CN109843047B - 涉及经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物中改善的人类红血细胞存活的方法和组合物 - Google Patents
涉及经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物中改善的人类红血细胞存活的方法和组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物，其基因组包含遗传修饰，其使所述非人类动物缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性，从而在施用于所述非人类动物时人类红血细胞的存活得以延长。本发明提供了测定推定的治疗剂在这样的经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物中的效果的方法。
Description
政府赞助
本发明是在国立卫生研究院授予的批准号R24ODO18259的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
相关申请的引用
本申请要求2016年8月11日提交的美国临时专利申请序列号62/373,671的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开的一般方面涉及用于评估经遗传修饰的免疫缺陷型动物中的人类红血细胞的方法和组合物。在具体方面，提供了用于评估经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中的人类红血细胞的方法和组合物。
背景技术
疟疾，镰状细胞贫血症和再生障碍性贫血等血液疾病影响着世界上许多人，尤其是非洲人后裔。目前，32亿人生活在处于疟疾传播风险的地区，而300万个体具有镰状细胞性状(CDC 2016)。对这些和其他血液病症的先进治疗是有限的，对非人类动物模型存在持续的需要，用于推定的药物治疗剂和其他处理的测定。
发明内容
根据本发明的方面提供了一种经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物，其基因组包含遗传修饰，其使所述非人类动物缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性，从而在施用于所述非人类动物时人类红血细胞的存活得以延长。
根据本发明的方面提供了一种经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，其基因组包含遗传修饰，其使所述小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性，从而在施用于所述小鼠时人类红血细胞的存活得以延长。
根据本发明的方面提供了一种经遗传修饰的NSG，NRG或NOG小鼠，其基因组包含遗传修饰，其使所述小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性，从而在施用于所述小鼠时人类红血细胞的存活得以延长。
根据本发明的方面提供了一种经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物，其基因组包含遗传修饰，其使所述非人类动物缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性，从而在施用于所述非人类动物时人类红血细胞的存活得以延长，其中所述遗传修饰是溶酶体运输调节因子(Lyst)基因的突变，使得所述非人类动物不表达功能性溶酶体运输调节蛋白，使所述非人类动物缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。
根据本发明的方面提供了一种经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，其基因组包含遗传修饰，其使所述小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性，从而在施用于所述小鼠时人类红血细胞的存活得以延长，其中所述遗传修饰是小鼠溶酶体运输调节基因的突变，使得所述小鼠不表达功能性溶酶体运输调节蛋白，使所述小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。
根据本发明的方面提供了一种经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，其基因组包含遗传修饰，其使所述小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性，从而在施用于所述小鼠时人类红血细胞的存活得以延长，其中所述遗传修饰是小鼠溶酶体运输调节基因的突变，使得所述小鼠不表达功能性溶酶体运输调节蛋白，使所述小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。其中所述突变包含所述经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的基因组中的Lyst基因的外显子5的25bp序列缺失：GAGCCGGTAGCTTTGGTTCAACGGA(SEQ ID NO:1)。
根据本发明的方面提供了一种经遗传修饰的NSG，NRG或NOG小鼠，其基因组包含遗传修饰，其使所述经遗传修饰的NSG，NRG或NOG小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性，从而在施用于所述经遗传修饰的NSG，NRG或NOG时人类红血细胞的存活得以延长，其中所述遗传修饰是小鼠溶酶体运输调节因子(Lyst)基因的突变，使得所述经遗传修饰的NSG，NRG或NOG不表达功能性溶酶体运输调节蛋白，使所述经遗传修饰的NSG，NRG或NOG缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。
根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠是Lystnull免疫缺陷型小鼠。
根据本发明的方面，经遗传修饰的NSG，NRG或NOG小鼠是Lystnull NSG，NRG或NOG小鼠。
根据本发明的方面，经遗传修饰的NSG，NRG或NOG小鼠是对于beige突变Lystbg是纯合的NSG，NRG或NOG小鼠。
根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠是NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ小鼠，其对于beige突变Lystbg是纯合的。
根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠是NOD.Cg-Rag1tm1MomIl2rgtm1Wjl/SzJ小鼠，其对于beige突变Lystbg是纯合的。
根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠是NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac小鼠，其对于beige突变Lystbg是纯合的。
根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠是NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/Lyst<em1Mvw>/Sz(NSG Lyst敲除)小鼠。
根据本发明的方面提供了一种经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物，其基因组包含遗传修饰，其使所述非人类动物缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性，从而在施用于所述非人类动物时人类红血细胞的存活得以延长，其中所述遗传修饰包含编码人CD47的转基因，使得所述非人类动物表达人CD47蛋白，并且还包含其内源CD47基因的突变，使得所述内源CD47不表达，使所述经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。
根据本发明的方面提供了一种经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，其基因组包含遗传修饰，其使所述小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性，从而在施用于所述经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠时人类红血细胞的存活得以延长，其中所述遗传修饰包含编码人CD47的转基因，使得所述小鼠表达人CD47蛋白，并且还包含小鼠CD47基因的突变，使得所述小鼠CD47不表达，使所述经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。
根据本发明的方面提供了经遗传修饰的NSG，NRG或NOG小鼠，其基因组包含遗传修饰，其使所述NSG，NRG或NOG缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性，从而在施用于所述经遗传修饰的NSG，NRG或NOG小鼠时人类红血细胞的存活得以延长，其中所述遗传修饰包含编码人CD47的转基因，使得所述经遗传修饰的NSG，NRG或NOG小鼠表达人CD47蛋白，并且还包含小鼠CD47基因的突变，使得所述小鼠CD47不表达，使所述经遗传修饰的NSG，NRG或NOG小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。
根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠是NOD.Cg-Prkdc<scid>Cd47<tm1Fpl>Il2rg<tm1Wjl>Tg(CD47)2Sz/Sz(NSG Cd47KO人CD47Tg)小鼠。
根据本发明的方面提供了一种经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物，其基因组包含遗传修饰，其使所述非人类动物缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性，从而在施用于所述非人类动物时人类红血细胞的存活得以延长，其中所述遗传修饰包含编码单纯疱疹病毒1胸苷激酶的转基因，使得所述小鼠表达单纯疱疹病毒1胸苷激酶蛋白，其与核苷类似物结合使所述非人类动物缺乏巨噬细胞。
根据本发明的方面提供了一种经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，其基因组包含遗传修饰，其使所述经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性，从而在施用于所述经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠时人类红血细胞的存活得以延长，其中所述遗传修饰包含编码单纯疱疹病毒1胸苷激酶的转基因，使得所述经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠表达单纯疱疹病毒1胸苷激酶蛋白，其与核苷类似物结合使所述经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠缺乏巨噬细胞。可以使用核苷类似物，例如更昔洛韦，阿昔洛韦或其组合。
本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物还包含施用于所述经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物的血液系统的人类红血细胞，例如通过腹膜内(IP)或静脉内(IV)施用。
本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠还包含施用于所述经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的血液系统的人类红血细胞，例如通过腹膜内(IP)或静脉内(IV)施用。
任选地，将人类造血细胞(HSC)施用于本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，使得在所述经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中产生人类红血细胞。
人类红血细胞在本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物(例如经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠)中比在其基因组不包含所述遗传修饰的相同类型的免疫缺陷型非人类动物(例如免疫缺陷型小鼠)中存活更久。例如，人类红血细胞在本发明的经遗传修饰的NSG，NRG或NOG小鼠中比在其基因组不包含所述遗传修饰的NSG，NRG或NOG小鼠中存活更久。
