CN109845599B - 一种玉米抗蛴螬评价生物测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种玉米抗蛴螬评价生物测定方法。本发明方法可以在实验室内测定玉米材料对蛴螬的抗虫性，能够在实验室条件下，测试地下害虫蛴螬对待测植物根系的危害情况，用以评价待测植物对于地下害虫的抗性，在测试过程中可随时进行无损植株移除、移栽和试虫接种、结果检查等操作，突破了植物抗地下害虫室内生测的瓶颈，极大的提高了植物抗地下害虫评价的工作效率。

Description

一种玉米抗蛴螬评价生物测定方法

技术领域

本发明涉及实验室观测设备技术领域，尤其涉及一种用于地下害虫生物测定的装置及方法。

背景技术

地下害虫是指整个生活史或生活史某个阶段生活在土壤中，危害植物地下部分(如根系、块根、地下茎、地下果实)、新播种子或近土表主茎的一类昆虫。地下害虫种类多、分布广、食性杂，可取食危害花生、大豆、玉米等多种农作物。主要的地下害虫类群有蛴螬、金针虫、地老虎、蝼蛄等，其在全国大部分省区均有分布。由于其在土壤中隐蔽危害，给防治带来了极大的困难。在当前免耕、秸秆还田耕作模式的广泛推广下，地下害虫的发生有逐年加重的趋势。目前地下害虫的防治仍然以化学农药为主，给土壤和环境带来严重的威胁。

筛选对地下害虫有自然抗性的作物品种，或经过遗传修饰(转基因技术)后对地下害虫有抗性的作物品系，是有效应对地下害虫的绿色防控方法之一。抗性作物品系筛选首先要进行室内生物测定，其过程包括：种植植物、评估植物生长状况、接种试虫、对试虫产生的危害进行定性和定量观察，对待测植物的地下害虫抗性进行分级(由于对具体地下害虫有抗性的材料尚不多，相关标准尚缺，因此本发明未涉及评价分级，仅涉及室内生物测定试验操作方法)。对于转基因植物品系，在接种试虫前还需要筛选阳性转化株进行保留或移栽，移除阴性株。但由于地下害虫通常在土壤中潜伏，危害植物根部，传统的盆栽试验难以直观观察植物根系的生长状况和受地下害虫危害的程度，也难以在不损伤植物根系的情况下对植株进行移栽等操作，成为了地下害虫室内生物测定的瓶颈。

蛴螬是鞘翅目金龟子科(Coleoptera:Scarabaeidae)昆虫幼虫的统称，是一类重要的地下害虫。植食性蛴螬取食危害作物根系或地下果实，造成作物产量和质量的双重下降。据统计，植物地下部分所受的危害80％以上是由蛴螬造成的。玉米是蛴螬的主要寄主之一，苗期受蛴螬危害最为严重。特别是近年来免耕和秸秆还田的大面积应用的情况下，玉米田蛴螬发生日益严重。蛴螬有很多种类，常见的危害大田作物的优势种有暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)、华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)、铜绿丽金龟(Anomalacorpulenta)等，其中暗黑鳃金龟是玉米田最常见和多发的种类。

由于蛴螬在土壤中隐蔽危害，使用传统的药物防治方法不仅防治困难，还给环境带来很大污染。筛选对蛴螬有自然抗性的玉米品种或转基因品系，会起到事半功倍的作用。由于玉米是根部受蛴螬危害，且由于植物根系类型的不同，被蛴螬危害后产生的症状也不同，因此玉米对蛴螬抗虫性的评价与成熟的玉米抗叶部害虫的评价指标和测定方法完全不同。

目前尚未有玉米和其他作物对蛴螬抗虫性鉴定的方法报道，本发明提供一种玉米对蛴螬抗虫性的鉴定方法。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明要解决的技术问题是提供一种玉米抗蛴螬评价生物测定方法，可无损、直观地观察植物根系生长状况和进行地下害虫测定工作，在测试过程中能随时进行无损植株移除和移栽操作，方便进行试虫接种和试验结果检查。

(二)技术方案

为了解决上述技术问题，本发明首先提供一种用于地下害虫生物测定的装置，包括底板、两个挡板和两组相对设置的侧板，两个所述挡板分别设置于所述底板的两端，两组所述侧板分别可拆卸的设置于所述底板和各个挡板的两侧；每组所述侧板均包括遮光板和观测板，各个所述遮光板分别平行的设置于观测板外。

