CN109890403B - 新生儿受试者中s100a8/s100a9诱导的免疫耐受 - Google Patents

Abstract

本申请提供S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/A9异二聚体在预防或治疗新生儿受试者中NF‑κB相关的出生后炎性病症的用途。而且，本发明涉及包含S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/A9异二聚体的药物组合物，和用于评估新生儿受试者发展NF‑κB相关的出生后炎性病症的风险的体外方法。

Description

新生儿受试者中S100A8/S100A9诱导的免疫耐受

技术领域

本发明涉及S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/A9异二聚体，其用于在预防或治疗新生儿受试者中NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变中使用。本发明还涉及包含S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/A9异二聚体的药物组合物，其用于在预防或治疗新生儿受试者中NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变中使用。本文还提供的是用于评估新生儿受试者发展NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的风险的体外方法，该方法包括：(a)确定来自所述受试者的样品中S100A8/S100A9异二聚体的量，和(b)将(a)的结果与参考值进行比较，其中相较于参考值增加的量的S100A8/S100A9异二聚体指示发展NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的风险减小，且其中相较于参考值减小的量的S100A8/S100A9异二聚体指示发展NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的风险增加。

背景技术

不受控的炎性过程在许多疾病例如感染、败血症、败血性休克、过敏和自身免疫疾病以及诸如动脉粥样硬化的慢性疾病中起重要作用。除特异性的适应性免疫系统之外，先天免疫系统的非特异性炎性过程也是近来关注的焦点。先天免疫系统是防御病原体和其他外部有害物质入侵的第一道防线。特定的“模式识别受体”(PRR)对各种病原体的保守结构的识别得到很好的表征。PRR尤其包括Toll样受体(TLR)家族，其启动针对病原体保守结构的炎症过程的激活，也称为“病原体相关分子模式”(PAMP)。革兰氏阴性菌主要通过脂多糖(LPS)的脂质A部分经由TLR4识别，而革兰氏阳性菌的脂磷壁酸、脂蛋白和肽聚糖主要由TLR2检测。然而，大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌能够通过细胞膜、细胞壁或细胞内存在的替代的PAMP激活另外的TLR(Mogensen,Clinical Microbiology Review(2009)22(2):240-273)。

作为示例性实例，在革兰氏阴性菌感染期间，LPS通过吞噬细胞中的LPS-受体复合物(TLR4/MD2/CD14)非常有效地诱导炎性反应，尤其是诱导促炎性细胞因子例如TNFα和IL-1β(Takeuchi等人,Cell(2010)140:805)。连接后，TLR4结合到衔接蛋白MyD88并引起NF-κB激活，从而诱导促炎性细胞因子程序包括TNFα、IL-1β和IL-6(Takeuchi等人,Cell(2010)140:805；Escoubet-Lozach等人,PLoS Genet(2011)7,e1002401)。干扰素调节因子5(IRF5)通过与NF-κB p65的顺反子相互作用巩固促炎性程序(Weiss等人,Mediators Inflamm(2013)245804；Saliba等人,Cell Rep(2014)8:1308)。TLR4通过其第二衔接分子——诱导IFN-γ(TRIF)的含有Toll/IL-1R结构域的衔接分子，激活IRF3。IRF3引发IFN-γ和STAT1的分泌，这进而通过激活1型IFN受体通路诱导基因比如IFNB1、CCL5、CXCL10和共刺激分子例如CD40、CD80和CD86(Escoubet-Lozach等人,PLoS Genet(2011)7,e1002401；Fitzgerald等人,J Exp Med(2003)198:1043；Yamamoto等人,Nat Immunol(2003)4:1144；Biswas等人,Trends Immunol(2009)30:475；Hoebe等人,Nat Immunol(2003)4:1223)。

阻断TLR4的治疗方法已经在临床研究中进行了检查。此外，在过去几年中已经鉴定了所谓的“损伤相关分子模式分子”(DAMP)，其是在细胞应激过程中由激活细胞或坏死细胞释放的蛋白质。这些内源性配体或“警报素”(Alarmin)同样地激活PRR，由此扩大炎性免疫应答并增强炎性反应。S100A8(髓样相关蛋白8，MRP8)和S100A9(髓样相关蛋白14，MRP14)是低分子量S100蛋白质家族的两个成员，它们属于DAMP蛋白质，并在许多种人疾病尤其是过敏、自身免疫疾病、类风湿性关节炎、炎性肠病、血管炎、皮炎或银屑病中表现出促炎性活性。S100A8和S100A9二者通常在循环嗜中性粒细胞和单核细胞的早期分化阶段、以及在炎性条件下的角质形成细胞和上皮细胞中共表达。在吞噬细胞激活期间释放S100A8和S100A9，提示在发炎期间的胞内以及胞外功能。

S100A8和S100A9能形成非共价联合的寡聚体，例如单价S100A8或S100A9同二聚体和S100A8/A9异二聚体(MRP8/14，钙防卫蛋白)，以及甚至更高级的寡聚体形式(Hunter和Chazin,J Biol Chem(1998)273(20):12427-35；Vogl等人,J Am Soc Mass Spectrom(1999)10:1124-1130)。在该上下文中，已经鉴定出独特的疏水氨基酸直接参与S100A8/S100A9二聚体形成(Leukert等人,Biol Chem(2005),386:429-434)。然而，S100A8和S100A9亚基的简单混合不足以形成适当的异二聚体复合物，而变性/复性步骤对于重组复合物表现出与自粒细胞得到的S100A8/S100A9等同的性质来说是必需的(Vogl等人,BBA(2006)1763:1298-1306；Leukert等人,Biol Chem(2005),386:429-434；Foell等人,Clin ChimActa(2004),344(1-2):37-51；Roth等人,Trends Immunol(2003),24:383-397)。还已发现S100A8和S100A9寡聚化成(S100A8/S100A9)₂异四聚体。四聚体形成严格依赖于钙的存在，在不存在钙时，异二聚体是S100A8和S100A9的优选形式。已知二聚体形式结合四个Ca²⁺离子，而(S100A8/S100A9)₂异四聚体结合八个Ca²⁺离子。S100A8和S100A9是吞噬细胞中的主要钙结合蛋白，两种蛋白质通过调控微管蛋白聚合而调节这些细胞的迁移。在生物样品中，S100A8和S100A9通常以异二聚体和四聚体存在。S100A8/S100A9发挥内源性TLR4配体的功能，并因其在炎症部位的特异性高表达，人们可将其作为TLR4/MD2/CD14驱动的炎性过程的主候选物。因此，S100A8/S100A9异二聚体可被视为是炎症早期扩大因子，诱导内皮细胞和吞噬细胞中的促炎性响应。然而，(S100A8/S100A9)₂四聚体化似乎引起非活性(S100A8/S100A9)₂四聚体复合物的形成，其不能与TLR4受体相互作用，因此阻断S100A8/S100A9活性，并因此阻断促炎性TNFα-释放通路(WO2014/037588)。

在成人中，S100A8/S100A9血清水平在许多炎性病症中升高，S100A8/S100A9累积的急性效应是，根据“警报素”的定义，炎性过程扩大直至败血性休克(Vogl等人,Nat.Med.(2007)13:1042-1049)。在这方面，已经描述过若干种用于检测和抑制所述蛋白质复合物的诊断和治疗策略(WO2014/037588、WO2015/078711、WO2004/110366、US8,916,163、US9,226,947)。此外，已经报道过在抑制细胞增殖和抑制上皮细胞感染中使用S100A8/S100A9mRNA(WO2014/110366)以及使用S100A8/S100A9异二聚体或S100A8/S100A9多肽用于治疗和/或预防皮肤疾病或退行性疾病、神经疾病或自身免疫疾病(WO2002/088181、WO2001/05422)。

近来已报道了在体外条件下内源性S100A8/S100A9衍生物在无菌炎症、多发伤和烧伤患者的吞噬细胞中诱导应激耐受(stress tolerance)。在这方面，已在体外显示用S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体预处理人和鼠单核细胞至少24小时、接着用LPS刺激所述单核细胞引起若干种细胞因子释放的衰减释放。在这方面，S100A8/S100A9衍生物显示出耐受化(tolerizing)效应。此外，在内毒素小鼠模型中，用S100A8/A9异二聚体进行预处理与经典诱导的LPS耐受相似，显著保护小鼠免于LPS诱导的休克，该效应引起增强的败血性休克存活(Melo等人,Braz.J.Med.Biol.Res.(2010)43:57-67)。因此，S100A8/S100A9衍生物对TLR4受体复合物的长期效应似乎引起吞噬细胞的称为“应激耐受”的微生物低反应性(hyporesponsivity)(Austermann等人,Cell Reports(2014)9:1-12；Biswas等人,Trends Immunol(2009)30:475)。此外，已显示健康足月新生儿在出生时大量释放S100A8/S100A9，并且能在足月新生儿的血清中和粪便中检测到升高浓度的S100A8/S100A9(Austermann等人,Cell Reports(2014)9:1-12)。

在成人中，内毒素耐受性(ET)似乎与促炎性MyD88依赖性转录程序特别相关，而TRIF依赖性基因显示参与ET的诱导。但对于新生儿情形，尚未定义MyD88和TRIF依赖性通路相对于LPS反应和出生后成熟过程的作用。此外，尽管先前的研究表明内源性S100A8/S100A9衍生物可能在体外在新生儿吞噬细胞中诱导低炎症(hypoinflammation)状态，但仍然完全不清楚新生儿吞噬细胞的低炎性状态是否不利，从而促进新生儿对感染的易感性，或者是否有益于在败血症发展进程中预防全身性高炎性(hyperinflammatory)反应综合征(Austermann等人,Cell Reports(2014)9:1-12)。

因此，S100A8/S100A9衍生物在新生儿免疫系统中的体内作用，特别是S100A8/S100A9在新生儿受试者例如早产儿受试者中的出生后作用仍然不明。然而，早产——也称为不足月出生(定义为妊娠37周前出生)是围产期死亡率和发病率的最重要风险因素(Deutsche Gesellschaft für

und Geburtshilfe:Leitlinie 015/025,

Wehenhemmung bei drohender Frühgeburt)。2011年德国所有儿童中有9％是在怀孕第37周完满之前出生的(AQUA–Institut für angewandte

und Forschung im Gesundheitswesen GmbH.Bundesauswertungzum Verfahrensjahr 2010 16/1–Geburtshilfe)。早产率在过去十年中保持稳定。然而，极度早产即妊娠28周之前的数量增加了65％。其原因尚未得到分析，但似乎源自于已知的人口统计学风险因素，例如孕妇年龄的增加。

格外早产的早产儿和出生体重极低的儿童发展败血症即血液的细菌感染的风险高。根据世界卫生组织的估计，2011年5岁以下的所有死亡人数中约有5％是新生儿败血性疾病造成的(WHO-UNICEF儿童健康流行病学参考小组(CHERG)估计)。因此，新生儿败血症是该年龄组儿童死亡率的主要危险因素(Liu等人,Lancet(2015)385:430)。新生儿败血症的一个特征是具有高炎性反应的极快进程(Zhao等人,Proc Natl Acad Sci USA(2008)105:7528)。患有败血症的新生儿通常无精打采、喂养不好且经常体温低。其他症状可能包括呼吸中断(呼吸暂停)、发烧、肤色苍白、皮肤血液循环不良、四肢发凉、腹胀、呕吐、腹泻、癫痫、神经过敏和黄疸。只有在新生儿血液培养物中鉴定出细菌，才能明确诊断。在等待血液培养结果时，医生给疑似有败血症的新生儿静脉内施用抗生素。一旦鉴定了具体的生物体，就可以调整抗生素类型。除抗生素治疗外，可能还需要其他治疗，如使用呼吸机、静脉内输液、血压和血液循环支持。然而，抗生素治疗导致肠道微生物群的正常发展的变化，通常与系统发育多样性的减少一致(Matamoros等人,Trends Microbiol.(2013)21(4):167-73)。此外，在本领域中颇有争议地讨论了含有可在败血症期间帮助身体中和细菌毒素的抗体的免疫球蛋白制剂的治疗用途。

通过剖腹产分娩的早产婴儿和新生儿受试者的早发型(在生命的前3天内发展)和迟发型(在生命的3天后发展)败血症风险都比足月阴道分娩出生的婴儿高得多。目前，人新生儿的高度易感性被归因于新生儿免疫系统的不成熟，因为发现在来自新生儿受试者的先天免疫细胞中对PAMP特别是LPS的反应受损。事实上，实验发现的先天性免疫反应(例如通过TLR4响应于源自革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS))受损促成了未成熟性(immaturity)这一概念(Kollmann等人,Immunity(2012)37:771；Levy,Nat Rev Immunol(2007)7:379)。然而，这一论证与新生儿败血症这种具有高炎性免疫反应的高动力进程的临床特征不一致。在此背景下未得到解释的临床观察是，以IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高的高动力免疫反应为特征的新生儿败血症的快速进程。这种明显的炎性反应与未成熟性的概念相矛盾，但暗示着在出生时存在替代的免疫调节。此外，由于目前尚未解决实验和临床发现的这种不一致性，故妨碍了更好的治疗策略的开发。

