CN109975248B - 用于对溶液中大肠杆菌浓度检测的传感器的制作方法及其大肠杆菌浓度的检测方法 - Google Patents

用于对溶液中大肠杆菌浓度检测的传感器的制作方法及其大肠杆菌浓度的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于对溶液中大肠杆菌浓度检测的传感器的制作方法，制备了一种基于石墨烯的1‑氨基芘和麦芽糖的复合膜，通过嫁接刀豆凝聚素A制成对糖类具有敏感性的改性石墨烯复合膜，并将其涂敷在光纤上制成基于改性石墨烯复合敏感膜涂敷粗锥型的生物传感器。其不仅制作简单容易，另外通过此方法制得的传感器在对溶液中大肠杆菌浓度的检测中，具有灵敏度高、检测效果好，响应时间快，精度和可靠性高的优点。

Description

用于对溶液中大肠杆菌浓度检测的传感器的制作方法及其大 肠杆菌浓度的检测方法
技术领域
本发明涉及一种光纤传感领域，具体涉及一种用于对溶液中大肠杆菌浓度检测的传感器的制作方法及其大肠杆菌浓度的检测方法。
背景技术
一直以来，食品安全都备受人们关注，它已经成为一个全球性的问题。随着人们生活水平的提高和食品种类的增多，也产生了许多食品安全隐患。其中，食源性细菌严重影响着现代人的健康，严重的甚至被夺去生命。大肠杆菌是一种常见的食源性病原体，每年有百万人受其影响，特别是肠出血型大肠杆菌，它主要与未高温消毒的牛奶、未煮熟的肉类和新鲜水果蔬菜等有关，感染后主要症状有发烧、头痛、恶心、呕吐、腹痛和腹泻等。
光纤传感技术是一项正在发展中的具有广阔前景的新型高技术。由于光纤本身在传递信息过程中具有许多特有的性质,如光纤传输信息时能量损耗很小,给远距离遥测带来很大方便。光纤材料性能稳定，不受电磁场干扰，在高温、高压、低温、强腐蚀等恶劣环境下保持不变所以光纤传感器从问世到如今，一直都在飞速发展。因此，如何利用光纤传感技术制作一种对溶液中大肠杆菌浓度检测的传感器的制作方法，使制作出来的传感器能够具有效果好、快速准确和可靠性高等效果，就成为需要进一步考虑的问题。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是：如何提供一种制作简易，制作出来的传感器灵敏度高、检测效果好的用于对溶液中大肠杆菌浓度检测的传感器的制作方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：
一种用于对溶液中大肠杆菌浓度检测的传感器的制作方法，包括以下步骤：
(1)将Pbs缓冲液与无水甲醇按照(0.8∶1)～(1.5∶1)的体积比进混合均匀得到混合溶液，然后将混合溶液与麦芽糖粉末、1-氨基芘粉末和氰基硼氢化钠粉末按照(300∶1∶1∶0.5)～(400∶1.2∶1∶0.7)的质量比进行混合，在密封且在50～80℃的环境下搅拌，然后将生成物洗涤、抽滤后得到复合材料粉末；
(2)将步骤(1)中得到的复合材料粉末与无水乙醇和Pbs缓冲液按照(1∶150∶150)～(1∶200∶200)的质量比进行混合，进行超声振荡使其分散均匀得到复合材料溶液，然后将石墨烯量子点溶液按照1∶2～1∶4的体积比加入到复合材料溶液中，进行超声振荡使其反应得到生成物溶液A，然后将刀豆凝聚素A按照(1:8000)∶(1:12000)的摩尔比加入到生成物溶液A中，在0～10℃的环境下进行超声振荡使其反应得到生成物溶液B；
(3)获取一根光子晶体光纤，将其浸入到步骤(2)中得到的生成物溶液B中，数分钟后提出置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥至恒重，使光子晶体光纤表面形成厚度为1～3μm的石墨烯复合膜层，得到覆膜光子晶体光纤，并将其两端进行切平处理；
(4)获取两根单模光纤，分别采用粗锥的熔接方式熔接在覆膜光子晶体光纤的两端，单模光纤的端面中心与覆膜光子晶体光纤的端面中心相对应，进而制得传感器。
本发明还公开了一种用于对溶液中大肠杆菌浓度进行检测的方法，包括以下步骤：
