CN110023278B - 用于生产百里香醌的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于在薄荷(Monarda)中生产百里香醌和/或麝香氢醌的方法，其通过以下进行：使薄荷(Monarda)生长伴随在新鲜植物组织中升高的水平的香荆芥酚和/或麝香草酚并且旺盛生长，收获所述薄荷(Monarda)，在存在氧气的情况下允许薄荷(Monarda)衰老以及从该衰老的组织提取百里香醌和/或麝香氢醌。

Description

用于生产百里香醌的方法
相关申请的引证
本申请是2016年11月10日提交的题目为“用于生产百里香醌的方法”的美国专利申请No.15/348,322的继续申请，以上专利申请的公开内容以其全部内容作为引证并入本文。
技术领域
本发明一般地涉及一种用于生产百里香醌的方法，并且更具体地涉及一种使生产香荆芥酚和/或麝香草酚(百里香酚，thymol)的植物，包括野蜂香薄荷(Monardafistulosa)生长以用于有效收获百里香醌精油的新方法。
背景技术
野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)(有时也称为香蜂草、薄荷茶(Oswego tea)、香柠檬或蜜蜂花)是唇形(薄荷)科家族。它是天然中西部大草原多年生植物种，其通过纤细的根茎并且通过种子增殖。它可以通过生根扦插体进行营养繁殖以从单株植物产生无性系。当在本文中使用术语“薄荷”时，应理解它也包括通过这些名称所知的植物，只要所述植物满足薄荷属的特征。
野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)常见于路边、草地、天然大草原保护点和林地边界，并且美洲土著人以及随后的开拓定居者高度赞扬其医学性质。
由于其医学性质，野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)在1850年代被引入药典。叶、茎和花全部作为药物使用，其中鉴别了超过17种生物活性分子，包括麝香草酚和香荆芥酚。作者Michael Wood(在他的书Herbal Wisdom中)以其本地名称之一“甜叶”将该物种描述为他的草药柜中最有价值的植物之一。
野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)在其叶及其它植物部分中积累麝香草酚和香荆芥酚的能力方面非常类似于牛至(Origanum vulgare)和百里香(麝香草(Thymusvulgaris))。自早至至少1907就已知野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)产生百里香醌(Wakeman,Pigments of Flowering Plants,Transactions of the Wisconsin Academyof Science,Arts and Letters,19卷,785-795页(1907))。
先前未知的是在叶或花的衰老期间，香荆芥酚和麝香草酚转化为百里香醌(TQ)，因此在死亡或将死组织中积累。百里香醌在新鲜组织中基本不积累。在死亡、将死或收获后组织中，存在用于百里香醌积累(从香荆芥酚和麝香草酚转化)的遗传变异，正如对于健康新鲜组织中香荆芥酚和麝香草酚的积累所进行的。因此，植物育种领域的任何技术人员可以从植物分离群体中选择积累高水平香荆芥酚或麝香草酚(或来自衰老组织的百里香醌)的植物以优化累积水平。
可以在均一控制或田间环境中播种和种植几百粒种子，并且一旦植物处于完全营养阶段，则可以采集叶片组织进行香荆芥酚和麝香草酚的植物化学分析。日长需要大于12小时且具有类似于完整日光的光强度，因为积累是日长和光强度驱动的。可以选择积累极端水平的香荆芥酚和麝香草酚(基于干物质，>3％)的群体(无性系)内的单个植株，并通过营养繁殖或者通过类似于其它作物的种子繁殖(扩大)。可以使用熟知的群选育种技术而改善野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)植物群体对于香荆芥酚和麝香草酚的积累，从而导致产生超积累这些分子的种子品种。
农艺学和田间作物生产领域的任何技术人员可以大面积种植多种改善的野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)，选择香荆芥酚或麝香草酚积累更高的植物，以产生使用熟知且经常实践的农艺学方法收获和提取的生物质。
