CN109863238A - 声学生物反应器方法 - Google Patents

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CN109863238A CN201680090300.0A CN201680090300A CN109863238A CN 109863238 A CN109863238 A CN 109863238A CN 201680090300 A CN201680090300 A CN 201680090300A CN 109863238 A CN109863238 A CN 109863238A
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/02—Separating microorganisms from the culture medium; Concentration of biomass
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting

Abstract

在生物反应器的生长容积内设置一系列的多维声驻波。当营养物流体流流经细胞培养物时，使用声驻波将细胞培养物保持在适当位置。营养物流体流从细胞培养物中取出一些细胞，然后其可被回收用于细胞疗法应用。细胞培养物连续扩增和繁殖，以允许从生物反应器中连续回收细胞。

Description

声学生物反应器方法
背景技术
生物技术领域的生长归因于许多因素，其中一些因素包括可用于生物反应器的设备的改进。设备的改进使得生物衍生材料(例如单克隆抗体和重组蛋白质)的生产容积更大、成本更低。在新的基于生物的药物的制造方法中使用的关键组件之一是生物反应器和与其相关的辅助方法。
现代生物反应器是非常复杂的设备。除其他参数外，它提供对流体流速、气体含量、温度、pH和氧含量的调节。所有这些参数都可以被调整，以使细胞培养物尽可能有效地从生物反应器方法中生产所需的生物分子。一个使用生物反应器领域的方法的是灌注方法。灌注方法与补料分批方法的区别在于其较低的资金成本和较高的通量。
在补料分批方法中，将培养物接种在生物反应器中。在生长周期中逐渐添加新鲜体积的选定营养物用于提高生产力和生长。在收获培养物后回收产物，通常是单克隆抗体或重组蛋白质。目前使用各种类型的过滤器进行分离，将所需产物与细胞、细胞碎片和其它废物分离。这些过滤器昂贵，并且随着生物反应器材料的加工而变得堵塞并失去功能。补料分批生物反应器也具有高的启动成本，并且通常需要大容积以在生长周期结束时获得有成本效益量的产物，并且这样的方法包括大量非生产性停机时间。
灌注生物反应器方法连续供应补料到生物反应器中的新鲜培养基，同时不断地移出生长抑制副产物。使用灌注生物反应器方法可以减少或消除非生产性停机时间。在灌注培养中实现的细胞密度(30-100百万细胞/毫升)通常高于补料分批模式(5-25百万细胞/毫升)。然而，灌注生物反应器需要细胞保留装置以防止在移出副产物时培养物逃逸。这些细胞保留系统为灌注方法增加了一定程度的复杂性，其成功操作需要管理、控制和维护。操作问题例如细胞保留设备的故障或失灵是灌注生物反应器以前存在的问题。这限制了它们在过去的吸引力。
发明内容
在各种实施方案中，本公开涉及用于生产生物分子(例如重组蛋白质或单克隆抗体)的系统，以及涉及在生物反应器中将这些所需产物与细胞培养物分离的方法。通常，生物反应器包括用于产生多维驻波的装置。驻波用于将细胞培养物保持在适当位置。营养物流体流在生物反应器中循环通过细胞培养物以收集由细胞培养物产生的生物产物/生物分子。然后可以从离开细胞培养物的营养物流体流中分离/收获生物分子。这些生物分子可包括病毒、外来体或植物化学物质。在各种其他实施方案中，本公开还涉及产生用于应用(例如细胞疗法)的生物细胞的系统和方法。在这种实施方案中，营养物流体流以足以从细胞培养物中取出细胞的速率在生物反应器中流动通过细胞培养物。然后可以从营养物流体流中分离/收获这些取出的生物细胞以获得细胞本身。在一些实施方案中，细胞是用于生物农业技术的植物细胞，例如生产植物化学物质或昆虫抗性植物。
在各种实施方案中公开了包括生物反应器的系统。生物反应器包括反应容器、搅拌器、补料入口和出口。反应容器内的生长容积由至少一个超声换能器和位于至少一个超声换能器对面的反射器限定。驱动至少一个超声换能器以在反应容器中的生长容积内产生多维驻波。生物反应器的出口可以通向外部过滤装置或通向进一步的纯化方法，例如细胞洗涤、细胞浓缩或细胞分级分离。
生物反应器还可以包含使细胞在上面生长的支架或类似结构。生物反应器内部的声驻波可用于将细胞与支架分离并用于在分离后收集细胞。
本文还公开了从细胞培养物中连续收集细胞的方法，包括：将细胞培养物悬浮在生物反应器的生长容积中，生物反应器包括至少一个超声换能器和位于至少一个超声换能器对面的反射器，驱动所述至少一个超声换能器以产生多维声驻波，所述多维声驻波将细胞培养物保持在生长容积中；并使营养物流体流流经细胞培养物以从细胞培养物中取出细胞；并将取出的细胞与营养物流体流分离。可以在具有产物出口和再循环出口的外部过滤装置中将取出的细胞与营养物流体流分离。通过产物出口回收细胞，然后营养物流体流通过再循环出口离开外部过滤装置。
生物反应器可进一步包括位于生长容积和生物反应器出口之间的二级过滤系统。如果多维声驻波失灵，则激活二级过滤系统。多维声驻波通常以共振方式操作。
生物反应器可具有形成超声换能器的元件阵列。可选地或另外地，每个超声换能器可产生多个多维声驻波。
在特定实施方案中，生物反应器在生长容积内不包括叶轮(即物理搅拌器)。在特定实施方案中，细胞培养物由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞组成。由此产生的生物分子可以是单克隆抗体或重组蛋白质。在其他实施方案中，细胞培养物由T-细胞、遗传修饰的T-细胞、B细胞或NK细胞组成。这些生物细胞在生物反应器中培养，用于连续生产和回收细胞本身。然后将回收的细胞用于细胞疗法(例如，用T-细胞/CAR T-细胞疗法接种患者)。