因此，本领域需要更好地理解当前临床与实验观察结果之间的矛盾，并对由革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌诱导的人成体和新生儿单核细胞的TLR依赖性信号传导进行全面比较。此外，本领域仍然需要新的手段和方法，其允许预防和治疗出生后炎性病症，例如新生儿受试者中的新生儿败血症、坏死性小肠结肠炎和支气管肺发育不良。同等地，需要预防和治疗出生后改变，例如扰乱的微生物群发展，其可能使出生后炎性病症的风险增加。因此，需要用于预防和治疗可直接导致新生儿受试者的出生后炎性病症的出生后炎性病症或出生后改变的治疗性组合物和方法。这种治疗途径应当允许显著降低新生儿受试者特别是早产儿受试者和剖腹产分娩的新生儿受试者发展所述出生后炎性病症的风险。因此，所述手段和方法还应提供用于预防和治疗与高动力免疫反应相关的所述出生后炎性病症的精确治疗工具。此外，本领域需要一种方法，该方法将允许评估新生儿受试者发展可导致所述出生后炎性病症的出生后炎性病症或出生后改变的风险。这种方法将允许识别和反映可在新生儿受试者特别是早产的新生儿受试者或剖腹产分娩的新生儿受试者中导致所述出生后炎性病症的出生后炎性病症或出生后改变的状态和/或进展。由此，本申请的技术问题是满足这种需求。该技术问题通过提供在权利要求中体现、在说明书中描述并在随后的实施例和附图中例示的实施方式而得以解决。

发明内容

本文提供适用于在预防或治疗新生儿受试者中出生后炎性病症或出生后改变中使用的方法和化合物，该出生后改变使出生后炎性病症风险增加。特别地，提供适用于在预防或治疗新生儿受试者中NF-κB相关的出生后炎性病症、例如易发高炎性免疫反应的TLR4-和/或TLR2-介导的出生后炎性病症中使用的方法和化合物。同样提供适用于在预防或治疗新生儿受试者中使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变中使用的方法和化合物。与常规治疗途径成对比，本文所述的方法或用途涉及向所述新生儿受试者施用低分子量S100蛋白质家族的内源性TLR4配体，即S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体。因此，尽管常规治疗途径旨在通过对患有出生后炎性病症的新生儿受试者进行抗生素治疗来消除作为出生后炎性病症病因的细菌感染，但本文提供的方法和用途旨在免疫耐受，其在出生后细菌定殖期间不会导致免疫反应扩大和随后的炎性病症。

因此，在这方面，本发明描述了通过使用S100A8/S100A9衍生物，预防或治疗新生儿受试者中NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变、引起改善的新生儿受试者长期存活率的可能性。在这方面，所提供的方法和用途特别适用于早产儿受试者和剖腹产分娩的新生儿受试者。由此，所提供的用途和方法比传统途径大体上特异得多。

使用转录组学、表观遗传学、生物信息学和免疫学途径，本发明的发明人证实出生时高水平的警报素(内源性TLR4-配体)瞬时地提高了MyD88依赖性基因的基线表达，由此使LPS刺激后上调该基因程序的能力降低。反过来，新生儿单核细胞强烈激活还未在基线表达的TRIF依赖性调节基因。该过程是表观遗传学调节的，因为在新生儿单核细胞中可观察到MyD88依赖性基因座的基础乙酰化标记，但在TRIF依赖性基因座处未观察到(图1-4)。后者获得表观遗传转录标记但并非在LPS攻击之前。在生命的第一年，TRIF依赖性基因的表达强度逐渐增加，使TRIF-和MyD88-依赖性基因调节之间的平衡朝向成人表型改变。因此，呈现的数据提供证据表明，出生时警报素介导的MyD88依赖性基因的耐受化(tolerization)对于防止高炎性反应是必要的，因为调节性TRIF依赖性基因需要启始。这些发现与出生时差异调节的但并非受损的免疫反应一致。因此，本发明的发明人预测，警报素介导的MyD88依赖性基因耐受化的减弱与同时的TRIF依赖性基因表达缺少或延迟为高炎性免疫反应铺平了道路，致使新生儿处于致命性败血症的增加的风险中。

此外，所呈现的数据提供证据表明，新生儿脆弱并非未成熟的问题，而是与新生儿先天免疫系统适应期间的替代调节的平衡表现相关联。具体来说，这一新发现与成人单核细胞形成鲜明对比，来自人新生儿的单核细胞对LPS刺激作出反应，对TRIF依赖性的多为调节性的基因具有非常强烈的诱导，而MyD88依赖性的多为促炎性的基因的表达没有大幅升高。此外，对于LPS的基因表达差异性诱导至少部分通过成人相较于新生儿单核细胞中MyD88依赖性炎性基因和TRIF依赖性调节基因的完全不同的基线表达状态得到解释。出生时TRIF基因和MyD88基因的差异性调节首次能被与升高水平的内源性警报素S100A8和S100A9——已知它们在健康新生儿出生时大大升高——相关联起来(Austermann等人,Cell Rep(2014)9(6):2112-23)。然而，如本发明人所示，所述警报素在早产儿受试者(图8)和剖腹产分娩的新生儿受试者(图9)中的升高要少得多。因此，内源性警报素S100A8和S100A9在足月和阴道分娩时引起的MyD88依赖性基因而非TRIF依赖性基因的预活化诱导了低反应性的耐受状态，防止NF-κB相关的高炎性反应。此外，在分子水平上，新生儿单核细胞的这种特异性转录和功能状态是由于改变的NF-κB活化和高基线IRF5活性以及MyD88依赖性和TRIF依赖性靶基因的表观遗传调控的差异——如在各个基因座通过组蛋白修饰所评估的，这最终引起基因转录和功能的全局性差异。尽管新生儿单核细胞的体外培养能够改变MyD88依赖性基因的调节，但在体外不能获得在成人单核细胞中观察到的TRIF依赖性基因的基因调控。更重要的是，当分析127名健康婴儿生命的第一年期间体内基因调控的变化时，可以清楚地证实TRIF依赖性基因的基线基因表达程序在这段长时间内稳定建立了(图1-4)。

这些发现强烈支持这样的假设，即先前提出的新生儿免疫系统的LPS反应受损由瞬时的出生相关的警报素诱导的无反应性(unresponsiveness)状态、特别是对于MyD88依赖性基因得到解释。可以认为，这是新生儿预防NF-κB相关的对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的高炎性反应的基本机制，只要调节性TRIF依赖性基因的表达强度在出生后仍然很低。然而，警报素诱导的MyD88依赖性促炎性基因的预活化不足以及TRIF依赖性调节基因的重编程受损或延迟使得新生儿、特别是早产新生儿和剖腹产分娩的新生儿受试者易感高炎性免疫反应，由此增加这些新生儿受试者的败血症风险。因此，通过向出生时的新生儿受试者施用诸如S100A8/S100A9衍生物的警报素，警报素诱导的MyD88依赖性而非TRIF依赖性基因的预活化似乎诱导对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌低反应性的耐受状态，由此防止NF-κB相关的高炎性反应和出生后炎性病症。因此，如本发明的发明人所示，新生儿中S100A8和S100A9的强释放不会诱导炎性病症扩大，而是诱导导致长期存活率提高的应激耐受性，这证实S100A8和S100A9属于新生儿免疫系统中的耐受诱导因子。

在这方面，可显示在早产的新生儿受试者中新生儿脐带血中的S100A8/S100A9水平显著低于正常胎龄的新生儿受试者中脐带血中的S100A8/S100A9水平(图8)。此外，发现剖腹产分娩的新生儿受试者中的S100A8/S100A9血清水平显著低于阴道分娩出生的受试者(图9)。相反，可以在母乳中检测到大规模高浓度的S100A8/S100A9衍生物(图10)。因此，这些观察结果可能描述了防止新生儿受试者特别是早产儿受试者和剖腹产分娩的剖腹产新生儿受试者对出生后细菌定殖的极端炎性反应的首要原则。因此，本发明在这方面描述了针对形成下述而预防性使用内源性警报素例如S100A8/S100A9衍生物的可能性：NF-κB相关的出生后炎性病症，其是新生儿对病原体相关分子模式(PAMP)特别是LPS反应的结果，比如败血症、坏死性小肠结节炎和支气管肺发育不良；或直接使NF-κB相关的出生后炎性病症形成风险增加的出生后改变，其是新生儿对PAMP反应的结果，比如扰乱的微生物群发展。

另外，本发明人在S100敲除小鼠的体内实验中发现，用S100A8/S100A9异二聚体或S100A8同二聚体替换都导致内毒素(LPS施用)模型(图5)和葡萄球菌/败血症模型(图6)下所述动物的存活率显著提高，这进一步支持了新生儿受试者出生时警报素诱导的对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的低反应性状态的假设。在这方面，当在试验系列之前用S100A8/S100A9衍生物进行预处理时，所述动物中肝、肺和肾的细菌负荷也显著降低(图7)。令人惊讶的是，对于S100A8单体可观察到最高效力，其看起来甚至比S100A8/S100A9异二聚体更有效(图5和图6)。因此，S100A8同二聚体的预防和治疗用途看起来高度值得推荐用于在新生儿受试者中实现期望的应激耐受效应。

已经报道了人脐带血单核细胞在出生时表现出显著增加的S100A8/S100A9异二聚体(钙防卫蛋白)分泌，并且可以在新生儿的血清和粪便中检测到增加浓度的S100A8/S100A9复合物。然而，迄今为止，所提示的因暂时的与出生相关的警报素诱导的无反应性状态(特别是对于MyD88依赖性基因)而引起的新生儿免疫系统的LPS反应受损的确切机制和解释仍然空白。此外，之前从未描述或提示过S100A8/S100A9衍生物在新生儿受试者特别是早产的新生儿受试者或剖腹产分娩的新生儿受试者中的预防或治疗用途。而本发明的发明人所呈现的数据表明，内源性TLR4配体S100A8和S100A9的释放似乎表现了在出生时以下的最深刻的基本原则：诱导对促炎性介质的耐受性和抗性，这使得出生后细菌定殖而不发生炎性反应。有趣的是，发现早产出生的人受试者和剖腹产后的新生儿中释放的S100A8/S100A9衍生物比起适时阴道分娩的新生儿要少得多，这与两组中已知的扰乱的微生物群发展相关联。

基于上述发现，本发明旨在在预防或治疗新生儿受试者中NF-κB相关的出生后炎性病症或导致NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变中使用S100A8/S100A9衍生物。特别地，上述数据促成了S100A8/S100A9异二聚体复合物和S100A8或S100A9同二聚体在新生儿受试者中用于预防、改善或治疗败血症、坏死性小肠结节炎、支气管肺发育不良和扰乱的微生物群发展的预防和治疗用途，由此提示着全身给药和口服给药。尽管之前有报道称人脐带血单核细胞在体外表现出显著增加的S100A8/S100A9异二聚体(钙防卫蛋白)分泌，但迄今尚未描述或者提示过TLR4配体S100A8和S100A9在环境适应的背景下用于新生儿免疫系统的耐受诱导的治疗或预防用途。

因此，在第一方面，本发明涉及S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/A9异二聚体用于在预防或治疗新生儿受试者中NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变中使用。本文所用的术语“S100A8或S100A9同二聚体”是指由两个S100A8或两个S100A9单体组成的二聚体复合物。术语“S100A8/S100A9异二聚体”是指由一个S100A8单体和一个S100A9单体组成的二聚体复合物。如前所述，S100A8和S100A9属于钙结合的胞质S100蛋白质，特征在于两个通过中心铰链区连接的对钙具有不同亲和力的钙结合EF手：C末端处的高亲和力位点(EF-手II)和N末端处的低亲和力位点(EF-手I)。EF-手基序具有位于中心钙结合环侧翼的两个α-螺旋，因此产生经典的螺旋-环-螺旋基序。S100A8和S100A9可以形成单价的同二聚体和已知为S100A8/A9(MRP8/14，钙防卫蛋白)的异二聚体，以及甚至更高级的寡聚体形式(Hunter和Chazin,J Biol Chem(1998)273(20):12427-35；Vogl等人,J Am Soc Mass Spectrom(1999)10:1124-1130)。在此背景下，已经鉴定出直接参与S100A8/S100A9二聚体形成的独特的疏水性氨基酸(Leukert等人,Biol Chem(2005),386:429-434)。然而，S100A8和S100A9亚基的简单混合不足以形成适当的异二聚体复合物，而变性/复性步骤对于重组复合物表现出与自粒细胞得到的S100A8/S100A9等同的性质来说是必需的(Vogl等人,BBA(2006)1763:1298-1306；Leukert等人,Biol Chem(2005),386:429-434；Foell等人,Clin Chim Acta(2004),344(1-2):37-51；Roth等人,Trends Immunol(2003),24:383-397)。但是，在炎性条件下，S100A8或S100A9同二聚体和S100A8/S100A9异二聚体似乎是更相关的S100A8/S100A9复合物形式，如WO2014037588中所详述的那样通过与TLR4受体相互作用而具有促炎性作用，而(S100A8/S100A9)₂四聚体化似乎导致形成失活的(S100A8/S100A9)₂四聚体复合物，其不能与TLR4受体相互作用。

根据本发明，S100A8同二聚体、S100A9同二聚体和S100A8/S100A9异二聚体同等地适用于本文所述的方法和用途。然而，如在S100敲除小鼠的体内实验中所示，用S100A8同二聚体进行的替换和预处理具有令人惊讶的最高效率并且在内毒素(LPS施用)模型和金黄色葡萄球菌败血症模型中都引起所述动物的最佳存活率和不同组织的细菌负荷显著降低(图5-7)。因此，当根据本发明在预防或治疗新生儿受试者中NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变中使用时，特别优选应用高度有效的S100A8同二聚体。

本文使用的术语“预防”或“预防病症”并非意在作为绝对术语。相反，预防NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变也可以指新生儿受试者中发病推迟、症状频率降低、与所述病症相关的症状的可能性降低或严重程度减轻。在优选的实施方式中，预防NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变可以指完全抑制新生儿受试者中所述病症的发作，即所述新生儿受试者不会发展NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变。因此，预防是指，本领域技术人员将理解的如本文其他部分所描述的用于预防新生儿受试者中NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变中任意者的广泛预防措施。在一些情形下，症状的严重程度降低到非病理水平，例如使得新生儿受试者不需要抗生素治疗或免疫制剂治疗。