1916年，S.C.Hood在USDA Bulletin 372中描述了从密切相关的物种(细斑香蜂草(Monarda punctata))中大规模生产麝香草酚的方法的早期实例。
可以优化种植密度以(a)减少杂草压力；和(b)优化单位面积的生物质积累。美国农业部自然资源保护处建议野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)的种植密度为3.6lbs每英亩。此外，在1916年发表的研究中，推荐种植密度使得常规耕种法产生遮蔽地面的植物，并因此防止杂草生长(1916，USDA Bulletin 372，同前)。
蒸汽蒸馏领域的那些技术人员可以产生野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)精油，其来自新鲜收获的生物质的香荆芥酚或麝香草酚的含量较高；或者来自正在衰老或衰老的生物质的百里香醌水平不断增加。蒸汽蒸馏，然后进行后续油剂倾析是经常用于产生精油的方法。使用该方法从牛至产生了香荆芥酚和麝香草酚油。
野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)独特的超积累香荆芥酚和/或麝香草酚的无性系代表了通过育种和选择所获得的等位基因的最佳集合。
野生香柠檬(野蜂香薄荷(Monarda fistulosa L.))是薄荷(唇形)科中的天然爱荷华州野花种，并且是百里香醌的潜在来源。百里香醌是作为洗发水及其它个人护理产品中用于控制头皮屑的官能分子使用的所关心的分子。百里香醌已知具有抗炎、抗微生物、抗氧化和免疫调节作用并且用于治疗皮疹、虫咬和太阳灼伤。它还显示具有显著的抗癌活性，香荆芥酚及其几何异构体麝香草酚可以氧化为百里香醌，其潜在商业价值显著高于其前体麝香草酚和香荆芥酚(图1)。来源于植物品种，如牛至的精油主要是香荆芥酚和麝香草酚，而来源于野生香柠檬和黑种草(Nigella sativa)的精油主要是自然界中不太常见的百里香醌。
具有高水平百里香醌(百里香醌水平≥2.5％)结合高生物质的专利薄荷(Monarda)无性系的开发将导致产生百里香醌经济可行的来源。
除固有遗传变异之外，这些分子的积累受植物生理成熟和它们生长的环境条件的影响。几种唇形科物种中精油的组成和量已知随生理成熟和环境条件，如日长和光强度而改变。很少进行研究来解释薄荷物种集合中百里香醌含量的变化；对于精油中百里香醌含量最大化的收获时间的研究也较少。薄荷物种集合中所报道的百里香醌的最高水平在花中为基于干物质的0.36％，在叶和茎中为0.26％。相对于植物和花的生理成熟，香荆芥酚、麝香草酚及其它酚类化合物的量是不同的，并因此在不同成熟期收获的花头的蒸馏可以导致产生具有不同谱的油。
1993年完成的另一项研究检查了薄荷(Monarda)作为某些油，具体地，香叶醇、芳樟醇、麝香草酚和香荆芥酚的来源。该研究还提供了以下概念：给定物种，但是生长和维持在不同地理范围的植物可能获得不同的油剂。(Mazza,G.,F.A.Kiehn,andH.H.Marshall.1993.Monarda:A source of geraniol,linalool,thymol and carvacrol-rich essential oils.628-631页.In:J.Janick and J.E.Simon(主编),Newcrops.Wiley,New York.)
熟知种植密度可以影响植物中的油得率和组成。例如，在莳萝(Anethumgraveolens L.)中，增加植物密度将增加水芹烯、α-蒎烯和莳萝醚的量(Callan,N.W.等人Industrial Crops and Products 25(2007)282-287)。发现当增加扁叶或卷叶欧芹的植物密度时，欧芹(Petroselinum crispum)的油得率将增加(Petropoulos,S.A.等人Scientia Horticulturae 115(2008)393-397)。类似地，增加植物密度将增加德国甘菊(母菊(Matricaria chamomilla L.))中精油的生产)(Pirzad,A.等人Australian Journal of Agricultural Engineering 2(5)(2011)120-126)。
考虑到以商业规模有效种植野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)和收集含有香荆芥酚和/或麝香草酚的精油的农艺学方法在本领域技术范围内，因此所需要的是超积累香荆芥酚和/或麝香草酚的野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)品种以及将这些化合物有效转化为百里香醌和/或麝香氢醌(百里氢醌，thymohydroquinone)的方法。
