CN109983117A - 修复润滑剂污染的洗涤溶液和方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于修复细胞学样本中的润滑剂污染的洗涤溶液包括基于Tris的碱性缓冲溶液。该缓冲溶液可以在甲醇中制备，并可以包括富质子蛋白，或碱性氨基酸，如精氨酸，赖氨酸，或胍。一种用于修复被润滑剂污染的样本的方法包括在制备显微镜载玻片之前使用洗涤溶液和/或向最终小瓶中添加盐。该方法可以包括将洗涤溶液加入样本中，离心样本和洗涤溶液以形成上清液和细胞颗粒，倾析上清液，和向细胞颗粒中加入保存溶液。该方法可以进一步包括向装有保存溶液和细胞颗粒的小瓶中加入盐。
Description
技术领域
本文公开的发明总体涉及用于修复被润滑剂污染或可能被润滑剂污染的细胞学样本的洗涤溶液和方法。
背景技术
细胞学是生物学的一个分支，涉及细胞的形成、结构和功能的研究。在实验室环境中应用时，细胞学家、细胞学技师和其他医疗专业人员基于对患者的细胞的样本的视觉检查而对患者的病情作出医学诊断。典型的细胞学技术是“巴氏”试验(“pap”test)，其中从女性的子宫颈刮下细胞并分析，以检测异常细胞(宫颈癌发病的前体)的存在。细胞学技术也用于检测人体其他部位的异常细胞和疾病。
细胞学技术已经被广泛使用，因为用于分析的细胞样品的收集通常比如组织提取活检的传统外科手术病理学方案具有更小的创伤性。细胞样品可以通过各种技术，包括，例如，通过刮擦或擦拭一区域，或通过使用针从胸腔、膀胱、椎管或其他合适区域吸取体液而从患者获取。细胞样品置于溶液中，并随后收集并转移到载玻片上用于在放大下观察。为了存档目的保存样品和便于检查，可以将固定和染色溶液施加于载玻片上的细胞。
通常期望的是，载玻片上的细胞具有合适的空间分布，从而可以检查单个细胞。通常优选单层细胞。因此，从含有许多细胞的流体样品制备样本通常需要首先通过机械分散，流体剪切或其他技术将细胞彼此分离，从而收集薄的单层细胞并将其沉积于载玻片上。以这种方式，细胞学技术人员可以更容易地辨别异常细胞。也能够计数单层中的细胞以确保已经评价了足够数量的细胞。
在美国专利号5,199,071、5,143,627、5,240,606、5,269,918、5,282,978、6,572,824、6,562,299和7,579,190中公开了用于在载玻片上产生有利于视觉检查的薄单层细胞的某些方法和装置，其全部转让于本发明的受让人，并且所有这些专利的公开内容通过引证以其全部内容结合于本文中。
根据这些专利中公开的一种方法，样品容器中的保存溶液中的患者细胞使用设置于其中的旋转过滤装置分散。将受控的真空施加于过滤装置以通过其膜吸取流体，直到对过滤器收集到期望的细胞数量和空间分布。此后，从样品容器中取出移出过滤器，并将过滤器膜压在玻璃载玻片上，以使所关注的颗粒以与它们在过滤器膜上收集的空间分布基本相同的空间分布转移到载玻片上。
一旦样本被制备、固定和染色，样本可以由细胞学技术人员通常在放大下并采用或不采用各种照明源来手动目视检查。可替代地或另外地，自动机器视觉系统已经用于辅助细胞学检查。例如，自动视觉系统可以对放置样本的整个载玻片进行初步评价而警示细胞学技术人员近距离检查的载玻片的可能的最相关区域，或可以用于重新筛选已经由细胞学技术人员分析过的样本。
2000、3000和5000系统(统称为“系统”)由位于马萨诸塞州马尔堡市的Hologic，Inc.(“Hologic”-前身为CytycCorporation)制造和销售，是可供女性使用的有效且广泛使用的宫颈癌筛查工具。自1996年引入系统以来，美国的创伤性宫颈癌已经下降。然而，仍然需要持续的宫颈筛查。虽然在收集的窥器上施加温水对所收集的巴氏样品的质量风险最小，但许多临床医生仍然在窥器上使用润滑剂凝胶以减轻患者在骨盆检查期间的不适。遗憾的是，在用于Pap测试的样品采集期间使用此类润滑剂，特别是具有基于卡波姆制剂的润滑剂，可能对样本载玻片的充分性产生不利影响，并可能提升实验室的“不满足评价要求”(以下称“UNSAT”)评级。