多维声驻波可以具有相同数量级的轴向力分量和横向力分量。生物反应器可以作为灌注生物反应器操作。生物反应器可包括用于调节生长容积中的流体温度的护套。
在特定实施方案中，超声换能器包括可以以更高阶振型(mode shape)振动的压电材料。压电材料可以具有正方形或矩形或非对称的多边形形状。
超声换能器可包括：具有顶端、底端和内部容积的壳体；位于壳体底端的晶体，其具有暴露的外表面和内表面，晶体在被电信号驱动时能够产生声波。在一些实施方案中，背衬层与晶体的内表面接触，背衬层由基本上声学透明的材料制成。基本上声学透明的材料可以是轻木、软木或泡沫。基本上声学透明的材料可以具有高达1英寸的厚度。基本上声学透明的材料可以是格子的形式。在其他实施方案中，晶体的外表面被具有半波长或更小厚度的耐磨表面材料覆盖，耐磨表面材料是氨基甲酸乙酯、环氧树脂或硅氧烷涂层。晶体的外表面还可以具有由粘附到晶体外表面的匹配层或耐磨板材料形成的耐磨表面。匹配层或耐磨板可以由氧化铝组成。在其他实施方案中，晶体不具有背衬层或耐磨层。
超声换能器还可以包括压电材料，其是聚合的，例如聚偏二氟乙烯(PVDF)。PVDF可以在高达数百兆赫兹范围的较高频率被激发，使得非常小的颗粒可以被声驻波捕获。
多维声驻波可以是三维驻波。反射器和/或超声换能器可以具有非平面表面。
以下更具体地描述这些和其它非限制性特征。
附图说明
以下是附图的简要描述，附图是出于说明本文公开的示例性实施方案的目的而给出的，而不是为了限制本发明。
图1示出由超声换能器和反射器产生的单个声驻波。
图2是将常规补料分批生物反应器系统与灌注生物反应器系统进行比较的图示。
图3是显示本公开的生物反应器的各个组件的横截面图。
图4是管状生物反应器及其中的生长容积的剖视图。多个超声换能器用于产生将细胞培养物保持在适当位置的驻波。箭头表示营养物流体流向上流过驻波和将细胞培养物保持在其中。
图5是常规超声换能器的横截面图。
图6是本公开的超声换能器的横截面图。换能器内存在气隙，并且不存在背衬层或耐磨板。
图7是本公开的超声换能器的横截面图。换能器内存在气隙，并且存在背衬层和耐磨板。
图8是可用于产生多维驻波的压电阵列的图示。
图9是在不同频率驱动的方形换能器的电阻抗幅度与频率的关系图。
图10示出从正交于流体流动方向的图9的七个峰幅度的捕获线构型。
图11是声压幅度(以Pa表示的右手刻度)和换能器面外位移(以米表示的左手刻度)的计算机模拟。左手刻度顶部的文本为“x10-7”。左手刻度顶部由向上指向的三角形显示的文本为“1.473x10-6”。左手刻度底部由向下指向的三角形显示的文本为“1.4612x10-10”。右手刻度顶部的文本为“x106”。右手刻度顶部由向上指向的三角形显示的文本为“1.1129x106”。右手刻度底部由向下指向的三角形显示的文本为“7.357”。三角形显示该图中给定刻度描绘的最大值和最小值。水平轴是腔室内沿X轴的位置，以英寸表示，垂直轴是腔室内沿Y轴的位置，以英寸表示。
图12显示了存在复合波时晶体的面内和面外位移。
图13显示了可以使用的具有一个生长容积的生物反应器的分解图。
图14显示了具有两个堆叠的生长容积的生物反应器的分解图。
图15是生物反应器为柔性包形式的实施方案的图示。
图16是用于产生CAR T-细胞的常规方法的图示。
图17是根据本公开产生CAR T-细胞的方法的图示。
具体实施方式
通过参考以下期望实施方案的详细描述和其中包括的实施例，可以更容易地理解本公开。在下面的说明书和随后的权利要求中，将提及许多术语，这些术语应被定义为具有以下含义。
尽管为了清楚起见在以下描述中使用了特定术语，但是这些术语仅旨在指示附图中选择的用于说明的实施方案的特定结构，并不旨在限定或限制本公开的范围。在下面的附图和以下描述中，应理解，相同的数字标记指的是相同功能的组件。
除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示。
术语“包含”在本文中用于要求存在所述组分并允许存在其他组分。术语“包含”应该被解释为包括术语“由......组成”，其允许仅存在所述组分，以及可能由所述组分的制造产生的任何杂质。
数值应该被理解为包括当减少到相同数量的有效数字时相同的数值，以及包括与所述值不同的数值，该数值小于本申请所述用来测量值的常规测量技术类型的实验误差。
本文公开的所有范围包括所列举的端点并且可独立组合(例如，“2克至10克”的范围包括端点2克和10克，以及所有中间值)。本文公开的范围的端点和任何值不限于精确的范围或值；它们不精确到足够包括近似这些范围和/或值的值。
联合数量使用的修饰语“约”包括所述值并且具有由上下文指示的含义(例如，它至少包括与测量特定数量相关的误差程度)。当在范围的上下文中使用时，修饰语“约”也应被视为公开由两个端点的绝对值所定义的范围。例如，“从约2到约10”的范围也公开了“从2到10”的范围。
应注意，本文使用的许多术语是相对术语。例如，术语“上”和“下”在位置上彼此相对，即在给定方向上，上组件位于比下组件更高的高度，但是如果翻转该设备则这些术语可以改变。关于给定结构，术语“入口”和“出口”是相对于流经它们的流体，例如，流体流经入口流入所述结构并流经出口流出所述结构。术语“上游”和“下游”是相对于流体流经各个组件的方向，即流体在流经下游组件之前流经上游组件。应当注意，在回路中，第一组件可以被描述为在第二组件的上游和下游。
术语“水平”和“垂直”用于指示相对于绝对参考(即地平面)的方向。然而，这些术语不应被解释为要求结构彼此绝对平行或绝对垂直。例如，第一垂直结构和第二垂直结构不一定彼此平行。术语“向上”和“向下”也是相对于绝对参考的；向上流动总是抵抗地球的引力。