类似地，术语“治疗/处理”或“治疗/处理病症”并非意在成为绝对术语。在一些情形下，根据本发明的S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体旨在减少新生儿受试者中与NF-κB相关的出生后炎性病症有关的症状，特别是如本文其他部分所描述的新生儿败血症、坏死性小肠结节炎和支气管肺发育不良的特征。同样，根据本发明的S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体旨在减少新生儿受试者中与使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变相关的症状，特别是如本文其他部分所描述的新生儿受试者中扰乱的微生物群发展的特征。在一些情形下，用根据本发明的S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体进行治疗引起预后改善或者症状的频率或严重程度减轻。因此，本文所用的术语“治疗/处理”(“treat”、“treatment”或“treating”)通常是指对有此需要的任何人新生儿或其他新生动物受试者的医药治疗。术语“治疗/处理”还意指减少、改善、稳定或抑制受试者中疾病和/或与之相关的症状的进展。所述受试者预期由医师或兽医医师进行体格检查，该医师已经给出了将表明使用该特定治疗有益于所述人或其他动物受试者的健康的初步或确诊诊断。根据受试者健康的现状，所述治疗的时间和目的可以因个体而异。因此，所述治疗可以是姑息治疗、对症治疗和/或根治治疗。就本发明而言，姑息治疗、对症治疗和/或根治治疗可以代表本发明的不同方面。

在本发明的上下文中，出生后炎性病症的特征在于NF-κB的活化增加，从而诱导所述新生儿受试者中促炎性细胞因子例如TNFα、IL-1β、IL-8和IL-6的释放或积累(Takeuchi等人,Cell(2010)140:805；Escoubet-Lozach等人,PLoS Genet(2011)7,e1002401)。此外，出生后炎性病症的特征在于细胞外的S100A8/S100A9异二聚体复合物浓度增加，其可以在来自所述新生儿受试者的样品中检测到。因此，在另一方面，本发明还涉及用于评估新生儿受试者发展NF-κB相关的出生后炎性病症或使新生儿受试者中NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的风险的体外方法，该方法包括：(a)确定来自所述受试者的样品中S100A8/S100A9异二聚体的量，和(b)将(a)的结果与参考值进行比较，其中相较于参考值增加的量的S100A8/S100A9异二聚体指示发展NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的风险减小，且其中相较于参考值减小的量的S100A8/S100A9异二聚体指示发展NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的风险增加。优选地，所描述的方法应用于早产的新生儿受试者或剖腹产分娩的新生儿受试者。

本文所用的术语“将结果与参考值进行比较”是指可以以任何合适的方式将所述样品与单个参考样品或多个参考样品(例如来自参考受试者的样品)进行比较。本文所用的术语“参考”可以用术语“对照”等同地代替。因此，本文描述的方法包括将来自所述新生儿受试者的样品中S100A8/S100A9异二聚体的量与参考样品中S100A8/S100A9异二聚体的量进行比较。所述参考或对照样品优选是如下新生儿受试者的样品：该新生儿受试者疑似或已知不患有NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变。因此，此文件中的对照测量也称为参考测量，可以是对已知不患有NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的受试者的样品进行的测量。在一些实施方式中，个别的参考测量是对来自年龄匹配的受试者的(对照)样品进行的。在一些实施方式中，这样的参考测量是对来自同一受试者、在更早时间点获取的样品进行的。在本文所公开的方法中，可以将(例如在样品中测定的)所形成的S100A8/S100A9异二聚体复合物的量与这种参考测量值进行比较。根据本发明的个别方法还可包括测量相应的S100A8/S100A9异二聚体复合物并将获得的结果与阈值进行比较。阈值可以例如是为决定是否形成S100A8/S100A9异二聚体复合物而设定的值。阈值也可以是为决定新生儿受试者是否患有NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变而设定的值。

作为示例性实例，对照或参考样品中S100A8/S100A9异二聚体的水平可通过例如在指定时间点的平均(均)值结合标准偏差值来表征。在一些实施方式中，当受试者中S100A8/S100A9异二聚体的水平比在一个或多个对照样品中测定的相应异二聚体/四聚体的平均值高或低一个标准偏差以上时，可认为受试者中S100A8/S100A9异二聚体的水平增加或降低。在一些实施方式中，S100A8/S100A9异二聚体的测定水平可在以下情况下视为增加或降低：获得的值比在对照样品中测定的平均值高或低大约1.5个标准偏差，包括高或低大约两个、大约三个、大约四个以上的标准偏差。在一些实施方式中，S100A8/S100A9异二聚体的测定的量在以下情况下视为是不同的：获得的值是在对照样品中测定的蛋白质水平大约1.2倍以上高或低，包括大约1.5倍、大约两倍、大约2.5倍、大约三倍、大约3.5倍、大约4倍、大约5倍以上高或低。

当在本文中使用时，术语“确定/测定”包括诸如检测、定量、半定量或视情况而定的诊断等变化。当术语“检测”(detect或detecting)以及术语“确定/测定”(determine或determining)在S100A8/S100A9异二聚体复合物的语境中使用时，其是指任何可用于鉴定由细胞释放或表达的蛋白质复合物的存在的方法。当在本文中与用语“水平”、“量”或“值”结合使用时，用语“确定/测定”或“检测”被理解为指代定量水平和定性水平。在一些实施方式中，样品中S100A8/S100A9异二聚体的测定可以是通过将样品中S100A8/S100A9异二聚体的水平与S100A8/S100A9异二聚体标准品的水平进行比较来确定S100A8/S100A9异二聚体的水平(定量或半定量)的方法。

“确定/测定”或“定量”生物样品中S100A8/S100A9异二聚体复合物或任何其他形式的S100A8/S100A9衍生物的量可以通过本领域技术人员可获得和已知的任何合适的技术进行。在一些实施方式中，确定生物样品中S100A8/S100A9异二聚体的量包括使用质谱。在应用质谱时，通过测量气相的质荷比和丰度，对样品中的S100A8/S100A9异二聚体进行化学鉴定和分析。质谱通过电离化合物来产生带电分子或分子碎片并测量它们的质荷比来工作。在这方面，光谱用于确定样品的元素或同位素特征、颗粒和分子的质量，并解析分子的化学结构。在一些实施方式中，确定生物样品中S100A8/S100A9异二聚体复合物的量包括使用适配体-靶标结合技术。当应用适配体-靶标结合技术时，通过一类小核酸配体(适配体)来鉴定S100A8/S100A9异二聚体。在一些实施方式中，适配体由对其靶标具有高特异性和亲和力的RNA组成。在一些实施方式中，适配体由对其靶标具有高特异性和亲和力的单链DNA寡核苷酸组成。与抗体相似，适配体通过识别特定的三维结构与其靶标相互作用，因此被称为“化学抗体”。与蛋白质抗体成对比，适配体基于其寡核苷酸特性提供独特的化学和生物学特征。在其他实施方式中，“确定”或“定量”样品中S100A8/S100A9异二聚体复合物的量包括使用对S100A8/S100A9异二聚体具有结合特异性的免疫球蛋白。在这方面合适的免疫测定技术的实例是诸如放射免疫测定(RIA)的放射性标记测定，或者酶免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、

测定、沉淀(特别是免疫沉淀)、夹心酶免疫测试、电化学发光夹心免疫测定(ECLIA)、解离增强镧系元素氟免疫测定(DELFIA)、闪烁临近测定(SPA)、比浊法、浊度测定法、乳胶增强比浊法或浊度测定法、或固相免疫测试。本领域已知的其他方法(例如凝胶电泳、2D凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹)可以单独使用或与本文所述的标记或其他检测方法组合使用。

术语“样品”在关于本发明的方法使用时涉及含有一种或多种目标分析物的材料或材料混合物，通常但不一定是液体形式。优选地，本发明的样品是生物样品。本文所用的术语“生物样品”是指从生物体或从生物体的构成部分(例如细胞)获得的样品，该生物体优选是新生儿受试者。样品可以是任何生物组织或流体的。样品往往将是“临床样品”，其是源自患者的样品。根据所述方法使用的样品包括但不限于血清样品、血浆样品、尿液样品、粪便样品、唾液样品、气管分泌物样品、支气管肺泡液样品、泪液样品或组织提取物样品。来自新生儿受试者的生物样品可以由经历自诊断测试(例如，血糖监测)的个体获得，或者由经过培训的医学专业人员通过各种技术包括例如用针抽血或者刮擦或擦拭特定区域而获得。用于收集各种生物样品的方法是本领域熟知的。

在本发明的上下文中，术语“评估风险”是指任何在体外用于评价新生儿受试者在出生后是否具有增加的罹患NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的可能性的程序或方法。在此上下文中，“评估风险”尤其指通过使用本发明的体外方法，任何在体外用于评价新生儿受试者是否具有增加的罹患本文其他部分所描述的新生儿败血症、坏死性小肠结节炎、支气管肺发育不良和/或扰乱的微生物群发展的特征的可能性的程序或方法。特别地，评估新生儿受试者发展NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的风险的方法包括：确定来自所述受试者的样品中S100A8/S100A9异二聚体的量，并将结果与如本文其他部分所描述的参考值进行比较。在这方面，在NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的任何特征出现之前，确定来自所述新生儿受试者的样品中S100A8/S100A9异二聚体的量。因此，可以在用药物对新生儿受试者进行任何出生后治疗比如抗生素治疗之前作出结论，以预防NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变。而且，在S100A8/S100A9水平相较于参考值增加或者在限定的阈值以上的情况下，评估新生儿受试者发展NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的NF-κB相关的出生后改变的风险可以帮助主治医师获得适当的信息以设定适当的治疗条件。优选地，来自所述新生儿受试者的样品中S100A8/S100A9异二聚体的量在出生后直接测定。在此上下文中使用的“出生后直接”意指来自所述新生儿受试者的样品中S100A8/S100A9异二聚体的量在出生后阶段确定。

根据本发明使用的术语“出生后”或“出生后阶段”是指来自所述新生儿受试者的样品中S100A8/S100A9异二聚体的量在生命的第一小时、几天、几周或一个月内确定。优选地，本文所用的术语“出生后”是指NF-κB相关的出生后炎性病症在生命的第一个月内出现，更优选在生命的第一周内出现。在这方面，设想来自所述新生儿受试者的样品中S100A8/S100A9异二聚体的量在生命的3、5、8、10、12、18、24或72小时内或在生命的前4天、5天、6天、7天、8天、10天、14天、21天或28天内确定。优选地，来自所述新生儿受试者的样品中S100A8/S100A9异二聚体的量在生命的前3天内确定。在这方面，特别设想的是确定出生后脐带血中S100A8/S100A9的量。

如本文所述，评估新生儿受试者发展NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的风险的方法在新生儿受试者为早产儿受试者或出生体重极低的新生儿受试者时可能特别有用。此外，评估新生儿受试者发展NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的风险的方法在新生儿受试者为剖腹产分娩的新生儿受试者时可能特别有用。如前所述，早产儿受试者和出生体重极低的新生儿受试者的围产期死亡率和发病率风险高，这尤其是由新生儿败血症即血液细菌感染或者其他NF-κB相关的出生后炎性病症引起的——其能通过所述受试者的低S100A8/S100A9脐带血水平(图8)和相关的S100A8/S100A9诱导的免疫耐受缺失来解释。此外，如本发明的发明人所示，剖腹产分娩的新生儿受试者也表现出极低的S100A8/S100A9血清水平(图9)。因此，早产儿受试者、出生体重极低的新生儿受试者以及剖腹产分娩的新生儿受试者处于发展与低水平S100A8/S100A9相关联的NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的增加的风险中。因此，所描述的方法对于所述受试者可能特别有用。

本文所用的术语“疾病”或“病症”是指有生命的动物受试者或其一部分的正常状态的任何受损，该受损中断或改变重要功能的性能，通常通过区别性的体征和症状显现。因此，“疾病”或“病症”是指由遗传或发育错误、感染、中毒、营养缺乏或不平衡、毒性或不利环境因素、生病、虚弱或不适的作用引起受试者的与身体的器官、部分、结构或系统功能不正常相关的任何身体状态。在本发明的上下文中，所描述的疾病或病症是出生后炎性病症。如本文所概述，所述出生后炎性病症是NF-κB相关的炎性病症。

术语“NF-κB-相关的”当在本文中使用时是指任何牵涉到NF-κB活化增加的出生后炎性病症，例如TLR诱导的炎性病症。通常，NF-κB的活化增加随后诱导促炎性细胞因子并导致高炎性状态。结果，如本发明的发明人所证实的，S100A8/S100A9诱导的吞噬细胞程序化显示出对其他也与NF-κB相关的TLR(尤其是TLR2)诱导的炎性模式的交叉耐受性(图5和图6)。因此，本文所述的用于在出生后直接使用S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体的途径和方法可能适合于在革兰氏阳性和革兰氏阴性攻击期间预防或治疗新生儿受试者中的高炎症和细菌过度生长。因此，本文所述的用于使用S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体预防或治疗新生儿受试者中NF-κB相关的出生后炎性病症的途径和方法可能同样适用于所有的通过活化NF-κB诱导促炎性作用的TLR介导的出生后炎性病症。

因此，根据本发明，所述NF-κB相关的出生后炎性病症优选是全身性高炎性反应综合征。特别设想的是，如本文所述的NF-κB相关的出生后炎性病症是TLR介导的NF-κB相关的出生后炎性病症。优选地，所述NF-κB相关的出生后炎性病症是TLR4和/或TLR2介导的出生后炎性病症。本文所用的术语“TLR4介导的”是指所述病症与LPS-受体复合物TLR4/MD2/CD的出生后活化直接相关，该活化调节针对病原体特别是革兰氏阴性菌的保守结构的炎性过程(病原体相关分子模式)。本文所用的术语“TLR2介导的”是指所述病症与TLR2受体的出生后活化直接相关，该活化调节针对病原体特别是革兰氏阳性菌的保守结构的炎性过程(病原体相关分子模式)。活化后，TLR4和TLR2受体导致NF-κB活化，由此诱导促炎性细胞因子包括TNFα、IL-1β、IL-8和IL-6。因此，“TLR4-和/或TLR2介导的”出生后炎性病症是与NF-κB活化增加和促炎性细胞因子释放增加有关的疾病。