进一步的，两组所述侧板的两侧和底部之间分别通过固定构件可拆卸的对应连接在所述底板和各个挡板的两侧，所述底板和各个挡板均设置于两个遮光板之间，且搭接在两个所述遮光板底部之间的固定构件上。

进一步的，所述固定构件包括螺杆和螺帽，所述螺杆穿套于两组所述侧板之间，所述螺杆的一端外焊接有一个所述螺帽，另一端外活动套接一个所述螺帽，两个所述螺帽分别设置于各组所述侧板外。

进一步的，两个所述挡板分别固定设置在所述底板的两端上，且两个所述挡板的两侧分别与两组所述侧板活动连接。

进一步的，所述底板上设有一个或多个透气沥水孔，所述透气沥水孔为多个时，多个所述透气沥水孔沿所述底板的长度方向均匀排列。

进一步的，所述底板的两端分别可拆卸的连接有挡板，两个所述挡板的两侧分别与两组所述侧板活动连接，所述挡板的底部与所述底板可拆卸的连接。

进一步的，各个所述挡板的底部均设有固定螺栓，所述固定螺栓穿过任一所述透气沥水孔内，且通过锁紧螺母固定，以将各个所述挡板可拆卸的设置于所述底板的任一预设位置上，通过任一所述挡板在各个预设位置之间进行位置调整，以改变所述底板、各个挡板和两组侧板之间的空间容积。

进一步的，所述底板通过折角连接件与任一组所述侧板可拆卸式连接。

进一步的，所述遮光板的材质为非透光材料、或所述遮光板上涂覆有遮光层；所述观测板由透明材料制成。

本发明还提供一种利用如上所述的装置进行玉米抗蛴螬评价生物测定方法，包括如下步骤：

S1、浸泡待测玉米种子和已知无抗性的普通玉米种子至出芽后备用；

本发明所述普通玉米种子是指对蛴螬无抗性的玉米种子。

S2、组装用于地下害虫生物测定的装置，所述装置包括底板、两个挡板和两组相对设置的侧板，两个所述挡板分别设置于所述底板的两端，两组所述侧板分别可拆卸的设置于所述底板和各个挡板的两侧；每组所述侧板均包括遮光板和观测板，各个所述遮光板分别平行的设置于观测板外；

S3、在所述装置内装入地下害虫生物测试基质，将出芽后的所述待测玉米种子和普通玉米种子分别植入所述装置内的基质中，进行生长；

进一步地，所述测试基质为湿度20±2％的土壤，优选过20目筛。

进一步地，所述测试基质的装载量为所述装置总容积的80-95％，优选为90％。

进一步地，将催好芽的玉米种子以根向下、芽向上的方式植入所述装置中的测试基质中。

进一步地，生长条件为温度25±2℃，相对湿度50±10％，光照时间(14-12):(10-12)(L:D)。一般在此条件下培养10-12d，可生长至4叶期。期间适时喷水，以保持土壤湿度。

S4、松开所述装置上位于同一侧的各个螺帽，拆开该侧遮光板并保留观测板，以观察植物根系生长状况；

S5、待玉米植株生长至适宜的时期时，拆下所述装置任一侧的侧板，将二龄初蛴螬幼虫按一定的虫株比接入所述装置内，装回该侧所述侧板；

进一步地，待玉米植株生长至4叶期时，开始接虫。

进一步地，所述二龄初蛴螬幼虫与玉米植株的虫株比为3:1-1:1，优选为2:1。

进一步地，所述蛴螬为暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)或华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)。

为确保测定结果的准确性，在接虫之前还包括对待测玉米植株进行筛选以去除阴性玉米植株的步骤。

一般地，所述阴性玉米植株是指不含抗虫基因的玉米品系。

在去除阴性玉米植株时，需要拆开装置，小心分离阴性植株根部土壤，将玉米植株(及其根系)全部移除。避免生硬拔除玉米植株，否则容易使玉米断根留在基质中，影响后续步骤的检查结果。

S6、所述步骤S5完成后，定时记录植株生长参数，其间可拆开一侧所述遮光板并保留所述观测板，观察玉米根系生长和受危害情况；一段时间后，拆下一侧所述侧板，移出待测植物，检查待测植物的根系受害情况，记录断根数、植株萎蔫数、蛴螬存活数等相关数据；