任选地，存在于本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物(例如本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠)中的人类红血细胞被感染剂感染。
任选地，将能够感染人类红血细胞的感染剂施用于经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物，例如本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠。根据特定方面，感染剂是疟原虫寄生虫，例如恶性疟原虫(P.falciparum)，卵形疟原虫(P.ovale)，间日疟原虫(P.vivax)或三日疟原虫(P.malariae)。
任选地，施用于本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物(例如本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠)的人类红血细胞来自个体人类或人类个体的群体，其中所述个体人类或人类个体的群体具有镰状细胞贫血症。
根据本发明的方面提供了一种测定推定的治疗剂的效果的方法，其包括：将一定量的所述推定的治疗剂施用于本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物，其中所述本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物包含人类红血细胞；和测量所述推定的治疗剂的效果。
根据本发明的方面提供了一种测定推定的治疗剂的效果的方法，其包括：将一定量的所述推定的治疗剂施用于本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，其中所述本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠包含人类红血细胞；和测量所述推定的治疗剂的效果。
用于某些经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠品系的缩写：
MD1：NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Lyst<em1Mvw>/Sz(通过从小鼠Lyst基因缺失SEQ ID NO:1而敲除Lyst的NSG小鼠品系)。
MD2：NSG CD47KO Tg(hCD47)(敲除小鼠CD47并包含编码人CD47的转基因的NSG小鼠品系)。
MD3：NSG CSF1r-HTK(包含转基因的NSG小鼠品系，其中CSF1r启动子驱动疱疹胸苷激酶的表达)。
MD4：B6.129S-Rag1<tm1Mom>CD47KO Il2rg<tm1Wjl>/Sz(敲除小鼠IL2rg并且敲除小鼠CD47的BL/6小鼠品系，也称为BL/6Rag1nullCD47KOIL2rgnull)。
附图说明
图1是显示与NSG对照小鼠相比，NSG Lyst(MD1)敲除(KO)小鼠中人类红血细胞(RBC)的存活，并证实在施用人类红血细胞后24小时，在经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中存活的人类红血细胞的数量增加了两倍的图。
图2是显示NSG HSV-1-tk转基因(Tg)小鼠与NSG对照小鼠相比的结果，并且证实在施用人类红血细胞后高至24小时，在经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中存活的人类红血细胞的数量显著更高的图。
图3是显示BL/6RagγMD4小鼠与NSG对照小鼠相比的结果的图。
图4是显示NSG MD2小鼠与NSG对照小鼠相比的结果，并且证实在施用人红血细胞后24小时，在经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中存活的人类红血细胞的数量增加超过两倍，并且在施用人类红血细胞后48，72和96小时，NSG MD2小鼠中与NSG对照小鼠相比人类红血细胞存活显著更高的数量的图。
图5是显示比较本发明的多种不同的经遗传修饰的免疫缺陷型品系中的人RBC存活与NSG对照小鼠相比的结果，并且证实在经遗传修饰的免疫缺陷型MD1和MD2小鼠中存活的人类红血细胞的数量与NSG对照小鼠相比增加的图。
具体实施方式
本文使用的科学和技术术语旨在具有本领域普通技术人员通常理解的含义。发现这些术语在各种标准参考文献中定义和使用，说明性地包括J.Sambrook andD.W.Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press；3rd Ed.,2001；F.M.Ausubel,Ed.,Short Protocols in MolecularBiology,Current Protocols；5th Ed.,2002；B.Alberts et al.,Molecular Biology ofthe Cell,4th Ed.,Garland,2002；D.L.Nelson and M.M.Cox,Lehninger Principles ofBiochemistry,4th Ed.,W.H.Freeman&Company,2004；A.Nagy,M.Gertsenstein,K.Vintersten,R.Behringer,Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press；December 15,2002,ISBN-10:0879695919；Kursad Turksen(Ed.),Embryonic stem cells:methods and protocols inMethods Mol Biol.2002；185,Humana Press；Current Protocols in Stem CellBiology,ISBN:9780470151808；Chu,E.and Devita,V.T.,Eds.,Physicians’CancerChemotherapy Drug Manual,Jones&Bartlett Publishers,2005；J.M.Kirkwood et al.,Eds.,Current Cancer Therapeutics,4th Ed.,Current Medicine Group,2001；Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins,21st Ed.,2005；L.V.Allen,Jr.et al.,Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems,8th Ed.,Philadelphia,PA:Lippincott,Williams&Wilkins,2004；和L.Brunton et al.,Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics,McGraw-Hill Professional,12th Ed.,2011。
除非另有明确说明或上下文另有明确说明，否则单数术语“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”并非旨在限制，并且包括复数指示物。
根据本发明的方面，提供了经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物，其基因组包含遗传修饰，其中遗传修饰使非人类动物缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物还包含人类红血细胞。施用于经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物的血液系统中的人类红血细胞在经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物中比在其基因组不包含所述遗传修饰的相同类型的免疫缺陷型非人类动物中存活更久。
术语“免疫缺陷型非人类动物”是指非人类动物，其特征在于以下中的一种或多种：缺乏功能性免疫细胞，例如T细胞和B细胞；DNA修复缺陷；编码淋巴细胞上的抗原特异性受体的基因的重排的缺陷；和缺乏免疫功能分子，如IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3和IgA。
根据本发明的方面，根据本发明的方面提供的经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物是小鼠，其基因组包含遗传修饰，其中遗传修饰使非人类动物缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。虽然本文的描述主要涉及其中经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物是小鼠的本发明的方面，但经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物也可以是哺乳动物，例如大鼠，沙鼠，豚鼠，仓鼠，兔，猪，羊或非人灵长类动物。
本文所用的短语“经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠”是指免疫缺陷型小鼠，其基因组包含遗传修饰，其中遗传修饰使免疫缺陷型小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。
短语“缺乏巨噬细胞”是指与不具有使免疫缺陷型小鼠缺乏巨噬细胞的基因突变的类似免疫缺陷型小鼠中存在的巨噬细胞的数量相比，巨噬细胞的数量减少。
术语“免疫缺陷型小鼠”是指特征在于以下中的一种或多种的小鼠：缺乏功能性免疫细胞，例如T细胞和B细胞；DNA修复缺陷；编码淋巴细胞上的抗原特异性受体的基因的重排的缺陷；和缺乏免疫功能分子，如IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3和IgA。免疫缺陷型小鼠的特征可以在于参与免疫功能的基因中的一个或多个缺陷，例如Rag1和Rag2(Oettinger,M.Aet al.,Science,248:1517-1523,1990；和Schatz,D.G.et al.,Cell,59:1035-1048,1989)。免疫缺陷型小鼠可以具有导致小鼠免疫功能异常的任何这些或其他缺陷。
特别有用的免疫缺陷型小鼠品系是NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ，通常称为NOD scidγ(NSG)小鼠，详细描述于Shultz LD et al,2005,J.Immunol,174:6477-89；NOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ，Shultz LD et al,2008Clin Exp Immunol 154(2):270-84，通常称为NRG小鼠；和NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac，详细描述于Ito,M.etal.,Blood 100,3175–3182(2002)，通常称为NOG小鼠。
术语“严重联合免疫缺陷(SCID)”是指特征在于不存在T细胞和缺乏B细胞功能的病症。
SCID的常见形式包括：X连锁SCID，其特征在于IL2RG基因中的γ链基因突变和淋巴细胞表型T(-)B(+)NK(-)；和常染色体隐性遗传SCID，其特征在于Jak3基因突变和淋巴细胞表型T(-)B(+)NK(-)，ADA基因突变和淋巴细胞表型T(-)B(-)NK(-)，IL-7Rα链变异和淋巴细胞表型T(-)B(+)NK(+)，CD3δ或ε突变和淋巴细胞表型T(-)B(+)NK(+)，RAG1/RAG2突变和淋巴细胞表型T(-)B(-)NK(+)，Artemis基因突变和淋巴细胞表型T(-)B(-)NK(+)，CD45基因突变和淋巴细胞表型T(-)B(+)NK(+)。
在进一步的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠在其编码DNA依赖性蛋白激酶，催化亚基(Prkdc)的内源基因中具有缺陷，其导致小鼠表达缺陷的内源DNA依赖性蛋白激酶，催化亚基和/或减少量的内源性DNA依赖性蛋白激酶，催化亚基，或者小鼠可以根本不表达内源性DNA依赖性蛋白激酶，催化亚基。免疫缺陷型小鼠可任选地为Prkdc无效，使得其缺乏功能性内源性Prkdc基因。
根据本发明的方面的经遗传修饰的小鼠具有严重联合免疫缺陷突变(Prkdcscid)，通常称为scid突变。scid突变是公知的，并且位于小鼠染色体16上，如Bosma,et al.,Immunogenetics 29:54-56,1989所述。对于scid突变为纯合的小鼠的特征在于不存在功能性T细胞和B细胞，淋巴细胞减少，低球蛋白血症和正常造血微环境。scid突变可以被检测，例如，通过使用公知方法，例如PCR或流式细胞术检测scid突变的标志物。