本申请涉及“相同数量级”。如果较大数除以较小数的商的值至少1且小于10，则两个数具有相同数量级。
本文使用的术语“搅拌器”是指可用于引起流体容积混合的任何装置或系统，使得流体容积中的材料分散并变得更均匀。术语“叶轮”用于指物理搅拌器，例如叶片。不是叶轮的搅拌器的实例可包括曝气器(其使用空气)。
术语“晶体”是指用作压电材料的单晶或多晶材料。
生物反应器用于制备生物分子，例如重组蛋白质或单克隆抗体。很通常的，细胞在具有培养基的生物反应器容器中培养以产生所需产物，然后通过与细胞和培养基分离来收获所需产物。使用哺乳动物细胞培养物(包括中国仓鼠卵巢(CHO)、NS0杂交瘤细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞和人类细胞)已被证明是生产/表达当今制药所需的重组蛋白质和单克隆抗体的非常有效的方式。
存在两种一般类型的生物反应器方法：补料分批和灌注。许多因素有利于使用灌注生物反应器方法。灌注生物反应器的资金和启动成本较低，需要较小的上游和下游容量，并且该方法使用比补料分批方法更小的容积和更少的种子步骤。灌注生物反应器方法也使得它自身对于开发、扩大规模、优化、参数灵敏度研究和验证更好。
灌注生物反应器技术的最新发展也有利于其使用。针对灌注生物反应器的控制技术和一般支持设备正在改进，增加灌注方法的稳健性。灌注方法现在可以使生物反应器规模扩大到容积高达1000升(L)。用于灌注生物反应器的更好的细胞保留系统导致比先前所见的更低的细胞损失和更大的细胞密度。现在，与约2000万个细胞/毫升的补料分批细胞密度相比，现在可以实现大于5000万个细胞/毫升的细胞密度。较低的污染和感染率已经改进了灌注生物反应器的输出。因此，灌注方法在收获中产生了更高的产物浓度和更高的产量却并没有显著的成本增加。
在补料分批生物反应器方法中，有改进过滤方法的需求。在灌注生物反应器方法中也有改进生物反应器中细胞的保留同时连续收获生物分子的需求。
简而言之，本公开涉及从一个或多个压电换能器产生三维(3-D)或多维声驻波，其中换能器被电或机械激发，使得它们以“鼓面(drumhead)”或多激发模式(即多模态位移(multi-mode displacement)模式)运动，而不是“活塞”或单激发模态方式。由此产生的波的类型可以表征为复合波，其位移谱类似于泄漏(leaky)对称(也称为压缩或拉伸)兰姆波。波是泄漏的，因为它们辐射到水层中，这导致在水层中产生声驻波。对称兰姆波具有相对于压电元件的中轴对称的位移谱，这导致在3-D空间中产生多个驻波。通过这种声驻波产生方式，产生比如果以“活塞”模态激发压电换能器时更高的横向捕获力，其中所述“活塞”模态仅产生单个平面驻波。因此，利用与压电换能器相同的输入功率，3-D或多维声驻波可以具有更高的横向捕获力，其可以比在活塞模态中产生的单个平面声驻波强高达10倍和超过10倍。输入功率可调节以控制流动。这可以用于将细胞培养物保持在限定的容积内(在本文中称为“生长容积”)，同时移出流体内容物和所需的副产物。
声泳(acoustophoresis)是一种低功率、无压降、无堵塞、固态的方法，用于从流体中分离固体，即它用于实现通常更多用多孔过滤器进行的分离，但它没有过滤器的缺点。具体来说，本公开提供了在宏观规模操作的生物反应器，以在高流速的流动系统中分离细胞培养物。生物反应器使用高强度三维超声驻波，其产生的声辐射力大于某些流速的流体阻力和浮力或重力的组合效应并且可以克服某些流速的流体阻力和浮力或重力的组合效应，因此能够捕获(即，保持在适当位置)驻波中的悬浮相(即细胞和细胞培养物)。保留的细胞可能结块或聚集。然后营养物流体流可以流过/循环通过细胞培养物，为细胞提供营养和氧合作用，并捕获由细胞产生的生物分子。还认为驻波刺激细胞培养物，从而增加所需生物分子的表达率。这提供了自包含的“声学生物反应器”，其中生物分子可以从细胞培养物中连续收获，并以加速的速率连续收获。本系统具有产生声学超声驻波场的能力，其能够将细胞培养物保持在流场中的适当位置，所述流场的线速度范围为0.1mm/sec至速度超过1cm/s。如上所述，驻波的捕获能力可以根据需要改变，例如通过改变流体的流速、声辐射力和生物反应器的形状以使细胞保留最大化。
多维超声声驻波可用于在流体流(例如细胞培养基或营养物流体流)中捕获(即保持固定)细胞培养物。这是与以前的方法的重要区别，在先前的方法中，细胞轨迹仅仅通过声辐射力的作用而改变。离开细胞的声场的散射产生三维声辐射力，其充当三维捕获场。当颗粒相对于波长较小时，声辐射力与颗粒体积(例如半径的立方)成比例。它与频率和声学对比因子(acoustic contrast factor)成比例。它还与声能(例如声压幅度的平方)成比例。对于谐波激发，力的正弦空间变化是将细胞驱动到驻波内的稳定位置的原因。当施加在细胞上的声辐射力强于流体阻力和浮力/重力的组合效应时，细胞被捕获在声驻波场内。声力(即横向和轴向声力)对捕获的细胞的作用导致浓缩、集结、结块、聚集和/或聚结的变化。
通常，(一个或多个)3-D或多维声驻波在通过超声驻波将产生生物分子的细胞培养物(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，最常见的用于重组蛋白质治疗剂的工业生产的宿主)保持在适当位置(即维持在固定位置)的电压和频率操作。在每个波节平面内，CHO细胞被捕获在声辐射势的最小值中。大多数生物细胞类型比它们所悬浮的培养基具有更高的密度和更低的可压缩性，因此细胞和培养基之间的声学对比因子具有正值。因此，轴向声辐射力(ARF)驱动生物细胞朝向驻波压力波节。声辐射力的轴向分量在正对比因子的情况下驱动细胞到压力波节平面，而在负对比因子的情况下细胞或其他颗粒被驱动到压力波腹平面。声辐射力的径向或横向分量有助于捕获细胞。ARF的径向或横向分量大于流体阻力和重力的组合效应。对于小细胞或乳液，阻力FD可表示为：