发明内容
根据公开的本发明的一个方面，用于处理被(或认为被)润滑剂污染的细胞学样本的方法包括以下动作：将样本造粒并倾析(即，移除)原始(“收集(collection)”)保存溶液(preservative solution)；向造粒的样本中加入洗涤溶液；离心样本和洗涤溶液以形成上清液和细胞颗粒；倾析上清液；和随后将细胞物质重新悬浮于替代保存溶液中。然后，可以使用得到的(再处理的)样本，使用例如仪器制备样本载玻片。在一个实施方式中，洗涤溶液是在甲醇(即，20％甲醇)中制备的基于Tris的碱性缓冲溶液。方法还可以包括将盐(例如NaCl或盐)添加到含有洗涤的、再悬浮的细胞的保存溶液中。洗涤溶液可以进一步包含富质子蛋白和/或碱性氨基酸，如精氨酸，赖氨酸，或胍。
在一个实施方式中，用于处理细胞学样本的方法包括向原始(“收集”)保存溶液中的样本中添加盐(如NaCl或CytoLyt盐)；和然后制备具有来自样本的细胞的显微镜载玻片。方法的这个实施方式可以进一步包括，在添加盐的步骤之前，用基于Tris的碱性缓冲溶液进行洗涤。进行洗涤可以包括将基于Tris的碱性缓冲溶液加入(造粒的/倾析的)样本中；离心样本和缓冲溶液以形成上清液和细胞颗粒；倾析上清液；和将细胞物质再悬浮于保存溶液中。缓冲溶液可以包括富质子蛋白和/或碱性氨基酸，如精氨酸，赖氨酸，或胍。
根据公开的本发明的另一个方面，一种提供用于修复被润滑剂污染的细胞学样本的洗涤溶液包括在甲醇中制备的基于Tris的碱性缓冲液。缓冲液可以在20％甲醇中制备。洗涤溶液可以进一步包括富质子蛋白和/或碱性氨基酸，如精氨酸，赖氨酸，或胍。
公开的本发明的另外的实施方式以及方面、特征和优点部分在以下的详细描述中阐述，并且由描述将会固有地或以其他方式变得显而易见，或可以通过公开的实施方式的实践而领会。在以下详细描述中，参考了构成其一部分并且其中通过说明用于实践公开的本发明的各种实施方式而示出的附图。实施方式将被充分详细描述以使本领域技术人员可以实践公开的本发明，并且应当理解的是，可以利用其它实施方式，并可以在不脱离公开的本发明的范围的情况下进行结构性改变。因此，以下详细描述不应该被视为具有限制意义，并且所公开的本发明的范围仅由所附权利要求及其合法等同物限定。
附图说明
在结合附图考虑随后的详细描述使，公开的实施方式的上述和其他方面和特征将变得更加显而易见，其中相同的附图标记始终表示相同的部件，并且其中：
图1是显示pH对润滑剂过滤器堵塞的影响的图表。
图2是对基于卡波姆的润滑剂的pH相对于粘度的图表。
图3a和3b分别描绘了中性pH和碱性pH下的基于卡波姆的润滑剂的分子；
图4是基于卡波姆的润滑剂的盐浓度相对于粘度的图表。
图5是显示添加盐对被润滑剂污染的样本的细胞转移的影响的表格。
图6描绘了由被润滑剂污染的样本制备的显微镜载玻片的图像，其中左侧的图像未经处理，且右侧的图像已经用盐处理；
图7是用于处理被润滑剂污染的细胞学样本的方法的流程图。
图8是显示由采用和未采用实施的处理的，具有至少5000的图像对象计数的润滑剂污染的样品制备的载玻片的数量的表格；和
图9是显示由采用和未采用实施的处理的润滑剂污染的样本制备的载玻片的“不满足评价要求”评级的表格。
具体实施方式
本公开以下主要在洗涤溶液和用于修复细胞学样本中的润滑剂污染的方法的上下文中描述。妇科标本的润滑剂污染源可能发生于样本采集点或个人使用。临床医生可能在妇科检查期间向窥器施加润滑剂以减轻患者在样本采集期间的不适。出于同样的原因，润滑剂经常用于非妇科应用，如膀胱镜，灌洗或膀胱洗涤溶液的收集，以及需要使用检视镜(scope)的任何类型的表面擦拭物。用于非妇科采样的润滑剂污染的另一个来源可以是在收集细针抽吸样本之前会扩散到皮肤上的超声凝胶的使用。
