CN109988864A - Rpa-lfd技术检测雪松疫霉的引物和探针组合及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种RPA‑LFD技术检测雪松疫霉的引物和探针组合及其应用方法。采用所述引物及探针组合检测雪松疫霉的具体方法为：1)提取待测样本DNA；2)以DNA为模板，进行RPA扩增；3)应用LFD进行扩增产物检测；当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有雪松疫霉；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有雪松疫霉。本发明所提供的引物及探针组合RPA扩增效果好，条带特异性强、灵敏度高，为雪松疫霉的检测提供了新的技术手段。

Description

RPA-LFD技术检测雪松疫霉的引物和探针组合及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及重组酶介导等温扩增-侧流层析技术(RPA-LFD)检测雪松疫霉(P.lateralis)的引物和探针组合及其应用。

背景技术

雪松疫霉(Phytophthora lateralis)是重要的毁灭性植物病原菌，也是我国已经对外公布的进境植物检疫性病菌。雪松疫霉可侵染美国扁柏(Chamaecyparis lawsoniana)和太平洋紫杉(Taxus brevifolia)等，引起严重的根腐病。该病菌最早于1923年在美国华盛顿西雅图苗圃里首次发现。我国2010年在台湾首次报道，目前大陆地区尚未发现。

目前，用于雪松疫霉检测的主要方法有发病组织病原菌的分离与形态学鉴定法、PCR法、Nested-PCR等；但这些方法或程序繁琐、周期长，或成本高，需使用昂贵的仪器设备和试剂等。为了阻止雪松疫霉传播范围的不断扩大，使雪松疫霉根腐病得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。雪松疫霉的传统检测方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和初发期作出诊断；从土壤中分离病原菌可能会同时得到多种病原菌和非病原菌，鉴定病原菌难度较大，而且采用传统检测方法难以估测病原菌量，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制，所以传统的检测方法逐步被分子检测技术所取代。近年来，已经开发了许多检测致病真菌的分子方法。DNA探针检测技术很早就被用于研究和开发的植物病原真菌检测。在中国，这项技术也被用于真菌病原体的检测。然而，在实际应用方面，因为核酸探针的制备相对困难，这种技术操作复杂，杂交和标本处理成本昂贵并且耗时。此外，可重复性差，以及可能造成的假阳性或假阴性，都是这项技术可能存在的一些问题。在PCR技术出现以来，已经被证明是一种快速、准确、灵敏、操作简单的检测技术，且被广泛应用于检测植物病原真菌，真菌识别，和系统发育研究等领域。实时定量PCR是美国应用生物系统公司1996年开发的，就有快速、灵敏、准确、定量、可重复性强等优点。这项技术已经成为分子生物学的一个重要工具。然而，考虑到实用性，检测致病真菌需要快速，操作简单，尽可能降低成本，尽量不依赖于昂贵的设备。需要可以在农场或基层这些设备相对落后的单位推广使用。

重组酶介导等温扩增技术(Recombinase Polymerase Amlification，RPA)被公认是可以替代PCR的核酸检测技术。其原理是利用重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。另外，RPA技术有多重工具酶匹配进行有效扩增，扩增效率远高于传统的PCR技术，所用时间更短，最短可在5min内实现。由于RPA技术具有扩增用时短、不需昂贵仪器、特异性好等特点，使其应用越来越广泛。RPA技术的最大特点是只需要1对引物即可在37℃左右的恒温条件下实现模板核酸的扩增，不需要通过高低温度循环实现核酸解链和退火，因此不需要昂贵的仪器设备。而且37℃的常规反应温度很容易满足，适合基层对病原菌的快速检测。

