CN109970726A - 一种用于检测过氧化氢的热活化延迟荧光探针 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测过氧化氢的热活化延迟荧光探针，基于含时密度泛函理论计算了用于检测过氧化氢的两种荧光探针分子Mol1和Mol2的光学性质，并对它们的响应机理进行了阐释。结果表明，与实验探针分子Mol1相比，Mol2由于加入了无金属侧链，其吸收峰和发射峰都发生了明显的红移，表现出了更好的荧光探针性质。此外，我们通过分析分子轨道分布和电荷转移差图，阐释了探针的光诱导电子转移机理。我们通过最优化泛函的方法对两个探针的S‑T能隙进行了计算，发现设计出的分子Mol.2的能隙为0.31eV,是具有延迟荧光效应的探针分子。

Description

一种用于检测过氧化氢的热活化延迟荧光探针
技术领域
本发明属于荧光探针的设计制备领域，具体涉及将延迟荧光与荧光探针相结合，延长探针分子的发光时间。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
活性氧是生物有氧代谢过程中的一种副产品，具有很高的生物分子反应活性。然而，过多的活性氧会导致癌症、细胞凋亡等。过氧化氢(H2O2)是活性氧的一种，一直以来备受人们的关注，因为它参与了可逆氧化蛋白质(如硫氧还蛋白)的信号转导。据一个外国的研究团队报道，姜黄素可以针对胞质或核硫氧还蛋白系统，提升海拉细胞的氧化应激反应能力。
在生物环境里，荧光成像是一个值得称道，而且广泛使用的方法。因为它具有高选择性、高空间分辨率和易用性等特征。相比荧光成像技术，荧光寿命在纳秒级别的荧光探针，使用时间分辨荧光显微法有许多优点。实验上，可以引入一个适当的脉冲激光，使得短暂的背景荧光得以消除。含重金属元素的荧光探针也可用于荧光成像技术，这是因为它们有较长的荧光寿命。然而，这些荧光探针往往将分子激发三重态的能量通过单线态氧转移到周围的细胞和组织，这会致使细胞凋亡或坏死，从而导致细胞死亡。而且，这些含重金属元素的荧光探针具有毒性，这在实际应用中必须加以考虑。另一方面，已有的许多有机荧光探针对细胞是无毒，但这些荧光探针的荧光寿命较短。为了延长荧光探针的寿命，并且避免了重金属元素对细胞的毒性作用。
发明内容
为了延长荧光探针的寿命，并且避免了重金属元素对细胞的毒性作用。本发明利用延迟荧光的发光机理对已有的有机荧光探针进行修饰，来达到这一目标。在这项工作中，本发明根据实验上的数据，设计了两个荧光探针。通过引入了从三重态到单重态的转换机制，减小了三重态和单重态间的能差，而且没有使用重金属配合物。本发明研究了探针和产物的激发波长、发射波长等光学性质。本发明预计，其中一个探针分子，是很好的E-型延迟荧光材料。在常温下，该延迟荧光探针分子就可以有较长的发光寿命，可以应用于时间分辨荧光成像技术。
本发明的目的之一是应用时间密度泛函理论研究两种荧光探针Mol1和Mol2在H2O2中的光学性质。本发明发现这两种探针都具有良好的探针性能。与Mol1+相比，探针Mol2+的吸收和发射波长出现了红移，本发明研究了良种探针的响应机制，表现为光诱导的电子转移(PET)。此外，本发明可以看到Mol2+的S-T能隙小于Mol1+，这就决定了它更容易产生延迟荧光。总的来说，Mol2是一种具有良好检测性能的TADF探针。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于检测过氧化氢的热活化延迟荧光探针Mol2，所述热活化延迟荧光探针Mol2的结构式如下：
在一些实施例中，所述热活化延迟荧光探针Mol2的发射峰位于1008nm处。
在一些实施例中，所述热活化延迟荧光探针Mol2的S-T能隙小于0.39eV。
本发明还提供了一种用于检测过氧化氢的荧光探针Mol1，所述荧光探针Mol1的结构式如下：
本发明中荧光探针Mol1、Mol2的具体合成方法，由本领域技术人员根据常规技术手段进行合成即可，只要获得的荧光探针Mol1、Mol2结构式与上述相同，即可获得良好地检测过氧化氢(H2O2)的性能。