进一步地，所述植株生长参数包括株高、是否萎蔫、是否死亡等。

S7、将步骤S6所得数据进行统计分析，对比蛴螬对不同玉米品种的危害情况，即可。

(三)有益效果

本发明的上述技术方案具有以下有益效果：本发明的用于地下害虫生物测定的装置中，装置包括底板、两个挡板和两组相对设置的侧板，两个挡板分别设置于底板的两端，两组侧板分别可拆卸的设置于底板和各个挡板的两侧，以使底板、两个挡板和两组侧板之间形成用于种植植物的空间，且便于随时拆开装置进行无损植物根系的试验操作；其中，每组侧板均包括遮光板和观测板，各个遮光板分别平行的设置于观测板外，遮光板可根据观测和种植需要安装和拆卸，从而可以无损、直观地观察植物根系生长状况和进行地下害虫生物测定试验。该装置结构简单，能够方便的进行待测植物的种植、无损伤移除、移栽等操作，还能随时在生测试验过程中观察植物根系的生长情况和被危害情况，方便的进行待测植物的种植、无损伤移除、移栽等操作，同时方便试虫接种与试验结果检查。

附图说明

图1为本发明实施例一的装置的结构示意图；

图2为本发明实施例一的装置的俯视图；

图3为本发明实施例二的装置的部分结构示意图；

图4为本发明实施例三的装置的部分结构示意图。

其中，1、底板；2、侧板；21、遮光板；22、观测板；3、挡板；4、螺杆；5、螺帽；6、透气沥水孔；7、固定螺栓；8、锁紧螺母；9、折角连接件。

图5表示玉米受蛴螬危害后的株高增长情况。

图6-图8为本发明一种装置的实物照片。

图9-图16为本发明实验例玉米抗蛴螬评价生物测定方法中部分实物照片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。

在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

本实施例提供的用于地下害虫生物测定的装置及方法能够在实验室条件下，测试地下害虫对待测植物根系的危害情况，用以评价待测植物对于地下害虫的抗性，并能随时进行无损植株移除、移栽和试虫接种、结果检查等操作，突破了植物抗地下害虫室内生测的瓶颈，极大的提高了植物抗地下害虫评价的工作效率。

以下通过实施例详细说明本装置的结构和本方法的内容。

实施例一

如图1和图2所示，本实施例一所述的装置包括底板1、两个挡板3和两组相对设置的侧板2，两个挡板3分别设置于底板1的两端，两组侧板2分别可拆卸的设置于底板1和挡板3的两侧，以使底板1、两个挡板3和两组侧板2之间形成用于种植植物的空间，且便于随时进行无损植物根系的试验操作；其中，每组侧板2均包括遮光板21和观测板22，各个遮光板21分别平行的设置于观测板22外，遮光板21可根据观测和种植需要安装和拆卸，从而可以无损、直观地观察植物根系生长状况和进行地下害虫生物测定试验。该装置结构简单，能够方便的进行待测植物的种植、无损伤移除、移栽等操作，还能随时在生测试验过程中观察植物根系的生长情况和被危害情况，方便的进行待测植物的种植、无损伤移除、移栽等操作，同时方便试虫接种与试验结果检查。

本实施例一中，两组侧板2的两侧和底部分别通过固定构件可拆卸的对应连接在底板1和两个挡板3的两侧，底板1和各个挡板3均设置于两个遮光板21之间，且搭接在两个遮光板21底部之间的固定构件上，优选两个挡板3分别固定设置在底板1的两端上，且两个挡板3的两侧分别与两组侧板2活动连接，从而使得底板1、两个挡板3和两组侧板2之间形成上述的用于种植植物的空间。

优选遮光板21上涂覆有遮光层，以确保植物种植空间内的避光效果，遮光板21也可以优选以非透明材料作为其材质，使其同样具有上述的避光效果；优选观测板22由透明材料制成，以确保取下遮光板21后，能透过观测板22清晰直观的看到植物根系生长情况，同时满足对地下害虫的定性定量观测的要求，进一步优选观测板22的材质为玻璃、透明塑料或透明树脂中的一种或几种组合。