润滑剂污染，尤其是含有卡波姆的润滑剂，对于样本是一个问题，因为润滑剂可能在处理器上制备载玻片期间堵塞过滤器，阻止细胞充分收集和/或阻碍细胞转移。这可能导致UNSAT载玻片结果，在这种情况下细胞学技术人员和细胞病理学家无法对受污染的患者样本进行诊断。UNSAT载玻片结果要求召回患者提供新样品。
用于修复被润滑剂污染的样本的洗涤溶液优选具有碱性pH。pH值对采用临床实践中常用的几种含卡波姆的润滑剂的过滤器堵塞的影响如图1所示。去除的保存溶液的平均重量的减少(图1中沿y轴所示)表明过滤器膜堵塞增加。典型的保存溶液，如和溶液(均由Hologic制造和销售)具有相对低的pH值，即分别为5.7和7.1。如图1所示，含卡波姆的润滑剂在典型的保存溶液(例如，pH值为5.7或7.1)中具有高的过滤器阻塞性能。当润滑剂暴露于高pH时，润滑剂的滤膜堵塞性能可以降低，如图1所示。
这可能是由于pH对润滑剂粘度的影响。图2显示升高的pH对基于卡波姆的润滑剂的粘度具有反作用。具体地，图2中的图表显示了EZ-2聚合物(LubrizolCorp.)的粘度相对于pH。在中性pH下，基于卡波姆的润滑剂处于粘性状态，如图3a中所示。在较高的碱性pH下，卡波姆会变得去质子化而产生线性取向的带更多电荷的分子，而因此处于较低粘性的状态，如图3b所示。如图1所示，在碱性状态下的这种较低粘度会降低了过滤器堵塞，这通过增加的保存溶液去除证实。
因此，在一个实施方式中，洗涤溶液是碱性pH的基于Tris的缓冲液。洗涤溶液可以在甲醇/水溶液中制备。例如，基于Tris的碱性缓冲液可以在20％甲醇中制备。
然而，虽然增加的pH导致细胞收集和转移的改进，但仍然存在润滑剂，其看上去直接与细胞表面结合，并阻碍了细胞形态的目视观察。因此，洗涤溶液还可以含有一定浓度的富质子蛋白，如鱼精蛋白，和/或碱性氨基酸，如精氨酸，赖氨酸，或胍。这些化合物的存在旨在通过提供通过静电相互作用的替代的结合配对物而中断带电共聚物和细胞表面蛋白之间的结合。例如，精氨酸在碱性pH下的净正电荷可以帮助卡波姆和细胞表面之间的缓冲，而防止结块(在润滑剂污染的临床样品中常见的问题)，而同时保持低卡波姆粘度。
因此，在20％甲醇中制备的基于Tris的碱性缓冲洗涤溶液可以用于修复样品的润滑剂污染。洗涤溶液可以进一步包括一定浓度的富质子蛋白如鱼精蛋白，和/或碱性氨基酸如精氨酸，赖氨酸，或胍。通过使用这种洗涤溶液，可以减少润滑剂的堵塞性，并且可以改进载玻片上的细胞收集。
在一个实施方式中，在进行洗涤后将盐溶液加入到最终样品中。这可以是NaCl或盐的溶液。已经显示将盐直接添加到被润滑剂污染的样品中会降低润滑剂的过滤器阻塞性并改进细胞转移。卡波姆聚合物具有低离子耐受性，因此可以通过离子强度控制粘度。图4描绘盐对聚合物凝胶粘度的影响。如图4所示，粘度随着盐浓度的增加而降低。
在另一个实施方式中，可以通过向样本中加入盐溶液而不进行洗涤来修复被润滑剂污染的样本。如图5所示，将盐溶液直接添加到含有不同润滑剂的样品中会增加转移到载玻片上的目标数量。完全未处理的样品(显示于图5中标记为“无”的列中)，具有非常少(如果有的话)的转移到载玻片上的对象。图6描绘了从掺有润滑剂的细胞池制备的样品，其中左侧的图像602，604未经处理，右侧的图像606，608已经用盐处理。未处理的样本在载玻片上的对象很少，而用盐处理的样本在载玻片上具有更多的对象。因此，在将盐溶液添加到样本中而不进行洗涤可以有效地修复被润滑剂污染的样品。
图7中显示了用于由被润滑剂污染(或认为会被潜在地污染)的患者样品制备样本载玻片的方案700。虽然该程序被描述为连续进行的一系列步骤，但术语“步骤”是为了方便起见进行使用的，而描述的基本行为不一定如35U.S.C.§112中使用的该术语“步骤”进行。因为患者样品最初包含于原始收集保存溶液(又称为PreservCyt溶液)中，则在这种方案的第一步骤701中，将样本通过离心造粒并倾析保存溶液，在样品容器中仅留下造粒的细胞物质，包括任何固化的润滑剂。然后，在步骤702中，将基于Tris的碱性缓冲溶液添加到造粒的样本中。接着，在步骤704中，将洗涤溶液中的样本离心而形成上清液和细胞颗粒。接着，在步骤706中，倾析上清液。最后，在步骤708中，将细胞颗粒再悬浮于替代的保存溶液中，且随后可以使用例如仪器成功生产载玻片。可选地，在步骤710中，可以将盐添加到替代的保存溶液中的再悬浮的细胞颗粒中。