根据本发明方面的经遗传修饰的小鼠具有IL2受体γ链缺陷。术语“IL2受体γ链缺陷”是指IL2受体γ链减少。IL2受体γ链减少可归因于基因缺失或突变。IL2受体γ链减少可以被检测，例如通过使用公知方法检测IL2受体γ链基因缺失或突变和/或检测降低的IL2受体γ链表达。
根据本发明的方面，提供了经遗传修饰的免疫缺陷NSG小鼠，其基因组包含遗传修饰，其中遗传修饰使小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。
根据本发明的方面，提供了经遗传修饰的免疫缺陷NRG小鼠，其基因组包含遗传修饰，其中遗传修饰使小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。
根据本发明的方面，提供了经遗传修饰的免疫缺陷NOG小鼠，其基因组包含遗传修饰，其中遗传修饰使小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。
产生缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性的免疫缺陷型小鼠的遗传
修饰
根据本发明的方面，提供了经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，其中遗传修饰是溶酶体运输调节因子(Lyst)基因的突变，使得小鼠不表达功能性溶酶体运输调节蛋白，使非人类动物缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞中抗人类红血细胞活性。根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物还包含人类红血细胞。施用于经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物的血液系统中的人类红血细胞在经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物中比在其基因组不包含所述遗传修饰的相同类型的免疫缺陷型非人类动物中存活更久。Lyst基因位于小鼠中的Chr13:13590409-13777440bp，+链，并且在许多物种中是保守的，包括人，黑猩猩，恒河猴，狗，牛，大鼠，鸡，斑马鱼和青蛙。
根据本发明的方面，提供了在Lyst基因座处具有一个或多个自发或诱导突变的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，其中小鼠不表达功能性溶酶体运输调节蛋白，使小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠还包含人类红血细胞。施用于经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的血液系统中的人类红血细胞在经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中比在其基因组不包含所述遗传修饰的相同类型的免疫缺陷型小鼠中存活更久。
根据本发明的方面，提供了在Lyst基因座处具有外显子5缺失的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，其中小鼠不表达功能性溶酶体运输调节蛋白，使小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人红血细胞活性。根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠还包含人类红血细胞。施用于经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的血液系统中的人类红血细胞在经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中比在其基因组不包含所述遗传修饰的相同类型的免疫缺陷型小鼠中存活更久。
根据本发明的方面，提供了在Lyst基因座的外显子5中具有25bp缺失的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，其中小鼠不表达功能性溶酶体运输调节蛋白，使小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。根据本发明的特定方面，25bp缺失是具有核苷酸序列GAGCCGGTAGCTTTGGTTCAACGGA(SEQ ID NO:1)的在Lyst基因座处的外显子5中的25bp基因组DNA片段的缺失。根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠还包含人类红血细胞。施用于经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的血液系统中的人类红血细胞在经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中比在其基因组不包含所述遗传修饰的相同类型的免疫缺陷型小鼠中存活更久。
根据本发明的方面，提供了在Lyst基因座处具有一个或多个自发或诱导突变的经遗传修饰，使得小鼠是Lystnull的免疫缺陷型小鼠，其中小鼠不表达功能性溶酶体运输调节蛋白，使小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠还包含人类红血细胞。施用于经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的血液系统中的人类红血细胞在经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中比在其基因组不包含所述遗传修饰的相同类型的免疫缺陷型小鼠中存活更长久。
根据本发明的方面，提供了经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，其对于beige突变Lystbg是纯合的，其中小鼠不表达功能性溶酶体运输调节蛋白，使小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人红血细胞活性。Lystbg再突变(remutation)(Lystbg-J)在The JacksonLaboratory(J：5311)的C57BL/6J品系中自发发生。该等位基因由Lystbg的非互补测试定义。这是Lyst的外显子54中的3bp缺失的结果，在蛋白质羧基末端附近的密码子3741处引起异亮氨酸缺失。该缺失影响WD40结构域。根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠还包含人类红血细胞。施用于经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的血液系统中的人类红血细胞在经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中比在其基因组不包含所述遗传修饰的相同类型的免疫缺陷型小鼠中存活更久。
根据本发明，提供了经遗传修饰的免疫缺陷型NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ小鼠，其对于beige突变Lystbg是纯合的，其中小鼠不表达功能性溶酶体运输调节蛋白，使小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠还包含人类红血细胞。施用于经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的血液系统中的人类红血细胞在经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中比在其基因组不包含所述遗传修饰的相同类型的免疫缺陷型小鼠中存活更久。
根据本发明的方面，提供了经遗传修饰的免疫缺陷型NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/Lyst<em1Mvw>/Sz(NSG Lyst敲除-MD1)小鼠，其中小鼠不表达功能性溶酶体运输调节蛋白，使小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠还包含人类红血细胞。施用于经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的血液系统中的人类红血细胞在经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中比在其基因组不包含所述遗传修饰的相同类型的免疫缺陷型小鼠中存活更久。
根据本发明的方面，提供了经遗传修饰的免疫缺陷型NOD.Cg-Rag1tm1MomIl2rgtm1Wj1/SzJ小鼠，其对于beige突变Lystbg是纯合的，其中小鼠不表达功能性溶酶体运输调节蛋白，使小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠还包含人类红血细胞。施用于经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的血液系统中的人类红血细胞在经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中比在其基因组不包含所述遗传修饰的相同类型的免疫缺陷型小鼠中存活更久。
根据本发明的方面，提供了经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，其中遗传修饰包含编码人CD47的转基因，使得小鼠表达人CD47蛋白，并且还包含小鼠基因组中小鼠CD47基因的突变，使得小鼠不表达功能性小鼠CD47蛋白，使小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠还包含人类红血细胞。施用于经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的血液系统中的人类红血细胞在经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中比在其基因组不包含所述遗传修饰的相同类型的免疫缺陷型小鼠中存活更久。
根据本发明的方面，提供了经遗传修饰的免疫缺陷NSG小鼠，其中遗传修饰包含编码人CD47的转基因，使得小鼠表达人CD47蛋白，并且还包含小鼠基因组中小鼠CD47基因的突变，使得使小鼠不表达功能性小鼠CD47蛋白，使小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠还包含人类红血细胞。施用于经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的血液系统中的人类红血细胞在经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中比在其基因组不包含所述遗传修饰的相同类型的免疫缺陷型小鼠中存活更久。
根据本发明的方面，提供了经遗传修饰的免疫缺陷NRG小鼠，其中遗传修饰包含编码人CD47的转基因，使得小鼠表达人CD47蛋白，并且还包含小鼠基因组中小鼠CD47基因的突变，使得小鼠不表达功能性小鼠CD47蛋白，使小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠还包含人类红血细胞。施用于经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的血液系统中的人类红血细胞在经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中比在其基因组不包含所述遗传修饰的相同类型的免疫缺陷型小鼠中存活更久。
根据本发明的方面，提供了经遗传修饰的免疫缺陷NOG小鼠，其中遗传修饰包含编码人CD47的转基因，使得小鼠表达人CD47蛋白，并且还包含小鼠基因组中小鼠CD47基因的突变，使得小鼠不表达功能性小鼠CD47蛋白，使小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性。根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠还包含人类红血细胞。施用于经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的血液系统中的人类红血细胞在经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中比在其基因组不包含所述遗传修饰的相同类型的免疫缺陷型小鼠中存活更久。