为了可靠实现两组侧板2之间、以及任一侧板2和底板1之间的可拆卸连接关系，优选固定构件包括螺杆4和螺帽5，螺杆4穿套于两组侧板2之间，螺杆4的一端外焊接有一个螺帽5，另一端外活动套接一个螺帽5，两个螺帽5分别设置于各组侧板2外。

具体的，优选侧板2为矩形，侧板2的四角及底部中央分别设有一安装孔，两组侧板2相对设置，其中，各组侧板2的遮光板21均设置在观测板22的外部；通过螺杆4顺次穿过两组侧板2同一位置上的对应安装孔内，以使两组侧板2分别设置在螺杆4的两端，利用螺帽5将两组侧板2锁紧固定在底板1和挡板3的两侧，利用底板1和挡板3隔开两组侧板2，以确保两组侧板2之间形成有效种植空间；当进行待测植物的根系观测或地下害虫测定时，松开各个螺杆4同一侧的螺帽5，取下该侧侧板2的遮光板21，然后重新将该侧的各个螺帽5一一对应拧紧在侧板2的观测板22外即可；当需要进行待测植物的移栽、移除等工作时，松开各个螺杆4同一侧的螺帽5，顺次取下该侧侧板2的遮光板21和观测板22即可，待移栽、移除等工作完成后，重新将该侧侧板2的观测板22和遮光板21顺次对应安装在各个螺杆4上，然后重新拧紧将该侧的各个螺帽5一一对应拧紧在侧板2的观测板22外即可。

进一步优选的，本实施例一的装置的观测板22和遮光板21分别采用透明和黑色两种颜色的亚克力板制成，厚度分别为5mm和2mm，固定构件采用304不锈钢材质、直径5mm的定制蝶形螺丝作为螺杆4，两端加设蝶形螺帽5。

需要说明的是，侧板2除了矩形，还可以采用其他形状，如圆形、椭圆形或多边形等，根据侧板2上的固定构件的设置位置保证两组侧板2之间的底板1和挡板3可靠连接，以及确保两组侧板2之间形成有效种植空间即可。

为了在种植植物时，确保植物的沥水和透气顺畅，优选在底板1上设有一个或多个贯通设置的透气沥水孔6，进一步的，可在底板1的下方设置与透气沥水孔6对应设置的排水槽，以收集溢出的水分，可进行进一步的测定工作。

实施例二

如图3所示，本实施例二的装置结构与实施例一基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：本实施例二的装置中，底板1上的透气沥水孔6为多个，多个透气沥水孔6沿底板1的长度方向均匀排列，优选多个透气沥水孔6沿底板1的长度方向对称的均匀排列成两列，底板1的两端分别可拆卸的连接有挡板3，两个挡板3的两侧分别与两组侧板2活动连接，挡板3的底部与底板1可拆卸的连接。

为了确保挡板3的底部与底板1的可拆卸连接关系的可靠性，优选各个挡板3的底部均设有固定螺栓7，利用固定螺栓7穿过任一对应设置的透气沥水孔6内，且通过锁紧螺母8在底板1的下表面与固定螺栓7锁紧固定，从而将各个挡板3可拆卸的设置于底板1上对应的任一预设位置上，当需要改变种植空间的大小时，通过任一挡板3在各个预设位置之间进行位置调整，以改变底板1、各个挡板3和两组侧板2之间的空间容积，具体可以松开锁紧螺母8，将挡板3底部的固定螺栓7从透气沥水孔6抽出，然后对应插入另一位置的透气沥水孔6，从而实现挡板3的位置调节。

实施例三

如图4所示，本实施例三的装置结构与实施例二基本相同，相同之处不再赘述，不同之处在于：本实施例三的底板1通过折角连接件9与任一组侧板2连接，以防止拆装一侧遮光板21时造成底板1、挡板3与另一侧的侧板2之间脱离，有效提高装置的连接可靠性和稳定性。

实施例四

本实施例四提供了一种装置使用方法(即玉米抗蛴螬评价生物测定方法)，是基于实施例一至实施例三中任一项所述的装置提出的，该使用方法包括如下步骤：

S1、先将待测玉米种子和已知对蛴螬无抗性的普通玉米在育苗盘中浸泡2-3天，待出芽后备用；

S2、按实施例一至实施例三任一项所述的装置结构，组装用于观测植物根系和测定地下害虫的装置，装置包括底板1、两个挡板3和两组相对设置的侧板2，两个挡板3分别设置于底板1的两端，两组侧板2分别可拆卸的设置于底板1和各个挡板3的两侧；每组侧板2均包括遮光板21和观测板22，各个遮光板21分别平行的设置于观测板22外。