本文所用的术语“炎性病症”意味着所述病症是指身体组织对有害刺激(例如病原体、受损细胞或刺激物)的复杂生物反应，并且是涉及免疫细胞、血管和分子介质的防御性反应。炎症的作用是消除细胞损伤的最初原因，清除由原始损伤和炎性过程损坏的坏死细胞和组织，并启动组织修复。急性炎症的典型体征是发热、疼痛、发红、肿胀(热、痛、红和肿)和功能丧失。因此，根据本发明的出生后炎性病症是以所述炎症特征中的至少一种为特征的出生后炎性病症。炎症是一种普遍反应，因此与对每种病原体具有特异性的适应性免疫相比，它被认为是先天免疫的机制。根据本发明，炎性病症是NF-κB相关的出生后炎性病症，例如TLR4和/或TLR2介导的出生后炎性病症。

优选地，如本文所述的NF-κB相关的出生后炎性病症是急性的NF-κB相关的出生后炎性病症。在这方面，急性炎症是身体对有害刺激的初始反应，并通过血浆和白细胞(特别是粒细胞)从血液到受损组织的增加的运动来实现。一系列生化事件传播炎性反应并使之成熟，涉及到局部血管系统、免疫系统和受损组织内的各种细胞。优选地，NF-κB相关的出生后炎性病症是败血症、坏死性小肠结节炎和支气管肺发育不良中的一种。在此情景下，设想NF-κB相关的炎性病症出现在“出生后”，即在生命的第一个月内，优选在生命的第一周内，如本文其他地方所述。

根据本发明，进一步设想所述败血症是早发型败血症或迟发型败血症。本文所用的术语“早发型”是指在生命的第一天和第三天之间发展的败血症。本文所用的术语“迟发型”是指在生命第三天之后发展的败血症。尽管早发型败血症和迟发型败血症的症状/体征可以是非特异性的，但根据本发明的败血症的优选特征在于至少一种选自下组的临床症状：呼吸暂停、心动过缓、去饱和、体温不稳定和喂养不耐受，和/或在所述临床症状发作后的48小时内存在以下特征中的至少三种：(a)C反应蛋白(CRP)值高于20mg/l，(b)血液学异常，例如血小板计数低于100,000/mm³的血小板减少症，(c)嗜中性粒细胞绝对计数低于2000/mm³的嗜中性粒细胞减少症，(d)分叶核嗜中性粒细胞左移，未成熟与总嗜中性粒细胞的比值为0.18或更高，(e)肺炎的射线影像学证据，(f)感染的培养证据(culturalevidence)，(g)绿色羊水，(h)胎膜早破，和(i)母亲感染的迹象。

根据本发明，S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体可进一步用于预防或治疗新生儿受试者中NF-κB相关的出生后炎性病症，其中新生儿受试者中的所述NF-κB相关的出生后炎性病症优选为坏死性小肠结肠炎。所述坏死性小肠结肠炎的优选特征在于下列症状中的至少一种：(a)带血粘液样便、(b)腹胀、(c)呕吐、(d)肠道积气的射线影像学证据、(e)门静脉积气、(f)血液学异常、(g)血小板计数低于100,000/mm³的血小板减少症、(h)嗜中性粒细胞绝对计数低于2000/mm³的嗜中性粒细胞减少症和(i)分叶核嗜中性粒细胞左移，未成熟与总嗜中性粒细胞的比值为0.18或更高。

根据本发明，进一步设想所述支气管肺发育不良的特征在于下列症状中的至少一种：(a)需要氧气治疗和(b)容易感染。支气管肺发育不良在出生体重低的婴儿和接受长期机械通气以治疗呼吸窘迫综合征(RDS)的婴儿中非常常见。支气管肺发育不良的其他症状是例如快速的浅呼吸，每次呼吸时胸部下方和肋骨之间急剧拉动，呼噜声和鼻孔张开。

在本发明的上下文中，新生儿受试者中使NF-κB相关的出生后炎性病症的风险增加的出生后改变是指新生儿受试者中的任何可引起NF-κB相关的出生后炎性病症的出生后生理变化。在这方面使用的术语“使NF-κB相关的出生后炎性病症的风险增加”和“引起NF-κB相关的出生后炎性病症”是指下述事实：所述出生后改变尽管不被视为是出生后病症或疾病，但其可在新生儿受试者中推进或促进NF-κB相关的出生后炎性病症的出现。一般来说，这种出生后改变——与出生后炎性病症不同——不会自动地涉及免疫系统，但是会导致免疫的病理性出生后发展。而且，由新生儿受试者中所述出生后改变引起的所述病理性出生后状态增加了NF-κB相关的出生后炎性病症的风险，例如TLR4和/或TLR2介导的出生后炎性病症。在此情境下，设想使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的所述出生后改变出现在生命的第一个月内，优选在生命的第一周内。优选地，本文提及的新生儿受试者中使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的所述出生后改变是新生儿受试者中的扰乱的微生物群发展。同样设想的是影响循环和呼吸的生理变化如心力衰竭和呼吸，其被认为影响NF-κB相关的出生后炎性病症的发展。

如本文所述的新生儿受试者中的扰乱的微生物群发展是如下的出生后改变：其优选特征在于，相较于具有正常的微生物群发展的新生儿受试者减少的微生物情况(germprofile)。人微生物群由生存在人体内和人体上的微生物以及其基因和基因组构成。科学家们正在探索这些寄居微生物对我们的健康和福祉有多重要，特别是就它们在维持我们的免疫系统、帮助我们的食物消化以及充当针对病原体的第一道防线方面所起的作用。如本领域所报道的，有许多疾病尤其是在新生儿受试者中可能是扰乱的微生物群发展的结果(Matamoros等人,Trends Microbiol.(2013)21(4):167-73)。而且，由于所述减少的微生物情况，所述扰乱的微生物群发展可因所述新生儿受试者中微生物定殖不足而使得NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加。在这方面，通过诱导对定殖微生物的免疫耐受性，用S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体治疗新生儿受试者促进微生物群发展和生态平衡。根据本发明，所述扰乱的微生物群发展是扰乱的肠微生物群发展、扰乱的呼吸道微生物群发展和/或扰乱的皮肤微生物群发展。

本文所用的术语“受试者”也称为个体，其指代哺乳动物生物，包括人或非人的动物。因此，本文描述的方法、用途和组合物通常可应用于人和非人的哺乳动物。非人的动物还可以代表特定的疾病或病症模型。或者，非人的动物可以代表需要疾病治疗的驯养宠物和/或家畜(例如狗、猫、山羊、牛、绵羊等)。优选地，本发明的主题是哺乳动物受试者，特别是人、非人的灵长类动物、狗、马、猫、豚鼠、兔、大鼠或小鼠。根据本发明，所述受试者是新生儿受试者。本文所用的术语“新生儿受试者”是指受试者是在出生后的第一个四周内。更优选地，新生儿受试者是在出生后的前两周内，再更优选地是在出生后的第一周内。因此，本发明的新生儿受试者是在如本文其他部分所定义的所谓“出生后阶段”中。如本文其他部分所概述，可以对从所述新生儿受试者(其通常为有生命的生物体)获得的样品进行分析。当受试者是可以如本文所述接受疾病或病症的治疗的有生命的人时，其还被称为“患者”。

优选地，本文所述的新生儿受试者是早产儿受试者或剖腹产分娩的新生儿受试者。本领域已知，早产婴儿发展出生后败血症的风险比足月出生的婴儿要高得多。本文所用的术语“早产”或“不足月”是指所述新生儿受试者过早出生，即在大约40周的一般胎龄之前。根据本发明，早产的新生儿受试者是胎龄少于37周出生的新生儿受试者，优选胎龄少于36、35、34、33、32或31周出生的新生儿受试者。更优选地，本发明的早产的新生儿受试者出生的胎龄少于30周。最优选地，本发明的早产的新生儿受试者出生的胎龄少于28周。术语“剖腹产(也称为C-section)分娩”是指采用手术来生产一个或多个哺乳动物受试者。当阴道分娩会使胎儿或母亲处于风险中时，通常会进行剖腹产手术。上述风险可包括：梗阻性分娩，双胎妊娠，母亲高血压，臀位分娩，胎盘、脐带或骨盆形状有问题，以及先前剖腹产过。如本发明的发明人所发现的，早产的人受试者和剖腹产分娩的人新生儿受试者表现出显著低于足月的人新生儿受试者或阴道分娩的人受试者的S100A8/S100A9水平(图8和图9)。此外，可以在母乳中检测到大规模高浓度的S100A8/S100A9衍生物(图10)。因此，在不被理论束缚的情况下，本发明的发明人提出这些观察结果可能描述了防止新生儿受试者特别是早产儿受试者和剖腹产分娩的新生儿受试者对出生后细菌定殖的极端炎性反应的最重要原理，该受试者的特征在于特定的出生环境而导致改变的细菌定殖。因此，在这一点，本发明描述了治疗或防御性地使用内源性警报素例如S100A8/S100A9衍生物避免NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变形成的可能性。

在这方面，在预防或治疗新生儿受试者中NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变中使用S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/A9异二聚体优选地诱导所述受试者中骨髓细胞的微生物低反应性。术语“微生物低反应性”是指S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/A9异二聚体的替换诱导对LPS低反应性的耐受状态，由此预防所述骨髓细胞的NF-κB相关的高炎性反应，并因此预防出生后的TLR介导的炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后病症改变。因此，在本发明的范畴内，设想的是本文所述的S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/A9异二聚体诱导免疫和应激耐受。优选地，诱导的效应是剂量和时间依赖性的。如本发明的发明人首次所证实的，在S100-敲除小鼠的内毒素(LPS施用)模型以及葡萄球菌/败血症模型中，用S100A8或S100A9同二聚体和S100A8/A100A9异二聚体替换引起所述动物显著提高的存活率。在这方面，诱导的效应是剂量和时间依赖性地建立微生物低反应性，从而引起所述受试者显著增加的存活率(图5和图6)。

对于S100A8或S100A9同二聚体和S100A8/A100A9异二聚体在预防新生儿受试者中NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的诱导效应而言，还设想的是用所述S100A8或S100A9同二聚体或所述S100A8/A9异二聚体在出生后处理该新生儿受试者至少12、24、36、48或72小时，或至少4、5、6或7天。优选地，新生儿受试者在出生后用所述S100A8或S100A9同二聚体或所述S100A8/A9异二聚体处理至少24小时。

根据本发明，施用S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/A9异二聚体用于在预防或治疗NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性疾病风险增加的出生后改变中使用，可以通过任何本领域已知的方法执行。优选地，所述S100A8或S100A9同二聚体或所述S100A8/A9异二聚体可以通过如下方式施用：口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、通过鼻内滴注、通过移植、通过腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、病灶内、经皮或者通过应用到黏膜、或通过它们的组合。在这方面，设想的是所述S100A8或S100A9同二聚体或所述S100A8/A9异二聚体与营养物一起口服施用。根据本发明人，S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/A9异二聚体的重组生产没有限制，同二聚体和异二聚体均很稳定，能够在宽pH范围(2-9)内稳定存储，对温度不敏感，且对光不敏感。因此，根据本发明，设想S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/A9异二聚体的全身和口服药理学应用，这使得这些蛋白质复合物对于药理学和医药应用极具吸引力。

因此，在另一方面，本发明还涉及一种包含S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/A9异二聚体的药物组合物，其用于在预防或治疗新生儿受试者中NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变中使用。同样地，在另一方面，本发明涉及一种用于预防或治疗新生儿受试者中NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的方法，所述方法包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/A9异二聚体。此外，在另一方面，本发明提供S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/A9异二聚体在制备用于预防或治疗新生儿受试者中NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的药物中的用途。因此，本文所述的方法和用途包括对有此需要的受试者特别是新生儿受试者施用S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体。因此，如本文其他部分所定义的，S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体可以以药物组合物的形式施用。优选地，S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体以治疗有效量施用。

本文所用的术语“治疗有效量”被理解为足以预防或治疗NF-κB相关的出生后炎性病症或者预防或治疗使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体的量，即，可应用于任何医学治疗的合理的受益/风险比。因此，所述治疗有效量应当足以抑制或缓解NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变。“治疗效果”或“治疗有效的”是指使用的化合物将引起研究人员、兽医、医生或其他临床医师正在寻求的组织、系统、动物或人的生物或医学反应。术语“治疗有效的”还指对引起或促成疾病或病症的因素的抑制。术语“治疗有效量”包括：当施用时足以显著改善所治疗的疾病或病症的进展或者预防所述疾病或病症的发展的化合物的量。治疗有效量将根据化合物、病症及其严重程度和受试者自身的个体因素而变化。因此，如前所述，本发明的化合物并不是在所有情况下都会显示为治疗有效，因为本文公开的方法不能就受试者是否可对所述化合物有反应提供100％安全的预测，因为个体因素也牵涉在内。关于用来治疗患有NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变或者处于患有NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的风险中的新生儿受试者的化合物是否将治疗有效而言，预期年龄、体重、总体健康、性别、饮食、药物相互作用等可能具有综合影响。

优选地，用于治疗患有NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎症风险增加的出生后改变或者处于患有NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的风险中的受试者的化合物的治疗有效量在大约0.001mg/kg体重至大约1g/kg体重之间，例如大约0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、200、300、400、500、600、700、800或大约900mg/kg体重。甚至更优选地，用于治疗患有NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎症风险增加的出生后改变或者处于患有NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的风险中的受试者的S100A8同二聚体或S100A9同二聚体的治疗有效量在大约0.001mg/kg体重至大约100mg/kg体重之间，例如在大约0.01mg/kg体重至大约50mg/kg体重之间，特别地在2.5至5mg/kg体重之间。优选地，用于治疗患有NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎症风险增加的出生后改变或者处于患有NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的风险中的受试者的S100A8/S100A9异二聚体的治疗有效量在大约0.001mg/kg体重至大约100mg/kg体重之间，例如在大约0.01mg/kg体重至大约100mg/kg体重之间，特别地在25至50mg/kg体重之间。取决于要治疗的受试者物种，化合物的治疗有效量将相对于其中所含的活性化合物重量而变化。