发明内容
本发明包括从野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)，包括超积累香荆芥酚和/或麝香草酚的品种生产百里香醌和/或麝香氢醌的方法，并因此一旦衰老，将获得高水平的百里香醌和/或麝香氢醌。优选的品种还具有优良的农艺学特征，其导致产生了大量用于收获和提取所期望的化合物的生物质。
因此，本发明的一个目标是种植超积累香荆芥酚和/或麝香草酚的野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)品种和使用将这些化合物有效转化为百里香醌和/或麝香氢醌的新方法。
本发明的另一个目标是种植除了超积累用于转化为百里香醌和/或麝香氢醌的香荆芥酚和/或麝香草酚之外，具有优良农艺学特征的野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)品种，从而产生从中可以收获所期望的化合物的高水平的生物质。
本发明的其它目标是提供新型野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)品种，所述野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)品种提供了生产百里香醌和/或麝香氢醌的经济可行的方式。
本发明的目标是种植具有高水平香荆芥酚和/或麝香草酚，和因此，通过正确处理所获得的用作人和动物饲料、饮料和个人护理产品中的生物活性分子的百里香醌和/或麝香氢醌的薄荷(Monarda)品种和使用专门的收获方法。
本发明的另一个目标是种植和专业化收获野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)品种，所述野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)品种是新型、稳定且均一的并且具有优良的农艺学特征，其允许作为产生大量从中可以提取上述生物活性分子的生物质的作物而有效种植所述品种。
已知推荐的野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)的播种率为至少3.6lbs./acre。这种种植密度导致产生了具有足够植物密度以遮蔽地面并因此防止杂草生长的作物。
此外，早至至少1916年已推荐在播种后用土壤覆盖种子并使其保持潮湿将增加萌发(1916，USDA Bulletin 372，同前)。当然，熟知的是用辊滚轧土壤将在种子萌发的同时提供用于保留水份和用于保护不受鸟类或其它害虫侵害的挤压以及更好的屏障。
与已知文献一致，本发明推荐通过撒播或条播的约3.6lbs/英亩范围内的播种率。所述方法主张与收获野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)以获得所期望的化合物，并且具体地，百里香醌的最佳得率有关的某些实践，并且描述了用于从所述植物中分离百里香醌的方式和方法。
本发明的其它目标、特征和优势将根据以下说明而易于理解。参考附图进行说明，提供附图以显示优选实施方式。然而，该实施方式不代表本发明的全部范围。具体指出并且在本说明书结束时的权利要求中明确主张了本发明人确实作为其发明的主题。
附图说明
图1是香荆芥酚(左图)；麝香草酚(中间图)和百里香醌(右图)的结构图。
图2A是显示(a)冻干组织和(b)冻干组织中香荆芥酚、麝香草酚和百里香醌(TQ)的群体频率分布的图
图2B是显示(a)冻干组织和(b)空气干燥组织中香荆芥酚、麝香草酚和百里香醌(TQ)的群体频率分布的图
图3是收获后第1天和第2天，通过2.5in.累积沉积的料堆混合系(wind rowedmixed lines)中百里香醌、香荆芥酚和麝香草酚的水平图。
图4是不通过沉积，料堆混合系中百里香醌、香荆芥酚和麝香草酚的水平图。
图5是野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)料堆干燥(左侧托盘)和每天一次，湿润4天(右侧托盘)的照片。
图6是第7天提取的野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)油的照片，其显示有目的地浇水的生物质中百里香醌显著增加。