S3、然后在装置内装入地下害虫生物测试基质(如湿度约为20±2％的土壤，过20目筛)，装载量为装置总容积的90％，将已经发芽的种子以根向下、芽向上的方式植入装置中的土壤中；以喷壶浇水适量，以保持表面湿润为宜。于温度25±2℃，相对湿度50±10％，光照时间12:12(L:D)条件下培养10-12d，至4叶期；期间适时喷水，以保持土壤湿度。S4、适时松开位于同一侧的各个螺帽5，拆开该侧黑色遮光板21并保留透明的观测板22，观察植物根系生长状况；

S5、待玉米植株生长至4叶期时，拆下装置任一侧的侧板2，将二龄初蛴螬(暗黑鳃金龟)幼虫按2:1的虫株比接入装置内，并将该侧侧板2装回；适时喷水，保持湿度。

在接虫之前还包括对待测玉米植株进行筛选以去除阴性玉米植株的步骤。

S6、步骤S5的接虫完成后，定时记录植株生长参数(包括株高、是否萎蔫、是否死亡)数据，其间可拆开一侧黑色遮光板21并保留透明的观测板22，观察植物根系生长和受危害情况；一段时间后，拆下一侧侧板2，移出待测植物，检查待测植物的根系受害情况，记录断根数、植株萎蔫数、蛴螬存活数等相关数据；

S7、将步骤S6所得数据进行统计分析，对比地下害虫对不同玉米品种的危害情况，即可。

综上所述，本实施例一至实施例四中，该用于地下害虫生物测定的装置及方法中，装置包括底板1、两个挡板3和两组相对设置的侧板2，两个挡板3分别设置于底板1的两端，两组侧板2分别可拆卸的设置于底板1和各个挡板3的两侧，以使底板1、两个挡板3和两组侧板2之间形成用于种植植物的空间，且便于随时进行无损植物根系的试验操作；其中，每组侧板2均包括遮光板21和观测板22，各个遮光板21分别平行的设置于观测板22外，遮光板21可根据观测和种植需要安装和拆卸，从而可以无损、直观地观察植物根系生长状况和进行地下害虫生物测定试验。该装置结构简单，能够方便的进行待测植物的种植、无损伤移除、移栽等操作，还能随时在生测试验过程中观察植物根系生长情况和被危害情况，方便的进行待测植物的种植、无损伤移除、移栽等操作，同时方便试虫接种与试验结果检查。

实验例1

1.所用材料、装置与测试条件

1.1蛴螬与饲养方法

鉴于蛴螬种类有很多，本实验以暗黑鳃金龟为例。傍晚自野外采集暗黑鳃金龟成虫，以雌雄比1：1置于透气的塑料培养箱(～50cm×40cm×50cm)中，每箱中成虫数量不超过50对，箱中预先铺上一层(约15cm深)过20目筛的20％湿度的沙壤土，以新鲜榆树叶饲养并每日更换。每天检查土中是否落卵，待产卵后，每天挑取新鲜卵粒，置于玻璃组培瓶(240mL)中培养，每瓶卵数不多于20粒，控制土壤水分含量在20～25％之间，至约10d后孵化。孵化后以新鲜土豆条为饲料饲养，直到约12d后长至二龄初待用。以上均在温度25±2℃，相对湿度50±10％，光照时间12:12(L:D)。

1.2玉米品种

使用至少两种玉米品种，其中一种作为对照进行对比试验，比较相对抗虫性，本实验以某种子公司提供的转基因玉米为待测玉米处理，普通玉米(即对蛴螬无抗性的玉米)为对照处理。

1.3育苗装置

育苗盘、育苗纸；

1.4生物测定装置

可使用实施例一至实施例三中任一项所述的装置。

1.5生物测定基质

20％％湿度的沙壤土(过20目筛)；

1.6测试环境条件

如无特别说明，测试条件均为温度25±2℃，相对湿度50±10％，光照时间12:12(L:D)。

1.7筛选阳性株使用的试剂

草甘磷或草胺磷(视玉米转化事件抗性而定)。

本次实验具体选择草甘磷。

2.测试方法

2.1玉米种植

2.1.1催芽

使用育苗盘、育苗纸进行催芽。方法如下，将育苗盘筛网和底盘分开、洗净，将二者组合，加自来水没过筛网并铺上一层育苗纸，待育苗纸浸润后，将适量玉米种子(每个育苗盘约200粒种子)散铺于育苗纸上，再覆上一层育苗纸，继续加水至上层育苗纸完全浸湿。置于1.6所述条件下培养。