根据本发明的方面，提供了经遗传修饰的免疫缺陷型NOD.Cg-Prkdc<scid>Cd47<tm1Fpl>Il2rg<tm1Wjl>Tg(CD47)2Sz/Sz(NSG Cd47KO人CD47Tg)小鼠。根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠还包含人类红血细胞。施用于经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的血液系统中的人类红血细胞在经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中比在其基因组不包含所述遗传修饰的相同类型的免疫缺陷型小鼠中存活更久。
根据本发明的方面，提供了经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，其中遗传修饰包含编码单纯疱疹病毒1胸苷激酶的转基因，使得小鼠表达单纯疱疹病毒1胸苷激酶蛋白，其与核苷类似物结合使小鼠缺乏巨噬细胞。可以使用与单纯疱疹病毒1胸苷激酶蛋白组合对巨噬细胞有毒的任何核苷类似物，例如但不限于更昔洛韦，阿昔洛韦或其组合。根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠还包含人类红血细胞。施用于经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的血液系统中的人类红血细胞在经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中比在其基因组不包含所述遗传修饰的相同类型的免疫缺陷型小鼠中存活更久。
可以使用各种方法中的任一种来产生其基因组包含遗传修饰的经遗传修饰的免疫缺陷型非人类动物，例如小鼠。使用标准遗传工程方法产生遗传修饰，例如但不限于化学诱变，辐射，同源重组和反义RNA的转基因表达。这样的技术在本领域中是公知的，并且还包括但不限于原核显微注射和胚胎干细胞转化。可以使用的用于产生其基因组包含被扰乱的基因的遗传修饰动物的方法包括但不限于J.P.Sundberg and T.Ichiki,Eds.,Genetically Engineered Mice Handbook,CRC Press；2006；M.H.Hofker and J.vanDeursen,Eds.,Transgenic Mouse Methods and Protocols,Humana Press,2002；A.L.Joyner,Gene Targeting:A Practical Approach,Oxford University Press,2000；Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,3rd edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press；December 15,2002,ISBN-10:0879695919；Kursad Turksen(Ed.),Embryonic stem cells:methods and protocols in Methods Mol Biol.2002；185,Humana Press；Current Protocols in Stem Cell Biology,ISBN:978047015180；Meyer et al.PNAS USA,vol.107(34),15022-1502描述的那些。
基于同源性的重组遗传修饰策略可用于通过“敲入”来遗传修饰免疫缺陷型小鼠以引入编码一种或多种外源蛋白质的核酸，例如编码单纯疱疹病毒1胸苷激酶的核苷酸序列或编码人CD47的核苷酸序列到免疫缺陷型小鼠的基因组中。类似地，基于同源性的重组遗传修饰策略可用于通过“敲除”或突变编码一种或多种内源蛋白质(例如小鼠CD47或小鼠Lyst)的基因来遗传修饰免疫缺陷型小鼠。
基于同源性的重组遗传修饰策略包括基因编辑方法，例如使用归巢核酸内切酶，整合酶，大范围核酸酶，转座子，使用锌指核酸酶(ZFN)的核酸酶介导过程，转录激活因子(TAL)，规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas，或果蝇重组相关蛋白(DRAP)方法。参见，例如，Cerbini et al.,PLoS One.2015；10(1):e0116032；Shen et al.,PLoS ONE 8(10):e77696；和Wang et al.,Protein&Cell,February 2016,Volume 7,Issue 2,pp 152–156。
基因组编辑例如通过本文所述的方法进行，并且如以下中详述J.P.Sundberg andT.Ichiki,Eds.,Genetically Engineered Mice Handbook,CRC Press；2006；M.H.Hofkerand J.van Deursen,Eds.,Transgenic Mouse Methods and Protocols,Humana Press,2002；A.L.Joyner,Gene Targeting:A Practical Approach,Oxford University Press,2000；Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,3rd edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press；December 15,2002,ISBN-10:0879695919；Kursad Turksen(Ed.),Embryonic stem cells:methods and protocols in Methods Mol Biol.2002；185,Humana Press；Current Protocols in Stem Cell Biology,ISBN:978047015180；Meyer et al.,PNAS USA,2010,vol.107(34),15022–15026；和Doudna,J.et al.(eds.)CRISPR-Cas:A Laboratory Manual,2016,CSHP。本文描述了多种基因组编辑技术的简要描述。
用于小鼠的遗传修饰的核酸酶技术
遗传修饰方法，例如但不限于核酸酶遗传编辑技术，可用于在预定的靶位点将期望DNA序列引入基因组，例如使用归巢内切核酸酶，整合酶，大范围核酸酶，转座子，使用锌指核酸酶(ZFN)的核酸酶介导过程，转录激活因子(TAL)，规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas，或果蝇重组相关蛋白(DRAP)的方法。简而言之，可以使用的遗传修饰方法包括将编码靶向TALEN，ZFN，CRISPR或DRAP和至少一种寡核苷酸的RNA分子引入ES细胞，iPS细胞，体细胞，受精卵母细胞或胚胎，然后选择具有期望的遗传修饰的ES细胞，iPS细胞，体细胞，受精卵母细胞或胚胎。
例如，可以通过核酸酶技术将期望的核酸序列引入小鼠的基因组中，所述核酸酶技术例如但不限于CRISPR方法学，TAL(转录激活因子样效应子方法)，锌指-介导的基因组编辑或DRAP以产生根据本发明的实施方式提供的经遗传修饰的小鼠，其基因组包含与启动子可操作地连接的编码人CD47或单纯疱疹病毒1胸苷激酶蛋白的核酸，其中动物表达编码的人CD47或单纯疱疹病毒1胸苷激酶蛋白。
如本文所用，在核酸酶遗传编辑技术的上下文中，术语“靶位点”和“靶序列”是指限定待编辑的染色体序列的一部分并且核酸酶被设计为识别并且如果存在用于结合的充分条件则与之结合的核酸序列。
CRISPR-Cas系统
CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复序列)是含有多个短直接重复序列的基因座，见于大约40％的测序细菌和90％的测序古细菌的基因组中，并赋予对外源DNA元件的抗性，参见Horvath,2010,Science,327:167–170；Barrangou et al,2007,Science,315:1709-1712；和Makarova et al,2011,Nature Reviews Microbiology.9:467-477。
CRISPR重复序列的大小范围为24至48个碱基对。它们通常表现出一些二元对称性，暗示形成二级结构，如发夹，但不是真正的回文。CRISPR重复序列由相似长度的间隔子分隔开。
CRISPR相关(cas)基因通常与CRISPR重复序列-间隔子阵列相关联。已经描述了超过40种不同的Cas蛋白家族(Haft et al.2005,PLoS Comput Biol.1(6):e60)。已经使用cas基因和重复结构的特定组合来定义8种CRISPR亚型，其中一些与编码重复相关神秘蛋白(RAMP)的另外的基因模块相关。
不同生物中存在多种CRISPR系统，最简单的中的一种是来自化脓链球菌的II型CRISPR系统：只有编码Cas9蛋白和两个RNA(成熟CRISPR RNA(crRNA)和部分互补的反式作用RNA(tracrRNA))的单个基因对于RNA引导的外源DNA沉默是必需且足够的(Gasiunas etal,2012,PNAS 109:E2579-E2586；Jinek et al,2012,Science 337:816-821)。crRNA的成熟需要tracrRNA和RNase III(Deltcheva et al,2011,Nature 471:602-607)。然而，通过使用包含模拟tracrRNA-crRNA复合物的设计发夹的工程化小指导RNA(sgRNA)可以绕过该要求(Jinek et al.,2012,Science 337:816-821)。由于Cas9的内切核酸酶活性，sgRNA和靶DNA之间的碱基配对导致双链断裂(DSB)。结合特异性由sgRNA-DNA碱基配对和与DNA互补区并置的短DNA基序(原型间隔子相邻基序[PAM]序列：NGG)决定(Marraffini&Sontheimer,2010,Nature Reviews Genetics,11:181-190)。例如，CRISPR系统需要两个分子的最小组，即Cas9蛋白和sgRNA，因此可以用作宿主非依赖性基因靶向平台。可以利用Cas9/CRISPR进行位点选择性RNA指导的基因组编辑，例如靶向插入，参见例如Carroll,2012,MolecularTherapy 20:1658-1660；Chang et al,2013,Cell Research 23:465-472；Cho et al,2013,Nature Biotechnol 31:230-232；Cong et al,2013,Science 339:819-823；Hwanget al,2013,Nature Biotechnol 31:227-229；Jiang et al,2013,Nature Biotechnol31:233-239；Mali et al,2013,Science 339:823-826；Qi et al,2013,Cell 152:1173-1183；Shen et al,2013,Cell Research 23:720-723；and Wang et al,2013,Cell 153:910-918)。尤其是Wang et al.2013,Cell 153:910-918描述了使用结合寡核苷酸的CRISPR/Cas9系统的靶向插入。
根据本发明方面的遗传修饰小鼠的产生可包括将用于CRISPR的合适的核酸，例如编码cas9的表达构建体和编码对待靶向基因特异的指导RNA的表达构建体，注射或转染到植入前胚胎或干细胞中，如胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞。任选地，cas9和指导RNA在单一表达构建体中编码。
TAL(转录激活因子样)效应子
转录激活因子样(TAL)效应子或TALE(转录激活因子样效应子)来源于植物病原菌属黄单胞菌属，并且这些蛋白质模拟植物转录激活因子并操纵植物转录物，参见Kay etal.,2007,Science,318:648-651。
TAL效应子含有串联重复的集中结构域，每个重复包含约34个氨基酸，这是这些蛋白质的DNA结合特异性的关键。另外，它们含有核定位序列和酸性转录激活结构域，综述参见Schornack et al 2006,J.Plant Physiol.,163(3):256-272；Scholze and Boch,2011,Curr Opin Microbiol,14:47–53。