本发明还提供了一种过氧化氢荧光检测设备，包括：任一上述的热活化延迟荧光探针Mol2。
本发明还提供了一种检测过氧化氢的试剂盒，包括：任一上述的热活化延迟荧光探针Mol2。
本发明还提供了任一上述的热活化延迟荧光探针Mol2在活性氧检测中的应用。
本发明还提供了任一项所述的热活化延迟荧光探针Mol2在检测活细胞中H2O2的应用。
本发明还提供了一种检测过氧化氢的方法，包括：
将任一上述的荧光探针溶解在生理盐水、缓冲液或培养液中，配制成储备液储存待用；
加入含有细胞组织的适当缓冲液中进行测试。
本发明还提供了一种非疾病的诊断与治疗中检测活细胞内过氧化氢的方法，包括：
(1)将含有任一上述的荧光探针的缓冲溶液5-10μM加入培养好的细胞放于培养箱中孵育10-30分钟；
(2)将细胞用生理PBS缓冲液洗去多余的探针，然后进行激光共聚焦显微成像，如果是检测内源性的物质，则是直接进行共聚焦成像，如果是外加检测物的，则是加了检测物后，再次孵育10分钟，进行成像。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明基于含时密度泛函理论计算了用于检测过氧化氢的两种荧光探针分子Mol1和Mol2的光学性质，并对它们的响应机理进行了阐释。结果表明，与实验探针分子Mol1相比，Mol2由于加入了无金属侧链，其吸收峰和发射峰都发生了明显的红移，表现出了更好的荧光探针性质。此外，我们通过分析分子轨道分布和电荷转移差图，阐释了探针的光诱导电子转移机理。我们通过最优化泛函的方法对两个探针的S-T能隙进行了计算，发现设计出的分子Mol.2的能隙为0.31eV,是具有延迟荧光效应的探针分子。我们的工作为实验上进一步的工作起到了指导作用。
(2)本发明利用延迟荧光的发光机理对已有的有机荧光探针进行修饰，来达到这一目标。在这项工作中，本发明根据实验上的数据，设计了两个荧光探针。通过引入了从三重态到单重态的转换机制，减小了三重态和单重态间的能差，而且没有使用重金属配合物。本发明研究了探针和产物的激发波长、发射波长等光学性质。本发明预计，其中一个探针分子，是很好的E-型延迟荧光材料。在常温下，该延迟荧光探针分子就可以有较长的发光寿命，可以应用于时间分辨荧光成像技术。
(3)本发明的操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1是实施例1中Mol1，Mol2，Mol1+，Mol2+分子几何结构；
图2是实施例1中HOMO-LUMO轨道；
图3是实施例1中Mol1和(b)Mol1+分子的光诱导电子转移过程。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，针对目前有机荧光探针具有毒性或荧光寿命较短的问题。因此，本发明新型的荧光探针Mol.2，延长了荧光的发光时间，以便于更好地实现荧光显微成像的效果。在原有实验探针分子的基础上，加上无金属侧链设计形成的。其S-T的能隙小于0.39eV，具有延迟荧光效应，延长了分子的发光时间。
实施例1：
本发明将检测H2O2的探针命名为Mol1和Mol2，它们与H2O2的产物分别命名为Mol1+和Mol2+。研究分子的几何结构如图1所示。
与探针Mol1相比，Mol2的荧光团有两个附属结构。通过Xiong的实验(DOI:10.1021/ja502292p)，可以假设这两个侧链可能导致分子的ΔEs-t减小，这更有利于产生延迟荧光。同时，与H2O2反应后，探针Mol1和Mol2的上部形成一个羧基。产物分子的几何结构发生了很大的变化，因此本发明可以确定其光学性质与探针分子相比也发生了变化。