(a)获取权利要求1中制得的用于对溶液中大肠杆菌浓度检测的传感器，将其一端的单模光纤接入光源，另一端的单模光纤接入光谱分析仪；
(b)配置多个含有大肠杆菌不同浓度的溶液，将步骤(a)中的传感器分别放入上述溶液中并获取相应的光谱图；
(c)在步骤(b)中所测得的所有光谱图中，选取同一段波谷的中心波长，并通过线性拟合得到y＝a-bx，即x＝(a-y)/b，其中a为不含大肠杆菌液体检测光谱图中选取波谷的中心波长，y为待检测溶液检测光谱中选取波谷的中心波长，b为每1cfu/ml浓度大肠杆菌在光谱中的偏移量，x为待检测溶液大肠杆菌的浓度；
(d)将步骤(a)中的传感器放入待检测溶液中并获取该溶液的光谱图，选取其中一段波谷的中心波长，代入公式x＝(a-y)/b计算得到溶液中大肠杆菌的浓度。
综上所述，本发明的有益效果在于：本发明中传感器制作简易，制作出来的传感器灵敏度高、检测效果好，响应时间快，精度和可靠性高。
附图说明
为了使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1为本发明实施例1中50cfu/ml和100cfu/ml大肠杆菌浓度溶液在波谷对应中心波长为1152nm～1156nm的范围内所输出的光谱图；
图2为本发明实施例1中200cfu/ml、300cfu/ml和400cfu/ml大肠杆菌浓度溶液在波谷对应中心波长为1152nm～1156nm的范围内所输出的光谱图；
图3为本发明实施例1中500cfu/ml和600cfu/ml大肠杆菌浓度溶液在波谷对应中心波长为1152nm～1156nm的范围内所输出的光谱图；
图4为本发明实施例1中传感器在50～600cfu/ml大肠杆菌浓度范围内对应中心波长为1152nm～1156nm的范围偏移与大肠杆菌浓度的线性拟合图；
图5为本发明实施例1中传感器的响应时间图；
图6为本发明实施例1中传感器检测光谱图1153nm～1158nm的范围内中心波长随时间的变化图；
图7为本发明实施例1中石墨烯复合膜层的透射显微图；
图8为本发明实施例1中石墨烯复合膜层的能谱分析；
图9为本发明实施例1中石墨烯复合膜层的傅里叶红外光谱分析图；
图10为本发明实施例1中石墨烯复合膜层的拉曼光谱分析图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
本具体实施方式中的用于对溶液中大肠杆菌浓度检测的传感器的制作方法，包括以下步骤：
(1)将Pbs缓冲液与无水甲醇按照1∶1的体积比进混合均匀得到混合溶液，然后将混合溶液与麦芽糖粉末、1-氨基芘粉末和氰基硼氢化钠粉末按照368∶1.11∶1∶0.58的质量比进行混合，在密封且在80℃的环境下搅拌，然后将生成物洗涤、抽滤后得到复合材料粉末；
(2)将步骤(1)中得到的复合材料粉末与无水乙醇和Pbs缓冲液按照1∶160∶160的质量比进行混合，进行超声振荡使其分散均匀得到复合材料溶液，然后将石墨烯量子点溶液按照1∶3的体积比加入到复合材料溶液中，进行超声振荡使其反应得到生成物溶液A，然后将刀豆凝聚素A按照1:10000的摩尔比加入到生成物溶液A中，在0℃的环境下进行超声振荡使其反应得到生成物溶液B；
(3)获取一根光子晶体光纤，将其浸入到步骤(2)中得到的生成物溶液B中，数分钟后提出置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥至恒重，使光子晶体光纤表面形成厚度为2.5μm的石墨烯复合膜层，得到覆膜光子晶体光纤，并将其两端进行切平处理；
(4)获取两根单模光纤，分别采用粗锥的熔接方式熔接在覆膜光子晶体光纤的两端，单模光纤的端面中心与覆膜光子晶体光纤的端面中心相对应，进而制得传感器。
马赫-曾德尔干涉主要原理是将单独光源发射的光束分裂成两道准直光线后经过不同的路径和介质所产生相对的位移变化，导致光程差，因此形成干涉。使用标准单模光纤与光子晶体光纤之间进行双粗锥熔接，一束光进入第一段单模光纤后，经过第一个粗锥熔接点光被分为两部分，一部分继续在纤芯内传输，另一部分进入光子晶体光纤的包层中，在第二个熔接点两部分光会产生汇聚，由于两部分光经过的路径和介质不同，导致光在第二段单模光纤传输时产生光程差，由此产生干涉现象，在光谱仪上可以观察到干涉光谱。
