CN109908139A - 西洛司特在制备用于治疗急性肾损伤相关病症的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种西洛司特的新适应症。本发明提出了西洛司特可以减轻顺铂诱导的急性肾损伤相关病症，包括急性肾小管损伤、肾功能、肾小管细胞凋亡、炎症因子的表达及分泌等病症，主要是通过抑制肾小管细胞的凋亡来减轻急性肾损伤。

Description

西洛司特在制备用于治疗急性肾损伤相关病症的药物中的 用途

技术领域

本发明涉及西洛司特(Cilomilast)的新用途，具体地涉及Cilomilast在制备 用于顺铂诱导的急性肾损伤相关病症的药物中的用途。

背景技术

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是指突然发生的肾功能下降，可伴 或不伴有少尿或无尿，为由肾小球、肾小管、肾间质或血管等病变引起的肾功能 在短期内急剧下降或丧失的临床综合征，表现为突然不能保持正常的水电解质平 衡，体内代谢产物堆积，出现氮质血症、水及电解质紊乱和代谢性酸中毒等症状。 AKI是一种可继发于多种疾病的临床综合征，具有发病急、进展快、病死率高的 特点，是慢性肾脏病的重要病因之一。它是一组严重的临床综合征群，死亡率高， 延误诊治或治疗不当可导致肾功能呈不可逆改变，使患者进入维持性透析，给社 会经济带来很大负面影响。

AKI的患病率社区为1％，在医院为7.1％。发病率为每年医院获得的AKI 的病死率为10％～80％，合并多脏器功能衰竭的病死率>50％，需要肾替代疗法的 病死率是80％，因此AKI具有高发病率和致死率。它的主要病因是缺血，肾有 毒物质所致或原发性肾脏病，肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cells，RTEC) 损伤是AKI的主要病理基础。在疾病状态下，功能活跃的RTEC更容易受到肾 毒素等造成的损伤而发生急性肾小管坏死(Acute Tubular Necrosis，ATN)，引起 AKI及肾功能衰竭。

顺铂(Cisplatin，CP)是临床上治疗实体肿瘤(包括头部、颈部、卵巢等) 最常用及最有效的化疗药物之一。临床调查表明，由于其具有剂量依赖性的肾脏 毒性作用，极大地限制其临床应用，顺铂诱导的AKI发生率为25％～35％，其 引起损伤的主要机制包括诱导肾小管上皮细胞的氧化应激引起细胞凋亡，并且能 够触发炎症反应参与肾脏损伤。如何切实有效地预防和减轻顺铂引起的AKI，更 好地发挥顺铂抗肿瘤作用已成为当前亟待解决的问题。

在病人和动物模型中肾小管细胞的丢失——包括小管凋亡和坏死被认为是 AKI发生发展中主要的参与细胞。另外，脱落的肾小管细胞与蛋白在管腔中形成 管型阻断尿流，损伤的小管可能会进一步促进肾脏间质纤维化、间质炎症、毛细 血管丢失。所以如何阻止肾小管细胞丢失是治疗AKI的关键。

顺铂进入细胞后能够激活Bcl-2家族中的促凋亡蛋白如Bax，促使线粒体通 透性转换孔开放，细胞色素C、凋亡诱导因子等促凋亡因子从线粒体释放到胞浆， 产生caspase级联反应，最终导致凋亡的发生。

Cilomilast(Cilo)是磷酸二酯酶4(PDE4)的选择性抑制剂，目前处于临床 III期研究阶段，主要用于治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)。磷酸二酯酶是一个 催化环腺苷酸(cAMP)和环鸟苷酸(cGMP)水解的超家族，也是细胞内降解 环核苷酸的唯一途径。PDE4具有专一性水解细胞内cAMP的功能，能将细胞内 的cAMP水解生成无活性的5’核苷酸，从而阻断它所介导的生理功能。cAMP 是细胞内重要的第二信使，参与体内如炎症反应、免疫反应、细胞的分裂分化、 神经递质的传递等重要的生理功能。有研究显示，在豚鼠气道炎症模型中，Cilomilast具有与泼尼松龙类似的抗炎能力。目前关于Cilomilast的研究较多集 中于呼吸系统疾病(COPD、过敏性鼻炎等)和神经系统疾病(抑郁症)等方面。 但是Cilomilast作为另一种PDE4抑制剂，尚未有能够改善顺铂引起的AKI的报 道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Cilomilast在制备用于减轻顺铂诱导的AKI相关 病症的药物中的用途。