图7是野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)无性系的料堆生物质的照片。
图8是收获3天后，野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)无性系的对照(干燥)和浇水生物质中百里香醌、香荆芥酚和麝香草酚的水平图。
图9是具有不同润湿水平的野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)无性系中百里香醌的水平图。
图10是收获后浇水一次的野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)生物质中百里香醌的水平图。
图11是收获后在两个24小时间隔中浇水两次的野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)生物质中百里香醌的水平图。
图12是收获后在3个24小时间隔中浇水3次的野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)生物质中百里香醌的水平图。
图13是收获后在4个24小时间隔中浇水4次的野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)生物质中百里香醌的水平图。
图14是收获后在光照区中在20-22℃下保持的野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)生物质的百里香醌的水平图。
图15是收获后在光照区中在30-32℃下保持的野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)生物质的百里香醌的水平图。
图16是收获后在避光区中在20℃下保持的野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)生物质的百里香醌的水平图。
具体实施方式
在本发明中，种植薄荷(Monarda)植物直至在植物组织或植物材料中存在香荆芥酚和/或麝香草酚。切割所述植物并使所切割的材料在有目的地施加或不施加水的情况下衰老。衰老期为至少1天并且长达约14天，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13天的一段时间。在所述期间内至少进行一次有目的地施加水，并且可以进行多次，例如，每天一次、每隔一天一次、每隔两天一次等。可以通过任何已知方法，如手动浇水或者使用喷雾器或灌溉法的机械浇水进行有目的地施加水。
在本发明中，在有目的地施加或不施加水的情况下，延长衰老的步骤将香荆芥酚和/或麝香草酚向百里香醌的转化增加至从所述植物材料中蒸馏得到的油的10w/w％至40w/w％之间的水平的范围内以及该范围内的所有值的水平。换言之，在本发明优选的实施方式中，所述油中百里香醌的范围可以为“ab.cd”ppm之间的任何值，其中a选自数字1、2、3和4，并且b、c和d选自数字0、1、2、3、4、5、6、7、8和9，除了当a为4时，b、c和d全部为0以外。
实施例1-超积累野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)无性系的发展
野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)的种子得自美国商品种子供应商。从该种子来源产生了约400种遗传上不同的植物。在2013年5月期间，将这些植物从温室移栽至小田间区域。使这些植物种植并发育通过2013年(第1年)初夏季节，然后在该田间区域过冬。
大部分植物在次年(第2年)年初出苗并快速生长通过早春月份。将来自该群体的总计200株植物随机标签以用于组织分析。在2014年6月14日采集叶片组织样品。在分析前，将叶片组织样品在间接日光下风干约4周。开发快速微-提取和定量方法并将其用于测量遗传变异品种的香荆芥酚、麝香草酚和百里香醌。
分析全部200个样品并且显示了对于所有三种分子较大的遗传变化。在所测试的200株植物中，百里香醌的范围在基于干物质的0.51％至2.46％，其中18株植物的基于干物质的百里香醌>2.0％。百里香醌的积累范围从基于干物质的2.46％的最高水平至0.51％的最低百里香醌积累。
此时，认为所发生的百里香醌积累发生在新鲜叶片组织(干燥期间固定)并且我们已能够鉴别一些百里香醌超积累植物。