其中Uf和Up是流体和细胞速度，Rp是颗粒半径，μf和μp是流体和细胞的动态粘度，并且是动态粘度的比率。浮力FB表示为：
对于要在超声驻波中捕获的细胞，细胞上的力平衡必须为零，因此可以找到横向声辐射力FLRF的表达式，其由下式给出：
FLRF＝FD+FB
对于已知尺寸的细胞和材料特性，并且对于给定的流速，该等式可用于估计横向声辐射力的量级。
一个用于计算声辐射力的理论模型基于Gor'kov开发的公式。初级声辐射力FA被定义为场势U的函数，
其中场势U定义为：
而f1和f2是单极子和偶极子贡献，定义为：
其中p是声压，u是流体颗粒速度，Λ是细胞密度ρp与流体密度ρf的比率，σ是细胞声速cp与流体声速cf的比率，Vo是细胞体积，并且<>表示波周期内的时间平均值。
Gor'kov的理论仅限于细胞尺寸相对于流体和细胞中的声场波长小时，并且它也没有考虑到流体和细胞的粘度对辐射力的影响。额外的理论和数值模型已经被开发用于计算细胞的声辐射力，而没有尺寸相对于波长的任何限制。这些模型还包括了流体和细胞粘度的影响，因此更准确的计算声辐射力。所实施的模型基于Yurii Ilinskii和EvgeniaZabolotskaya的理论工作，如AIP Conference Proceedings,Vol.1474-1,pp.255-258(2012)中所述。额外的内部模型已经被开发用来计算圆柱形物体的声捕获力，例如驻波中被捕获的颗粒的“冰球”，其非常类似于圆柱体。
由本公开的(一个或多个)超声换能器产生的总声辐射力(ARF)的横向力分量是显著的，并且足以克服线速度高达并超出1cm/s时的流体阻力，并产生紧密堆积的簇，并且与总声辐射力的轴向力分量具有相同数量级。因此，该横向ARF可用于在生物反应器方法继续的同时将细胞保留在生物反应器的特定容积中。对于灌注生物反应器尤其如此。
在灌注生物反应器系统中，希望能够将细胞和细胞碎片与流体流(即细胞培养基或营养物流体流)中的表达的材料过滤和分离。表达的材料由生物分子如重组蛋白质或单克隆抗体组成，并且是待回收的所需产物。
驻波可用于捕获细胞培养基中存在的细胞和细胞碎片。具有正对比因子的细胞移动到驻波的波节(与波腹相对)。当细胞在驻波的波节处聚集时，还进行细胞培养基的物理擦洗，由此当更多细胞在与已经保持在驻波内的细胞接触时被捕获。这通常将细胞与细胞培养基分开。表达的生物分子保留在营养物流体流(即细胞培养基)中。
理想地，(一个或多个)超声换能器在流体中产生三维或多维声驻波，其在悬浮颗粒上施加横向力并伴随轴向力，从而增加驻波的颗粒捕获能力。文献中公布的典型结果表明，横向力比轴向力小两个数量级。相反，本申请中公开的技术提供的横向力与轴向力具有相同数量级。
灌注生物反应器也可用于产生随后可用于自体和/或同种异体细胞疗法的细胞。在这种类型的灌注生物反应器中，将用于细胞疗法的生物细胞在生物反应器中培养并扩增(即通过细胞繁殖来增加生物反应器中的细胞数)。这些细胞可以是淋巴细胞，例如T细胞(例如，CAR T细胞、Jurkat T细胞)、B细胞或NK细胞；它们的前体，如外周血单核细胞(PBMC)；遗传修饰的T细胞，如CAR T细胞；等。声驻波用于将细胞培养物保持在生物反应器内。细胞培养物在由声驻波保持时繁殖。然后使营养物流体流流经细胞培养物，取出一些细胞并将剩余的细胞培养物留在声驻波内。随后可以分离和纯化通过营养物流体流从细胞培养物带走的取出的细胞以用于细胞疗法。
在这些应用中，声学声驻波充当细胞保留机制。本文所述的声学细胞保留系统可以在一定范围的细胞再循环速率操作，在一定范围的灌注(或培养基移出)速率有效地保留细胞，并且可以通过调整流体流速、换能器功率或频率操纵，以完全保留或选择性地通过一定百分比的细胞。功率和流速均可被监控，并将其用作自动控制系统中的反馈。
设计本公开的生物反应器以维持高强度多维声驻波。该装置由函数发生器和放大器(未示出)驱动。装置性能由计算机监控和控制。有时，由于声流，可能需要调制驻波的频率或电压幅度。该调制可以通过幅度调制和/或通过频率调制来完成。
图1示出单个驻波系统100，其由反射板101和超声换能器103组成，超声换能器103被设置为共振以形成驻波102。通常由换能器103施加在数百kHz至数十MHz的范围内的激发频率。在换能器103和反射器101之间产生一个或多个驻波。驻波是在频率和强度上相等并且在相反方向上(即从换能器到反射器并返回)行进的两个传播波的总和。传播波破坏性地相互干扰，从而产生驻波。虚线105用于指示幅度。波节是波具有最小幅度的点，并且用参考图号107表示。波腹是波具有最大幅度的点，并且用参考图号109表示。
图2是将常规补料分批生物反应器系统201(左侧)与常规灌注生物反应器系统202(右侧)进行比较的示意图。从左侧的补料分批生物反应器开始，生物反应器210包括反应容器220。细胞培养基通过补料入口222补料到反应容器。搅拌器225用于使培养基在整个细胞培养物中循环。这里，搅拌器被描绘为一组旋转叶片，但是可以预期任何类型的引起循环的系统。生物反应器允许种子培养物通过生长/生产周期生长，在此期间碎片、废物和不可用的细胞将在生物反应器积累，并且也将产生所需产物(例如生物分子，例如单克隆抗体、重组蛋白质、激素等)。由于这种积累，补料分批方法的反应容器通常比灌注方法中的反应容器大得多。然后在生产周期结束时收获所需产物。反应容器220还包括用于移出材料的出口224。