如上讨论的，在一个实施方式中，方法可以包括仅进行添加盐溶液的步骤710，并且可以不包括步骤702～708。在这个实施方式中，提供了悬浮于保存溶液中的样本，并将盐加入到含有样本的保存溶液中。使用例如系统制备显微镜载玻片。由于盐处理，降低了润滑剂的堵塞性，则显微镜载玻片将可能具有足够的来自样本的细胞以满足评价要求。
在已经确定样本为UNSAT之后，可以进行用于实施洗涤和/或添加盐溶液的方案700。换言之，将样本使用系统处理并形成载玻片，并且由样本制备的载玻片确定为UNSAT。这种样本可能被润滑剂污染。因此，如上描述的，可以使用洗涤溶液和/或盐溶液在其原始收集保存溶液中修复样本，并且可以由处理的样本制备新的载玻片。可替换地，在由样本制备任何载玻片之前，样本可以用洗涤溶液和/或盐溶液处理。
这种修复技术在减少润滑剂污染的不利影响方面的有效性已经对一个可能导致巴氏试验的UNSAT问题的润滑剂的八个成员的组进行了测试。在本研究中使用三个由确定为NILM、LSIL或萎缩的样本制备的细胞池。细胞池以中等细胞浓度分散到小瓶中。然后在处理器上进行载玻片制备时，将小瓶加入足以产生UNSAT的水平的润滑剂。使用缓冲的基于Tris的洗涤溶液对每种润滑剂和细胞池重新处理至多达六次重复。载玻片在处理器上制备，用Pap Stain染色，并盖上盖玻片。然后在加入含有盐的等分溶液后，由每个残留的样品瓶制备第二个载玻片，并随后染色并盖上盖玻片。
使所有载玻片通过成像系统，并收集成像载玻片度量(imagingslide metrics)以获得对象计数。对象计数数据使用成像质量控制测试程序收集。这是一种自动化的软件工具，其记录由成像器算法的图像分割阶段所识别的暗、圆形的对象(外表上是细胞核)的数量。
来自大约一半样品复制的载玻片由ASCP认证的细胞技术专家(CT)审查细胞适当性(cellular adequacy)。通过使用视场数(FN)22的目镜在40倍放大倍数下在10个交替视野(FOV)中发现的所有保存良好且可视化良好的鳞状细胞的平均值确定适当性。FOV沿直径计数并包括细胞斑点的中心。载玻片被确定为符合要求(SAT)，SAT-边界线，UNSAT-边界线，或UNSAT。
在通过细胞池类型和处理条件排列的成像器上产生的对象计数的载玻片如图8中所示。通过CT检查了共223个载玻片的SAT或UNSAT测定结果。UNSAT被定义为无论是否存在异常细胞，少于5,000个细胞，或低于平均3.8个细胞/FOV。
由掺有润滑剂的细胞池制备的载玻片在使用洗涤方法时显示出细胞覆盖率的增加并由UNSAT转化为符合要求。如图9所示，当用基于Tris的碱性缓冲液洗涤时，符合评价要求(SAT)率从未处理的8.9％(即91.1％的UNSAT)变为38.9％(即61.1％的UNSAT)。采用使用洗涤缓冲液结合加入CytoLyt盐，SAT评级增加到98.6％(即，1.4％的UNSAT)，如图9所示。
对于许多润滑剂，小瓶中的极少量可能对细胞转移有害并产生UNSAT结果。这种洗涤溶液，结合向最终小瓶中添加盐，可以有助于降低接受被润滑剂污染的样本的实验室内的UNSAT率。在另一个实施方式中，单独的洗涤溶液可以有助于降低接受被润滑剂污染的样本的实验室的UNSAT率。在又一个实施方式中，在不使用洗涤溶液的情况下向最终小瓶中添加盐也可以有助于降低接受被润滑剂污染的样本的实验室的UNSAT率。