所述组织在2014年7月23日再次采样，并且将样品冻干，而不是将样品风干4周，并将样品送去分析。意外地，这些样品中未发现百里香醌，并且假设薄荷(Monarda)中百里香醌积累的窗期狭窄。小心标注获得数据之间的日期。再次使群体生长至成熟和开花，然后过冬至次年(第3年)。
从2015年(第3年)4月开始，从18株百里香醌超积累植物(第2年鉴别)每月采集叶片组织样品，从而预期百里香醌随日长和光强度增加开始从春季积累至夏季。继续采集叶片组织样品至6月底，但是意外地，在上年度显示出高百里香醌表型的任何这些植物中未发现百里香醌的积累。
检查生物化学筛选实验室所使用的分析方法并且发现它们没有问题。至6月底，实验室从来自第3年数据组的一个样品中发现异常，其显示百里香醌积累为基于干物质的1.8％。这是原有18株选择株中唯一显示出任何百里香醌积累的植物。通过密切检查，在发现和送至实验室之前，该植物样品在田间错误地保留了超过一周。然后，从全部18株选择株加整个群体采集叶片组织样品，并且将从每株植物上分离的样品(a)冻干48小时；或者(b)风干3-4周。冻干样品显示香荆芥酚和麝香草酚的水平升高，但是无百里香醌。仅在风干样品中检测到百里香醌，其范围在基于干物质的1.0％至2.79％之间(图2A和图2B)。
对群体内全部200株植物进行相同实验，并且在来自相同植物的冻干组织和长时间空气干燥组织之间观察到对于百里香醌积累的数据组的分离。该实验显示百里香醌本身在新鲜、健康组织中不积累；但是的确在使来自相同植物的组织干燥(迫使衰老)长达4周时积累。因此，百里香醌一定是收获后组织中香荆芥酚或麝香草酚的分解或氧化产物。
很可能可以通过相对于香荆芥酚和麝香草酚的收获前积累优化收获时机而进一步优化百里香醌的水平。
发现在开花前阶段期间，精油及其含量最高。在6月的第一周，在收获时所有植物均未开花，并且发现香荆芥酚和麝香草酚含量处于最高水平。因此，应开花前收获薄荷(Monarda)以使香荆芥酚和麝香草酚得率最大。在适合的生长条件下同时具有足够的降雨量，这些植物可以在种植季节收获两次；一旦在六月中旬，另一次在八月最后一周。
本发明包括以约2.5磅每英亩至约5磅每英亩，并且更优选地，约3.6磅每英亩的种植率在田间种植野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)或者薄荷属(Monarda)的任何种的种子，从而在第一年对田间定期除草，然后在此后的年份里进行收获。单本种植的植物寿命通常为5-7次收获，但是根据土壤条件、气候和耕作方法可以更长或更短。用于调节田地、种植种子、对植物除草、切割植物和聚集植物的设备分别可以是本领域技术人员容易地已知和理解的任何类型。
在第一季期间，可以定期对田间除草。根据降雨量、土壤和气候条件，可以在该季节中以4-6次的频率进行除草或者以2-4次的频率除草。通过植物高度确定除草频率。除草旨在使杂草高度降低以允许薄荷(Monarda)长成。种植率、生长速率、植物尺寸以及薄荷(Monarda)自身的化学防御导致产生了通常不需要进一步除草剂处理，但是可能具有通过手动喷雾器或物理除去可以控制的偶尔的杂草块(weed patch)的作物。
在仲夏，野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)植物产生熏衣草色的香花。在开花峰值之前收获植物，这在美国中西部通常为六月中旬。可以使用多种设备以一些方式而完成以本发明方式培育的野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)的田间收获。优选的方法是使用具有刀杆的植物切割机而切割植物并使它们放置在它们的切割位置。2012年1月26日提交的未决美国专利申请序列号No.13/359045描述：“切割的植物应在田间保持2-8小时，优选地2-6小时，并且更优选地，4-6小时。最好，但不是至关重要地，这些天应温暖且阳光充足。使植物放置导致植物中的香荆芥酚和麝香草酚氧化为百里香醌(图1)。然后，通过适合的装置，如饲料切碎机18聚集切割的植物，并将其置于一定方式中以将其从田间输送30。”
2013年3月14日提交的未决美国专利申请序列号No.13/804026描述：“所述种植方法增加了萌发、减少了除草剂使用和燃料使用，并且增加了野蜂香薄荷(Monardafistulosa)油，具体地，香荆芥酚、麝香草酚以及百里香醌(TQ)和麝香氢醌(THQ)的得率。百里香醌和麝香氢醌的水平合计占所蒸馏的油的约5％。”本发明显示在不进行有目的地浇水的情况下达到27.5％(实施例2的表1)，在有目的地浇水的情况下达到40％。