现在转到右手侧的灌注生物反应器202，同样，生物反应器包括具有用于细胞培养基的补料入口222的反应容器220。搅拌器225用于使培养基在整个细胞培养物中循环。反应容器的出口224流体连接到过滤装置230的入口232，并连续地将培养基(包含细胞和所需产物)补料给过滤装置。过滤装置230位于反应容器的下游，并将所需产物与细胞分离。过滤装置230具有两个单独的出口，产物出口234和再循环出口236。产物出口234将过滤装置230流体连接到过滤装置下游的安全壳240，该安全壳240接收来自过滤装置的所需产物(加上培养基)的浓缩流。从那里，可以进行进一步的处理/纯化以分离/回收所需产物。再循环出口236将过滤装置230流体连接回反应容器220的再循环入口226，并用于将细胞和细胞培养基送回反应容器中以继续生长/生产。换句话说，在反应容器和过滤装置之间存在流体回路。灌注生物反应器系统202中的反应容器220具有连续的产物通量，因此可以制造的比补料分批生物反应器系统201更小。过滤方法对灌注生物反应器的通量至关重要。不良的过滤方法将仅允许低通量并导致所需产物的低产量。
图3是在本公开的系统中使用的生物反应器300的横截面图。如此处所示，生物反应器包括具有内部容积323的反应容器320。容器顶部的补料入口322用于将营养物流体流补料入容器，并且还可用于补料另外的细胞以保持细胞培养物。搅拌器325以叶轮叶片的形式存在。出口324显示在容器的底部。曝气器(未示出)可用于向内部容积提供气体。传感器314显示在容器的右上方。示出了泵316用于将营养物流体流补料到容器中，而另一个泵318用于从容器中移出营养物流体流。这些泵用于使营养物流体流在细胞培养物中循环并提供营养和氧合作用以保持细胞的活力和生产力。泵还将产生的生物分子递送到生物反应器的另一部分(未示出)，其中这些生物分子可以在反应容器的下游进一步过滤和分离。
反应容器还包括位于容器一侧的超声换能器330，以及位于与超声换能器相对的另一侧的反射器332。在换能器和反射器之间存在生长容积334(用虚线示出)。在换能器和反射器之间产生多维驻波(未示出)，其将细胞培养物保持在生长容积中。应注意，生长容积334是内部容积323的一部分。还应注意，搅拌器325的叶片不位于生长容积334内，因为它的存在可破坏驻波。
热护套310围绕着反应容器，并用于调节内部容积323和细胞培养物的温度。在这方面，通常希望将细胞培养物的温度保持在38℃以下以防止细胞受损。热护套通常是用于减轻任何超声换能器产生的多余热量的冷却系统。应注意，热护套通常包含温度调节流体。由换能器330和反射器332产生的驻波可以传播通过护套和其中的温度调节流体，并且仍然继续在反应容器中操作以将细胞培养物保持在适当位置。
二级过滤系统312位于生长容积334和出口324之间。预期在驻波不能将细胞培养物保持在适当位置的事件中，将操作二级过滤系统以将细胞培养物保持在反应容器内并维持它们与产生的生物分子的分离。例如，如果高百分比的超声换能器失灵，或者如果失去共振，或者如果切断到反应容器的电源，则可能发生这种情况。
在操作通过细胞生产生物分子的过程中，营养物流体流通过补料入口322加入到反应容器中。反应容器的内容物用搅拌器325混合。所需产物(例如生物分子)由位于生长容积334内的细胞连续产生，并通过流经生长容积的营养物流体流与细胞培养物分离。含有生物分子产物的营养物流体流通过出口324从反应容器中抽出。从那里，可以处理营养物流体流以分离所需产物。
处理后，任何细胞和营养物流体可以再循环回到反应容器中。在这方面，本公开不应被解释为声明从来没有细胞逃脱驻波和生长容积。
应注意，在图3中，反应容器入口322描绘在容器的顶部，而出口324描绘在容器的底部。如果需要，这种布置可以颠倒，例如取决于要获得的所需产物。
当操作生物反应器以产生用于细胞疗法的另外的细胞时，同样，通过声驻波将细胞培养物保持在生长容积334内，并且细胞培养物繁殖/扩增。营养物流体流流经生长容积并从细胞培养物中取出一些细胞。然后通过出口324将这些取出的细胞从反应容器中抽出。随后可以使用下游方法将细胞与营养物流体流分离。取出的细胞可以包括活细胞、非活细胞、细胞碎片等，并且它是希望被回收的活细胞。可用于某些净化目的的下游方法的一个实例是图2中所示的外部过滤装置230。该方法可以连续进行。
图4是生物反应器的反应容器420的另一个图示。这里，反应容器是管状的，出口位于容器的顶部，入口位于容器的底部，流体流动由箭头405表示。换能器430的阵列在一侧垂直布置，并且反射器432的阵列布置在换能器的相对侧。波401从换能器传输到反射器，并且波402从反射器弹回到换能器。细胞培养物被保持在如此产生的驻波的波节处，并用参考图号403表示。
在另外的实施方案中，特别考虑使用柔性包或袋作为生物反应器。这种生物反应器在图15中示出。柔性包700的内部容积操作为细胞的生长容积。柔性包包括入口702和出口704。柔性包的相对表面可以是硬的。一个表面包括超声换能器710，并且相对表面包括与换能器相对的反射器712，使得可以在包内产生多维声驻波。这里仅示出了一个入口和出口。不包括图3中所示的生物反应器的其他部分，例如搅拌器、泵、传感器、热护套等，尽管这些部件可以与图15的包一起使用。
在使用中，细胞培养基和从细胞来源(例如患者或反应容器)抽取的细胞通过入口进入包中。由换能器产生的多维声驻波将细胞培养物捕获在包内。然后，流体(例如细胞培养基和其他材料)流经入口，随后经过包的出口离开。添加的流体可以从声驻波中捕获的细胞培养物中取出细胞，或者可以用于移出被捕获的细胞培养物表达的生物分子。
在其它实施方案中，特别预期的是生物反应器包括刚性壳体。它可以采用如图3所示的塑料、玻璃或者金属容器的形式。刚性壳体包含所有各个部件，包括超声换能器和反射器。具有适当连接的柔性聚合物包或袋(如图15所示)放置在刚性壳体内并连接到各个入口、出口和其它组件。柔性包本身包含入口和出口。该柔性包或袋类似于图15中的包700，但是没有附接到其上的超声换能器和反射器。此处，细胞培养物维持在柔性包内。当需要改变细胞培养物时(例如，为了获得其它细胞或生物分子)，可以移出含有细胞培养物的包并将新的包放置在刚性壳体内。这就为生物反应器提供了更快的周转以制造新产物，并将该方法保持为封闭系统，使得细胞培养物不会被污染。