TAL效应子的特异性取决于见于串联重复序列中的序列。重复序列包含大约102bp，并且重复序列通常彼此91-100％同源(Bonas et al,1989,Mol Gen Genet 218:127-136)。重复序列的多态性通常位于12和13位，并且在12和13位的高变二残基的同一性与TAL效应子的靶序列中的连续核苷酸的同一性之间似乎存在一一对应关系，参见Moscouand Bogdanove 2009,Science 326:1501；and Boch et al2009,Science 326:1509-1512。这两个高变残基称为重复可变二残基(RVD)，藉此一个RVD识别DNA序列的一个核苷酸并确保每个TAL效应子的DNA结合域可以高精度(15-30nt)靶向大的识别位点。实验上，已经确定了用于这些TAL效应子的DNA识别的代码，使得12和13位的HD序列导致与胞嘧啶(C)结合，NG与T结合，NI与A、C、G或T结合，NN与A或G结合，IG与T结合。这些DNA结合重复序列已组装成具有重复序列的新的组合和数量的蛋白质，以制备能够与新序列相互作用并激活植物细胞中的报告基因的表达的人工转录因子(Boch et al 2009,Science 326:1509-1512)。已经显示这些DNA结合结构域在所有细胞类型中的靶向基因组编辑或靶向基因调节领域具有普遍适用性，Gaj et al.,Trends in Biotechnol,2013,31(7):397-405。此外，已显示工程化TAL效应子与不是天然见于天然黄单胞菌TAL效应或哺乳动物细胞中的蛋白质中的外源功能性蛋白质效应结构域如核酸酶结合起作用。TAL核酸酶(TALN或TALEN)可以通过将TAL与核酸酶(例如在N末端或C末端的FokI核酸酶结构域)组合来构建，Kim et al.1996,PNAS93:1156-1160；Christian et al 2010,Genetics 186:757-761；Li et al,2011,NucleicAcids Res 39:6315-6325；and Miller et al,2011,Nat Biotechnol 29:143-148。已经在大鼠，小鼠，斑马鱼，非洲爪蟾，青蛙，大鼠和人细胞中显示了TALEN导致通过NHEJ进行缺失的功能，Ansai et al,2013,Genetics,193:739-749；Carlson et al,2012,PNAS,109:17382-17387；Hockemeyer et al,2011,Nature Biotechnol.,29:731-734；Lei et al,2012,PNAS,109:17484-17489；Moore et al,2012,PLoS ONE,7:e37877；Stroud et al,2013,J.Biol.Chem.,288:1685-1690；Sung et al,2013,Nature Biotechnol 31:23-24；Wefers et al,2013,PNAS 110:3782-3787。
对于TALEN，在美国专利US8420782，US8450471，US8450107，US8440432，US8440431和美国专利申请US20130137161，US20130137174中进一步描述了制备它们的方法。
其他有用的内切核酸酶可包括，例如，HhaI，HindIII，NotI，BbvCI，EcoRI，Bg/I和AlwI。一些核酸内切酶(例如，FokI)仅作为二聚体发挥功能的事实可以被充分利用，以增强TAL效应子的靶特异性。例如，在一些情况下，每个FokI单体可以融合至识别不同DNA靶序列的TAL效应子序列，并且仅当两个识别位点非常接近时，非活性单体才聚集在一起以产生功能性酶。通过要求DNA结合来激活核酸酶，可以产生高度位点特异性的限制酶。
在一些实施方式中，TALEN还可包含核定位信号或序列(NLS)。NLS是其有助于将TALEN核酸酶蛋白靶向到细胞核中，以在染色体的靶序列中引入双链断裂的氨基酸序列。
核定位信号在本领域中是已知的，参见例如Makkerh et al.1996,Curr Biol.6:1025-1027。NLS包括来自SV40大T抗原的序列PKKKRKV，Kalderon 1984,Cell,39:499–509；来自核质蛋白的RPAATKKAGQAKKK(SEQ ID NO:9)，Dingwallet al.,1988,J Cell Biol.,107,841–9。其他实例描述于McLane and Corbett 2009,IUBMB Life,61,697–70；Dopie etal.2012,PNAS,109,E544–E552。
切割结构域可以从任何内切核酸酶或外切核酸酶获得。可以从其衍生切割结构域的内切核酸酶的非限制性实例包括但不限于限制性内切核酸酶和归巢内切核酸酶。参见，例如，2002-2003Catalog,New England Biolabs,Beverly,Mass.；and Belfort et al.(1997)NucleicAcids Res.25:3379-3388。已知切割DNA的另外的酶，例如SI核酸酶；绿豆核酸酶；胰腺DNase I；微球菌核酸酶；酵母HO内切核酸酶。另见Linn et al.(eds.)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993。这些酶中的一种或多种或其功能片段可用作切割结构域的来源。
锌指介导的基因组编辑
已经很好地建立了锌指核酸酶(ZFN)用于基因编辑的用途，例如通过同源定向修复过程进行靶向插入。例如，参见Carbery et al,2010,Genetics,186:451-459；Cui etal,2011,Nature Biotechnol.,29:64-68；Hauschild et al,2011,PNAS,108:12013-12017；Orlando et al,2010,Nucleic Acids Res.,38:e152-e152；和Porteus&Carroll,2005,Nature Biotechnology,23:967-973。
ZFN介导过程的组分包括具有DNA结合结构域和切割结构域的锌指核酸酶。这样的例如描述于Beerli et al.(2002)Nature Biotechnol.,20:135-141；Pabo et al.(2001)Ann.Rev.Biochem.,70:313-340；Isalan et al.(2001)Nature Biotechnol.19:656-660；Segal et al.(2001)Curr Opin.Biotechnol.,12:632-637；和Choo et al.(2000)CurrOpin.Struct.Biol.,10:411-416；和U.S.Pat.Nos.6,453,242和6,534,261。设计和选择针对靶序列的锌指结合结构域的方法是本领域已知的，参见例如Sera,et al.,Biochemistry2002,41,7074-7081；U.S.Pat.Nos.6,607,882；6,534,261和6,453,242。
在一些实施方式中，锌指核酸酶还可包含核定位信号或序列(NLS)。NLS是有助于将锌指核酸酶蛋白靶向到细胞核中以在染色体中的靶序列处引入双链断裂的氨基酸序列。核定位信号在本领域中是已知的。参见，例如，Makkerh et al.(1996)Current Biology6:1025-1027。
切割结构域可以从任何内切核酸酶或外切核酸酶获得。可以从其衍生切割结构域的内切核酸酶的非限制性实例包括但不限于限制性内切核酸酶和归巢内切核酸酶。参见，例如，2002-2003Catalog,New England Biolabs,Beverly,Mass.；and Belfort et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388。已知切割DNA的另外的酶(例如，S1核酸酶；绿豆核酸酶；胰腺DNase I；微球菌核酸酶；酵母HO内切核酸酶)。另见Linn et al.(eds.)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993。这些酶中的一种或多种(或其功能片段)可用作切割结构域的来源。切割结构域也可以衍生自如上所述的酶或其部分，其需要二聚化以实现切割活性。
切割可以需要两个锌指核酸酶，因为每个核酸酶包含活性酶二聚体的单体。或者，单个锌指核酸酶可包包含两种单体以产生活性酶二聚体。限制性内切核酸酶(限制酶)存在于许多物种中，并且能够与DNA(在识别位点)进行序列特异性结合，并在结合位点处或附近切割DNA。某些限制酶(例如，IIS型)在离开识别位点的位点处切割DNA并具有可分离的结合和切割结构域。例如，IIS型酶FokI催化DNA的双链切割，在一条链上离其识别位点9个核苷酸，在另一条链上离其识别位点13个核苷酸。参见，例如，U.S.Pat.Nos.5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li et al.(1992)PNAS89:4275-4279；Li et al.(1993)PNAS 90:2764-2768；Kim et al.(1994)PNAS 91:883-887；Kim et al.(1994)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。因此，锌指核酸酶可包含来自至少一种IIS型限制酶的切割结构域和一个或多个锌指结合结构域，其可以是或可以不是工程化的。示例性的IIS型限制酶描述于例如国际公布WO07/014275中，其公开内容通过引用整体并入本文。另外的限制酶还含有可分离的结合和切割结构域，并且这些也是本公开所考虑的。参见，例如，Roberts et al.(2003)Nucleic Acids Res.31:418-420。示例性的IIS型限制酶，其切割结构域可与结合结构域分离，是FokI。这种特殊的酶作为二聚体具有活性(Bitinaite et al.1998,PNAS 95:10,570-10,575)。因此，出于本公开的目的，锌指核酸酶中使用的FokI酶部分被认为是切割单体。因此，对于使用FokI切割结构域的靶向双链切割，可以使用两个锌指核酸酶(每个包含FokI切割单体)来重构活性酶二聚体。或者，也可以使用含有锌指结合结构域和两个FokI切割单体的单一多肽分子。在某些实施方式中，切割结构域可包含最小化或防止同源二聚化的一种或多种工程化切割单体，如例如美国专利公开号20050064474，20060188987和20080131962中所述，其各自通过引用并入本文。整体。作为非限制性实例，FokI的446，447，479，483，484，486，487，490，491，496，498，499，500-531，534，537和538位的氨基酸残基均为影响FokI切割半结构域二聚化的靶标。形成专性异二聚体的FokI的示例性工程化切割单体包括一对，其中第一切割单体包含FokI的氨基酸残基位置490和538处的突变，并且第二切割单体包含氨基酸残基位置486和499处的突变。因此，在一个实施方式中，氨基酸位置490处的突变用Lys(K)取代Glu(E)；氨基酸残基538处的突变用Lys(K)取代Ile(I)；氨基酸残基486处的突变用Glu(E)取代Gln(Q)；并且位置499处的突变用Lys(K)代替Ile(I)。具体地，工程化切割单体可以通过在一个切割单体中在490位从E突变成K和在538位从I突变成K以产生称为“E490K:I538K”的工程化切割单体，并通过在另一个切割单体中在486位从Q突变成E和在499位从I突变成L以产生称为“Q486E:I499L”的工程化切割单体而制备。上述工程化切割单体是专性异二聚体突变体，其中异常切割被最小化或消除。可以使用合适的方法制备工程化切割单体，例如，如美国专利公开号20050064474中所述，通过野生型切割单体(FokI)的定点诱变。
可以改造上述锌指核酸酶以在整合的靶向位点引入双链断裂。双链断裂可以位于整合的目标位置，或者它可以远离整合位点至多1，2，3，4，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，100或1000个核苷酸。在一些实施方式中，双链断裂可以远离整合位点至多1，2，3，4，5，10，15或20个核苷酸。在其他实施方式中，双链断裂可以远离整合位点至多10，15，20，25，30，35，40，45或50个核苷酸。在其他实施方式中，双链断裂可以远离整合位点至多50，100或1000个核苷酸。
DRAP技术已在US6534643，US6858716和US6830910以及Watt et al,2006中描述。
产生经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，其基因组包含遗传修饰，其中遗传修饰使小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性的小鼠，可以通过将基因靶向载体引入植入前胚胎或干细胞(如胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞)中来实现。
术语“基因靶向载体”是指有效重组和突变特定染色体基因座的双链重组DNA分子，例如通过插入或替换靶基因。
对于靶向基因破坏或引入期望核酸序列，使用重组DNA技术制备基因靶向载体，并包含与干细胞内源靶基因同源的5'和3'序列。基因靶向载体任选且优选地还包含可选择标志物，例如新霉素磷酸转移酶，潮霉素或嘌呤霉素。本领域普通技术人员能够选择用于包含在基因靶向载体中的序列，并且仅使用常规实验使用这些序列。基因靶向载体可以使用熟知的方法重组或合成产生。