在一个实施方式中，输送切割和衰老植物的方式包括作为蒸汽蒸馏车(steamdistillation wagon)在本领域中熟知的方式，如作为用于从唇形科(Lamiacea family)植物，包括野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)除去油的一些方法之一所广泛使用的。
上述种植法导致产生了商业上期望的油含量，即高质量香荆芥酚、麝香草酚、百里香醌和麝香氢醌的量的增加。对于野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)已知的建议种植率为3.6磅每英亩的种植率，正好是提供培育和收获植物和以所期望的油质量水平获得它们所含的所期望的精油的更好方式的种植率。这些已知种植率下的油质量较高，这至少部分是由于杂草压力及其所产生的污染的减少和接近消除所造成的。质量还可以部分归因于除草剂或杀虫剂的较少使用。
实施例2-在所选的野蜂香薄荷(Monarda fistulosa L)系中麝香草酚和香荆芥酚 向百里香醌的氧化生物转化
在2014和2015年的冬季月份期间，在爱荷华州的温室中使31个野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)无性系增殖并种植。在先前建立的5英亩野蜂香薄荷(M.fistulosa)区域旁的31个小区域内种植增殖植物。该5英亩区域种植得自市售种子供应商的种子来源。
使这些区域中的每一个中的植物种植并发育通过2015年夏季，然后在该田间区域过冬。大部分植物在2016年初出苗并快速生长通过早春月份。
另一项研究在2016年进行以鉴定和比较收获后干燥两周前后来自野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)的31个所选择的系的亚型的精油中百里香醌、麝香草酚和香荆芥酚的含量。在5英亩区域中种植的未选择的野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)群体用作对照。在2016年5月26和27日，从所选择的无性系区域和未选择的区域收获叶片组织(top 8”)。将从每个区域收集的生物质分成两半。一半生物质萎蔫24小时并蒸汽蒸馏以获得精油。另一半样品避光萎蔫14天并蒸汽蒸馏以获得精油。
使用HPLC分析所述油以测定香荆芥酚、麝香草酚和百里香醌，重复三次(表1)。
表1-所选择野蜂香薄荷(M.fistulosa)无性系中它们精油中的香荆芥酚、麝香草酚和TQ含量
Figure BDA0002053219710000091
Figure BDA0002053219710000101
ND-代表未检出；
在延长干燥前，对于高麝香草酚所选择的无性系显示出按重量计40至72％的麝香草酚，并且显示出多达100％的转化以获得基于重量的21％的百里香醌平均得率。在干燥前，对于高香荆芥酚所选择的系在按重量计90至92％香荆芥酚之间的范围内，并且显示出小于30％的转化以获得25％的百里香醌平均得率。干燥前，未选择的材料产生28％的香荆芥酚和15％的麝香草酚，其在干燥后转化为小于5％的百里香醌。该混合群体中麝香草酚和香荆芥酚的转化接近70％。
实施例3-通过有目的地向收获后的生物质施加水而增加香荆芥酚和麝香草酚向 百里香醌的生物转化的方法
先前对于野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)的工作已确认香荆芥酚和麝香草酚可以在收获后干燥期间在生物质中转化为百里香醌。优化收获后处理，如蒸馏釜、聚丙烯袋和料堆中的储存显示在料堆(在地面上方4-6英寸切割植物，并将所述生物质成堆保留以在地面上干燥)材料中的转化程度最快，其次是在聚丙烯袋中和蒸馏釜中储存。
在田间研究中，据观察雨是有帮助的并且对于香荆芥酚和麝香草酚向百里香醌的更快速转化也是关键的。在连续两周进行的两次收获中的百里香醌水平明显不同，其中在第一次收获后的第1天和第2天下雨(累积2.5英寸)(图3)，而第二次收获后无雨(图4)。
在第二次收获中，百里香醌的转化非常缓慢，并且未达到在上周收获中所观察到的5天干燥期间所期望的百里香醌水平。在干燥生物质中还检测到了大量残留的香荆芥酚和麝香草酚，表明转化不完全。
这导致以下假设：与所述生物质上不存在过量水时相比，水使得香荆芥酚和麝香草酚向百里香醌的生物转化更快速发生。为了测试这一想法，对在温室控制条件下种植的具有高麝香草酚含量的野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)无性系生物质进行单变量分析(图5)。