根据前线轨道理论，分子系统的前线轨道是决定一个系统的化学反应和各种性质的关键。其他能量的分子轨道对系统的影响很小，可以忽略不计。根据完全优化的几何结构，最高占据分子轨道(HOMO)与最低未占据分子轨道(LUMO)之间的前线轨道能隙ΔEs-t如图2所示。可以看出，探针Mol1和Mol2的ΔEs-t分别为2.61eV和2.40eV。与H2O2反应后，产物Mol1+和Mol2+的ΔEs-t分别增加到3.10eV和2.83eV。此外，本发明可以看到探针Mol1和Mol2的HOMO和LOMO的分子轨道重合度很小，反应后分子内的电荷发生较大的转移，产物Mol1+和Mol2+的HOMO和LUMO轨道基本重合。所以本发明可以推测它们是开关型探针。
单光子吸收和发射
在分子基态和激发态优化的基础上，本发明计算了分子的光学性质，包括单光子吸收和荧光发射过程。考虑到荧光探针主要工作在活细胞和组织中，而其中大部分是水。在不失去普遍性的前提下，本发明在水溶剂条件下进行了研究。本发明计算了化合物的单光子吸收(OPA)特性，包括激发能、相应的OPA波长、振子强度和在H2O2中的跃迁特性。本发明将化合物OPA特征列在表1中。
表1水中分子的单光子吸收特性，包括激发能量Eopa(eV)，对应的波长λopa(nm)，振子强度δopa(a.u)和过渡特性。
化合物Mol1和Mol2的吸收峰位于419nm和508nm，相应的振子强度是0.36和0.24。当与H2O2发生反应时，Mol1+的吸收峰在420nm处，振子强度为0.41，Mol2+的吸收峰在504nm处，振子强度为0.29。与反应前相比，两个探针的最大OPA波长没有明显的变化，但振子强度增加，这意味着该产物具有较好的光吸收能力。此外，产物Mol2+的吸收波长从420nm到504nm，与产物Mol1+相比，可以减少激发光的能量，从而减少对生物体的伤害。
此外，本发明还研究了探针的荧光发射特性。根据Kasha规则，荧光只从第一个激发态到基态有可观的产量。基于完全优化的第一激发态几何结构，表2列出了这些探针和产物的化合物、发射特性，包括发射能量、相应的发射波长、振子强度、过渡特性和在水中的荧光寿命。并且辐射寿命也是由爱因斯坦辐射理论计算出来的。
表2水中分子的单光子发射特性，包括发射能量Eope(eV)、相应的发射波长λope(nm)、振子强度δope(a.u)、过渡特性和荧光辐射寿命τ(ns)
由表2可知，化合物Mol1、Mol2的发射峰分别位于859nm、1008nm处，振子强度仅为0.01。与H2O2反应后，Mol1+、Mol2+的发射强度分别增大到0.44和0.28，发射波长分别为580nm和742nm。与Mol1+相比，Mol2+的发射波长有较大的红移，在生物细胞检测中有较好的表现。分子的发射主要是由于HOMO对LUMO的贡献，分子的跃迁概率与分子轨道重叠成正比，因此本发明得到的结果与分子结构的分析是一致的。发射寿命也是评价探针的一个重要决定因素。反应后，Mol1+化合物的发射寿命较短，为11.5ns，Mol2+的发射寿命为29.5ns。较短的荧光寿命意味着较强的发射强度，而两个较短的荧光寿命很容易引起激发光的干扰。本发明计算了两种产物的瞬时荧光速率，并在纳秒级观察了它们的瞬态荧光辐射寿命。
发光机理
通过分析探针的分子轨道分布和电荷转移，本发明研究了探针的响应机理。根据探针的一般特性，可以预测当化合物被激发时，受体和荧光团之间可能存在电子转移。本发明通过对分子轨道分布图的分析，证明了该方法的有效性。通过计算，本发明可以得到两个探针具有相同的响应机制。这里，本发明以Mol1为例。从分子结构上看，Mol1和Mol1+是由苯和荧光团组成的。激发光激发分子体系时，苯基与荧光团之间可能发生电子转移，本发明通过分子轨道演示电子转移过程。此外，本发明希望从分子轨道的理论角度来研究荧光探针分子的发光机理。