反应容器可以是管状、立方体或者其它多边形的形状。经过生物反应器的反应容器的营养物流体流的流动可以是垂直的、水平的或两者间的任何角度。超声换能器和反射器的组合在反应容器内部建立了共振波。驻波将细胞培养物保持在其净零压力波节处。超声换能器和反射器可以垂直于经过声学生物反应器的营养物流体流的流体流动，或与经过声学生物反应器的营养物流体流的流体流动其呈另一角度。这使得用于细胞培养物的声驻波更大的保持强度。反射器可以是平坦的或非平面的无源形状，或者它自身也可以是能够改变其形状以保持共振的有源压电元件，但是本身不能产生声波。
CAR T-细胞是遗传修饰的T-细胞的一个实例，它可以使用本公开的装置和方法获得。CAR T-细胞疗法的方法涉及从接受疗法的患者(称为自体疗法)或从一组个体(称为同种异体疗法)的全血中分离的淋巴细胞。淋巴细胞是白细胞的一种亚型，包含免疫系统的主要部分。
淋巴细胞有三种类型：1)B淋巴细胞(B细胞)产生能够抗感染的抗体2)T淋巴细胞(T-细胞)和3)自然杀伤(NK)细胞。T-细胞和NK细胞直接杀死感染的或者癌性细胞，并利用称为“细胞因子”的化学物质告诉免疫系统的其它细胞。
免疫疗法是一种利用身体自身免疫系统对抗癌症的治疗。它提高了身体检测和杀伤癌细胞的能力，并且它基于免疫细胞或抗体可以识别和杀死癌细胞的概念。
在自体疗法方法中，如图16所示，通过单采血液成分术从患者收集T-细胞(步骤900)，该方法从身体抽取血液并将一种或多种血液成分(例如血浆、血小板或白细胞)移出。剩余的血液随后重新回到体内。然后培养和扩增提取的T-细胞可以(步骤902)。
T细胞随后被送至实验室或药物制造工厂，在那里对它们被遗传工程化以在其表面上产生嵌合抗原受体(CAR)(步骤904)。
经过该再工程化之后，T-细胞就被称为“嵌合抗原受体(CAR)T-细胞”。CAR是允许T-细胞识别靶向的肿瘤细胞上的抗原的蛋白质。
随后将再工程化的CAR T-细胞进行“扩增”或者繁殖(步骤906)。通过在实验室中生长细胞直至它们有数百万细胞来“扩增”患者遗传修饰的T-细胞数量。这些CAR T-细胞被冷冻，当它们足够时，被送到患者治疗所在的医院或者中心。
在医院或者治疗中心，CAR T-细胞随后被输注到患者体内(步骤908)。许多患者在接受CAR T-细胞的输注之前，会给予一种或多种化疗药剂的简短疗程(该过程称为预处理(preconditioning))。预处理过程抑制患者对修饰的T-细胞的应答，使得已经返回患者血液流中的CAR T-细胞可以更有效并且数量增加。这些“攻击手”细胞能够识别并杀死那些在表面具有靶向的抗原的癌性细胞。
CAR T-细胞预防患者靶向的癌症的复发。在输注完成后的长时间，CAR T-细胞可留在体内。它们预防癌症复发，因此与化疗或需要患者连续接种的单克隆抗体疗法相对的是，该疗法通常导致长期缓解。
如图17所示，本公开的声学生物反应器可以在该方法的至少两个步骤中使用。首先，声学生物反应器可用于T-细胞工程化前扩增T-细胞(步骤902)。其次，声学生物反应器可用于在将CAR T-细胞施用回患者体内之前扩增CAR T-细胞(步骤906)。这些声学生物反应器可以是包的形式，如图15所示。
现在，对声泳过滤装置中使用的(一个或多个)超声换能器进行更加详细地描述可能是有帮助的。图5是常规超声换能器的横截面图。该换能器在底端具有耐磨板50，环氧树脂层52，陶瓷晶体54(例如由锆钛酸铅(PZT)制成)，环氧树脂层56和背衬层58。在陶瓷晶体的两侧各有一个电极：正电极61和负电极63。环氧树脂层56将背衬层58连接到晶体54。整个组装包含在壳体60中，壳体60可以由例如铝制成。电适配器62为电线提供连接以使其穿过壳体并连接附接在晶体54上的导线(未示出)。通常，设计背衬层来增加阻尼并在宽范围频率内产生带有均匀位移的宽带换能器，并设计背衬层以抑制在特定振动本征模态的激发。耐磨板通常设计为阻抗变换器，以更好地匹配换能器所辐射到的培养基的特征阻抗。然而，晶体的振荡压力和加热会导致耐磨板与晶体分离。
图8是本公开中超声换能器81的横截面图，它被用于本公开的声泳过滤装置中。换能器81具有铝壳体82。PZT晶体86定义了换能器的底端，并暴露于壳体的外部。晶体在其周边由小的弹性层98例如硅氧烷或类似材料支撑，其位于晶体和壳体之间。换言之，不存在耐磨层。壳体也可以由导电性能更好的材料构成，例如钢。壳体也可以接地到换能器的负侧。
螺钉(未示出)通过螺纹88将壳体的铝顶板82a连接到壳体的主体82b上。顶板包括连接器84以将电力传递到PZT晶体86。PZT晶体86的底部和顶部表面分别连接到电极(正极和负极)上，例如银或镍。环绕式电极片90连接到底部电极上并与顶部电极相隔离。通过晶体上的电极向PZT晶体86提供电能，其中环绕片90为接地连接点。值得注意的是，晶体86没有如图5中所示的背衬层或环氧树脂层。换句话说，在铝顶板82a和晶体86之间的换能器中存在气隙87(即气隙完全是空的)。在一些实施方案中可以提供最小背衬58和/或耐磨板50，如图9所示。
换能器的设计能够影响系统的性能。典型的换能器为分层结构，其中陶瓷晶体被粘合到背衬层和耐磨板上。因为换能器装载有由驻波所呈现的高机械阻抗，所以耐磨板的传统设计指南(例如对于驻波应用的半波长厚度或对于辐射应用的四分之一波长厚度)以及制造方法可能并不合适。而在本公开的一个实施方案中，没有耐磨板或背衬的换能器允许晶体在其具有高Q-因子的本征模态之一中振动。振动陶瓷晶体/盘直接暴露于流经流动室的流体。
移出背衬(例如使晶体获得空气背衬)也允许陶瓷晶体以较高阶的振动模态振动，同时几乎没有阻尼(例如高阶模态位移)。在具有带背衬晶体的换能器中，晶体像活塞一样以更加均匀的位移振动。移出背衬允许晶体以非均匀位移的模态振动。晶体的振型越高阶，晶体所具有的波节线就越多。晶体的更高阶模态位移产生更多的捕获线，尽管捕获线与波节的相关性并不需要是一一对应的，并且以更高的频率来驱动晶体也不一定产生更多的捕获线。