将等量(100gm)来自野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)的生物质保存在具有多孔底的两个托盘中，并且在收获后第1、2、5和6天，每天一次用约2升水对标记为“湿润”的托盘有目的地浇水。多孔托盘不会有任何静水积累并且不浸没所述生物质。将对照保持“干燥”并且处于相邻位置以将两个托盘在7天内在实验室中暴露于类似的温度(21-23℃)和湿度(45-49％)。
通过蒸汽蒸馏从该生物质的每一个中提取精油并通过HPLC测试所述油的含量。当在收获后7天测试时，来自有目的地浇水的生物质的油具有更高的百里香醌含量(湿润的27.6％相对于干燥的22.0％)(图6)。麝香草酚未完全转化，并且在该油中未检测到香荆芥酚。
基于实验室结果，将具有高麝香草酚含量并且其生物质可用的野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)无性系收获并料堆。
将所述料堆分成北部和南部区域(图7)。北部区域通过附接到水罐车的水管在收获后第1和2天有目的地浇水。对照南部区域保持干燥而无额外浇水。
该实验期间的平均温度在17-27℃之间，并且在测试期间无降雨记录。
在第0和3天采集样品。通过蒸汽蒸馏从该生物质的每一个中提取精油并通过HPLC测试所述油的含量。
来自在收获后有目的地浇水2天的生物质的油具有显著更高的百里香醌的量(湿润的27.7％相对于干燥的18.3％)(图8)。在所述生物质中保留了显著的量的麝香草酚，其有可能转化为百里香醌。
由于在收获后第4天，北部和南部区域均被几乎0.18in的雨湿润，因此实验不可以作为对照研究继续。
然而，在收获后第7天从两个区域采集的样品均显示出比收获后第3天的样品更高的百里香醌水平(32-37％)(图9)。在这些油中未检测到残留的香荆芥酚或麝香草酚，表明用于这种生物转化的起始材料不再可用。
有目的地浇水的北部区域显示出比干燥区域稍微更低的百里香醌。有可能的是在第4-6天之间，百里香醌可能已完全转化，并且在转化后可能已开始蒸发或冲洗掉。
总之，在收获后，对野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)的无性系和/或混合系的料堆生物质有目的地浇水将积极地增加香荆芥酚和麝香草酚向百里香醌的转化率，因此减少了所述生物质需要保留在地面上的天数。
平均地，从收获次日开始对收获后的生物质有目的地施加2-3天的水可以获得最大转化，同样鉴别为残留香荆芥酚和麝香草酚在蒸汽蒸馏的油中处于最低检测水平的时间。
还指示在发生完全转化之后，百里香醌可能开始蒸发，并因此应基于百里香醌的最高转化和保留而优化油提取的时间。
实施例4-高-香荆芥酚积累的所选野蜂香薄荷(MONARDA FISTULOSA)无性系中香 荆芥酚向百里香醌的生物转化
目的是确定在7-天内，以24小时间隔的浇水频率对香荆芥酚/麝香草酚向百里香醌的转化率的影响。
材料和方法
设计控制单变量研究，以24小时间隔通过浇水1、2、3和4次来处理生物质。
将薄荷(monarda)无性系KI-Mf0435切割并通过将切割的生物质在多孔托盘中堆叠2英寸高而产生料堆。一个托盘分别经历1、2、3和4天的有目的地浇水(5L每650gm起始材料)。对于每个24-小时间隔处理，将对照保持干燥。在每次处理24和48小时之后并且每天从干燥对照提取精油。
结果
直至收获后7天，保持干燥的对照未显示出百里香醌的转化或形成(图10、11、12和13)。在浇水完成后24-48小时内浇水的生物质样品开始形成可检测的百里香醌(图10-13)。在收获7天内，通过以24小时间隔浇水4次的频率，然后干燥2天，获得了百分之三十(30％)的百里香醌。(图13)。
讨论和结论
该数据强烈表明以24小时的间隔有目的地浇水起始并且增加了香荆芥酚向百里香醌的转化率。即使在第7天结束时，检测到大量起始分子，因此还存在TQ增加至大于30％的可能性。
基于该研究，设计了具有以24小时间隔，浇水3次的频率的以下研究。
实施例5-温度和光对高-香荆芥酚积累的所选野蜂香薄荷(Monarda Fistulosa) 无性系中香荆芥酚向百里香醌的生物转化的影响
该研究的目的是确定温度和光对以24小时间隔浇水3次的生物质中香荆芥酚/麝香草酚的转化和百里香醌的形成的影响。
材料和方法
设计了控制的13-天单变量研究，通过以24小时间隔浇水3次并在两个温度以及在光照和避光区域储存而处理生物质。