对于将基因靶向载体DNA注射到植入前胚胎中的方法，基因靶向载体在注入非人类植入前胚胎之前被线性化。优选地，将基因靶向载体注射到受精卵母细胞中。在交配后那天(0.5dpc)从超排卵的雌性收集受精卵，并注射表达构建体。将注射的卵母细胞培养过夜或直接转移到0.5天p.c.假孕雌性的输卵管中。用于超数排卵，收获卵母细胞，基因靶向载体注射和胚胎移植的方法是本领域已知的并且描述于Manipulating the Mouse Embryo:ALaboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press；December15,2002,ISBN-10:0879695919。可以通过DNA分析(例如PCR，Southern印迹或测序)测试后代是否存在靶基因破坏。可以测试具有破坏的靶基因的小鼠的靶蛋白表达，例如通过使用ELISA或Western印迹分析和/或mRNA表达，例如通过RT-PCR。
或者，可以使用众所周知的方法将基因靶向载体转染到干细胞(ES细胞或iPS细胞)中，例如电穿孔，磷酸钙沉淀和脂质转染。
小鼠ES细胞在针对特定品系优化的培养基中生长。通常，ES培养基含有在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中的15％胎牛血清(FBS)或合成或半合成等同物，2mM谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，0.1mM非必需氨基酸，50U/ml青霉素和链霉素，0.1mM 2-巯基乙醇和1000U/ml LIF(对于一些细胞系加上分化化学抑制剂)。详细描述是本领域已知的(Tremmlet al.,2008,Current Protocols in Stem Cell Biology,Chapter 1:Unit 1C.4)。关于ES细胞分化抑制剂的综述，参见Buehr,M.,et al.(2003).Genesis of embryonic stemcells.Philosophical Transactions of the Royal Society B:BiologicalSciences358,1397-1402。
通过DNA分析，例如PCR，Southern印迹或测序，筛选细胞的靶基因破坏或期望核酸序列引入。可以测试具有破坏靶基因的正确同源重组事件的细胞的靶蛋白表达，例如通过使用ELISA或Western印迹分析和/或mRNA表达，例如通过RT-PCR。如果需要，可以通过用Cre重组酶处理干细胞除去可选择标志物。在Cre重组酶处理后，分析细胞中编码靶蛋白的核酸的存在。
可以将具有破坏靶基因的正确基因组事件或引入期望核酸序列的选定干细胞注射到植入前胚胎中。对于显微注射，使用胰蛋白酶和EDTA的混合物将ES或iPS细胞培养成单细胞，然后重悬于ES培养基中。使用精细拉出的玻璃针(内径20-25微米)选择单一细胞的组，并使用装有显微操纵器的倒置显微镜通过胚胎透明带引入胚泡腔(囊胚腔)。作为胚泡注射的替代，可以将干细胞注射到早期胚胎中(例如，2细胞，4细胞，8细胞，宫颈前膜或桑椹胚)。可以用打开透明带的激光或压电脉冲辅助注射。每个胚泡或8细胞期胚胎注射大约9-10个选定的干细胞(ES或iPS细胞)，每个4细胞期胚胎注射6-9个干细胞，每个2细胞期胚胎注射约6个干细胞。在干细胞引入之后，使胚胎在37℃下在氮气中的5％CO2，5％O2中恢复若干小时或培养过夜，之后转移到假孕雌性受体中。在干细胞注射的另一替代方案中，干细胞可与桑椹胚阶段胚胎聚集。所有这些方法都很成熟，可用于生产干细胞嵌合体。有关更详细的描述，参见Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,3rd edition(A.Nagy,M.Gertsenstein,K.Vintersten,R.Behringer,Cold Spring Harbor LaboratoryPress；December 15,2002,ISBN-10:0879695919,Nagy et al.,1990,Development 110,815-821；US7576259:Method for making genetic modifications,US7659442,US 7,294,754,Kraus et al.2010,Genesis 48,394-399)。
使用本领域已知的方法制备假孕胚胎受体。简言之，将6-8周龄的可育雌性小鼠与输精管切除的或不育的雄性交配以诱导有利于支持手术引入的胚胎的激素状态。在交配后2.5天(dpc)，将至多15个含有胚泡的干细胞引入子宫角，非常靠近子宫-输卵管连接处。对于早期胚胎和桑椹胚，将这样的胚胎体外培养到胚泡中或根据胚胎阶段植入0.5dpc或1.5dpc假孕雌性中进入输卵管。来自植入胚胎的嵌合幼崽在转移后16-20天出生，这取决于植入时的胚胎年龄。选择嵌合雄性进行育种。可以通过涂层颜色和核酸分析(例如PCR，Southern印迹或测序)分析后代的ES细胞基因组的传播。此外，可以分析靶基因的表达的靶mRNA或蛋白质表达，例如通过蛋白质分析，例如免疫测定或功能测定，以确认靶基因破坏。将具有靶基因破坏或期望核酸序列引入的后代杂交以产生对于靶基因破坏或期望核酸序列的存在为纯合的非人类动物。将转基因小鼠与免疫缺陷型小鼠杂交以产生同源免疫缺陷品系，其中靶基因被破坏或存在期望的核酸序列。
评估经遗传修饰的小鼠以确定靶基因是否被破坏使得小鼠缺乏表达靶基因的能力或者是否已经引入期望的核酸序列使得小鼠表达期望的编码蛋白的方法是众所周知的并包括标准技术，如核酸分析，光谱分析，免疫分析和功能分析。
可以使用一种或多种标准物来定量测定样品中的靶蛋白。
可以进行用于评估具有推定的靶基因破坏的动物中的功能性靶蛋白的测定法。用于评估具有推定的靶基因破坏的动物中的靶蛋白功能的测定法是本领域已知的，如Deering et al.,Clin Vaccine Immunol January 2006,vol.13,No.1,68-76中示例。
术语“野生型”是指天然存在的或未突变的生物、蛋白质或核酸。
任选地，通过选择性育种产生根据本发明方面的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠。具有第一期望基因型的第一非人类动物的亲本品系可以与具有第二期望基因型的非人类动物的第二亲本品系一起繁殖以产生后代，所述后代是具有第一和第二期望基因型的经遗传修饰的非人类动物。例如，免疫缺陷的第一小鼠可以与具有Lyst基因破坏使得Lyst的表达不存在或减少的第二小鼠一起繁殖以产生后代，其是免疫缺陷的并且具有Lyst基因破坏，使得Lyst的表达不存在或减少。在进一步的实例中，NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ小鼠，NOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ小鼠或NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac小鼠可以与具有靶基因破坏使得靶基因的表达不存在或减少的小鼠一起繁殖以产生后代，其是免疫缺陷的并且具有靶基因破坏，使得靶蛋白的表达不存在或减少。在更进一步的实例中，NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ小鼠，NOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ小鼠或NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac小鼠可以与其在基因组中具有编码待表达的蛋白质的引入的核酸的小鼠一起繁殖，产生后代，其是免疫缺陷的并且表达由基因组中引入的核酸编码的期望蛋白质。
本发明的方面提供了经遗传修饰的小鼠，其包含在基本上所有细胞中的靶基因破坏，以及经遗传修饰的小鼠，其包含在一些但不是所有细胞中的靶基因破坏。
本发明的实施方式提供经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，其包含在基本上所有细胞中的编码期望蛋白质的核苷酸序列，例如人CD47或单纯疱疹病毒1胸苷激酶，以及经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，其包含在一些但不是所有细胞中的编码期望蛋白质的核苷酸序列，例如人CD47或单纯疱疹病毒1胸苷激酶。根据本发明的方面，可以将编码期望蛋白质(例如人CD47或单纯疱疹病毒1胸苷激酶)的核苷酸序列的一个或多个拷贝(例如多联体)整合到免疫缺陷型小鼠的细胞的基因组中。
包含人类红血细胞的小鼠模型
根据本发明的方面，经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠还包含人类红血细胞。
人类红血细胞可以通过各种途径施用于非人类动物，例如但不限于静脉内或腹膜内施用。
人类红血细胞可以向经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠施用一次或多次。本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中人类红血细胞的存活增加允许减少人类红血细胞的注射次数以允许评估人类红血细胞，例如通过本文所述的测定。
在施用于本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠之前，任选地洗涤人类红血细胞以除去其他血液成分。人类红血细胞的洗涤是根据各种众所周知的方法完成的，例如通过温和离心人全血样品以沉淀人类红血细胞，去除血沉棕黄层和血浆，以及重新悬浮人红血细胞到合适的液体中，例如等渗缓冲液。任选地，用于重悬洗涤的人类红血细胞的液体体积与人全血样品的原始体积基本相当(±5％)，使得经洗涤的人类红血细胞称为“未稀释的经洗涤的人类红血细胞”。
根据本发明的方面，通过施用人造血干细胞(HSC)将人类红血细胞引入经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，所述人造血干细胞植入免疫缺陷型小鼠并通过HSC的分化产生人类红血细胞。
本文使用的术语“人干细胞”和“人HSC”是指表达c-Kit受体的多能干细胞。表达c-Kit受体的多能干细胞的实例包括但不限于造血干细胞，也称为原始血细胞。C-Kit受体是本领域公知的，例如描述于Vandenbark GR et al.,1992,Cloning and structuralanalysis of the human c-kit gene,Oncogene 7(7):1259–66；和Edling CE,HallbergB,2007,c-Kit--a hematopoietic cell essential receptor tyrosine kinase,Int.J.Biochem.Cell Biol.39(11):1995–8。
人HSC的分离，人HSC施用于宿主小鼠以及评估宿主小鼠中的植入的方法是本领域熟知的。
用于施用于免疫缺陷型小鼠的人HSC可以从任何含有人HSC的组织获得，例如但不限于脐带血，骨髓，GM-CSF动员的外周血和胎肝。
人HSC可以通过各种途径施用于新生小鼠，例如但不限于心脏、肝脏和/或面部静脉中。人HSC可以通过各种途径施用于成年小鼠，例如但不限于，施用于尾静脉、股骨骨髓腔或脾脏中。在另一个实例中，含有人HSC的胎肝可以植入肾囊下。
向小鼠施用人HSC可包括向小鼠施用包含人HSC的组合物。组合物可进一步包含，例如，水，张力调节剂(例如盐，例如氯化钠)，pH缓冲剂(例如柠檬酸盐)和/或糖(例如葡萄糖)。
人HSC在免疫缺陷型小鼠中的植入的特征在于免疫缺陷型小鼠中存在分化的人类造血细胞。人HSC的植入可以通过各种方法中的任一种来评估，例如但不限于，在施用人HSC后的一个或多个时间点对人HSC施用的动物中的细胞进行流式细胞术分析。
用于分离人HSC，向宿主小鼠施用人HSC的示例性方法和评估其植入的方法描述于本文和T.Pearson et al.,Curr.Protoc.Immunol.81:15.21.1-15.21.21,2008；Ito,M.etal,Blood 100:3175-3182；Traggiai,E.et al,Science 304:104-107；Ishikawa,F.et al,Blood 106:1565-1573；Shultz,L.D.et al,J.Immunol.174:6477-6489；Holyoake TL etal,Exp Hematol.,1999,27(9):1418-27。
根据本发明的方面，从原始来源材料中分离施用于免疫缺陷型小鼠的人HSC，以获得富含人HSC的细胞群。分离的人HSC可以是纯的，也可以不是纯的。根据方面，通过选择细胞标志物(例如CD34)来纯化人HSC。根据方面，施用的人HSC是其中CD34+细胞构成总细胞的约1-100％的细胞群，尽管也可以使用其中CD34+细胞构成少于总细胞的1％的细胞群。根据实施方式，施用的人HSC是T细胞耗竭的脐带血细胞，其中CD34+细胞构成总细胞的约1-3％，谱系耗竭的脐带血细胞，其中CD34+细胞构成总细胞的约50％，或CD34+阳性选择细胞，其中CD34+细胞构成总细胞的约90％。
就本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中的人类红血细胞的产生而言，施用的HSC的数量不被认为是限制性的。单个HSC可在经遗传修饰的免疫缺陷型宿主小鼠中产生红血细胞。因此，施用的HSC的数量通常在1×103至1×106(1,000至1,000,000)个CD34+细胞的范围内，其中受体是小鼠，尽管可以使用更多或更少。