应理解的是，本发明化合物的总日剂量将由主治医师在医学判断范围内决定。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括预防或治疗的病症和病症严重程度、采用的具体化合物的活性、采用的具体组合物、患者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食、给药时间、给药途径、所采用的具体化合物的排泄率、治疗持续时间、与所采用具体多肽组合或同时使用的药物以及医学领域中熟知的类似因素。例如，以低于实现希望的治疗效果所需的水平开始化合物剂量、并逐渐增加剂量直至达到希望的效果完全在本领域技术范围内。然而，产品的日剂量可以在0.001至1,000mg/kg/天的宽范围内变化。S100A8或S100A9同二聚体的日剂量可以在0.001至10mg/kg/天的范围内变化。S100A8/S100A9异二聚体的日剂量可以在0.001至100mg/kg/天的范围内变化。施用的S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体可以与药学上可接受的赋形剂和任选的缓释基质(例如可生物降解的聚合物)组合以形成治疗组合物。

根据本发明的组合物优选配制成单位剂型，各剂量包含大约1至大约500mg、更常见的是大约5至大约300mg的活性成分。本文所用的术语“单位剂型”是指适合作为用于人受试者或其他哺乳动物的单一剂量的物理上离散的单位，每个单位含有经计算可产生希望的治疗效果的预定数量的活性物质，其与合适的药物载体结合。本文所用的“剂量”是指施用于患者的治疗剂的量。本文所用的“日剂量”是指在一天内给予患者的治疗剂的总量。

根据本发明的药学上可接受的赋形剂包括，作为说明而非限制，稀释剂，崩解剂，粘合剂，黏合剂，润湿剂，聚合物，润滑剂，助流剂，加入以掩盖或抵消不良质地、味道或气味的物质，调味剂，染料，芳香剂和加入以改善所述组合物外观的物质。可接受的赋形剂包括乳糖、蔗糖、粉状淀粉、玉米淀粉或它们的衍生物，烷酸的纤维素酯，纤维素烷基酯，滑石，硬脂酸，硬脂酸镁，氧化镁，磷酸和硫酸的钠盐和钙盐，明胶，阿拉伯树胶，海藻酸钠，聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙烯醇，盐水，右旋糖，甘露醇，乳糖，卵磷脂，白蛋白，谷氨酸钠，盐酸半胱氨酸等等。用于软明胶胶囊的合适赋形剂的实例包括：植物油，蜡，脂肪，半固体和液体多元醇。用于制备溶液和糖浆的合适赋形剂包括而不限于水，多元醇，蔗糖，转化糖和葡萄糖。用于可注射溶液的合适赋形剂包括而不限于水，醇，多元醇，甘油和植物油。诊断组合物可另外包括防腐剂，增溶剂，稳定剂，润湿剂，乳化剂，甜味剂，着色剂，调味剂，缓冲剂，包衣剂或抗氧化剂。合适的诊断载体记载于Remington的Pharmaceutical Sciences,(马克出版公司)，其是本领域的标准参考书。

在本发明的药物组合物中，主要活性物质即S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体——单独或与其他主要活性物质相组合——可以作为与常规药物载体的混合物以单位给药形式施用给本发明的新生儿受试者。合适的单位给药形式包括口服途径形式，例如片剂，凝胶胶囊，粉剂，颗粒和口服悬浮液或溶液，舌下和经颊给药形式，气溶胶，植入物，皮下(subcutaneous)、透皮、局部、腹膜内、肌内、静脉内、皮下(subdermal)、透皮、鞘内和鼻内给药形式和直肠给药形式。优选地，药物组合物含有对于能够注射的制剂而言药学上可接受的载体。这些可以尤其是等渗的、无菌的、盐溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或者干燥的特别是冻干的组合物——其在视情况添加无菌水或生理盐水时允许构成可注射溶液。

适用于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液，包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液的制剂，以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的并且必须是流动的，流动程度达到易于注射。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须保存免受微生物如细菌和真菌的污染作用。包含本发明化合物作为游离碱或药理学上可接受的盐的溶液可以在适当地与表面活性剂如羟丙基纤维素混合的水中制备。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和在油中制备。在一般储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。本发明的S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体还可以以中性或盐形式配制成组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，其与无机酸如盐酸或磷酸或者与有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及衍生自有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。载体也可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适的混合物以及植物油。例如，通过使用涂层如卵磷脂，通过在分散剂的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。

可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。通过连同上面列举的其它成分中的若干种(按需)，将活性多肽以所需的量掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌，制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和来自那些上面所列举项的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冻干技术，其从先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何其他所需成分的粉末。在配制时，溶液将以与剂量配方相容的方式并以治疗有效的量施用。制剂易于以多种剂型给药，例如上述可注射溶液的类型，但也可使用药物释放胶囊等。

例如，对于水溶液的肠胃外给药，溶液应按需适当缓冲，并首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内给药。就此而言，根据本公开内容，可以使用的无菌水性介质对于本领域技术人员而言是已知的。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并将其添加至1000ml的皮下输注液中或在所提出的输注部位注射。取决于所治疗的受试者的状况，必然发生剂量的一些变化。在任何情况下，负责给药的人员将确定个体受试者的适当剂量。除了将本发明的S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体配制用于肠胃外给药(例如静脉内或肌内注射)，其他药学上可接受的形式包括例如，用于口服给药的片剂或其它固形物，脂质体制剂，定时释放胶囊和任何目前使用的其他形式。

此外，本发明的药物组合物可包含另外的治疗活性剂，例如抗炎药、抗生素或中和细菌毒素的免疫球蛋白。因此，本发明的S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体还可以与其它治疗活性剂组合使用。在这方面，优选的抗炎药是皮质类固醇，例如糖皮质激素。在这方面，优选的抗生素是氨苄青霉素、庆大霉素、妥布霉素、头孢噻肟(cefotaxom)、万古霉素、美罗培南、亚胺培南、利奈唑胺、青霉素G和甲硝唑。此外，本发明的S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体还可以与抗真菌剂例如氟康唑、两性霉素B和制霉菌素组合使用。因此，可以打算将本发明的S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体与其他治疗活性剂分开给药。或者，在本文所述的“组合”处理中，S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体与其他治疗活性剂顺序或同时组合。因此，药剂可以以单独变化的剂量方案并通过不同途径给药。例如，当顺序施用时，可以以紧密间隔(例如，在5-10分钟的时间段内)或以更长的间隔(例如，间隔1、2、3、4或更多个小时，或需要时甚至间隔更长的时间段)施用药剂，精确的给药方案与本文所述的治疗剂的性质包括它们的协同作用相称。药剂可以以单一剂型一起配制，或者，各个药剂可以单独配制并以试剂盒的形式(例如在泡罩包装中)一起提供，任选地具有其使用说明。

因此，在另一方面，本发明还涉及适用于在预防或治疗NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变中使用的套盒(kit-of-part)。在一个实施方式中，本发明的套盒可包括：(i)本文其他部分所定义的S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体，和(ii)至少一种抗炎性药物，(i)和(ii)各自布置成单独、顺序或同时施用。在一个实施方式中，本发明的套盒可包括：(i)本文其他部分所定义的S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体，和(ii)至少一种抗生素，(i)和(ii)各自布置成单独、顺序或同时施用。在一个实施方式中，本发明的套盒可包括：(i)本文其他部分所定义的S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体，和(ii)至少一种中和细菌毒素的免疫球蛋白，(i)和(ii)各自布置成单独、顺序或同时施用。在一个实施方式中，本发明的套盒可包括：(i)本文其他部分所定义的S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/S100A9异二聚体，和(ii)至少一种抗炎性药物，(i)和(ii)各自布置成单独、顺序或同时施用。

本文公开的S100A8或S100A9同二聚体和S100A8/S100A9异二聚体还可以用于预防或治疗家畜中NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变，所述家畜例如猫、狗、兔、豚鼠、牛、羊和马。因此，本发明还提供兽医制剂，其包含用于在预防或治疗新生儿受试者中NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变中使用的S100A8或S100A9同二聚体或S100A87S100A9异二聚体，连同兽医学可接受的稀释剂或载体。这些制剂包括尤其是软膏、浇泼制剂、点涂制剂、浸渍剂、喷雾剂、摩丝、洗发剂、颈圈和粉末制剂。

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除非另有说明，否则本文件中包括说明书和权利要求中使用的以下术语具有下文给出的定义。

本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验确定本文所述的本发明具体实施方式的许多等同形式。这些等同形式旨在包含在本发明中。

应注意，如本文所用的单数形式“一”(“a”、“an”)和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一试剂”包括一种或多种这样的不同试剂，并且对“该方法”的提及包括指代本领域普通技术人员已知的可以修改或替代本文所述方法的等同步骤和方法。

除非另有说明，否则在一系列元件之前的术语“至少”应理解为指代该系列中的每个元件。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验确定本文所述方法和用途的具体实施方式的许多等同形式。这些等同形式旨在包含在本发明中。

贯穿此说明书和随后的权利要求，除非上下文另有要求，否则词语“包括”和诸如“包括着”和“包括有”的变形将被理解为暗示包括所述整数或步骤或者整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤组。当在本文中使用时，术语“包括有”可以用术语“含有”代替，或者有时在本文中用术语“具有”代替。

“由......组成”当在本文中使用时不包括所主张的元素中未指定的任何元素、步骤或成分。“基本上由......组成”当在本文中使用时不排除不会实质上影响所主张的基本和新颖特征的材料或步骤。在本文的每种情况下，术语“组成”、“由......组成”和“基本上由......组成”中的任一个可以用其他两个术语中的任何一个替换。

本文所用的在多个所记载元件之间的连词“和/或”被理解为包含单个和组合选项。例如，在两个元素由“和/或”连接的情况下，第一个选项是指应用第一个元素而没有第二个元素。第二种选择是指应用第二个元素而没有第一个元素。第三种选择是指第一个元素和第二个元素一起应用。这些选项中的任何一个都被理解为落在含义内，因此满足本文所用术语“和/或”的要求。所述选项中的多于一个的同时应用也应理解为落入含义内，因此满足本文所用的术语“和/或”的要求。

如本文所述，“优选实施方式”意指“本发明的优选实施方式”。同样，如本文所述，“各种实施方式”和“另一实施方式”意指“本发明的各种实施方式”和“本发明的另一实施方式”。

本文所用的词语“约”是指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内的值，其将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“大约”可以表示在1或大于1的标准偏差内。术语“大约”还用于表示所讨论的量或值可以是指定的值或者大致相同的某个其他值。该短语旨在表达相似的值促成根据本发明的等同结果或效果。在此上下文中，“大约”可以指至多10％的以上和/或以下的范围。在一些实施方式中，词语“大约”是指某一值以上和以下的范围，该范围为该值以上或以下至多5％，例如至多2％、至多1％、或至多0.5％。在一个实施方式中，“大约”是指在给定值以上和以下至多0.1％的范围。

在本公开的文本中引用了若干文献。本文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明、说明书等)，无论在上文或下文中，均通过整体引用并入本文。如果通过引用并入的材料与本说明书相矛盾或不一致，则说明书将取代任何此类材料。本文中的任何内容均不应被解释为承认因在先发明而使本发明无权早于此类公开内容。

该说明书包括可用于理解本发明的信息。这并不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关或者具体或隐含地引用的任何出版物是现有技术。

附图说明

图1：成人和新生儿单核细胞中LPS诱导的转录组学变化。(A)实验设置和生物信息数据分析。QC/QA＝质量控制/质量保证。(B)各组相对于组均值的表达差异在CEA网络上的可视化结果。(C)LPS诱导的所选MyD88和TRIF依赖性基因的表达的倍数变化(qRT-PCR)。数据条表示均值±s.d.(n＝7)。*P<0.05,**P<0.005，学生t检验。

图2：成人和新生儿单核细胞之间的基础基因表达差异。(A)描绘有(LPS)或无(对照)LPS处理的成人(AB-Mo)相对于新生儿(CB-Mo)Mo的组关系的转录组数据的PCA。(B)在数据集内具有最高方差的1.000基因的分层聚类(P<0.000005，单向ANOVA)。(C)表示差异表达(DE)基因的数的图。(D)基础DE基因的GOEA。(E)MyD88和TRIF依赖性基因的相对基础表达(qRT-PCR)。数据条表示均值±s.d.(n＝7)。*P<0.05，**P<0.005，学生t检验。(F)左：在CEA网络上绘制的基线和LPS水平处的DE基因。高亮显示的是LPS刺激后失去表达差异的基因。右：基线处DE基因的TF预测分析。NES＝归一化富集分数。

图3：成人和新生儿单核细胞中LPS应答基因的转录调节。(A)LPS活化的p65-P、RelB、IRF5、IRF3-P和STAT1-P的代表性免疫印迹。密度测定数据代表相应上样对照的百分比均值±s.d.(n＝4)。*P<0.05，**P<0.005，学生t检验。(B)在不存在和存在S100A8/S100A9的指定培养时间后，在CB-Mo中MyD88和TRIF依赖性基因的相对表达。数据条表示均值±s.d.(n＝3)。*P<0.05，学生t检验。(C)AB-Mo中S100A8/S100A9诱导的TF活化。代表性印迹和密度测定法(n＝3)。*P<0.05，**P<0.005，学生t检验。(D)来自n＝5个独立ChIP测定的指定基因启动子的代表性PCR。(E)通过密度测定法对ChIP-PCR进行的定量分析，绘制为来自输入(IP；100％)的百分比均值±s.d.。*P<0.05，学生t检验。

