CN109897784A - 一种新型的两阶段自养-异养培养促进微藻脂质的方法 - Google Patents

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本发明公开一种新型的两阶段自养‑异养培养促进微藻脂质的方法，该方法可以同时有效净化酿酒废水并显著提高小球藻脂质的产量。该方法包含两个阶段，第一阶段为微藻光合自养阶段：小球藻UTEX‑265在酿酒废水BWW#2(经过厌氧消化器处理)中进行培养7‑10天，完成小球藻收集后，排出已经净化的废水。此阶段TN含量从75mg/L降到7mg/L，TP含量从20mg/L降到2mg/L，达到排放要求。第二阶段为光合异养阶段：在5‑7天的培养期间外加有机碳源，第一阶段中大量生长的微藻在第二阶段受到营养胁迫大量利用BWW1中的有机碳进行光合异养培养，达到净化废水和提高微藻油脂生产力的目的，其中小球藻脂质最大产量为108mg/L day。本方法具有净化废水、抑制细菌污染、无需废水预处理、节约微藻收集的成本优点。

Description

一种新型的两阶段自养-异养培养促进微藻脂质的方法
技术领域
本发明属于废水处理和生物燃料生产领域,具体涉及一种新型的两阶段自养-异养培养促进微藻脂质的方法。
背景技术
微生物不仅仅能够生产生物燃料并且可以从大气中捕捉二氧化碳。在微生物培养系统中营养素和水是主要的开销最大的地方。实际上，化学肥料作为营养源导致了很高的花费以及能量的消耗，因此，利用微生物从废水中获取营养元素并产生物燃料是一种很经济型的方法。
目前，全世界酿造啤酒的数量大约是1339×106hetoliters(hL)，其中每hL产生5-6hL的废水BWW含有足够的总氮(TN)和总磷(TP)用于微藻培养[1]。传统上，酿酒废水(BWW)在厌氧消化器中进行处理以减少废水中的高浓度有机碳，因此，酿酒废水(BWW)在微藻培养过程中不仅具有作为无机营养源的潜力，而且具有足够的有机碳作为替代碳源。
有各种微藻培养模式，其中涉及光合自养，异养和兼养等不同培养方式。以这些方式培育小球藻对生物量和油脂生产力都有积极影响。兼养在其较高的生物量和油脂生产力方面优于光自养和异养模式。废水单一阶段兼养和异养培养相关的两个主要问题是有机底物的高成本以及含有机碳源造成的有害细菌的生长。在一个真实的废水系统中，有大量的内生细菌和大量废水需要处理，废水预处理步骤将成为影响微藻生物柴油生产的另一个成本因素。
营养元素充足是微藻生物质积累的必要因素，但是营养胁迫状态下微藻的脂质能够大量累积，所以在单一阶段培养方式下同时获得很高的生物质和脂质产量是不可能的。
发明内容
本发明的目的是克服上述背景技术中存在的问题，提出一种新型的两阶段自养-异养培养促进微藻脂质的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：两阶段光合自养-光合异养模式，其过程为：
1)将小球藻Chlorella vulgaris(UTEX-265)以接种体积为10％-30％(V接种物/V培养基)接种于TAP培养基中，置于光照下培养5-10天；
培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m2.s-1并在转速150rpm的振荡器上振荡，小球藻藻悬液在基体培养基中的吸光度调节为1.0；
2)光合自养阶段为模式的第一阶段：以接种体积为10％-30％(V接种物/V培养基)将小球藻接种于经厌氧消化处理后的酿酒废水BWW#2中培养7-10天，小球藻UTEX-265沉降10-24hrs后排出废水，收集底部小球藻UTEX-265；
酿酒废水(BWW)从市酿酒厂收集，酿酒废水(BWW#1)的TN＝30-45mg/L，TP＝12-16mg/L，TOC＝1400-1500mg/L，COD＝2000-3000mg/L；BOD＝1300±2.6mg/L，TSS＝300-320mg/L，PH＝5.5-6.0；
酿酒废水BWW#2的TN＝50-75mg/L，TP＝15-20mg/L，TOC＝80-100mg/L，COD＝100-150mg/L；BOD＝150±2.3mg/L，TSS＝100-130mg/L，PH＝6.5-7.5；
3)光合异养阶段为模式的第二阶段：在封闭的环境中(例如2L的圆柱形容器、培养箱、大型光合反应器等相对封闭环境，目的是为了减少和控制细菌污染)外加碳源，将完成第一阶段生长的小球藻UTEX-265投入培养5-7天；