如果在光子晶体光纤的包层上涂上敏感膜，当敏感膜吸附待测物时包层的有效折射率将会改变，光程差也会随之改变，在光谱上的干涉光谱也将发生偏移，通过监测偏移量就可以得知待测物的浓度信息。通过制备了一种基于石墨烯的1-氨基芘(1-Apy)和麦芽糖的复合膜，通过嫁接刀豆凝聚素A(ConA)制成对糖类具有敏感性的改性石墨烯复合膜，并将其涂敷在光纤上制成基于改性石墨烯复合敏感膜涂敷粗锥型马赫-曾德尔干涉的生物传感器。由于大肠杆菌的细胞膜的主要成分为脂多糖，恰好能被刀豆凝聚素A所吸附，因此该传感器可以用于大肠杆菌的快速检测工作中。
在上述石墨烯复合材料的制备过程中，每一种材料的加入都必不可少。首先是麦芽糖与1-氨基芘的反应，它们之间的反应是一种在特定实验条件下的偶联反应，洗涤并抽滤之后得到了麦芽糖与1-氨基芘的复合材料，以下简称Mal-Apy。为了使Mal-Apy材料能够更好地包覆在光纤上，我们加入了石墨烯量子点，将石墨烯作为镀膜材料。Mal-Apy和石墨烯量子点之间的反应是π-π堆积作用，由于1-氨基芘具有六边形结构，能很好的与石墨烯量子点相结合。最后，我们加入刀豆凝聚素A，以上述材料中麦芽糖为抓手，与刀豆凝聚素A中的糖结合位点相结合，由于刀豆凝聚素A的结合位点较多，因此还可以用来检测其他糖类物质，由此制成了我们所需要的石墨烯复合材料。另外，pbs缓冲液不仅作为溶液，还起到了缓冲PH的作用，确保活性物质在最佳PH值条件下进行反应；氰基硼氢化钠作为一种温和的还原剂，确保1-氨基芘中的氨基在制备过程中不被氧化。
在步骤(3)中，进行冷冻干燥优点在于：在不破坏刀豆凝聚素A活性的情况下将样品干燥好，并使得石墨烯复合膜在光子晶体光纤的表面能够更加的稳定，增加了材料与光纤之间的作用力，使得传感器的稳定性得到了保证。
为了探究传感器的使用寿命，研究了传感器在短时间(0～6天)内的稳定性，如图6所示，表明监测波长随着时间并无明显变化，说明该传感器在短时间内的寿命得到了保证。另外，该传感器实验环境为溶液，且刀豆凝聚素在高温下容易发生蛋白质变质，因此本实验应在室温的条件下进行且可以排除湿度的影响。
在步骤(3)中制得覆膜光子晶体光纤后，对其石墨烯复合膜层进行分析表征。获取部分样品利用场发射透射电子显微镜，首先进行TEM扫描，如图7所示，为该样品的形貌，图7(a)标度尺为2μm，图7(b)标度尺为100nm。从图中可以看出该材料表面形貌较好，分散度较高。
对样品进行EDS元素分析，结果如图8所示，图8(a)表明该样品含有N、O、Na、P五种元素，图8(b)、(c)分别表示透射在C元素和N元素上的荧光图，其中C元素主要来源于石墨烯量子点，N元素主要来源于1-氨基芘中的氨基和刀豆素的组成成分氨基酸，O元素主要来源于刀豆素与麦芽糖、Na和P为杂质元素，主要来源分别为氰基硼氢化钠和Pbs缓冲液，通过EDS的分析可以确定该样品中存在N。
为了证明氨基的存在，使用傅里叶变换红外光谱仪来进行测试，如图9所示：其中958.51cm-1处的峰属于CN-O的伸缩振动，原因是在材料制备过程中部分氨基被氧化；1070.09cm-1处的峰属于直链C-C伸缩振动，原因是1-氨基芘和氨基酸中有C-C键；1249.97cm-1处的峰属于NO3振动的反对称伸缩，由氨基被氧化所导致；当氮氢的振动频率为1560～1535cm-1时，该振动的模式属于仲酰胺振动，该峰为NH面内弯曲振动和CN伸缩振动发生耦合的结果，主要是NH面内的变角振动，因此1538.54cm-1处的峰属于氨基的一个特征峰；当氮氢的振动频率为1560～1535cm-1时，该振动的模式属于NH2扭曲振动，该峰的主要特点为宽峰，因此833.22cm-1处的峰也属于氨基的一个特征峰；当氮氢的振动频率为770～700cm-1时，该振动的模式属于NH面外弯曲振动脂肪族，因此737.68cm-1处的峰也属于氨基的一个特征峰。综上所述，该样品中含有氨基。