图4：人单核细胞中的出生后表达变化。(A)源自AB-Mo(AB-MDM)和CB-Mo(CB-MDM)的巨噬细胞的形态。左，相衬；右，MGG染色。(B)、(C)未处理的AB-MDM和CB-MDM(B)中和LPS诱导的FC(C)中的相对基因表达。数据条表示均值±s.d.(n＝3)。*P<0.05，学生t检验。(D)从健康婴儿(n＝127)和成人(n＝20)获得的血液样品的工作流程。(E)MyD88和TRIF依赖性基因的年龄依赖性表达。数据条表示均值±s.e.m.。通过ANOVA——如所有年龄组的加帽末端线(*P<0.05；**P<0.001；***P<0.0001)所示——和事后ANOVA t检验(年龄亚组和成人之间的开放线，P<0.05)确定显著差异。

图5：小鼠内毒素模型(LPS处理)。用S100A8/A9异二聚体或S100A8同二聚体替换后S100敲除小鼠的存活率。用S100A8/A9异二聚体或S100A8同二聚体预处理显著保护小鼠免受LPS诱导的败血性休克。

图6：小鼠葡萄球菌/败血症模型。(A)金黄色葡萄球菌(S.aureus)诱导败血症后存活的wt(n＝12)和S100A9^-/-(n＝16)新生儿的百分比。*P<0.0001(Mantel-Cox检验)。(B)用S100A8/A9异二聚体或S100A8同二聚体替换后S100敲除小鼠的存活率。用S100A8/A9异二聚体或S100A8同二聚体预处理显著保护小鼠免受LPS诱导的败血性休克，并与人新生儿的败血症风险成反向相关。

图7：测量为每个组织的菌落形成单位(CFU)的不同小鼠组织中的细菌负荷。(A)感染后(p.i.)的细菌负荷(每组n＝10个wt，11个S100A9-/-)。结果绘制为均值±s.d.。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005(非配对t检验)。(B)用和不用S100A8同二聚体替换的小鼠的肝、肺和肾组织中的CFU。用S100A8同二聚体预处理显著保护小鼠器官免受细菌负荷。细菌负荷(PBS n＝5。S100A8n＝11)。数据条表示均值±s.d.。*P<0.05，**P<0.01(非配对t检验)。

图8：取决于胎龄的S100A8/S100A9脐带血水平。(A)脐带血中S100A8/S100A9异二聚体的浓度随着人新生儿受试者的胎龄显著增加。(B)足月(n＝31)和不足月(n＝49)人新生儿的脐带血中的S100A8/A9水平。数据条表示均值±s.e.m.，**P<0.05(Mann-Whitney U检验)。(C)S100A8/A9脐带血水平在不足月新生儿中差异化，LONS晚出现(n＝13)或不存在(n＝49)。箱线图显示中位数和四分位数范围±s.d.，*P<0.05(Mann-Whitney U检验)。(D)在(B)和(C)中分析脐带血中S100A8/S100A9水平的不足月婴儿组和足月婴儿组的出生特征。

图9：剖腹产和阴道分娩的人新生儿受试者中的S100A8/S100A9血清水平。在阴道分娩的人新生儿受试者中S100A8/S100A9异二聚体的浓度显著高于剖腹产出生的人新生儿受试者的水平。

图10：人母乳中的S100A8/S100A9浓度取决于新生儿的年龄。与正常成人血清S100A8/S100A9异二聚体水平相比，在新生儿的第一个月期间，人母乳中的S100A8/S100A9异二聚体浓度显著升高。

具体实施方式

以下实施例例示本发明。这些实施例不应解释为限制本发明的范围。包含这些实施例是出于说明的目的，且本发明仅受权利要求所限。本领域技术人员将清楚，本发明可以以不同于本说明书和实施例中具体描述的方式实施。鉴于上述教导，本发明的许多修改和变化都是可能的，因此，它们都在所附权利要求的范围内。

为捕捉新生儿和成人之间的总体差异，本发明的发明人评价了响应于LPS刺激的分离的成人血液(AB)和脐带血(CB)单核细胞(Mo)中的全局转录调节(图1A)。在这里可以鉴定差异表达的(DE)基因，并且共表达基因作为网络可以可视化(图1B)。形成两个大的集簇，从而反映出LPS引起的基因上调(右集簇)或下调(左集簇)(图1B)。在集簇内，最强调节的基因的分布在AB-Mo和CB-Mo之间大有不同。根据基因本体注释(GOEA)的聚类指向TLR4下游的主要信号传导模块的差异化参与(图2A和图2B)，其通过通路富集分析进一步验证(数据未显示)。LPS引起的基因上调在AB-Mo中主要通过MyD88依赖性信号传导所介导，但在CB-Mo中主要通过TRIF依赖性信号传导所介导。在使用定量PCR(qPCR)的独立实验中，能够证实在AB-Mo中在用LPS刺激后有显著更高的MyD88/NF-κB/IRF5依赖性候选基因(CCL2、IL-6、IL-1β、CXCL2、CCL20、TNFα)的上调。相比之下，CB-Mo中TRIF/IRF3/STAT1依赖性调节性IFNγ应答基因(IFNB1、IDO1、CCL5、CXCL10、CXCL11、CD80)的诱导显著更高(图1D)。

为了更好地理解定义的TLR4信号传导模块在AB-Mo和CB-Mo中的互利使用，对数据集内方差最大的1,000个基因进行了主成分分析(PCA)(图2A)和层次聚类(HC)(图2B)。令人惊讶的是，AB-Mo和CB-Mo之间的基线差异(扩展数据表3)结果比LPS诱导的表达变化更明显。在基线下在AB-Mo和CB-Mo之间发现最高数量的DE基因(图2C)，表明对LPS的响应差异主要由基线差异决定。基础DE基因的GOEA(图2D)和HC(数据未显示)表明与AB-Mo相比，在CB-Mo中具有升高的基础表达的基因具有促炎性免疫应答功能，而与免疫调节相关的基因表达较低。独立的qPCR证明与AB-Mo相比，促炎性MyD88依赖性基因在CB-Mo中基础升高，而TRIF依赖性调节基因几乎不表达(图2E)。基础表达水平明显反向地影响LPS反应性(图1D)。当使用分析LPS可诱导基因的共表达网络的无偏方法时，这种反向关系也成立(图2F)。在基线下，63个共表达的基因在CB-Mo中表达较高，但在LPS刺激时增加程度比在AB-Mo中更少，因此表达差异在LPS水平下降低。相比之下，在CB-Mo中有57个基础表达较低的基因以更高的LPS诱导倍数变化进行响应，达到与AB-Mo中相当的LPS诱导的表达水平。

使用这两个基因组作为饵(bait)，过显现分析(overrepresentation analyse)揭示了对于57个低表达基因的IRF3转录因子结合位点(TFBS)和STAT1-TFBS的强烈富集，而在CB-Mo中升高的63个基因主要是NF-κB靶标(图2F)。利用构成PCA的第一和第二主成分的前2.5％基因进行无偏TFBS过显现分析产生类似的结果(数据未显示)。在新生儿转录组中，LPS诱导的AB-Mo和CB-Mo的转录组改变同样使NF-κB-TFBS显著富集，而AB-Mo和CB-Mo之间的基础改变以IFR5-TFBS显著富集和STAT1-TFBS低显现(underrepresentation)为特征。总之，这些数据表明新生儿Mo中在基线时具有高NF-κB/IRF5和低IRF3/STAT1活性，后者与最近的提出新生儿缺乏IRF3活性的Mo表达数据计算机研究结果(Lissner M.M.等人PLoS One(2015)10,e0132061)相一致。有趣的是，在早产儿中，显示70个TRIF轴下游的IFN应答基因的表达水平比足月新生儿中甚至更低(Singh V.V.等人PLoS One(2013)8,e62845)。

此外，追踪了TLR4下游的转录激活因子的活化(图3A)。在AB-Mo中，在LPS处理后NF-κB p65迅速磷酸化，这在CB-Mo中未观察到。相比之下，在CB-Mo中观察到与LPS耐受性相关的NF-κB RelB的显著核积累，但在AB-Mo中未观察到。IRF5在CB-Mo中呈现高度刺激依赖性的先天表达(a priori expression)和二聚化，而AB-Mo中的IRF5表达仅在LPS活化后增加而没有二聚化(图3A)。汇总而言，这些数据记录了CB-Mo中对LPS刺激有耐应性的NF-κB的活化改变和高基础IRF5活性。出乎意料的是，IRF3和STAT1在AB-Mo和CB-Mo中类似地表达并磷酸化(图3A)。由此没有鉴定出IRF3和STAT1之间能够解释CB-Mo中TRIF依赖性基因的低基础表达的显著差异。

先前报道过CB-Mo强烈表达并释放警报素S100A8和S100A9——内源性TLR4配体，其在成人单核细胞中与ET非常相似地诱导低反应性状态，但AB-Mo并不如此。如本文所示，CB-Mo中MyD88依赖性基因的高表达确实需要在细胞培养期间存在S100A8/S100A9。然而，S100A8/S100A9对TRIF依赖性基因的低表达没有显著影响(图3B)。而且，S100A8/S100A9在S100A8/S100A9幼稚的AB-Mo中强烈活化NF-κB和IRF5，但不活化IRF3(图3C)。尽管警报素活化STAT1，但快速动力学指向IRF3非依赖性活化通路。这些数据表明，警报素引起新生儿MyD88/NF-κB/IRF5依赖性的而非TRIF/IRF3/STAT1依赖性的基因的程序化。

可以通过独特的表观遗传调节来解释差异细胞程序化(Saeed S.等人,Science(2014)345:1251086；Alvarez-Errico D.等人,Nat Rev Immunol(2015)15:7)。因此，已经调查了关注下述的启动子相关组蛋白修饰：H3K9三甲基化(H3K9me3)，其与基因抑制；以及H3K4三甲基化(H3K4me3)和H4K91乙酰化(H4K91ac)，这两者都与基因活化相关(图3B和图3C)。在AB-Mo中，MyD88依赖性基因IL-6、IL-1β和TNFα在LPS刺激后未显著乙酰化并且增加H4K91ac表达。然而，在CB-Mo中，这些基因的启动子具有高基线水平的H3K4me3和H4K91ac，它们是积极转录基因的标志物。在LPS攻击后没有观察到进一步的组蛋白乙酰化或甚至观察到脱乙酰化，使人联想起耐受状态。这些结果与在CB-Mo中，相较于在AB-Mo中的强诱导性，警报素介导的IL-6、IL-1β和TNFα的预活化和LPS低反应性相一致。相比之下，在AB-Mo中IDO1、CXCL10和CD80的启动子区域具有显著的H3K4me3和H4K91ac标记。这些在LPS刺激后没有变化，这解释了扎实的基础表达强度和中等的LPS诱导性。然而，在CB-Mo中，所有这些TRIF依赖性基因的启动子在基线时未被乙酰化并且几乎没有三甲基化，但在LPS刺激时相当强烈地乙酰化，这与出生时缺乏基础基因表达但LPS具有强诱导性一致。这些数据进一步说明CB-Mo在功能性上没有受损，而是在转录和表观遗传上受到差异调节。

AB-Mo和CB-Mo之间的差异表明，出生后成熟引起Mo中的细胞重编程。我们试图通过在体外将CB-Mo暴露于AB血浆14天来模拟这种重编程。细胞活力和巨噬细胞样形态的获得(图4A)在AB-Mo和CB-Mo中是相当的。在该培养期后，在培养的CB-Mo中MyD88/NF-κB/IRF5依赖性基因的表达降低至与培养的AB-Mo中相当或甚至更低的水平(图4B)，导致显著更强的LPS诱导性(图4C)。相比之下，在CB-Mo中大多数TRIF/IRF3/STAT1依赖性基因的表达在14天培养期间没有增加(图4B)，并且对LPS刺激作出更强表达增加的响应(图4C)。该数据清楚地表明，在没有调节基因程序成熟的情况下丧失警报素耐受性导致新生儿Mo的炎性表型。我们在S100A9-/-新生儿中的发现——易于发生败血症的高炎性过程支持了这一点。

因此，可以假设TRIF/IRF3/STAT1依赖性基因需要体内条件和/或更长的时间段以达到成人基线水平。因此，进行了在健康婴儿的生命第一年期间评价体内基因表达变化与成人志愿者相比较的研究(图4D)。与体外模型相似，出生后促炎性IL-6和IL-1β的高表达在生命的第一天迅速下降。然而，TRIF依赖性基因达到与健康成人中所见相当的表达水平，对于CD80开始于11至30天，对于CCL5和IDO1开始于生命第一年的后半年。CXCL10在第一年内甚至没有达到成人水平。

基于这些发现可以提出一种模型，其解释了先前提出的通过瞬时的出生相关的警报素诱导的低反应性状态(特别是对于MyD88依赖性基因)引起的新生儿免疫系统的LPS反应受损。在成人Mo中TRIF依赖性基因调节新出现的MyD88依赖性促炎性反应。如本文所证明的，它们在出生时尚未表达，但需要在生命的第一年中在延长的时间段内朝着成人表型进行重编程。因此，可以建议，警报素介导的耐受化是新生儿预防对LPS过度炎性反应的必要机制，只要调节性TRIF依赖性基因的表达强度在出生后仍然很低。然而，警报素诱导的MyD88依赖性促炎性基因的预活化不足以及TRIF依赖性调节基因的重编程受损或延迟致使新生儿易于发生高炎性免疫反应，由此增加该年龄组的败血症风险。最近在新生儿败血症鼠模型中的观察进一步支持了这些发现，在该鼠模型中用TRIF依赖性代表性CXCL10治疗是保护性的(Cuenca A.G.等人,Infect Immun(2011)79:2746；Cuenca A.G.等人,J Immunol(2015)194:1169)。在胎儿发育期间，TRIF依赖性基因的沉默对于防止适应性免疫的激活可能是重要的(Kanagavelu S.等人,Infect Immun(2015)83:4404；Kolb J.P.等人,SciSignal(2014)7:ra108)，这将有助于胎儿母体耐受。通过使用激活TRIF信号传导的特异性TLR4激动剂促进出生后免疫成熟，可以为处于败血症高风险的新生婴儿提供有价值的预防选择。