2.1.2栽种

催芽2-3d后待大部分玉米种子长出根和芽时，记录发芽率。之后进行栽种，每个装置栽种10株。栽种方法如下：先把装置组装好，装入90％容积的生物测定基质(见1.5部分)，之后将其平放，拆开其中一侧侧板和遮光板，将催好芽(催芽3-5d)的玉米种子以根向下、芽向上的方式种植于生测装置中，装上刚刚拆开的侧板和遮光板，将装置直立，再加入适量生测基质使表面平齐。以喷壶浇水适量，以保持表面湿润为宜。于1.6所述条件下培养10-12d，至4叶期，期间适时喷水，以保持土壤湿度。

2.2阳性株筛选

本实验以转基因玉米品种为例，因此测定转基因品系的抗虫性，需进行阳性转化株的筛选，以确保待测植株中抗虫基因被成功转入。

具体方法为：首先确定待测转化事件的抗性筛选基因(如抗草甘磷基因)，将草甘磷稀释100倍后，备用。待玉米长至4叶期，选取玉米第二片老叶，用剪刀剪去叶尖5mm以作标记，然后用毛笔将草甘磷100倍稀释液，涂抹在叶尖1cm处，待第一遍药液风干后，再次涂抹一遍。3-5d后，查看标记叶片是否萎蔫，若未萎蔫则为阳性，萎蔫则为阴性。

待阳性株筛选完毕后，打开装置一侧侧板和遮光板，小心移除阴性植株，避免伤到其他植株根系。操作完毕后，小心将侧板和遮光板装回。

2.3试虫接种

阳性株筛选后，打开一侧侧板和遮光板，将1.1所述蛴螬二龄初幼虫以虫株比2:1的比例小心接入玉米根系附近，将侧板和遮光板装回。适时喷水，保持湿度。

2.4试验重复

每次试验均至少3个重复。

2.5结果检查

2.5.1结果检查时间

试虫接种2周后，小心打开装置一侧侧板和遮光板，检查试验结果：检查蛴螬取食造成的断根数目和最后蛴螬的存活数，期间测量玉米的株高，对不同转化事件的数据进行统计分析，得到相对抗性状况。2.5.2检查指标

由于玉米为须根系，表现为从茎基部的节上生出许多粗细相等的不定根，再由不定根上生成侧根，整个根系外形呈絮状。据我们研究，须根系植物其受蛴螬危害后的症状和表现与直根系植物有所不同。玉米侧根发达，蛴螬取食切断不定根后，产生断根。但玉米根系补偿生长能力很强，部分须根被切断后，会很快长出新的须根，而株高的增长基本不受影响。经我们研究，在评价玉米抗蛴螬作用时，不宜用株高等地上部分的生长表现为指标，而应该以玉米根部受害情况为指标，具体来说，以断根数目来评价玉米受危害的情况，即断根数越多则受害越严重，对蛴螬的抗性越差；反之断根数越少，则表明对蛴螬抗性越强。

2.5.3检查方法

打开生物测定装置后，小心认真分离土壤、植株、断根和蛴螬，对断根数和蛴螬存活数进行记录。

2.6数据统计

利用Excel 2013和SPSS 16.0进行数据分析。不同转化事件的断根数目、蛴螬存活数和玉米生长值采用独立样本t检验进行差异显著性分析。

2.7实验结果

2.7.1各转基因玉米材料发芽率情况如表1，可以看出待测转化事件和野生型对照的发芽率都比较高，但是测转化事件比野生型对照的发芽率还要高。

表1 各转化事件玉米发芽率

2.7.2阳性株筛选情况见表2，转化事件1的阳性率为45.0％。

表2 各转化事件玉米阳性株率

(N.A.表示未筛选)

2.7.3玉米受蛴螬危害情况见表3，由数据可以看出，转化事件1的断根数目与转化事件2(野生型对照)的断根数目之间无显著性差异。

表3 各转化事件玉米受蛴螬危害情况

(数据为Mean±SE，F＝2.232，P＞0.05)