RPA可以与侧流层析试纸条(Lateral flow dipstick，LFD)结合起来应用，在RPA扩增体系中，需要生物素标记的反向引物和荧光素标记的探针，探针在距荧光素30个碱基处有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被nfo核酶识别、切割，产生新的羟基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成带有生物素和荧光素双标记的RPA产物，然后将产物应用LFD试纸条样进行检测。LFD样品端包被有带荧光素抗体的纳米金粒，检测线上包被有生物素抗体，当反应液进入试纸条时，带有荧光素和生物素的扩增产物就会通过抗原抗体结合作用，在检测线上形成生物素抗体-核算-纳米金粒复合体并显色。检测时间短，5分钟左右就能目测结果，肉眼判读。

目前，RPA技术已经广泛应用于人体、动物或植物上的病毒检测，但在植物病原卵菌的检测方面，尤其是对于雪松疫霉的检测，未见相关应用报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存的上述问题，本发明的目的是提供一种基于RPA-LFD技术检测雪松疫霉(P.lateralis)的引物和探针组合，并建立一种雪松疫霉的RPA-LFD检测方法，特异性强，灵敏度高；本发明的另一目的是提供一种含有该雪松疫霉的引物和探针组合的试剂盒，可用于快速检测雪松疫霉。

技术方案：为了解决上述问题，本发明采用的技术方案如下：

一种基于RPA-LFD技术检测雪松疫霉(P.lateralis)的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示，其中反向引物序列5′端用生物素(Biotin)标记；探针序列5′端用荧光素(FAM)标记，距离5′端30个碱基的位置处用四氢呋喃(THF)作为dSpacer替代一个碱基，3′端用C3-spacer阻断；所述引物和探针序列如下：

正向引物RPA-PlaRPA-F：

5′-GTATGTCTGCGGGAGATTTTTTCCCGCTTTCCTT-3′；(SEQ ID NO.1)；

反向引物RPA-PlaRPA-R：

5′-Biotin-GTCAATATCCTTCCGCGAGGTTTCCAAAGCTAGA-3′；(SEQ ID NO.2)；

探针序列PlaRPA-P：

5′-FAM-TTACTCTTGTAGTGGGACACGGCCGGCCAG-THF-AGCGCTTCCGCA CGA-C3spacer-3′；(SEQ ID NO.3)。

所述的引物和探针组合在检测雪松疫霉(P.lateralis)中的应用。

所述的引物和探针组合在制备雪松疫霉(P.lateralis)的检测试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种基于RPA-LFD技术检测雪松疫霉(P.lateralis)的试剂盒，其特征在于，至少包括1次用量以上所述的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。

所述试剂盒还包括：装有冻干酶粉的TwistAmp反应单元管、Rehydration Buffer、MgAc、去离子水、Buffer(Milenia Biotec，Germany)、LFD侧流层析试纸条。

所述检测雪松疫霉(P.lateralis)的试剂盒在检测雪松疫霉(P.lateralis)中的应用。

本申请还提供了一种基于RPA-LFD技术检测雪松疫霉(P.lateralis)的方法，包括以下步骤：

1)提取待测样本DNA；

2)以DNA为模板，利用所述引物和探针组合或所述检测雪松疫霉(P.lateralis)的试剂盒进行RPA扩增；

3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测；当试纸条出现两条棕色条带(Controlline and Test line)，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有雪松疫霉(P.lateralis)；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带(Control line)，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有雪松疫霉(P.lateralis)。

Ypt1基因是一个Ras相关的基因，其在酵母中编码一个与Ras相关的GTP结合蛋白。Ypt1基因包含有多个内含子，其保守序列和进化区域相互间隔，适合作为疫霉菌分子检测的靶标。本发明首先针对雪松疫霉的Ypt1基因(DQ162991.1)作为靶标序列，采用PrimerPremier5.0软件设计了一系列的RPA引物，并通过实验对所设计的引物进行优化筛选，获得了一对用于RPA检测雪松疫霉的专用引物和探针。与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp，探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：