4)净化的废水排放，收集小球藻可加以利用；
5)监测油脂。
与现有技术相比，本发明对酿酒废水的处理，同时可以充分提高藻类的产脂率，是一种多功能的模式，在两阶段培养模式中，微藻菌株首先在厌氧消化后的BWW(表示为BWW#2)中以光合自养模式生长，以有效利用无机营养素，达到生物质积累和更好地控制细菌增长的目的。在微藻生长晚期指数阶段，微藻暴露于葡萄糖或未经厌氧消化的酿酒废水(表示为BWW#1)等有机碳中。这种微藻培养系统可有效利用废水中的无机和有机营养物质，并抑制细菌污染，非常适合大规模的种植。在光合自养生长阶段，产生微藻生物量，而在第二阶段，在营养限制条件下，即超过营养物质消耗的条件下，投入有机碳如葡萄糖或是BWW#1，达到脂质积累的过程。具体如下：
1)可以不用对废水进行预处理、充分利用废水中的有机和无机营养元素和利用小球藻UTEX-265的自我沉降对微藻进行收集等，大大降低了培养微藻和处理废水的成本。
2)该模式有效控制了细菌的生长，适合大规模种植。
3)相对于传统单阶段培养模式，本发明大大提高了小球藻UTEX-265的脂质生产力。
附图说明
图1代表在BWW#1的灭菌状态和未灭菌状态以及在TAP培养基中小球藻UTEX-265的生长情况。
图2(a)代表在单级光合自养培养模式中培养小球藻UTEX-265，小球藻的生长曲线、BWW#2水质的PH、TN和TP含量的变化；
图2(b)代表在两阶段光合自养-异养模式的第二阶段中，小球藻UTEX-265在BWW#1中培养时，BWW#1的水质去除效率。
图3是代表两阶段光合自养-光合异养培养模式培养下使用葡萄糖或BWW#1作为有机碳源时小球藻(UTEX-265)的细胞干重和脂质含量：
x轴中，1＝单级光合自养；
2＝两阶段光合自养-光合异养模式(100％BWW#1)；
3＝两阶段光合自养-光合异养模式(3g/L葡萄糖)；
4＝两阶段光合自养-光合异养模式(5g/L葡萄糖)；
5＝两阶段光合自养-光合异养模式(10g/L葡萄糖)。
图4代表在两阶段光合自养-光合异养培养下的小球藻(UTEX-265)的脂质组合物。
图5表示两阶段光合自养-光合异养培养模式示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了更好地使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何的限制。
图5为两阶段光合自养-光合异养培养模式示意图。
实施例1
本实施例微藻细胞生长在500mL锥形瓶中；
本发明方法步骤如下(单级异养模式)：
1)将小球藻Chlorella vulgaris(UTEX-265)以接种体积为10％(V接种物/V培养基)接种于TAP培养基中，置于光照下培养8天；
培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m2.s-1并在转速150rpm的振荡器上振荡，小球藻藻悬液在基体培养基中的吸光度调节为1.0；
2)在500mL锥形瓶中分别接入250mL的BWW#1或250mLTAP培养基进行高压灭菌；分别在未灭菌的BWW#1、已灭菌的BWW#1和已灭菌的TAP培养基以接种体积为10％(V接种物/V培养基)将小球藻接种于锥形瓶中培养9天，每天监测微藻生长情况；
培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m2.s-1并在转速150rpm的振荡器上振荡；
酿酒废水(BWW)从市酿酒厂收集，酿酒废水(BWW#1)的TN＝30-45mg/L，TP＝12-16mg/L，TOC＝1400-1500mg/L，COD＝2000-3000mg/L；BOD＝1300±2.6mg/L，TSS＝300-320mg/L，PH＝5.5-6.0；
3)培养周期结束后收集小球藻进行油脂测定。
实施例2
本实施例微藻细胞生长在含有250mL的BWW#2的500mL锥形瓶中；
本发明方法步骤如下(单级光合自养模式)：
1)将小球藻Chlorella vulgaris(UTEX-265)以接种体积为10％(V接种物/V培养基)接种于TAP培养基中，置于光照下培养5天；