因此，根据本发明方面的方法可包括施用约103(1000)至约106(1,000,000)，约103(1000)至约105(100,000)，约104(10,000)至约106(1,000,000)，约105(100,000)至约107(10,000,000)，约1×103(1,000)至约1×104(10,000)，约5×103(5,000)至约5×104(50,000)，约1×104(10,000)至约1×105(100,000)，约5×104(50,000)至约5×105(500,000)，约1×105(100,000)至约1×106(1,000,000)，约5×105(500,000)至约5×106(5,000,000)，约1×106(1,000,000)至约1×107(10,000,000)，约2×104(20,000)至约5×105(500,000)，或约5×104(50,000)至约2×105(200,000)个人HSC至经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠。方法可以包括施用至少约1×102，约2×102，约3×102，约4×102，约5×102，约6×102，约7×102，约8×102，约9×102，约1×103，约2×103，约3×103，约4×103，约5×103，约6×103，约7×103，约8×103，约9×103，约1×104，约2×104，约3×104，约4×104，约5×104，约6×104，约7×104，约8×104，约9×104，约1×105，约2×105，约3×105，约4×105，约5×105，约6×105，约7×105，约8×105，约9×105，约1×106，约2×106，约3×106，约4×106，约5×106，约6×106，约7×106，约8×106，约9×106，或约1×107个人HSC至经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠。普通技术人员将能够使用不超过常规的实验确定待施用于特定小鼠的人HSC的数量。
在任何施用的非HSC的大部分已经退化的时候检测到在受体经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中的人HSC和/或从人HSC分化的细胞的情况下，植入是成功的。通过在施用人HSC后从小鼠获得的样品中检测人类红血细胞，可以实现分化的HSC的检测。
根据本发明的方面，人HSC在经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中的植入包括在施用人HSC之前“调理”经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，例如通过用高频电磁辐射来亚致死辐射受体动物，通常使用γ辐射，或用放射性药物如白消安或氮芥等处理。据信调理可减少宿主造血细胞的数量，为人HSC的植入产生适当的微环境因子，和/或产生用于人HSC植入的微环境空间。用于调节的标准方法是本领域已知的，例如描述于本文和J.Hayakawa et al,2009,Stem Cells,27(1):175-182。
根据本发明的方面提供了方法，其包括将人HSC施用于经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，而不在施用人HSC之前“调理”经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠。根据本发明的方面提供了方法，其包括将人HSC施用于经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，而不在施用人HSC之前通过辐射或辐射模拟药物“调理”经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠。
感染
根据特定方面，施用本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的人类红血细胞被感染剂感染。
根据特定方面，施用本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的人类红血细胞被疟原虫寄生虫感染。根据本发明的方面，疟原虫寄生虫是恶性疟原虫(P.falciparum)。根据本发明的方面，疟原虫寄生虫是卵形疟原虫(P.ovale)，间日疟原虫(P.vivax)，或三日疟原虫(P.malariae)。
根据特定方面，将感染剂施用于本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，其中经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠包含人RBC，并且感染剂能够感染人RBC。根据特定方面，施用于经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的感染剂是疟原虫寄生虫。根据本发明的方面，疟原虫寄生虫是恶性疟原虫(P.falciparum)。根据本发明的方面，疟原虫寄生虫是卵形疟原虫(P.ovale)，间日疟原虫(P.vivax)，或三日疟原虫(P.malariae)。
疾病
根据特定方面，施用于本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的人类红血细胞受到病症或疾病的影响。
根据特定方面，施用于本发明的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的人类红血细胞来自个体人类或人类个体的群体(例如，合并的样品)，其中个体人类或人类个体的群体具有镰状细胞性贫血。
测定
根据本发明的方面提供了测定推定的治疗剂的效果的方法，其包括将一定量的推定的治疗剂施用于包含人类红血细胞的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠；和测量推定的治疗剂的效果。
用于本发明方法的推定的治疗剂可以是任何化学实体，说明性地包括合成或天然存在的化合物，或者合成或天然存在的化合物的组合，小有机或无机分子，蛋白质，肽，核酸，碳水化合物，寡糖，脂质或这些中的任一种的组合。
根据本发明的方面提供了测定推定的治疗剂的效果的方法，其包括：用巨噬细胞毒素处理小鼠，产生具有少于正常巨噬细胞的经处理的小鼠；将人类红血细胞施用经处理的小鼠；将一定量的推定的治疗剂施用于经处理的小鼠；和测量推定的治疗剂的效果。巨噬细胞毒素的非限制性实例包括二膦酸盐，例如但不限于唑来膦酸盐，氯膦酸盐，帕米膦酸盐和伊班膦酸盐。
根据本发明的方面提供了测定推定的治疗剂的效果的方法，其包括：用巨噬细胞毒素处理经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，其中所述经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠是根据本发明的方面的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，产生具有少于正常的巨噬细胞的经处理的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠；将人类红血细胞施用于经处理的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠；将一定量的推定的治疗剂施用于经处理的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠；和测量推定的治疗剂的效果。巨噬细胞毒素的非限制性实例包括二膦酸盐，例如但不限于唑来膦酸盐，氯膦酸盐，帕米膦酸盐和伊班膦酸盐。
根据本发明的方面提供了测定推定的治疗处理的效果的方法，其包括将推定的治疗处理施用于包含人类红血细胞的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠；和测量推定的治疗的效果。作为非限制性实例，可以进一步遗传修饰经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，例如通过基因疗法，以治疗红血细胞的病症或疾病。红血细胞的病症和疾病包括但不限于疟疾和红血细胞的其他感染性疾病，镰状细胞贫血症等。
根据本发明的方面，用于治疗疟疾的治疗剂可以施用于包含人类红血细胞的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠，其中人类红血细胞可以被疟原虫寄生虫感染，如恶性疟原虫，卵形疟原虫，间日疟原虫，或三日疟原虫。用于治疗疟疾的治疗剂的实例包括阿莫地喹；青蒿素；青蒿素衍生物，如青蒿琥酯，蒿甲醚，双氢青蒿素，蒿酸和蒿乙醚；阿托伐醌；氯胍(proguanil)；氯喹；弱金鸡纳碱(cinchoine)；金鸡纳啶(cinchoidine)；克林霉素；多西环素；卤代蒽醌，羟氯喹；本芴醇；甲氟喹；哌喹；伯氨喹，乙胺嘧啶；咯萘啶；奎宁；奎尼丁；磺胺；他非诺喹；和四环素。
根据本发明的方面，将一种或多种治疗剂掺入人类红血细胞中并施用于经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠以确定治疗剂的效果。治疗剂可以掺入人RBC中，例如，通过将治疗剂和RBC一起温育以允许治疗剂扩散或主动摄取到RBC中，或者通过施用，例如通过显微注射。治疗剂可以与刺激RBC摄取的载体结合，例如但不限于脂质体。
适用于测定的标准是本领域公知的，所用标准可以是任何合适的标准。
可以使用各种方法的统计分析来分析测定结果，例如参数或非参数测试，方差分析，协方差分析，多变量分析的逻辑回归，Fisher精确检验，卡方检验，学生T-测试，Mann-Whitney检验，威氏符号秩次检验，McNemar检验，Friedman检验和Page的L趋势检验。这些和其他统计学测试在本领域中是众所周知的，详见Hicks,CM,Research Methods forClinical Therapists:Applied Project Design and Analysis,Churchill Livingstone(publisher)；5th Ed.,2009；和Freund,RJ et al.,Statistical Methods,AcademicPress；3rd Ed.,2010。
本发明组合物和方法的实施方式在以下实施例中示出。提供这些实施例是为了说明的目的，并不认为是对本发明组合物和方法范围的限制。
实施例
方法和材料
动物
在该研究中使用的小鼠是在NSG或C57BL/6品系背景上并在The JacksonLaboratory(Bar Harbor，ME)饲养。使用年龄为2至4个月的雄性和雌性小鼠。所有动物都被安置在BSL2认证的房间内，因为注射人血是该项目的主要组成部分。标准寝具、食物和水是任意可得的。笼子维持在23℃的12小时光照/黑暗循环(在6:00开灯)。NSG小鼠代表“标准”品系，因此用作相对于其他新开发品系的对照。
人体血液样本
每周接受肝素中的人血样。一旦获得，在使用前测试血液的淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)和细菌。
测试程序
每个单独的实验由5只NSG小鼠和5只下一代NSG小鼠或BL/6RagγCD47(MD4)KO小鼠组成。所有实验均在指定的BSL2认证室进行。通过静脉内或腹膜内注射将200ul经洗涤的未稀释的人类红血细胞注射到小鼠中。在每个相应的实验中，注射类型保持一致。在每次初始注射后，在预定时间点从尾巴放血。
施用更昔洛韦
将更昔洛韦(GVC)施用于NSG MD3小鼠品系以诱导巨噬细胞的消融。在实验开始之前将GVC连续4天施用于5只小鼠。
抗体混合物
使用两种不同的抗体混合物：1)与APC Ter-119和FACS缓冲液混合的FITC血型糖蛋白A(GPA)和2)与APC Ter-119，PE Glycophorin A和FACS缓冲液混合的FITC CD41b。为了制造前者，FITC GPA以1:500稀释使用，而APC Ter-119以1:50稀释使用。后者使用1:20稀释的FITC CD41B，1:50稀释的APC Ter-119和1:500稀释的PE GPA制备。涡旋所有混合物以确保充分混合。
流式细胞术
为了从外周血定量和分化细胞群，对每个样品使用1:500稀释的用于人类血型糖蛋白A(GPA)的异硫氰酸荧光素(FITC)(E-Biosciences)和1:50稀释的别藻蓝蛋白(APC)，每2ul血液为50ul抗体混合物。将抗体与血液混合，并冷藏于4℃下30-60分钟，以确保足够的染色。然后将血液重悬于1mL PBS叠氮化物中。根据制造商方案使用Attune流式细胞仪(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)进行流式细胞术。然后使用细胞分析软件FlowJo(FlowJo LLC，Ashland，OR)对样品进行定量。
结果