使用显微共聚焦拉曼光谱仪进行测试，测试结果如图10所示：其中1011cm-1、1210cm-1、1215cm-1、1404cm-1等峰都与α-丙氨酸相近，1011cm-1、1407cm-1等峰都与β-丙氨酸相近，540cm-1、1050cm-1、1404cm-1、1618cm-1等峰都与6-氨基己酸相近，1050cm-1、1320cm-1、1404cm-1、1586cm-1、1618cm-1等峰都与甘氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等氨基酸相近。通过实验确定了氨基酸的存在，证明了该样品成功引入了刀豆凝聚素A。
一种用于对溶液中大肠杆菌浓度进行检测的方法，包括以下步骤：
(a)获取权利要求1中制得的用于对溶液中大肠杆菌浓度检测的传感器，将其一端的单模光纤接入光源，另一端的单模光纤接入光谱分析仪；
(b)配置50cfu/ml、100cfu/ml、200cfu/ml、300cfu/ml、400cfu/ml、500cfu/ml和600cfu/ml的大肠杆菌浓度的溶液，将步骤(a)中的传感器分别放入上述溶液中并获取相应的光谱图；
(c)根据图1至图3所示，在步骤(b)中所测得的所有光谱图中，选取1152nm～1156nm范围内波谷的中心波长，计算得到每1cfu/ml大肠杆菌浓度在光谱图中的偏移量为3.43pm，不含大肠杆菌的液体的光谱图中对应1152nm～1156nm范围内波谷的中心波长为1554.8nm，并通过使用origin软件线性拟合得到y＝a-bx，拟合系数R2＝0.95649，灵敏度为3.43pm/(cfu/ml)，即x＝(a-y)/b，如图4所示，其中a为不含大肠杆菌液体检测光谱图中选取波谷的中心波长，y为待检测溶液检测光谱中选取波谷的中心波长，b为每1cfu/ml浓度大肠杆菌在光谱中的偏移量，x为待检测溶液大肠杆菌的浓度；
(d)将步骤(a)中的传感器放入待检测溶液Ⅰ中并获取该溶液的光谱图，其中1152nm～1156nm之间波谷的中心波长，代入公式x＝(a-y)/b计算得到溶液中大肠杆菌的浓度为96cfu/ml。
将步骤(a)中的传感器放入待检测溶液Ⅱ中并获取该溶液的光谱图，选取其中1152nm～1156nm之间波谷的中心波长，代入公式x＝(a-y)/b计算得到溶液中大肠杆菌的浓度为366cfu/ml。
将步骤(a)中的传感器放入待检测溶液Ⅲ中并获取该溶液的光谱图，选取其中1152nm～1156nm之间波谷的中心波长，代入公式x＝(a-y)/b计算得到溶液中大肠杆菌的浓度为528cfu/ml。
在上述步骤中，从图1至图3中可以看出随着浓度的增大，传感器的监测干涉波谷随着大肠杆菌浓度的增加呈现了向短波长方向偏移的现象，称之为蓝移。其原因是：改性石墨烯复合敏感膜中的刀豆凝聚素A可以与溶液中的大肠杆菌发生反应，薄膜自身折射率将发生改变，使光子晶体光纤的包层有效折射率发生改变，导致光子晶体光纤中纤芯与包层的光程差发生变化，因此可以从光谱仪上观察到光谱中监测的干涉波谷将发生偏移，从而将大肠杆菌的浓度与波长的偏移联系起来，达到检测浓度的目的。
选用浓度为400cfu/ml的大肠杆菌溶液加入水槽中来测试响应时间，对于时间的记录，本实施例中以3秒为取样间隔来保存光谱数据，实验过程在室温24℃的条件下进行，测试结果如图5所示。整个传感器从开始到响应完成时间约为15秒，由于该传感器的反应机理为生物反应，因此可以实现超快响应。
实施例2
作为本发明的另外一种实施方式，本具体实施方式中的用于对溶液中大肠杆菌浓度检测的传感器的制作方法，包括以下步骤：
(1)将Pbs缓冲液与无水甲醇按照1.2～1的体积比进混合均匀得到混合溶液，然后将混合溶液与麦芽糖粉末、1-氨基芘粉末和氰基硼氢化钠粉末按照380∶1.15∶1∶0.6的质量比进行混合，在密封且在80℃的环境下搅拌，然后将生成物洗涤、抽滤后得到复合材料粉末；