培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m2.s-1并在转速150rpm的振荡器上振荡，小球藻藻悬液在基体培养基中的吸光度调节为1.0；
2)在500mL锥形瓶中接入250mL的BWW#2，以接种体积为10％(V接种物/V培养基)将小球藻接种于锥形瓶中培养14天，每天对BWW#2的水质进行监测；
培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m2.s-1并在转速150rpm的振荡器上振荡；
酿酒废水(BWW)从市酿酒厂收集，酿酒废水BWW#2的TN＝50-75mg/L，TP＝15-20mg/L，TOC＝80-100mg/L，COD＝100-150mg/L；BOD＝150±2.3mg/L，TSS＝100-130mg/L，PH＝6.5-7.5；
3)培养周期结束后收集小球藻进行油脂测定。
实施例3
本实施例微藻细胞生长在500mL锥形瓶中；
本发明方法步骤如下(两阶段光合自养-光合异养模式)：
1)将小球藻Chlorella vulgaris(UTEX-265)以接种体积为10％(V接种物/V培养基)接种于TAP培养基中，置于光照下培养5天；
培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m2.s-1并在转速150rpm的振荡器上振荡，小球藻藻悬液在基体培养基中的吸光度调节为1.0；
2)光合自养阶段为模式的第一阶段：在500mL锥形瓶中接入250mL的BWW#2，以接种体积为10％(V接种物/V培养基)将小球藻接种于锥形瓶中培养7天，小球藻UTEX-265进行光合自养达到生物质积累。7天后小球藻UTEX-265发生群集而自动沉降，沉降10hrs后将净化后的废水排出，底部小球藻UTEX-265将被收集，留作第二阶段使用；
培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m2.s-1并在转速150rpm的振荡器上振荡；
酿酒废水(BWW)从市酿酒厂收集，酿酒废水(BWW#1)的TN＝30-45mg/L，TP＝12-16mg/L，TOC＝1400-1500mg/L，COD＝2000-3000mg/L；BOD＝1300±2.6mg/L，TSS＝300-320mg/L，PH＝5.5-6.0；
酿酒废水BWW#2的TN＝50-75mg/L，TP＝15-20mg/L，TOC＝80-100mg/L，COD＝100-150mg/L；BOD＝150±2.3mg/L，TSS＝100-130mg/L，PH＝6.5-7.5；
3)光合异养阶段为模式的第二阶段：在500mL锥形瓶中接入250mL的BWW#1、3g/L的葡萄糖溶液、5g/L的葡萄糖溶液或或10g/L的葡萄糖溶液，将完成第一阶段生长的小球藻UTEX-265投入至于光培养箱中培养5天，期间小球藻大量消耗有机碳，并遭到营养胁迫(TN、TP含量不足)而脂质大量积累。最大脂质产量从单阶段光合自养培养的31.1mg/L提升到108mg/L。
4)5天后净化的废水排放，收集小球藻进行油脂测定。
实施例4
本实施例微藻细胞生长在光合反应器中；
本发明方法步骤如下(两阶段光合自养-光合异养模式)：
1)将小球藻Chlorella vulgaris(UTEX-265)以接种体积为30％(V接种物/V培养基)接种于TAP培养基中，置于光照下培养10天；
培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m2.s-1并在转速150rpm的振荡器上振荡，小球藻藻悬液在基体培养基中的吸光度调节为1.0；
2)光合自养阶段为模式的第一阶段：在光合反应器中接入BWW#2，以接种体积为10％(V接种物/V培养基)将小球藻接种于锥形瓶中培养10天，小球藻UTEX-265进行光合自养达到生物质积累。10天后小球藻UTEX-265发生群集而自动沉降，沉降24hrs后将净化后的废水排出，底部小球藻UTEX-265将被收集，留作第二阶段使用；
培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m2.s-1并在转速150rpm的振荡器上振荡；