1)本发明选用的YPT1基因引物是经大量实验筛选获得的，特异性好，与其它病原菌无交叉反应。本发明所使用的引物探针扩增效果良好，条带特异性强，能够在检测区形成较高浓度的引物-探针异二聚体，因而使试纸条呈现强阳性反应，增加检测的灵敏度，本发明所建立检测方法可检测100pg·μL^-1的雪松疫霉基因组。

2)本发明的RPA技术并结合侧流层析技术检测雪松疫霉的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器，尤其适于基层实验室和检疫现场的雪松疫霉快速筛查检测。

3)本发明的方法与常规PCR相比，检测速度快，不必经过变性、退火、延伸三个步骤，RPA反应的最适温度在37℃-40℃之间，无需变性，在常温下20min左右即可完成反应。不需要复杂的仪器设备，适用于现场检测。实现了恒温扩增，不像PCR法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源RPA反应就可以发生，极大的扩展了RPA使用的范围，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测。

4)本发明可以用于带菌植株组织中雪松疫霉的快速检测，只需约1h即可完成检测过程，是一种检测雪松疫霉的有效手段。本发明检测方法还可用于雪松疫霉的发病前期检测与病害的预测预报，对于确定防治适期、有效防治病害具有十分重要的意义。

本发明系首次采用RPA-LFD技术建立快速检测雪松疫霉的方法，特异性强、灵敏度高，可用于实际样品的检测，为雪松疫霉的现场检测提供一种灵敏、可靠和便捷的新方法。该方法能够在病害侵染初期就鉴定出病原物，可以对苗圃地或者发病植株中的雪松疫霉进行检测。

附图说明

图1为RPA-LFD检测雪松疫霉在种间的特异性检测结果图；图中，1：雪松疫霉(P.lateralis)(分离自松苗根部)；2：雪松疫霉(P.lateralis)(分离自松树根部)；3：丁香疫霉(P.syringae)；4：冬生疫霉(P.hibernalis)；5：瓜类疫霉(P.melonis)；6：致病疫霉(P.infestans)；7：恶疫霉(P.cactorum)；8：阴性对照；

图2为RPA-LFD检测雪松疫霉在属间的特异性检测结果图；1：雪松疫霉(P.lateralis)；2：终极腐霉(Globisporangium ultimum)；3：木贼镰孢菌(Fusariumequiseti)；4：平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)；5：大丽轮枝菌(Verticiliumdahliae)；6：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；7：稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)；8：阴性对照；

图3为RPA-LFD检测雪松疫霉的灵敏度试验结果图；

图4为苗圃地进行实际样品实验检测结果图：1-4：人工接种雪松疫霉引起的疫病的植株样品RPA检测结果；5-6：健康植株RPA检测结果；8：阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：提取供试病原菌菌株的基因组DNA

具体提取过程如下：

取少量菌丝粉，加900μL 2％CTAB提取液和90μL 10％SDS，漩涡混匀，于60℃水浴1h，中间每10min上下颠倒几次。12000rpm离心10min，取上清液加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min；将上清液转移至新管中，加入等体积的氯仿，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min。取上清液转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc(pH5.2)，-20℃沉淀(＞1h)。12000rpm离心10min，倾去上清液，沉淀用70％乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE(pH8.0)溶解沉淀(含20μg mL^-1RNase)，37℃处理1h后，-20℃保存备用。

对于土壤中DNA的提取，首先将每个土样晾干碾碎，然后分别称取0.5g土样作为提取样品，采用SPIN试剂盒(Q-Biogene Ltd，USA)进行DNA的提取。土壤DNA提取的具体步骤参见试剂盒说明书。

当发病组织中存在雪松疫霉时，采用NaOH快速裂解法提取发病组织中的DNA，具体过程如下：取一段发病的组织样品，每毫克组织加入10μL0.5M NaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5mL的EP管中，12000rpm离心5min，取5μL上清液加入495μL0.1mM Tris(pH 8.0)，混匀后取1μL直接用于RPA反应。

