呈直径为3mm，高度为5mm的柱状结构。
7.如权利要求3所述的植物免疫诱抗剂，其特征在于，所述植物免疫诱抗剂通过以下步骤制备的：
将所述2-氨基-3,5-二氯苯甲酸、磺胺氯哒嗪、壳聚糖、印楝素、平平加O和茶籽粉溶解在水中，以便获得所述植物免疫诱抗剂。
8.如权利要求1~7中任一项所述的植物免疫诱抗剂在防治采后柑橘青霉病中的应用。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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