(2)将步骤(1)中得到的复合材料粉末与无水乙醇和Pbs缓冲液按照1∶180∶180的质量比进行混合，进行超声振荡使其分散均匀得到复合材料溶液，然后将石墨烯量子点溶液按照1∶2.5的体积比加入到复合材料溶液中，进行超声振荡使其反应得到生成物溶液A，然后将刀豆凝聚素A按照1:9000的摩尔比加入到生成物溶液A中，在0℃的环境下进行超声振荡使其反应得到生成物溶液B；
(3)获取一根光子晶体光纤，将其浸入到步骤(2)中得到的生成物溶液B中，数分钟后提出置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥至恒重，使光子晶体光纤表面形成厚度为2.8μm的石墨烯复合膜层，得到覆膜光子晶体光纤，并将其两端进行切平处理；
(4)获取两根单模光纤，分别采用粗锥的熔接方式熔接在覆膜光子晶体光纤的两端，单模光纤的端面中心与覆膜光子晶体光纤的端面中心相对应，进而制得传感器。
在具体实施的过程中，其中步骤(3)，将光子晶体光纤浸入到生成物溶液B中，再提出置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥至恒重，可以重复多次实施，为了确保镀膜的均匀性。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (2)

1.一种用于对溶液中大肠杆菌浓度检测的传感器的制作方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将Pbs缓冲液与无水甲醇按照(0.8∶1)～(1.5∶1)的体积比进混合均匀得到混合溶液，然后将混合溶液与麦芽糖粉末、1-氨基芘粉末和氰基硼氢化钠粉末按照(300∶1∶1∶0.5)～(400∶1.2∶1∶0.7)的质量比进行混合，在密封且在50～80℃的环境下搅拌，然后将生成物洗涤、抽滤后得到复合材料粉末；
(2)将步骤(1)中得到的复合材料粉末与无水乙醇和Pbs缓冲液按照(1∶150∶150)～(1∶200∶200)的质量比进行混合，进行超声振荡使其分散均匀得到复合材料溶液，然后将石墨烯量子点溶液按照1∶2～1∶4的体积比加入到复合材料溶液中，进行超声振荡使其反应得到生成物溶液A，然后将刀豆凝聚素A按照(1:8000)∶(1:12000)的摩尔比加入到生成物溶液A中，在0～10℃的环境下进行超声振荡使其反应得到生成物溶液B；
(3)获取一根光子晶体光纤，将其浸入到步骤(2)中得到的生成物溶液B中，数分钟后提出置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥至恒重，使光子晶体光纤表面形成厚度为1～3μm的石墨烯复合膜层，得到覆膜光子晶体光纤，并将其两端进行切平处理；
(4)获取两根单模光纤，分别采用粗锥的熔接方式熔接在覆膜光子晶体光纤的两端，单模光纤的端面中心与覆膜光子晶体光纤的端面中心相对应，进而制得传感器。
2.一种用于对溶液中大肠杆菌浓度进行检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(a)获取权利要求1中制得的用于对溶液中大肠杆菌浓度检测的传感器，将其一端的单模光纤接入光源，另一端的单模光纤接入光谱分析仪；
(b)配置多个含有大肠杆菌不同浓度的溶液，将步骤(a)中的传感器分别放入上述溶液中并获取相应的光谱图；
(c)在步骤(b)中所测得的所有光谱图中，选取同一段波谷的中心波长，并通过线性拟合得到y＝a-bx，即x＝(a-y)/b，其中a为不含大肠杆菌液体检测光谱图中选取波谷的中心波长，y为待检测溶液检测光谱中选取波谷的中心波长，b为每1cfu/ml浓度大肠杆菌在光谱中的偏移量，x为待检测溶液大肠杆菌的浓度；
(d)将步骤(a)中的传感器放入待检测溶液中并获取该溶液的光谱图，选取其中一段波谷的中心波长，代入公式x＝(a-y)/b计算得到溶液中大肠杆菌的浓度。
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