尽管本公开已经提供于某些实施方式和实施例的上下文中，但本领域技术人员将会理解的是，本公开延伸超出具体公开的实施方式至其他可替换的实施方式和/或实施方式及其显而易见的修改和等同物的使用。另外，技术人员将会认识到的是，任何上述方法可以使用任何合适的装置实施。此外，本文中与实施方式相关的任何具体特征、方面、方法、性质、特性、质量、属性、要素等的公开内容可以用于本文阐述的所有其他实施方式中。因此，这旨在表达本文公开的本发明的范围不应该限于所举例说明和/或描述的实施方式，而是仅由所附权利要求及其合法等同物限定。
Claims (20)
1.一种用于处理悬浮于收集保存溶液中的被润滑剂污染的细胞学样本样品的方法，所述方法包括：
将所述样本造粒；
倾析所述收集保存溶液以分离造粒的所述样本；
向造粒的所述样本中加入洗涤溶液，其中所述洗涤溶液包含基于Tris的碱性缓冲液；
离心所述样本和所述洗涤溶液以形成上清液和细胞颗粒；
倾析所述上清液以分离所述细胞颗粒；和
向所述细胞颗粒中加入替换保存溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述缓冲液在甲醇中制备。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述缓冲液在20％甲醇中制备。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，进一步包括向所述替换保存溶液和所述细胞颗粒中加入盐。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述盐包含NaCl或CytoLyt。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述洗涤溶液进一步包含富质子蛋白。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述洗涤溶液进一步包含碱性氨基酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述碱性氨基酸包括精氨酸、赖氨酸或胍。
9.一种用于修复被润滑剂污染的细胞学样本的洗涤溶液，其中，所述洗涤溶液包含在甲醇中制备的基于Tris的碱性缓冲液。
10.根据权利要求9所述的洗涤溶液，其中，所述缓冲液在20％甲醇中制备。
11.根据权利要求9或10所述的洗涤溶液，其中，所述洗涤溶液进一步包含富质子蛋白。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的洗涤溶液，其中，所述洗涤溶液进一步包含碱性氨基酸。
13.根据权利要求12所述的洗涤溶液，其中，所述碱性氨基酸包括精氨酸、赖氨酸或胍。
14.一种用于处理悬浮于收集保存溶液中的被润滑剂污染的细胞学样本的方法，所述方法包括：
向所述收集保存溶液中的所述样本中加入盐；和
加入所述盐后，制备具有来自所述样本的细胞的显微镜载玻片。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述盐包含NaCl或CytoLyt。
16.根据权利要求14或15所述的方法，进一步包括在加入所述盐之前，使用基于Tris的碱性缓冲液进行所述样本的洗涤。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，进行所述洗涤包括
将所述样本造粒；
向造粒的所述样本中加入在溶液中的所述基于Tris的碱性缓冲液；
离心所述样本和缓冲溶液以形成上清液和细胞颗粒；
倾析所述上清液以分离所述细胞颗粒；和
向所述细胞颗粒加入保存溶液。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述缓冲溶液进一步包含碱性氨基酸。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述碱性氨基酸包括精氨酸、赖氨酸或胍。
20.根据权利要求16所述的方法，其中，所述缓冲溶液进一步包含富质子蛋白。
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