将收获的薄荷(monarda)无性系生物质混合以辅助均一采样，并将其分成六个托盘(三个样品托盘和三个对照托盘)，每个托盘具有650gm萎蔫材料。将第一组样品和对照托盘(批次A)保持在20-22℃和43-48％之间的湿度。将第二组样品和对照托盘(批次B)保持在30-32℃。将第三组样品和对照托盘(批次C)避光保持在20-22℃。对照托盘始终保持干燥。从收获次日开始，以24小时间隔用5L水对含有650gm生物质的三个样品托盘中的每一个浇水3次，然后是干燥期。
在第3、6、9和13天，从全部位置采集样品。使用蒸汽蒸馏从每个样品和对照提取精油。使用先前建立的HPLC方法，分析精油的香荆芥酚、麝香草酚和百里香醌含量。
结果
批次A样品在光照区域保持良好干燥并且从第3天开始显示出香荆芥酚的减少和百里香醌的形成(图14)。在第6天和第9天之间观察到最高的百里香醌水平，然后在第13天稍微降低。即使在第13天仍检测到残留的香荆芥酚，表明在来自该所选系的油中可以积累大于24.8％的百里香醌。相反，对照干燥样品中的转化非常缓慢，在13天后仅获得了15.2％的百里香醌。
批次B样品在高温和光照区域中保持良好干燥，并且比20℃样品转化了稍微更高的百里香醌。(图15)。相反，对照干燥样品转化了非常少的百里香醌，并且大于50％的香荆芥酚仍可检测，表明干燥和高温对于所述生物转化是非常不利的。在每一天中，TQ形成的差异(>30％)以及对照与湿样品之间香荆芥酚的减少是显著的。在第6天与第9天观察到最高的TQ，然后在第13天稍微降低。
保持避光的批次C样品不像所有其它样品一样变得干燥易碎。当与保持在光照区中的生物质相比时，对照柔韧且颜色为浅绿色。湿样品具有潮湿叶片，并且所有样品具有强烈的霉味。来自对照和样品的油具有>30％水平的最高TQ(图16)，具有比其它来源相对较低的得率并且具有气味谱中明显的霉味。对照显示出有效且类似的向百里香醌的转化，表明光在该生物转化过程中不重要。在13-天研究期间，百里香醌的形成在对照和湿样品中显示出上升趋势，未观察到降低。13天后，在湿样品中观察到最大的香荆芥酚减少，表明湿润和缺少光对于这种转化是有利的。
讨论和结论
在来自所述无性系的任何油中未检测到麝香草酚。
在这些所选的系中，需要最少3次有目的地浇水的频率以起始和促进香荆芥酚向百里香醌的生物转化。在13天中，在光照条件下，浇水3天可以将高达55％的香荆芥酚转化为百里香醌，并且在避光和潮湿条件下可以转化高达85％。香荆芥酚向百里香醌的完全转化需要超过13天。
以上描述和附图包含本发明的说明性实施方式。基于本领域那些技术人员的能力、经验和偏好，上述实施方式和本文所述的方法可以是不同的。仅以特定顺序列出所述方法的步骤不构成对所述方法步骤顺序的任何限制。上述描述和附图仅解释和说明了本发明，并且本发明不限于此，除非这样限制了权利要求。具有本发明公开内容置于他们面前的本领域那些技术人员将能够在不背离本发明的范围的情况下对其作出改变和变化。

Claims (8)

1.一种生产百里香醌的方法，其包括以下步骤：
(a)通过播种种子或者通过移植扦插体而培育野蜂香薄荷(Monarda fistulosa)植物；
(b)使所述野蜂香薄荷植物生长直至在所述植物中存在升高的水平的香荆芥酚和/或麝香草酚；
(c)在开花前切割所述植物；
(d)允许所述切割的植物材料在存在氧气的情况下衰老，
其中在所述衰老的期间，将水有目的地施加至所述材料至少一次，且
所述方法进一步包括从所述衰老的材料中收集百里香醌。
2.根据权利要求1所述的方法，其中允许衰老使油中的百里香醌的水平增加至10％至40％之间。
3.根据权利要求1所述的方法，其中通过暴露于雨而施加水。
4.根据权利要求2所述的方法，其中通过选自由通过手动或机械施加的灌溉和喷雾组成的组的方法而施加水。
5.一种生产百里香醌的方法，其包括以下步骤：
(a)通过播种种子或者通过移植扦插体而培育野蜂香薄荷植物；
(b)使所述野蜂香薄荷植物生长直至在所述植物中存在升高的水平的香荆芥酚和/或麝香草酚；
(c)在开花前切割所述植物；
(d)向所述切割的植物材料施加水，
其中施加水使油中的百里香醌的水平增加至10％至40％之间，且
所述方法进一步包括从所述切割的植物中收集百里香醌。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在从所述切割的植物中收集百里香醌之前，有目的地施加水至少一次。
7.根据权利要求6所述的方法，其中通过暴露于雨而施加水。
8.根据权利要求6所述的方法，其中通过选自由通过手动或机械施加的灌溉和喷雾组成的组的方法而施加水。
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