与上述观察相一致，在本发明中可以进一步证明，在早产(不足月)新生儿受试者中脐带血中S100A8/S100A9的水平显著低于正常胎龄新生儿受试者脐带血中的S100A8/S100A9水平(图8)。此外，发现通过剖腹产分娩的新生儿受试者的S100A8/S100A9血清水平显著低于通过阴道分娩出生的受试者(图9)。相反，可以在母乳中检测到大规模高浓度的S100A8/S100A9衍生物(图10)。因此，这些观察结果表明了一种可能的防止新生儿受试者特别是以细菌定殖减少为特征的早产儿受试者和剖腹产新生儿对出生后细菌定殖的极端炎性反应的首要原则。因此，本发明在这方面描述了针对形成下述而预防性使用内源性警报素例如S100A8/S100A9衍生物的可能性：出生后炎性病症，其是新生儿对病原体相关分子模式(PAMP)特别是LPS反应的结果，比如败血症、坏死性小肠结节炎和支气管肺发育不良；或直接使出生后炎性病症形成风险增加的出生后改变，其是新生儿对PAMP反应的结果，比如扰乱的微生物群发展。

另外，可以在S100敲除小鼠的体内实验中证明，用S100A8/S100A9异二聚体或S100A8同二聚体替换在内毒素(LPS施用)模型以及葡萄球菌/败血症模型中导致所述动物的存活率显著提高(图5和图6)，这进一步支持了新生儿受试者在出生时警报素诱导的对LPS低反应性状态的假设。在这方面，当在测试系列之前用S100A8/S100A9衍生物预处理时，所述动物的肝、肺和肾的细菌负荷也显著降低(图7)。令人惊讶的是，对于S100A8单体可以观察到最高效力，其似乎比S100A8/S100A9异二聚体更有效。因此，较低浓度S100A8同二聚体的预防和治疗性使用似乎高度值得推荐用于在新生儿受试者中实现期望的应激耐受效应。

研究群体

在从父母获得书面知情同意后，在生命第一年期间从出生日(第0天)开始从没有潜在炎性疾病的健康婴儿收集1ml EDTA样品(n＝127，这些婴儿经历常规的外周血抽血用于先天性代谢缺陷国家筛查项目或用于测试生理黄疸引起的胆红素血液水平或用于在可选程序或操作之前进行的常规血液测试)。参与者于2011年6月至2015年12月期间在汉诺威医学院(德国汉诺威)进行前瞻性登记。根据末次月经期来计算胎龄。当使用胎儿顶-臀长度(CRL)在11-13⁺⁶周妊娠的早期超声偏离超过7天时，使用超声波进行孕程测量(dating)。排除涉及以下情况的妊娠：体外授精、多胎妊娠、由母体创伤引起的分娩、以及有重大异常的新生儿、对于胎龄而言体重小或大以及羊膜感染综合征的临床或实验室征兆。从过去4周内没有感染迹象的健康志愿者供体获得成人血液样品(n＝20)。

伦理声明

这些研究得到了汉诺威医学院机构审查委员会的批准(编号6031-2011，编号6031-2015，研究产科生物库编号1303-2012)。从所有参与个体的父母分别获得了书面知情同意书。

细胞和细胞培养条件

对于比较成人和新生儿Mo的所有研究，从父母获得书面知情同意书，以自阴道分娩的健康足月新生儿收集50ml肝素化的CB样品。人AB-Mo来自健康供体的血沉棕黄层。在Ficoll-Paque密度梯度离心后，使用Monocyte Isolation Kit II(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)分离Mo。对于研究群体内的表达分析，我们使用EasySep^TMDirect Human Monocyte Isolation Kit(Stemcell Technologies，Grenoble，France)在收集的1小时内从EDTA样品中分离Mo。使用PE-标记的抗CD14单克隆抗体(mAb)，使用FACSCanto II流式细胞仪并用DIVA软件V6.1.3(均为BD Biosciences，Heidelberg，Germany)，通过流式细胞术确定分离的Mo的纯度>90％，并进行质量控制。在将1x 10⁶个细胞/ml于铁氟龙袋中在补充有1％谷氨酰胺、1％青霉素-链霉素和15％FBS的McCoy’s改良培养基(Biochrom AG,Berlin,Germany)中过夜(o/n)培养之后，将Mo与10ng/ml LPS或2μg/mlS100A8/S100A9一起孵育指定时间段用于基因表达研究，与100ng/ml LPS或10μg/mlS100A8/S100A9一起孵育指定时间段用于免疫印迹分析，与1μg/ml LPS一起孵育指定时间段用于ChIP测定。

通过将纯化的Mo在补充有1％谷氨酰胺、1％青霉素-链霉素和10％人AB血浆的RPMI 1640中培养14天，获得衍生自单核细胞的巨噬细胞样细胞(MDM)。由此，每三天将30％的培养基用新鲜的巨噬细胞培养基替换。将在Lap-Tek室(Thermo Fisher Scientific，Darmstadt，Germany)中培养的风干和2％PFA固定的MDM用于May-Grunwald-Giemsa(MGG，Pappenheim)染色。

试剂

LPS(大肠杆菌055:B5)购自Sigma(Steinheim,Germany)。人S100A8/S100A9复合物分离自粒细胞，如Austermann等人,Cell Reports(2014)9:1-12所述。

基因阵列表达研究和微阵列数据的生物信息学分析

对于各实验条件(LPS，对照(Ctrl))，使用NucleoSpin RNA II试剂盒(Macherey-Nagel，Düren，Germany)从三个个体供体分离总RNA。使用Affymetrix

HumanGenome U133A 2.0处理样品用于微阵列杂交，(hgu133a)用于AB-Mo，hgu133plus2用于CB-Mo，如前所述(Viemann D.等人,J Immunol(2011)186:164)。在批量校正之前，使用RMA(Robust Multi-array Average，一种用于背景校正的算法，log₂变换和Affymetrix表达数据的分位数归一化)将数据导入Partek Genomics Suite 6.6(PGS；V6.14.0724)。将来自不同芯片类型(来自hgu133a的AB-Mo，来自hgu133plus2的CB-Mo)的表达值组合，仅保留具有来自两种芯片类型的信息的探针，产生22,277个探针。此外，通过选择所有样品中具有最高方差的探针，每个基因符号仅留下一个探针，产生13,515个独特转录物。差异表达(DE)基因通过倍数变化(FC)>2或<-2来定义，并且错误发现率(FDR)-校正p<0.05。

为了将数据内的结构可视化，使用PGS中的默认设置，基于根据整个条件下样品表达值的P值，我们对数据集内方差最大的1,000个基因的所有现有和层次聚类(HC)进行了主成分分析(PCA)。对于通路富集分析，我们将DE基因列表导入生物通路和过程的反应组(Reactome)数据库(http://www.reactome.org)(Fabregat A.等人,Nucleic Acids Res(2016)44:D481-D487)。应用单尾Fisher精确检验计算DE基因组内通路的过显现。只考虑概率p<0.0001的顶级通路的过显现。使用R package ggplot2通过条形图将所选择的富集的反应组通路可视化。富集P值以log₁₀标度绘制。为了将DE基因与已知的生物学功能联系起来，我们使用与对照CB-Mo相比LPS活化的CB-Mo中376个最差异上调和319个最下调的基因，与对照AB-Mo相比LPS活化的AB-Mo中482个最差异上调和780个最下调的基因，以及与对照CB-Mo相比对照AB-Mo中162个最差异上调和517个最下调的基因(FC>4或<-4和FDR-校正的P值<0.05)，以便通过使用BiNGO(Maere S.等人,Bioinformatics(2005)21:3448)、EnrichmentMap(Merico D.等人,PLoS One(2010)5:e13984)和Cytoscape(http://www.cytoscape.org/)中的WordCloud(Oesper L.等人,Source Code Biol Med(2011)6:7)，生成和可视化基于GO富集分析(GOEA)的网络。节点的颜色和大小表示相应的FDR调整的富集P值(Q值)。GO-条目之间的基因重叠由边指示。为了使用基因调控网络确定因活化引起的年龄依赖性变化，我们构建了DE基因的联合体，从而比较LPS活化的AB-Mo与对照AB-Mo和DE基因，比较LPS活化的CB-Mo与对照CB-Mo。使用BioLayout3D(Theocharidis A.等人,NatProtoc(2009)4:1535)将这些基因的表达值用于所有12个数据集的共表达分析(CEA)。应用0.7的关联截止值得到具有442个节点(基因)的共表达网络。计算出的基因-基因对连同其Pearson相关系数从BioLayout3D输出，并使用力导向布局输入到Cytoscape进行可视化。Cytoscape用于将进一步的信息映射到网络上。例如，我们将每个条件的FC值(基于ANOVA模型)或组FC值(基于每个条件与所有条件下的均值的比较)分别映射到网络上。为了基于共表达网络分析鉴定CB-Mo和AB-Mo之间的小差异，将对照CB-Mo与对照AB-Mo相比较，我们标记了FC>1.2或<-1.2的基因，产生了两个基因簇。然后使用iRegulon将每个基因簇的基因用于TF结合位点(TFBS)预测(Janky R.等人,PLoS Comput Biol(2014)10:e1003731)。对于转录因子过显现分析，使用R包pcaGoPromoter V1.12.0(Hansen M.等人,PLoS One(2012)7:e32394)。提取PCA负荷以从在正向和负向上构成第一(PC1)和第二主成分(PC2)的前2.5％基因获得探针标识符。这些最有构成作用的基因被进一步考虑用于预测调节转录因子网络。以以下参数使用primo算法进行对预测的转录因子结合位点的过显现分析：显著性的P值截止值＝0.05，用FDR调整P值用于多种检验，应由转录因子结合的启动子的百分比>＝90％。微阵列数据符合MIAME标准并存入GEO(GSE78697)。

定量实时PCR(qRT-PCR)

使用NucleoSpin RNA II试剂盒分离RNA。使用Agilent 2100BioAnalyzer和RNA6000Nano Kit(RNA完整值(RIN)>7.0)(Agilent，Santa Clara，CA)评价质量。如Viemann D.等人,J Leukoc Biol(2006)80:174中所述进行qRT-PCR。

采用的引物为GAPDH(F:GCAAATTCCATGGCACCGT(SEQ ID NO:1)，R:GCCCCACTTGATTTTGGAGG(SEQ ID NO:2))，CCL2(F:TCGCCTCCAGCATGAAAGTC(SEQ ID NO:3)，R:TTGCATCTGGCTGAGCGAG(SEQ ID NO:4))，IL-6(F:AGAGGCACTGGCAGAAAACAAC(SEQ ID NO:5)，R:AGGCAAGTCTCCTCATTGAATCC(SEQ ID NO:6))，IL-1β(F:GCGGCCAGGATATAACTGACTTC(SEQ ID NO:7)，R:TCCACATTCAGCACAGGACTCTC(SEQ ID NO:8))，CXCL2(F:ACATCCAAAGTGTGAAGGTGAAGTC(SEQ ID NO:9)，R:AAGCTTTCTGCCCATTCTTGAGT(SEQ ID NO:10))，CCL20(F:ACCCTCCATGATGTGCAAGTG(SEQ ID NO:11)，R:TTCTGGAATGGAATTGGACATAGC(SEQ ID NO:12))，TNFα(F:CTTCTCGAACCCCGAGTGAC(SEQ ID NO:13)，R:TGAGGTACAGGCCCTCTGATG(SEQ ID NO:14))，IFNB1(F:TCTGGCACAACAGGTAGTAGGC(SEQ IDNO:15)，R:GAGAAGCACAACAGGAGAGCAA(SEQ ID NO:16))，IDO1(F:TGCAGGCCAAAGCAGCGTCT(SEQ ID NO:17)，R:GAGCAGCATGTCCTCCACCAGC(SEQ ID NO:18))，CCL5(F:CAGTGGCAAGTGCTCCAACC(SEQ ID NO:19)，R:CCATCCTAGCTCATCTCCAAAGAGT(SEQ ID NO:20))，CXCL10(F:AAGGATGGACCACACAGAGG(SEQ ID NO:21)，R:TGGAAGATGGGAAAGGTGAG(SEQID NO:22))，CXCL11(F:CAGAATTCCACTGCCCAAAGG(SEQ ID NO:23)，R:GTAAACTCCGATGGTAACCAGCC(SEQ ID NO:24))和CD80(F:CTGCTTTGCCCCAAGATGC(SEQ ID NO:25)，R:CAGATCTTTTCAGCCCCTTGC(SEQ ID NO:26))。样品数据表示为使用比较Ct方法与对照细胞相比基因表达的倍数诱导或表示为相对于管家对照基因GAPDH的相对表达。

免疫印记

为了检测相对于总p65、IRF3和STAT1的磷酸化以及检测相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的IRF5，通过在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解5×10⁶个细胞获得全细胞裂解物，如Viemann D.等人,Blood(2005)105:2955中所述。为了检测相对于组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)的核RelB积累，使用NE-PER核和细胞质提取试剂盒(ThermoFisher Scientific)制备核细胞提取物。如前所述进行SDS-PAGE和蛋白质印迹染色(Viemann D.等人,Blood(2005)105:2955；Viemann D.等人,Blood(2004)103:3365)。第一抗人抗体(Ab)p-NF-κB p65(Ser 311)、NF-κB p65(C-20)、RelB(C-19)、IRF-5(10T1)、GAPDH(FL-335)和IRF-3(FL-425)来自Santa Cruz Biotechnology，p-IRF3(Ser 396)和p-STAT1(Tyr701)来自Thermo Fisher Scientific，HDAC1(10E2)、STAT1和合适的辣根过氧化物酶结合的第二抗小鼠和抗兔抗体来自Cell Signalling(Leiden,Netherlands)。使用增强的化学发光系统使蛋白质条带可视化，并使用ChemiDoc MP System和Image Lab Softwarev.4.0(所有Bio-Rad Laboratories，München，Germany)通过密度测定分析进行定量。