2.7.4蛴螬取食玉米之后的存活数情况见表4，由数据可以看出，转化事件1的蛴螬存活数与转化事件2(野生型对照)的蛴螬存活数之间无显著性差异。

表4 各转化事件蛴螬存活数

(数据为Mean±SE，F＝4.000，P＞0.05)

2.7.5玉米受蛴螬危害后生长情况见图5，统计结果可以看出转化事件1的玉米生长值与转化事件2(野生型对照)的玉米生长值之间无显著性差异(P＞0.05)。

2.8总结与分析：由断根数目、虫存活数和玉米生长值的数据可以看出，与转化事件2(野生型对照)相比，转化事件1没有有显著抗性。

注：本实验例所用测定装置装置的实物照片见图6-图8；本实验例测定方法中部分实物照片见图9-图16。其中，图9表示玉米催芽，图10表示玉米种植，图11表示拆开装置接虫，图12表示拆开装置检查结果，图13表示蛴螬对玉米根部的危害状况，图14表示未接虫玉米根部生长情况，图15(箭头所指)表示玉米阳性株，图16表示玉米阴性株。

本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。

Claims (4)

1.一种玉米抗蛴螬评价生物测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、浸泡待测玉米种子和已知对蛴螬无抗性的普通玉米种子至出芽后备用；

S2、组装用于地下害虫生物测定的装置，所述装置包括底板、两个挡板和两组相对设置的侧板，两个所述挡板分别设置于所述底板的两端，两组所述侧板分别可拆卸的设置于所述底板和各个挡板的两侧；每组所述侧板均包括遮光板和观测板，各个所述遮光板分别平行的设置于观测板外；

S3、在所述装置内装入地下害虫生物测试基质，将出芽后的所述待测玉米种子和普通玉米种子分别植入所述装置内的测试基质中，进行生长；

所述测试基质为湿度20±2%的土壤；

生长条件为温度25±2℃，相对湿度50±10%，光照时间（14-12）:（10-12），L:D；

S4、松开所述装置上位于同一侧的各个螺帽，拆开该侧遮光板并保留观测板，以观察植物根系生长状况；

S5、待玉米植株生长至4叶期时，拆下所述装置任一侧的侧板，将二龄初蛴螬幼虫按一定的虫株比接入所述装置内，装回该侧所述侧板；

S6、所述步骤S5完成后，定时记录植株生长参数，其间拆开一侧所述遮光板并保留所述观测板，观察玉米根系生长和受危害情况；一段时间后，拆下一侧所述侧板，移出待测植物，检查待测植物的根系受害情况，记录包括断根数、植株萎蔫数、蛴螬存活数在内的相关数据；

S7、将步骤S6所得数据进行统计分析，对比分析蛴螬对不同玉米品种的危害情况，即可；

步骤S5中，所述二龄初蛴螬幼虫与玉米植株的虫株比为3:1-1:1；和/或，所述蛴螬为暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela）或华北大黑鳃金龟（Holotrichia oblita）；

两个所述挡板分别固定设置在所述底板的两端上，且两个所述挡板的两侧分别与两组所述侧板活动连接；所述底板上设有一个或多个透气沥水孔，所述透气沥水孔为多个时，多个所述透气沥水孔沿所述底板的长度方向均匀排列；所述底板的两端分别可拆卸的连接有挡板，两个所述挡板的两侧分别与两组所述侧板活动连接，所述挡板的底部与所述底板可拆卸的连接；各个所述挡板的底部均设有固定螺栓，所述固定螺栓穿过任一所述透气沥水孔内，且通过锁紧螺母固定，以将各个所述挡板可拆卸的设置于所述底板的任一预设位置上，通过任一所述挡板在各个预设位置之间进行位置调整，以改变所述底板、各个挡板和两组侧板之间的空间容积。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤S5中，所述二龄初蛴螬幼虫与玉米植株的虫株比为2:1。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤S5中，如果待测玉米材料为转基因材料，在接虫之前还包括对待测玉米植株进行筛选以去除阴性玉米植株的步骤。

4.根据权利要求1-3任一项所述的测定方法，其特征在于，步骤S6中，所述植株生长参数包括株高、是否萎蔫、是否死亡。

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