通过观察图3中分子轨道的分布,本发明可以发现两个探针分子的前线分子轨道是局部的荧光团或苯基,本发明可以重新指定一系列的分子轨道为一组分子轨道和分子苯基分子轨道。该方法的具体操作如下:先得到一系列分子的轨道分布，通过观察轨道分布，主要分布在荧光团或苯基中的分子轨道可以选作为荧光分子轨道。如此，该方法得到的Mol1荧光团的HOMO和LUMO分别对应于Mol1的HOMO、LUMO+1、苯基的HOMO和LUMO分别对应于HOMO-4和LUMO。可以看出，Mol1荧光团的HOMO和LUMO能分别为-5.91eV和-2.73eV，苯基的LUMO能为-3.25eV。由于苯基的LUMO能量介于荧光团的HOMO和LUMO能量之间，因此在光激发后苯基和荧光团之间容易发生光诱导电子转移(PET)过程，荧光猝灭。然而,与过氧化氢的反应后,产物Mol1+的荧光团和苯基团的前线轨道能量改变。苯基团的LUMO能量增加到-2.01eV,高于荧光团的LUMO能量，因此PET过程禁止，极大地增强了荧光强度。综上所述，本探针的响应机制是H2O2调节PET的开关，进而影响荧光猝灭与恢复之间的转换。
能隙是决定上述转换过程的最重要的参数之一。绝热S-T能隙的计算非常耗时。这里采用了一种简单可靠的方法。当然，首先要确定依赖于电荷转移量的函数，计算两个产物之间的电荷转移，结果如表3所示。
表3分子单线态激发状态S1，三重激发态CT态，LE态的能量，和能级间隙,单位是(eV)
产物分子Mol1+和Mol2+的电荷转移数分别为0.071eV和0.120eV，相应的HF％分别为2.98％和5.0％。因此，使用MPWLYP1M函数。计算E0-0(S1)，E0-0(3CT)和E0-0(3LE)。通过比较E0-0(3CT)和E0-0(3LE)，可以确定T1的能量状态，ΔS-T也能被计算。
用OHF法计算的两种探针产物的Δs-T如表3所示。Mol1+和Mol2+的Δs-t能隙分别为0.39eV和0.31eV。它们比通常认为的延迟荧光产生阈值0.42eV要小。此外，Mol2+的Δs-t小于Mol1+，这种差异主要来自于不同的HOMO-LUMO重叠度，如表3所示。Mol1+和Mol2+的HOMO-LUMO重叠率分别为75.9％和67.7％。与Mol1+相比，Mol2+的HOMO-LUMO重叠度有所降低。造成这个结果的原因是，HOMO-LUMO轨道重叠的程度越大，S-T能量差就越小。因此Mol2+具有很大的TADF潜力，这就决定了Mol2是一个很好的TADF探针。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种用于检测过氧化氢的热活化延迟荧光探针Mol2，其特征在于，所述热活化延迟荧光探针Mol2的结构式如下：
2.如权利要求1所述的热活化延迟荧光探针Mol2，其特征在于，所述热活化延迟荧光探针Mol2的发射峰位于1008nm处。
3.如权利要求1所述的热活化延迟荧光探针Mol2，其特征在于，所述热活化延迟荧光探针Mol2的S-T能隙小于0.39eV。
4.一种用于检测过氧化氢的荧光探针Mol1，其特征在于，所述荧光探针Mol1的结构式如下：
5.一种过氧化氢荧光检测设备，其特征在于，包括：权利要求1-3任一项所述的热活化延迟荧光探针Mol2。
6.一种检测过氧化氢的试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1-3任一项所述的热活化延迟荧光探针Mol2。
7.权利要求1-3任一项所述的热活化延迟荧光探针Mol2在活性氧检测中的应用。
8.权利要求1-3任一项所述的热活化延迟荧光探针Mol2在检测活细胞中H2O2的应用。
9.一种检测过氧化氢的方法，其特征在于，包括：
将权利要求1-4任一项所述的荧光探针溶解在生理盐水、缓冲液或培养液中，配制成储备液储存待用；
加入含有细胞组织的适当缓冲液中进行测试。
10.一种非疾病的诊断与治疗中检测活细胞内过氧化氢的方法，其特征在于，包括：
(1)将含有权利要求1-4任一项所述的荧光探针的缓冲溶液5-10μM加入培养好的细胞放于培养箱中孵育10-30分钟；
(2)将细胞用生理PBS缓冲液洗去多余的探针，然后进行激光共聚焦显微成像，如果是检测内源性的物质，则是直接进行共聚焦成像，如果是外加检测物的，则是加了检测物后，再次孵育10分钟，进行成像。
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