ChIP测定

在对照和2-h LPS刺激的AB-Mo和CB-Mo中进行ChIP测定。收获细胞(各条件5×10⁶个)，在室温下用1％甲醛固定10分钟并用125mM甘氨酸淬灭10分钟。洗涤后，在冰上将细胞在1％SDS裂解缓冲液中裂解10分钟，通过超声处理剪切DNA(Bandelin Sonoplus HD2070(Berlin,Germany)：10×30秒，35％功率，无循环)，等分试样作为输入对照保留。将100-200μl核染色质裂解物(对应于1×10⁶个细胞)分别用ChIP稀释缓冲液(0.01％SDS，1.1％Triton x-100，1.2mM EDTA，16.7mM Tris pH:8,1，167mM NaCl)1:10稀释，用A/G-琼脂糖珠(Thermo Fisher Scientific)预清洗90分钟。在用抗组蛋白H3(三甲基K4)、组蛋白H3(三甲基K9)、和组蛋白H4(乙酰基K91)的特异性多克隆抗体和多克隆对照抗HA标签抗体(均为Abcam，Cambridge，USA)于4℃过夜免疫沉淀(IP)之后，用蛋白质A/G-琼脂糖珠提取DNA-蛋白质复合物。严格洗涤后，使输入的各个IP DNA和蛋白质之间的交联逆转，用100μg蛋白酶K(65℃过夜)消化蛋白质。对DNA使用ChIP DNA Clean&Concentrator试剂盒(ZymoResearch，Irvine，USA)进行纯化，使用来自Genaxxon(Ulm，Germany)的PCR Mastermix通过PCR进行分析。对IL6的启动子使用引物(F:CCCCCTAGTTGTGTCTTGCC(SEQ ID NO:27)，R:CTTTGTTGGAGGGTGAGGGT(SEQ ID NO:28))，IL-1β(F:GGCATTGATCTGGTTCATCCA(SEQ ID NO:29)，R:GGCAGAGAACATACGGTATGCA(SEQ ID NO:30))，CCL20(F:AGCAGGAAGTTTTCCTTGCG(SEQID NO:31)，R:AGAAGGCGTGTTGCCACAT(SEQ ID NO:32))，TNFα(F:CCTCCAGGGTCCTACACACA(SEQ ID NO:33)，R:TTGGGGACACACAAGCATCA(SEQ ID NO:34))，IDO1(F:AGCGCGAGAGCTATTCTAGACTGT(SEQ ID NO:35)，R:AGAAACCAAGTTGCCCGTTCCTCT(SEQ ID NO:36))，CCL5(F:TGGGAGAGACCCTATGACCAGGA(SEQ ID NO:37)，R:GGCAGTTGATCTGAGCTGGGCA(SEQ ID NO:38))，CXCL10(F:ACCACTCTCTCTCCTTCCAACT(SEQ ID NO:39)，R:TAGGCCAAGCTCTGTTATGCTAC(SEQ ID NO:40))，CXCL11(F:TCCCACCAACACTCACATAAGG(SEQ IDNO:41)，R:TTAATGGGTAGGTGGGAAAGACAG(SEQ ID NO:42))和CD80(F:AGGCCCCTTCTGCCAATACA(SEQ ID NO:43)，R:AGTTTGTGGCAGAGCTTAGTGG(SEQ ID NO:44))。将PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上跑胶，用4.0版本Image Lab软件定量并分别相对输入(100％)进行归一化。

小鼠内毒素模型(LPS处理)

使用C57BL/6小鼠(野生型(wt)；Harlan Laboratories)和S100A9敲除小鼠(-/-)(Manitz等人,Mol.Cell.Biol.(2008)29:1034-1043)并且无病原体地饲养。通过分别腹膜内注射40mg LPS(大肠杆菌055：B5)和680mg D-Gal(Sigma)/kg体重，在2个月大的WT小鼠中诱导败血性休克。平行地，通过每只小鼠静脉内注射100ng LPS或300mg S100A8/S100A9对小鼠进行预处理，然后在24小时后进行LPS/D-Gal攻击。在另外的方法中，在LPS/D-Gal攻击之前注射两次S100A8/S100A9复合物(12小时和24小时)。分析受攻击小鼠的存活48小时。在2天龄时使用新生WT和S100A9^-/-小鼠。用10mg LPS或PBS(对照)皮下注射幼崽。对于细胞因子表达分析，在LPS处理后2小时收获血液和器官。对于存活研究，观察小鼠80小时。

细胞因子测定和ELISA

通过使用从eBioscience(Vienna，Austria)获得的鼠FlowCytomix Set来研究小鼠血浆中的细胞因子水平。对于Mo培养物上清液中的细胞因子研究，我们使用来自BDBiosciences的IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α的人FlexSet。通过ELISA测定人S100A8/A9的血清浓度，如Austermann等人,Cell Reports(2014)9:1-12、在WO 2016/116881中的Vogl,T.等人,Nat.Med.(2007)13:1042-1049中所述。

金黄色葡萄球菌诱导的新生儿败血症的小鼠和模型

使用C57BL/6小鼠(野生型(wt)；Harlan Laboratories)和S100A9敲除小鼠(-/-)，并在无特定病原体的条件下饲养。在2天龄时使用新生wt和S100A9^-/-小鼠，通过皮下(s.c.)注射20μl含有7×10⁴个CFU金黄色葡萄球菌菌株Newman(GenBank登录号AP009351.1)的细菌悬液来诱导败血症。对照新生小鼠s.c.接受20μl PBS。对于预处理研究，S100A9^-/-幼崽在1天龄时用20μl PBS中的25μg或40μg S100A8/A9或者2.5μg S100A8腹膜内(i.p.)注射。仅用PBS预处理的小鼠作为对照。在预处理后40小时通过s.c.注射7×10⁴个CFU金黄色葡萄球菌诱导败血症。在80h的时间段内监测小鼠的存活。对于基因表达、细胞因子研究和细菌负荷分析，在细菌接种后24小时通过断头处死小鼠以收获血浆和器官。对于RNA分离，将右肝叶在液氮中快速冷冻并精细研磨，然后再悬浮于RNA裂解缓冲液中并在-80℃下储存。为了测定细菌负荷，收获右肺、右肝叶和两个肾，并使用70μm细胞过滤器均质化。将器官匀浆物以连续稀释液铺板在血琼脂平板上。在37℃孵育18小时后对金黄色葡萄球菌菌落计数。

用金黄色葡萄球菌离体感染人单核细胞

将新鲜分离的成年和新生儿人Mo以2×10⁶个细胞/ml的浓度接种在补充的McCoy's改良培养基中，不添加抗生素。为了模拟新生儿情况，将成人Mo额外在10μg/ml人S100A8/A9或100ng/ml人S100A8的存在下培养。过夜孵育后，将细胞用金黄色葡萄球菌菌株Newman以0.1和1.0的感染复数(MOI)感染3小时和6小时。p.i.一小时，通过添加最终浓度为100μg/ml的庆大霉素来杀死细胞外细菌。收集上清液并储存在-80℃直至每次进行细胞因子分析。收获细胞并计数以确定接种的Mo中存活Mo的比例。然后通过添加无菌水裂解细胞。将连续稀释液涂布在血琼脂平板上。在37℃孵育18小时后进行金黄色葡萄球菌菌落计数。为了评价吞噬作用，将新鲜生长的对数期晚期的金黄色葡萄球菌菌株Newman的细菌悬液在95℃水浴中热灭活30分钟，然后在冰上用终浓度为0.004％的FITC溶液(Sigma)标记30分钟。将FITC标记的细菌在-20℃储存直至使用。将如上所述分离和培养的人Mo在37℃和0℃下(阴性对照)孵育，热灭活的FITC-结合的金黄色葡萄球菌的MOI为20。在0分钟、30分钟和60分钟收集细胞，将其在2％PFA中固定，通过流式细胞术分析。吞噬率定义为30分钟或60分钟时FITC阳性Mo的百分比-0分钟时FITC阳性Mo的百分比。

取决于胎龄的S100A8/S100A9脐带血水平

分娩后直接获得脐带血，并将血清在-80℃下冷冻。之后通过S100A8/S100A9-ELISA测定S100A8/S100A9水平，如Austermann等人,Cell Reports(2014)9:1-12、在WO2016/116881中的Vogl,T.等人,Nat.Med.(2007)13:1042-1049中所述。

剖腹产和阴道分娩的人新生儿受试者中的S100A8/S100A9血清水平

分娩后直接获得脐带血，并将血清在-80℃下冷冻。之后通过S100A8/S100A9-ELISA测定S100A8/S100A9水平，如Austermann等人,Cell Reports(2014)9:1-12、在WO2016/116881中的Vogl,T.等人,Nat.Med.(2007)13:1042-1049中所述。

人母乳中的S100A8/S100A9浓度

将母乳样品以1300rpm离心10分钟以除去细胞和颗粒物。之后，将母乳上清液在-80℃冷冻，通过S100A8/S100A9-ELISA测定S100A8/S100A9水平，如Austermann等人,CellReports(2014)9:1-12、在WO 2016/116881中的Vogl,T.等人,Nat.Med.(2007)13:1042-1049中所述。

统计学分析

应用于微阵列数据分析和TFBS过显现分析的统计检验如上所述。使用双尾学生t检验计算qRT-PCR和密度测定分析的统计学显著性。通过运行单向ANOVA然后进行事后双尾t检验来评估基因表达的年龄依赖性。P值<0.05被判断为显著的。

Claims (24)

1.S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/A9异二聚体在制备用于预防或治疗新生儿受试者中NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述新生儿受试者是早产的新生儿受试者或剖腹产分娩的新生儿受试者。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述NF-κB相关的出生后炎性病症是败血症、坏死性小肠结肠炎和支气管肺发育不良中的一种。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变是扰乱的微生物群发展。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物诱导所述受试者中骨髓细胞的微生物低反应性。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物诱导免疫和应激耐受。

7.根据权利要求5所述的用途，其中诱导的效应是剂量和时间依赖性的。

8.根据权利要求6所述的用途，其中诱导的效应是剂量和时间依赖性的。

9.根据权利要求1所述的用途，其中为预防NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变，在出生后用所述药物治疗所述新生儿受试者至少24小时。

10.根据权利要求1所述的用途，其中所述NF-κB相关的出生后炎性病症或所述使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变在生命的第一个月内出现。

11.根据权利要求1所述的用途，其中所述NF-κB相关的出生后炎性病症或所述使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变在生命的第一周内出现。

12.根据权利要求3所述的用途，其中所述败血症是早发型败血症或迟发型败血症。

13.根据权利要求3所述的用途，其中所述败血症的特征在于至少一种选自呼吸暂停、心动过缓、去饱和、体温不稳定和喂养不耐受的临床症状，和/或在所述临床症状发作后的48小时内存在以下特征中的至少三种：

a)C反应蛋白(CRP)值高于20mg/l，

b)血液学异常，

c)嗜中性粒细胞绝对计数低于2000/mm3的嗜中性粒细胞减少症，

d)分叶核嗜中性粒细胞左移，未成熟与总嗜中性粒细胞的比值为0.18或更高，

e)肺炎的放射学证据，

f)感染的培养证据，

g)绿色羊水，

h)胎膜早破，和

i)母亲感染的迹象。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述血液学异常为血小板计数低于100,000/mm3的血小板减少症。

15.根据权利要求3所述的用途，其中所述小肠结节炎的特征在于以下症状中的至少一种：

a)带血粘液样便，

b)腹胀，

c)呕吐，

d)肠道积气的射线影像学证据，

e)门静脉积气，

f)血液学异常，

g)血小板计数低于100,000/mm3的血小板减少症，

h)嗜中性粒细胞绝对计数低于2000/mm3的嗜中性粒细胞减少症，和

i)分叶核嗜中性粒细胞左移，未成熟与总嗜中性粒细胞的比值为0.18或更高。

16.根据权利要求3所述的用途，其中所述支气管肺发育不良的特征在于以下症状中的至少一种：

(a)需要氧气治疗，和

(b)容易感染。

17.根据权利要求4所述的用途，其中所述扰乱的微生物群发展的特征在于，相较于具有正常微生物群发展的新生儿受试者减少的微生物情况。

18.根据权利要求4所述的用途，其中所述扰乱的微生物群发展是扰乱的肠微生物群发展、扰乱的呼吸道微生物群发展和/或扰乱的皮肤微生物群发展。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的用途，其中所述受试者是哺乳动物受试者。

20.根据权利要求1至18中任一项所述的用途，其中所述受试者是人、非人的灵长类动物、狗、马、猫、豚鼠、兔、大鼠或小鼠。

21.根据权利要求1至18中任一项所述的用途，其中所述药物能够口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、通过鼻内滴注、通过移植、通过腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、病灶内、经皮或者通过应用到黏膜施用。

22.根据权利要求21所述的用途，其中所述药物与营养物一起口服施用。

23.S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/A9异二聚体在制备用于评估新生儿受试者发展NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的风险的试剂中的用途。

24.包含S100A8或S100A9同二聚体或S100A8/A9异二聚体的药物组合物在制备用于预防或治疗新生儿受试者中NF-κB相关的出生后炎性病症或使NF-κB相关的出生后炎性病症风险增加的出生后改变的药物中的用途。

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