本发明通过动物实验和体外细胞实验两个方面发现Cilomilast对于减轻顺铂 诱导的AKI相关病症的药物中的用途。

具体地，本发明提出了Cilomilast在制备用于减轻顺铂诱导的急性肾小管损 伤的药物中的用途。

本发明还提出了Cilomilast在制备用于减轻顺铂诱导的AKI肾功能的药物中 的用途。

进一步地，本发明发现了Cilomilast在制备用于减轻顺铂诱导的肾小管细胞 凋亡的药物中的用途。

本发明还提出了Cilomilast在制备用于减轻顺铂诱导的肾脏炎症分子的表达 及分泌的药物中的用途。具体地，所述肾脏炎症因子为IL-6和TNF-α。

本发明意外地发现了Cilomilast对于减轻顺铂诱导的AKI相关病症具有显著 的效果，为顺铂诱导的AKI相关病症提供新的治疗方法。

附图说明

图1为用顺铂造模以及用Cilomilast治疗后的肾功能及糖原染色(PAS)结 果；

图2为QPCR法及ELISA法研究Cilomilast对顺铂诱导的肾脏炎症分子的 表达及分泌的影响；

图3为QPCR法、Western blot研究Cilomilast对顺铂诱导的小管细胞凋亡及 肾脏损伤相关分子的影响；

图4为流式细胞及QPCR法检测Cilomilast在体外对顺铂诱导的小管细胞凋 亡；

图5为QPCR法研究Cilomilast在体外对顺铂诱导的肾脏小管细胞凋亡以及 炎症的影响。

具体实施方式

本发明中Western blot、实时荧光定量PCR、PAS染色、流式细胞法的具体 操作步骤如下：

Western blot：

组织裂解液提取肾脏组织总蛋白，采用BCA法测定蛋白质浓度，取30μg 蛋白上样，10％或12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS.PAGE)，320mA×1.5h湿转 转至PVDF膜上，封闭液室温封闭1h，TBST洗脱后加入一抗，Bax(Cell Signaling Technology)，Caspase-3(Proteintech)，Cleaved caspase3(Cell SignalingTechnology)， GAPDH(CellSignalingTechnology)，4℃孵育过夜。TBST洗膜5次，每次5min， 以相应二抗室温孵育1h，TBST洗膜5次。抗原抗体复合物用增强化学发光法 (ECL)显示，用伯乐凝胶成像分析系统曝光并扫描，蛋白质定量采用对目的条带 进行灰度值分析，以目的条带灰度值/GAPDH灰度值表示目的蛋白的相对表达 量。

实时荧光定量PCR(QPCR)：

提取肾脏组织总RNA，用分光光度法测定RNA溶液浓度和纯度。利用逆转 录试剂盒(Takara,DaLian)将1μgRNA逆转录成cDNA，按照下面的反应体系 检测不同基因的变化情况。

a.反应体系

b.PCR热循环参数

PAS染色：

4％多聚甲醛固定组织48h，石蜡包埋切片，脱蜡至水，蒸馏水冲洗，70％ 酒精冲洗3次。浸入高碘酸酒精溶液10min(此溶液温度以17－20度为好)， 70％酒精洗后，入还原液中1min(此溶液温度以17－20度为好)，70％酒精洗 后，入无色盐基性品红溶液1-1.5h，冬天室温较低时，可放入37度温箱。流水 冲洗10min，用Mayer\'s苏木素复染液复染细胞核3-5min，再用1％盐酸酒精分 化，流水冲洗后，脱水透明，最后封片。

Annexin V/PI凋亡双染实验:

取对数生长期肾小管上皮细胞(RTEC)接种于6孔板中，分别给予顺铂及Cilomilast，药物作用24h后，用无EDTA胰酶消化细胞，以1000rpm转速离心 5min，收集细胞，弃掉培养基。用预冷过的PBS溶液洗涤细胞两次，在其中加 入400μL 1×BindingBuffer悬浮细胞，细胞密度大约为1×10⁶cells/mL。每组 细胞悬液分别加入5μLAnnexin V和5μL PI，轻轻混匀后室温避光条件下孵育 15min。1h内用流式细胞仪检测。

下面通过具体的实施案例详细说明本发明。

实施例1 Cilomilast对顺铂诱导的急性肾损伤肾功能的影响。

取体重18～22g的雄性C57BL/6小鼠，分为3组，即对照组，顺铂模型组以 及Cilomilast治疗组(n＝8)。

对照组：每日1次腹腔注射等体积介质，共4天；

顺铂模型组：腹腔注射，20mg/kg，单次给药；

Cilomilast治疗组：Cilomilast提前给药1天(腹腔注射，30mg/kg，Cilomilast，200μL/次)，随后单次给药顺铂(腹腔注射，20mg/kg)，Cilomilast再治疗3 天，顺铂注射72h后取血，留取肾组织。