在一些实施方案中，晶体可具有对晶体的Q-因子影响最小(例如小于5％)的背衬。背衬可以由基本上声学透明的材料(例如轻木、泡沫或软木)制成，它们允许晶体以更高阶的振型振动并保持高Q因子，同时仍能为晶体提供一些机械支撑。背衬层可以是实心的，或者可以是具有穿过该层的孔的格子，使得格子以特定的更高阶振动模态来跟随振动晶体的波节，在波节位置处提供支撑的同时允许晶体的其余部分自由振动。格子结构或声学透明材料的目标是在不降低晶体的Q-因子或不干扰特定振型激发的情况下提供支撑。
通过避免环氧树脂层和耐磨板的阻尼和能量吸收效应，将晶体置于与流体直接接触，也有助于高Q-因子。其它实施方案可具有耐磨板或耐磨表面以防止含有铅的PZT接触主(host)流体。这在例如生物应用如分离血液中可能是需要的。这些应用可能使用耐磨层，例如铬、电解镍或化学镀镍等。化学气相沉积也可用于施加聚(对二甲苯)(poly(p-xylylene))(例如聚对二甲苯(parylene))或其它聚合物层。有机和生物相容性涂层如硅氧烷或聚氨基甲酸乙酯等也可用作耐磨表面。
在一些实施方案中，超声换能器具有1英寸的直径和标称2MHz的共振频率。每个换能器会消耗大约28W的功率用于捕获流速为3GPM的液滴。这就意味着能量成本为0.25kWhr/m3。这表明该技术的能源成本是非常低的。理想情况下，每个换能器由各自的放大器进行供电和控制。在其它实施方案中，超声换能器使用方形晶体，例如具有1”x1”的尺寸。或者，超声换能器也可以使用矩形晶体，例如具有1”x2.5”的尺寸。为了获得足够的声学捕获力，每个换能器的功耗为10W每1”x1”的换能器横截面积和每英寸的声驻波跨度。对于4”跨度的中等规模系统，每个1”x1”方形换能器消耗40W。在中等规模系统中，更大的1”x2.5”矩形换能器使用100W。三个1”x1”方形换能器的阵列将消耗共计120W，而两个1”x2.5”换能器的阵列将消耗大约200W。紧密间隔的换能器阵列代表该技术可选的潜在实施方案。可根据需要改变换能器的尺寸、形状、数量和位置，以产生所需的三维声驻波模式。
图8是可用于产生多个驻波的压电超声换能器800的示意图。换能器的基座801具有由表面上多个压电元件802形成的阵列。这些压电元件能够以各种方式形成于表面上，包括压电晶体的粘附、光掩模和沉积技术，例如电子工业中使用的那些。例如，压电晶体的表面能够以一种模式切割到特定深度，然后将切除的区域用二级材料进行填充以隔离各个区域从而在压电晶体表面上形成所得模式。
换能器的尺寸、形状和厚度决定了在不同激发频率的换能器位移，这反过来也会影响分离效率。通常，换能器在接近厚度共振频率(半波长)的频率进行操作。换能器位移中的梯度通常导致更多的细胞/生物分子捕获位置。更高阶模态位移在声场的所有方向上产生具有强梯度的三维声驻波，从而在所有方向上产生同样强的声辐射力，造成多个捕获线，其中捕获线的数量与换能器的特定振型相关联。
为了研究换能器位移谱对声捕获力和分离效率的影响，使用1”x1”方形换能器重复进行10次实验，除激发频率外所有的条件均相同。将十个连续的声共振频率(分别由图9中带圆圈的数字1-9和字母A表示)用作激发频率。条件是实验持续时间为30分钟，1000ppm油浓度为约5微米的SAE-30油滴，流速为500毫升/分钟，施加功率为20W。使用油滴是因为油比水的密度大，并且可以通过声泳将其与水分离。
图9展示了方形换能器的测量电阻抗幅度与2.2MHz换能器共振附近频率的函数。换能器电阻抗中的最小值对应于水柱的声共振，并且表示了操作的潜在频率。数值模拟表明，换能器位移谱在这些声共振频率处变化显著，从而直接影响声驻波和所产生的捕获力。由于在换能器厚度共振附近操作换能器，因此电极表面的位移基本上是异相的。换能器电极的典型位移并不均匀，并且会根据激发频率而变化。例如，在具有单个捕获油滴线的一个激发频率下，位移在电极的中间具有单个最大值并且在换能器的边缘附近具有最小值。在另一个激发频率下，换能器谱具有造成多个捕获油滴线的多个最大值。更高阶的换能器位移模式导致更高的捕获力以及捕获油滴的多个稳定捕获线。
当油-水乳液通过换能器时，油滴的捕获线就被观察并被表征。表征涉及流体通道中捕获线数量的观察以及模式，如图10所示，在图9中确定了10个共振频率中的7个。换能器的不同位移谱可以在驻波中产生不同的(更多的)捕获线，其中位移谱中更多的梯度通常产生更高的捕获力和更多的捕获线。
图11是显示与9捕获线模式相匹配的压力场数值模型。数值模型为二维模型；因此仅观察到了三条捕获线。在垂直于页面平面的第三维中还存在另外两组三条捕获线。
在本系统的实例中，在一定的电压和频率下操作系统，使得细胞(构成细胞培养物)被超声驻波捕获，即保持在固定位置。沿着明确的捕获线收集细胞，其由半个波长分开。在每个波节平面内，细胞在声辐射势的最小值处被捕获。声辐射力的轴向分量驱动具有正对比因子的细胞到压力波节平面，而具有负对比因子的细胞被驱动到压力波腹平面。声辐射力的径向或横向分量是捕获细胞的力。因此，对于颗粒捕获，该力大于流体阻力和重力的组合效应。在使用典型换能器的系统中，声辐射力的径向或横向分量通常比声辐射力的轴向分量小几个数量级。然而，由本公开的换能器所产生的横向力是显著的，与轴向力分量在相同数量级上，并且足以克服线速度高达1cm/s时的流体阻力。
通过以更高阶振型来驱动换能器可以增加横向力，这与晶体有效地作具有均匀位移的活塞移动的振动形式相反。声压与换能器的驱动电压成比例。电功率与电压的平方成比例。换能器通常是薄的压电板，其中电场沿z轴并且主要位移沿z轴。换能器通常在一侧通过空气(例如换能器内的气隙)耦合，而在另一侧则通过细胞培养基的流体进行耦合。板中产生的波的类型为复合波。压电板中复合波的子集类似于泄漏对称(也称为压缩或拉伸)兰姆波。板的压电性质通常导致对称兰姆波的激发。波是泄漏的，因为它们辐射到水层中，这导致在水层中产生声驻波。兰姆波存在于表面上具有无应力条件的无限范围的薄板中。因为该实施方案的换能器在本质上是有限的，所以实际的模态位移会更加复杂。