酿酒废水(BWW)从市酿酒厂收集，酿酒废水(BWW#1)的TN＝30-45mg/L，TP＝12-16mg/L，TOC＝1400-1500mg/L，COD＝2000-3000mg/L；BOD＝1300±2.6mg/L，TSS＝300-320mg/L，PH＝5.5-6.0；
酿酒废水BWW#2的TN＝50-75mg/L，TP＝15-20mg/L，TOC＝80-100mg/L，COD＝100-150mg/L；BOD＝150±2.3mg/L，TSS＝100-130mg/L，PH＝6.5-7.5；
3)光合异养阶段为模式的第二阶段：在光合反应器中接入BWW、3g/L的葡萄糖溶液、5g/L的葡萄糖溶液或或10g/L的葡萄糖溶液，将完成第一阶段生长的小球藻UTEX-265投入培养7天，期间小球藻大量消耗有机碳，并遭到营养胁迫(TN、TP含量不足)而脂质大量积累。最大脂质产量从单阶段光合自养培养的31.1mg/L提升到108mg/L。
4)7天后净化的废水排放，收集小球藻进行油脂测定。
由图1可以看出，在单级异养模式下，小球藻UTEX-265在灭菌和未灭菌的BWW#1的培养基中生长情况相似，说明灭菌和未灭菌的条件对小球藻UTEX-265生长情况影响不大，其中使用未灭菌的BWW#1作为碳源能够节约成本。
由图2(a)可以看出，在光合自养培养阶段，培养8天后BWW#2的TN含量从75mg/L降到7mg/L，TP含量从20mg/L降到2mg/L，达到排放要求。由图2(b)可以看出，在光合异养阶段，TP的去除率为76％，TN的去除率为78％，TOC的去除率为82％。
本模式对脂质积累具有双重协同作用，一种是由于第一阶段结束时的营养胁迫，另一种是第二阶段有机碳的供应。表1对两阶段培养模式的多种方法进行小球藻UTEX-265的脂质产量进行测定，发现两阶段培养模式均对UTEX-265的生物质和脂质有促进作用，小球藻UTEX-265最高脂质产量可达108mg/L day，是在TAP培养基中脂质产量(31.5mg/L day)的3倍。
表1代表小球藻(UTEX-265)在TAP培养基和BWW下单一或两阶段光合自养-光合异养模式下的生物量和脂质含量
图4可以看出，在两阶段光合自养-光合异养模式下，C16和C18等使用价值较高的脂肪酸(可以用作化妆品、生物燃料、保健品等多个方面)占80％以上，有很高的利用价值。脂质成分中油酸C18:1(具有良好的生物燃料性质，可产生物柴油)的比例非常高，约占36％-45％之间，且本模式小球藻UTEX-265的脂质产量较好，且具有很高的使用价值。
应当理解的是，这里所讨论的实施方案及实例只是为了说明，对本领域技术人员来说，可以加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种新型的两阶段自养-异养培养促进微藻脂质的方法，其特征是,提高微藻产油和同时净化废水的经济混合系统，且能够有效控制细菌污染,
1)将小球藻Chlorella vulgaris(UTEX-265)以接种体积为10％-30％(V接种物/V培养基)接种于TAP培养基中，置于光照下培养5-10天；
培养条件为：温度25℃，白色荧光照明100μmol.m2.s-1并在转速150rpm的振荡器上振荡，小球藻藻悬液在基体培养基中的吸光度调节为1.0；
2)光合自养阶段为模式的第一阶段：以接种体积为10％-30％(V接种物/V培养基)将小球藻接种于经厌氧消化处理后的酿酒废水BWW#2中培养7-10天，小球藻UTEX-265沉降10-24hrs后排出废水，收集底部小球藻UTEX-265；
酿酒废水(BWW)从市酿酒厂收集，酿酒废水(BWW#1)的TN＝30-45mg/L，TP＝12-16mg/L，TOC＝1400-1500mg/L，COD＝2000-3000mg/L；BOD＝1300±2.6mg/L，TSS＝300-320mg/L，PH＝5.5-6.0；
酿酒废水BWW#2的TN＝50-75mg/L，TP＝15-20mg/L，TOC＝80-100mg/L，COD＝100-150mg/L；BOD＝150±2.3mg/L，TSS＝100-130mg/L，PH＝6.5-7.5；
3)光合异养阶段为模式的第二阶段：在封闭的环境中外加碳源，将完成第一阶段生长的小球藻UTEX-265投入培养5-7天；
4)5-7天后净化的废水排放，收集小球藻；
5)监测油脂。
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