将血标本离心(20min，3000r/min),用肌酐试剂盒(Creatinine Assay Kit(cat:K625-100,biomars))、尿素氮试剂盒(QuantiChrom Urea Assay kit(cat:DIUR-500,Hayward,CA))测定血肌酐、尿素氮，实验结果见图1A。

图1B为用顺铂造模以及用Cilomilast治疗后的PAS染色结果。从结果中可 以看出，给予顺铂后造模成功，血肌酐、尿素氮显著升高，提示肾脏受到损伤。 而使用Cilomilast治疗后，可以明显改善肾功能，肌酐、尿素氮水平与模型组相 比模型降低，p<0.01。根据PAS染色结果，顺铂组肾小管结构破坏，蛋白管型 形成，Cilomilast能够显著改善顺铂诱导的肾脏损伤。

实施例2 Cilomilast对顺铂诱导的肾脏炎症分子的表达及分泌的影响。

利用QPCR法及ELISA法研究Cilomilast对顺铂诱导的肾脏炎症分子的表 达及分泌的影响。

如图2A所示，利用ELISA法研究Cilomilast对顺铂诱导的肾脏炎症分子的 表达及分泌的影响。在顺铂诱导的AKI模型中，顺铂模型组的炎症因子IL-6表 达水平与对照组相比明显升高，p<0.01。而Cilomilast治疗组能够显著降低IL-6 表达水平，p<0.01。

如图2B所示，利用QPCR法研究Cilomilast对顺铂诱导的肾脏炎症分子的 表达及分泌的影响。在顺铂诱导的AKI模型中，顺铂模型组的炎症因子IL-6、 TNF-α表达水平与对照组相比明显升高，p<0.05。而Cilomilast治疗组能够显著 降低IL-6、TNF-α表达水平，p<0.05。

结果表明，Cilomilast能够明显降低顺铂诱导的AKI模型中IL-6、TNF-α表 达水平。

实施例3 Cilomilast对顺铂诱导的小管细胞凋亡及肾脏损伤相关分子的影响。

利用QPCR法和Western blot法检测肾脏凋亡及损失相关分子的表达水平 来测定Cilomilast对顺铂诱导的AKI的改善情况，结果如图3所示，顺铂模型组 的凋亡相关分子Bax、Cleaved caspase 3表达明显升高；损伤相关分子KIM-1， NGAL表达明显升高。而Cilomilast治疗组能够显著降低Bax、KIM-1、NGAL、 Cleaved caspase 3的表达水平。

结果表明，Cilomilast能够明显降低顺铂诱导的肾脏凋亡及损失相关分子的 表达水平。

实施例4 Cilomilast在体外对顺铂诱导的小管细胞凋亡的影响。

体外应用RTEC细胞(小鼠肾小管上皮细胞系)，选择对数生长期的细胞接 种于6孔板中，分别给予顺铂(5μg/mL)及Cilomilast(5μM)，药物作用24h 后，利用流式细胞仪检测小管细胞的凋亡发生率。结果如图4所示，顺铂模型组 细胞发生凋亡的比率明显升高，可以观察到约40％的凋亡率，Cilomilast治疗组 与顺铂模型组相比，发生凋亡的比率明显降低，观察到约20％的凋亡率。

结果表明，顺铂刺激RTEC细胞24h，可以明显诱导细胞凋亡的发生。给予Cilomilast治疗后，能够明显减少顺铂诱导的细胞凋亡的发生，提示Cilomilast 有可能改善顺铂诱导的细胞凋亡。

实施例5 Cilomilast在体外对顺铂诱导的小管细胞凋亡以及炎症的影响。

体外应用RTEC细胞(小鼠肾小管上皮细胞系)，选择对数生长期的细胞接 种于6孔板中，分别给予顺铂(5μg/mL)及Cilomilast(5μM)，药物作用24h 后，利用QPCR检测Bax、IL-6、IL-1β的表达。结果如图5所示，顺铂模型组， 凋亡相关蛋白表达水平上调。Cilomilast治疗组与顺铂模型组相比，下调IL-6及 IL-1β表达水平。

结果表明，顺铂刺激RTEC细胞24h，给予Cilomilast处理后能降低炎症因 子的表达，同时抑制由顺铂所诱导的肾小管细胞凋亡。

Claims (6)

1.西洛司特在制备用于减轻顺铂诱导的急性肾损伤相关病症的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述急性肾损伤相关病症为急性肾小管损伤。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述急性肾损伤相关病症为急性肾损伤肾功能。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述急性肾损伤相关病症为肾小管细胞凋亡。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述急性肾损伤相关病症为肾脏炎症因子的表达及分泌。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述肾脏炎症因子为IL-6和TNF-α。