图12展示了在板的厚度上的面内位移(x位移)和面外位移(y位移)的典型变化，其中面内位移是整个板厚度的一个偶函数而面外位移是一个奇函数。由于板的尺寸有限，位移分量在板的宽度和长度上变化。通常，(m，n)模态是换能器的位移模态，其中在宽度方向上的换能器位移存在m个波动而在长度方向上为n个波动，并且具有如图14中所述的厚度变化。m和n的最大数是晶体尺寸和激发频率的函数。
驱动换能器使得压电晶体以通式(m，n)的更高阶模态振动，其中m和n独立地为1或更大。通常，换能器将以高于(2,2)的更高阶模态振动。更高阶模态将产生更多的波节和波腹，导致流体层中三维驻波的生成，其特征在于声场的所有方向上(不仅在驻波方向，而且在横向方向)均为强梯度。因此，声学梯度导致横向上产生更强的捕获力。换句话说，驱动换能器以产生多模态振动可以从一个压电晶体中产生多个驻波。
在实施方案中，驱动换能器的脉冲电压信号可以具有正弦、方形、锯齿或三角波形；并且频率可以为500kHz至10MHz。脉冲电压信号可以用脉冲宽度调制来驱动，其产生任何所需的波形。脉冲电压信号还可以具有幅度或频率调制的开始/停止能力以消除串流(streaming)。同样，通常操作换能器使得声驻波保持共振。为此目的通常会存在一个反馈系统。
(一个或多个)换能器用于产生压力场，该压力场在与驻波方向正交和在驻波方向产生相同数量级的力。当力大致为相同数量级时，尺寸为0.1微米至300微米的颗粒将会更有效地移向聚集区域(“捕获线”)。由于正交声泳力分量中同样大的梯度，存在并不位于换能器和反射器之间驻波方向上的规则位置的“热点”或颗粒收集区域。热点位于声辐射势的最大值或最小值。这些热点代表颗粒收集位置，这允许收集期间在换能器和反射器之间更好的波传输和更强的颗粒间力，导致更快和更好的颗粒聚集。
图13和图14是分解图，显示使用声泳将细胞保持在生长容积的适当位置的反应容器的各个部件。图15提供了仅一个用于一个生长容积的腔室，而图16具有两个腔室并且可具有两个不同的生长容积。
参照图13，流体通过四端入口191进入反应容器190。提供过渡件192以产生通过腔室193的平推流(plug flow)。换能器40和反射器194位于腔室内相对的壁上，以将细胞培养物保持在适当位置。流体随后通过出口195离开腔室193以及反应容器。生长容积位于腔室193中。
图14具有两个腔室193。系统耦合器196放置在两个腔室193之间以将它们连接在一起。生长容积可位于每个腔室193中。
在生物学应用中，预期系统中的所有部件(例如反应容器、通向生物反应器和来自生物反应器的管道、温度调节护套等)可以彼此分离并且是可自由支配的。避免离心机和过滤器会更好地分离CHO细胞而不降低细胞的活力。换能器的频率也可以进行改变以获得给定功率下的最佳效力。
本公开已经参考示例性实例进行了描述。其他人可以在阅读和理解前面的详细描述之后进行修改和变化。本公开旨在被理解为包括上述所有这些修改和变化，只要它们落入所附权利要求或其等价物的范围之内。

Claims (21)

1.一种从细胞培养物连续收集细胞的方法，包括：
将细胞培养物悬浮在生物反应器的生长容积中，所述生物反应器包括至少一个超声换能器以及位于所述至少一个超声换能器对面的反射器，驱动每个超声换能器以产生将细胞培养物保持在生长容积中的多维声驻波；以及
使营养物流体流流经细胞培养物以从细胞培养物中取出细胞；以及
将取出的细胞与营养物流体流分离。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞培养物由T细胞、遗传修饰的T-细胞、B细胞或者NK细胞组成。
3.权利要求1的方法，其中所述取出的细胞在外部过滤装置中与营养物流体流分离，从产物出口回收分离的细胞，并且营养物流体流通过再循环出口离开外部过滤装置。
4.权利要求1的方法，其中所述生物反应器还包括位于生长容积和生物反应器出口之间的二级过滤系统。
5.权利要求4的方法，如果多维声驻波失灵，则进一步包括激活二级过滤系统。
6.权利要求1的方法，其中所述多维声驻波是共振的。
7.权利要求1的方法，其中所述至少一个超声换能器是元件阵列。
8.权利要求1的方法，其中每个超声换能器产生多个多维声驻波。
9.权利要求1的方法，其中所述生物反应器在生长容积内不包括叶轮。
10.权利要求1的方法，其中所述多维声驻波具有相同数量级的轴向力分量和横向力分量。
11.权利要求1的方法，其中所述超声换能器包括可以以更高阶振型振动的压电材料。
12.权利要求11的方法，其中所述压电材料具有矩形形状。
13.权利要求1的方法，其中所述超声换能器包括：
具有顶端、底端和内部容积的壳体；和
位于壳体底端的晶体，其具有暴露的外表面和内表面，所述晶体在电压信号驱动时能够振动。
14.权利要求13的方法，其中背衬层与晶体的内表面接触，所述背衬层由基本上声学透明的材料制成。
15.权利要求14的方法，其中所述基本上声学透明的材料是轻木、软木或者泡沫。
16.权利要求14的方法，其中所述基本上声学透明的材料具有高达1英寸的厚度。
17.权利要求14的方法，其中所述基本上声学透明的材料为格子形式。
18.权利要求13的方法，其中所述晶体的外表面被具有半波长或更小厚度的耐磨表面材料覆盖，所述耐磨表面材料为氨基甲酸乙酯、环氧树脂或硅氧烷涂层，或者由氧化铝制成。
19.权利要求13的方法，其中所述晶体不具有背衬层或者耐磨层。
20.权利要求1的方法，其中所述多维声驻波是三维驻波。
21.一种制备来自患者的CAR T-细胞的方法，包括：
将细胞培养物悬浮在生物反应器的生长容积中，所述生物反应器包括至少一个超声换能器以及位于所述至少一个超声换能器对面的反射器，驱动每个超声换能器以产生将细胞培养物保持在生长容积中的多维声驻波，其中所述细胞培养物由已从患者中移出并遗传修饰成CAR T细胞的T-细胞形成。
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