实施例2：雪松疫霉(P.lateralis)RPA引物和探针设计及RPA-LFD检测方法建立

RPA引物长度一般为30至35个核苷酸。引物过短会严重影响重组酶的活性，长引物并不一定能提高扩增性能，反而会增加形成二级结构的可能性，增大来自引物的噪音。此外，引物设计时应尽量避免容易形成二级结构、引物-引物互作、发夹结构的序列，减少引物二聚体的形成。扩增产物大小不超过500bp。

根据雪松疫霉的Ypt1基因(DQ162991.1)，使用Primer Premier5.0设计了正向引物序列RPA-PlaRPA-F，反向引物序列RPA-PlaRPA-R，探针序列PlaRPA-P。其中反向引物序列RPA-PlaRPA-R的5′端用生物素(Biotin)标记；探针序列PlaRPA-P的5′端用荧光素(FAM)标记，距离5′端30个碱基的位置处用四氢呋喃(THF)作为dSpacer替代一个碱基，3′端用C3-spacer阻断；具体序列如下：

RPA-PlaRPA-F：5′-GTATGTCTGCGGGAGATTTTTTCCCGCTTTCCTT-3′；(SEQ ID NO.1)：

RPA-PlaRPA-R：

5′-Biotin-GTCAATATCCTTCCGCGAGGTTTCCAAAGCTAGA-3′；(SEQ ID NO.2)；

PlaRPA-P：

5′-FAM-TTACTCTTGTAGTGGGACACGGCCGGCCAG-THF-AGCGCTTCCGCACGA-C3spacer-3′；(SEQ ID NO.3)。

以提取的DNA为模板，采用设计的RPA引物，在下述反应体系中进行RPA反应：

样品检测：向装有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应单元管(TwistAmp Basickits，Twist)中加入Rehydration Buffer(TwistAmp Basic kits，Twist)29.5μL，10μM的上游引物2.1μL，10μM的下游引物2.1μL，280mM探针0.6μL，DNA 2.0μL，MgAc 2.5μL，去离子水补足至50μL；将RPA扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于39℃金属浴上反应20min。取5μL的RPA扩增产物直接滴到LFD试纸条的一段，另一段垂直放入100μL Buffer(MileniaBiotec，Germany)，5分钟后观察结果。当试纸条出现两条棕色条带(Control line andTest line)，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有雪松疫霉(P.lateralis)；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带(Control line)，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有雪松疫霉(P.lateralis)。

阴性对照：操作步骤同样品检测，将2.0μL模板DNA改为加入2.0μL去离子水。RPA反应结束后，应用LFD进行扩增产物检测。当试纸条出现两条棕色条带(Control line andTest line)，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有雪松疫霉；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带(Control line)，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有雪松疫霉。

实施例3：RPA-LFD检测雪松疫霉的特异性验证

为了验证RPA-LFD检测雪松疫霉方法的特异性，以雪松疫霉菌株和其它疫霉以及病原菌为供试材料(表1)，RPA侧流层析试纸条检测方法的结果显示雪松疫霉的试纸条出现两条棕色条带(Control line and Test line)，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性(+)，其余疫霉以及真菌的试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性(-)，表明样本中不含有雪松疫霉。

表1供试菌株及RPA-LFD检测结果

选择与雪松疫霉不同种(雪松疫霉；丁香疫霉；冬生疫霉；瓜类疫霉；致病疫霉；恶疫霉；栗黑水疫霉等)和不同属的菌(终极腐霉；木贼镰孢菌；平头炭疽菌；大丽轮枝菌；立枯丝核菌；稻瘟病菌等)的DNA作为模板，进行RPA-LFD检测。按照实施例1-2的方法进行检测，检测结果如图1和图2所示，由图可见，以实施例1设计的引物和探针进行RPA扩增反应后，含有雪松疫霉样本RPA扩增产物的LFD检测结果显示2条棕色条带(Control line and Testline)，目标条带清析，能有效检测出雪松疫霉。而其它真菌和卵菌只有在质控区出现一条棕色条带，阴性对照也只有在质控区出现一条棕色条带。结果表明所设计的引物和探针组合以及所建立的RPA-LFD检测雪松疫霉方法能特异地检出雪松疫霉，可用于雪松疫霉的检测应用。

实施例4：RPA-LFD检测雪松疫霉的灵敏度测定

使用Nanodro 2000微量分光光度计测出实施例1提取雪松疫霉DNA的浓度为100ng·μL^-1。将其依次稀释为100pg·μL^-1、10pg·μL^-1、1pg·μL^-1、100fg·μL^-1和10fg·μL^-1，根据实施例1-2采用的引物、反应体系和反应条件，对不同浓度的DNA进行RPA-LFD检测。

结果如图3所示，反应体系中分别含有100ng·μL^-1、10ng·μL^-1、1ng·μL^-1、100pg·μL^-1雪松疫霉DNA的试纸条出现两条棕色条带(Control line and Test line)，呈阳性反应，反应体系中分别含有10pg·μL^-1、1pg·μL^-1、100fg·μL^-1、10fg·μL^-1雪松疫霉DNA的纸条出现一条棕色条带(Control line)，呈阴性反应；显色结果表明RPA-LFD技术的灵敏度达到100pg·μL^-1；RPA检测时间仅需30min，且不需要PCR仪等昂贵的仪器设备，操作程序简便，更有利在生产中推广应用。

实施例5：苗圃地进行实际样品实验检测

首先采用实施例1的方法快速提取发病苗圃地中的病原菌DNA。然后，采用实施例2的方法对提取的病原菌DNA进行RPA反应并应用LFD侧流层析试纸条进行扩增产物检测。结果如图4所示，人工接种雪松疫霉引起的疫病的植株样品1-4号出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，表明含有雪松疫霉，健康植株5-7号和阴性对照样本8号仅有一条带(Control line)，不含有雪松疫霉。再次证明了RPA-侧流层析试纸条检测方法检测结果准确可靠，有很强的实用性。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> RPA-LFD技术检测雪松疫霉的引物和探针组合及其应用

<130> 100

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> RPA-PlaRPA-F引物序列(Artificial)

<400> 1

gtatgtctgc gggagatttt ttcccgcttt cctt 34

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> RPA-PlaRPA-R引物序列(Artificial)

<400> 2

gtcaatatcc ttccgcgagg tttccaaagc taga 34

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> PlaRPA-P探针序列(Artificial)

<400> 3

ttactcttgt agtgggacac ggccggccag agcgcttccg cacga 45

Claims (7)

1.一种基于RPA-LFD技术检测雪松疫霉的引物和探针组合，其特征在于，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。

2.权利要求1所述的引物和探针组合在检测雪松疫霉中的应用。

3.权利要求1所述的引物和探针组合在制备雪松疫霉的检测试剂或试剂盒中的应用。

4.一种基于RPA-LFD技术检测雪松疫霉的试剂盒，其特征在于，至少包括1次用量以上的权利要求1所述的引物和探针组合，所述引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ IDNo.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。

5.权利要求4所述检测雪松疫霉的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：装有冻干酶粉的TwistAmp反应单元管、Rehydration Buffer、MgAc、去离子水、Buffer、侧流层析试纸条。

6.权利要求4所述检测雪松疫霉的试剂盒在检测雪松疫霉中的应用。

7.一种基于RPA-LFD技术检测雪松疫霉的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取待测样本DNA；2)以DNA为模板，利用权利要求1所述引物和探针组合或权利要求4所述检测雪松疫霉的试剂盒进行RPA扩增；3)应用侧流层析试纸条进行RPA扩增产物检测；当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有雪松疫霉；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有雪松疫霉。