基因工程小鼠以改善人类RBC存活
NSG Lyst(MD1)KO小鼠品系(NSG MD1小鼠)
这种小鼠的独特之处在于它已经敲除了Lyst基因，这种基因在突变/不存在时可导致人类疾病综合症。没有这种基因，小鼠的先天免疫系统受到损害，导致溶酶体功能障碍和免疫细胞功能障碍。
产生经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠-NSG Lyst敲除MD1
通过将Cas9RNA(100ng)和单一指导序列(50ng)，sgRNA-1537(ATCCGTTGAACCAAAGCTAC，SEQ ID NO:2)原核注射到NSG受精卵母细胞中，在The JacksonLaboratory产生NSG Lyst敲除MD1小鼠。
对于sgRNA-1537：转移55个胚胎(3个假)，14个活体，2/14(14％)NHEJ
CRISPR策略导致小鼠Lyst基因的外显子5中的25碱基对缺失(GAGCCGGTAGCTTTGGTTCAACGGA，SEQ ID NO:1)的特定缺失。
设计了四种引物用于基因分型：
Primer#1578
GGGTGAATATTGAAGTTCTGAGAC(SEQ ID NO:3)
Primer#1579
CATTTGAATCCTGTCTCAGAATGA(SEQ ID NO:4)
Primer#1580
GCCACCAAAGAACAGGTCCTTT(SEQ ID NO:5)
Primer#1581
GAAGTGGGAATACTCACAACGC(SEQ ID NO:6)
为了对sg1537靶向的突变体进行基因分型，使用引物1580/1581进行基因分型PCR和测序。产物应为～903bp，使用NEB Standard Taq(M0273)的最佳PCR程序如下：
95C-30秒
95C-15秒}
60C-30秒}30X循环
68C-1分钟}
68C-5分钟
4C保持
从1537-sgRNA靶向组中鉴定的首建突变体是：#7和#12。
>1580/1581扩增子(903bp)(SEQ ID NO:7)
GCCACCAAAGAACAGGTCCTTTCTGACACCATGTCTGTGGAAAACTCCAGAGAAGTCATTCTGAGACAGGATTCAAATGGTGACATATTAAGTGAGCCAGCTGCTTTGTCTATTCTCAGTAACATGAATAATTCTCCTTTTGACTTATGTCATGTTTTGTTATCTCTATTGGAAAAAGTTTGTAAGTTTGACATTGCTTTGAATCATAATTCTTCCCTAGCACTCAGTGTAGTACCCACACTGACTGAGTTCCTAGCAGGCTTTGGGGACTGCTGTAACCAGAGTGACACTTTGGAGGGACAACTGGTTTCTGCAGGTTGGACAGAAGAGCCGGTAGCTTTGGTTCAACGGATGCTCTTTCGAACCGTGCTGCACCTTATGTCAGTAGACGTTAGCACTGCAGAGGCAATGCCAGAAAGTCTTAGGAAAAATTTGACTGAATTGCTTAGGGCAGCTTTAAAAATTAGAGCTTGCTTGGAAAAGCAGCCTGAGCCTTTCTCCCCGAGACAAAAGAAAACACTACAGGAGGTCCAGGAGGGCTTTGTATTTTCCAAGTATCGTCACCGAGCCCTTCTACTACCTGAGCTTCTGGAAGGAGTTCTACAGCTCCTCATCTCTTGTCTTCAGAGTGCAGCTTCAAATCCCTTTTACTTCAGTCAAGCCATGGATTTAGTTCAAGAATTTATCCAGCACCAAGGATTTAATCTCTTTGAAACAGCAGTTCTTCAGATGGAATGGCTGCTTTCAAGGGACGGTGTTCCTTCAGAAGCTGCAGAACATTTGAAAGCTCTGATAAACAGTGTAATAAAAATAATGAGTACTGTGAAAAAGGTGAAATCAGAGCAACTTCATCATTCCATGTGCACAAGGAAAAGACACCGGCGTTGTGAGTATTCCCACTTC
>1578/1581扩增子(1625bp)(SEQ ID NO:8)
GGGTGAATATTGAAGTTCTGAGACACTATAAACTACTCTATGTCTTAATTTTAACATTACTAAAGATTTCTAAATGGTGAGCACAGCAACTGGATAACCCAGAGTCTCATATTTTGAAATCACAATGCAATATATAGGTTCAACTTAGGTCTACTTTCCTAACTCTTCCTTGCTATTTTCAAATCAGTTTGTATCCCCTGAGCTAATTCCACTTGGCATTGAGAATTAAAAAGATAAGTGTGGGGAGAAGTGACCCAGAGATGCAACTAGGGAAAGCAGCCTTGAAGGGAAATTATGCCAGGCCAGACTCATGCCGGTTGTGAGTCATTGCCTGTGTGTTTAACAGTTACTAACCTAAGACTTCTTTCTTGATTTCATTAGATTTTAACCTGCCACTGTCATCTGATATAATCCTGACCAAAGAAAAGAACTCAAGTTTGCAAAAATCAACTCAGGGAAAATTATATTTAGAAGGAAGTGCTCCATCTGGTCAGGTTTCTGCAAAAGTAAACCTTTTTCGAAAAATCAGGCGACAGCGTAAAAGTACCCATCGTTATTCTGTAAGAGATGCAAGAAAGACACAGCTCTCCACCTCTGACTCCGAAGGCAACTCAGATGAAAAGAGTACGGTTGTGAGTAAACACAGGAGGCTCCACGCGCTGCCACGGTTCCTGACGCAGTCTCCTAAGGAAGGCCACCTCGTAGCCAAACCTGACCCCTCTGCCACCAAAGAACAGGTCCTTTCTGACACCATGTCTGTGGAAAACTCCAGAGAAGTCATTCTGAGACAGGATTCAAATGGTGACATATTAAGTGAGCCAGCTGCTTTGTCTATTCTCAGTAACATGAATAATTCTCCTTTTGACTTATGTCATGTTTTGTTATCTCTATTGGAAAAAGTTTGTAAGTTTGACATTGCTTTGAATCATAATTCTTCCCTAGCACTCAGTGTAGTACCCACACTGACTGAGTTCCTAGCAGGCTTTGGGGACTGCTGTAACCAGAGTGACACTTTGGAGGGACAACTGGTTTCTGCAGGTTGGACAGAAGAGCCGGTAGCTTTGGTTCAACGGATGCTCTTTCGAACCGTGCTGCACCTTATGTCAGTAGACGTTAGCACTGCAGAGGCAATGCCAGAAAGTCTTAGGAAAAATTTGACTGAATTGCTTAGGGCAGCTTTAAAAATTAGAGCTTGCTTGGAAAAGCAGCCTGAGCCTTTCTCCCCGAGACAAAAGAAAACACTACAGGAGGTCCAGGAGGGCTTTGTATTTTCCAAGTATCGTCACCGAGCCCTTCTACTACCTGAGCTTCTGGAAGGAGTTCTACAGCTCCTCATCTCTTGTCTTCAGAGTGCAGCTTCAAATCCCTTTTACTTCAGTCAAGCCATGGATTTAGTTCAAGAATTTATCCAGCACCAAGGATTTAATCTCTTTGAAACAGCAGTTCTTCAGATGGAATGGCTGCTTTCAAGGGACGGTGTTCCTTCAGAAGCTGCAGAACATTTGAAAGCTCTGATAAACAGTGTAATAAAAATAATGAGTACTGTGAAAAAGGTGAAATCAGAGCAACTTCATCATTCCATGTGCACAAGGAAAAGACACCGGCGTTGTGAGTATTCCCACTTC
携带种系中的经修饰等位基因的后代进行杂交以产生纯合的经遗传修饰的基因组。所有F1交配都产生正常的产仔数，在该基因座有孟德尔分布。得到的小鼠近交品系命名为NSG Lyst(MD1)KO小鼠品系(NSG MD1小鼠)，其不表达功能性Lyst蛋白。
图1显示与NSG对照小鼠相比，来自这些NSG Lyst(MD1)敲除(KO)小鼠的人RBC的保留。虽然NSG Lyst(MD1)KO似乎比NSG小鼠更有效地保留人RBC，但在该实验中超过24小时没有统计学显著性。
图1：NSG对比NSG MD1。该图显示与NSG MD1KO(虚线)相比时NSG内的RBC存活(实线)。NSG MD1小鼠确实以比NSG更高的比率保留人。在该实验中，数据在多达24小时是非显著性的(P值>0.1)。腹腔注射。
NSG小鼠品系，其包含转基因，其中CSF1r启动子驱动疱疹胸苷激酶的表达(NSG-
MD3小鼠)
小鼠细胞通常不表达单纯疱疹病毒1胸苷激酶(HSV-1-tk)，这是疱疹病毒的衍生物。然而，通过获得在其巨噬细胞上表达细胞特异性HSV-1-tk的小鼠模型，获得了巨噬细胞的条件性消融。单独的HSV-1-tk对哺乳动物细胞不是致命的。
编码巨噬细胞集落刺激因子受体(CSF-1R)的基因排他地在髓系谱系细胞以及滋养细胞中表达。第二个内含子中的保守元件Fms-Intronic Regulatory Element(FIRE)对于该基因的巨噬细胞特异性转录是必要的，参见例如Sasmono R T et al.Blood2003；101:1155-1163。
携带小鼠Csf1r基因：RP23-30G17的BAC克隆用于将小鼠Csf1r启动子克隆到载体中，然后使用三向连接引入作为PCR扩增子提供的IRES和HSV TK基因/pA以产生表达构建体。其中HSV TK由pUC57简单中的Csfr1r驱动。该转基因的总大小为9,850bp，包括7,510bp的小鼠Csf1r 5'侧翼区和延伸到外显子3的5'末端中的序列。HSV TK基因在IRES元件的3'表达，HSV TK基因转录由TK pA序列终止。
为了产生这些小鼠，将编码在CSF1r(集落刺激因子1受体)启动子控制下的HSV-1-tk的表达构建体注射到NOD×NOD scid受精卵中。然后将转基因首建体与NSG杂交以建立NSG HSV-1-tk Tg品系。为了使NSG品系对HSV-1-tk转基因纯合，将两个品系杂交。
单纯疱疹病毒1胸苷激酶(HSV-1-tk)的细胞特异性表达提供了一种简单且高效的技术，以实现转基因小鼠中靶向细胞类型的条件性消融。通过用抗疱疹药物更昔洛韦处理表达HSV-1-tk的转基因动物来诱导消融。在由Csf1r启动子驱动的表达HSV-1-tk的小鼠组织中，预期更昔洛韦的施用导致巨噬细胞谱系内的细胞的破坏。不表达HSV-1-tk的组织对药物处理不敏感。
更昔洛韦是2'-脱氧鸟苷的合成类似物。它首先通过病毒激酶磷酸化为更昔洛韦单磷酸。随后，细胞激酶催化更昔洛韦二磷酸和更昔洛韦三磷酸的形成，其在CMV或单纯疱疹病毒(HSV)感染的细胞中以比未感染细胞高10倍的浓度存在。更昔洛韦三磷酸盐是脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)掺入DNA的竞争性抑制剂，并且相比于细胞DNA聚合酶更优先抑制病毒DNA聚合酶。此外，更昔洛韦三磷酸盐用作链延长的不良底物，从而通过第二种途径破坏病毒DNA合成。类似于疱疹病毒感染的细胞，转基因小鼠(NSG-Tg(Csf1r-HSV-1-tk)内的巨噬细胞将被更昔洛韦杀死。
然而，HSV-1-k能够磷酸化特定的核苷类似物。这些核苷单磷酸被细胞激酶磷酸化为核苷三磷酸并掺入DNA中，进而导致细胞死亡。为了诱导巨噬细胞死亡，在实验前连续四天用抗疱疹性更昔洛韦处理NSG-MD3小鼠。图2描绘了与NSG对照小鼠相比，这些HSV-1-tkTg小鼠的结果。同样，在测量的时间点，在NSG MD3小鼠中存活的人RBC的数量高于NSG对照中的数量。当原始数据通过配对t检验时，存在长达24小时的轻微显著性差异(P<0.05)。
图2：NSG对比NSG MD3。该图显示与NSG MD3(虚线)相比时NSG内的RBC存活(实线)。NSG MD3小鼠确实以比NSG更高的比率保留人。数据在多达24小时是显著性的(P值<0.05)。腹腔注射。
B6.129S-Rag1<tm1Mom>CD47KO Il2rg<tm1Wjl>/Sz(BL/6RagγMD4)。
在所有产生的小鼠中，这是BL/6背景的唯一小鼠品系。此外，这只小鼠的CD47被基因敲除。小鼠RBC表达遍及全身普遍表达的CD47。CD47与抑制性免疫受体相互作用，这种受体是一种调节信号，可调节细胞吞噬作用。从本质上讲，这种蛋白质起着“不吃我”的作用。尽管人RBC表达CD47，但它与鼠CD47不同源。这种同源性缺乏是导致人类红血细胞被识别为外来并随后清除的主要原因。图3描绘了与NSG对照小鼠相比时的这些BL/6RagγMD4小鼠。
有趣的是，人类RBC在这些BL/6RagγMD4小鼠中比在NSG对照中被更快地清除。
图3：NSG对比BL/6RagγMD4。该图显示与BL/6RagγMD4(虚线)相比时NSG内的RBC存活(实线)。BL/6RagγMD4KO小鼠不以比NSG更高的比率保留人。数据是显著性的(P>0.01)。腹腔注射。
NOD.Cg-Prkdc<scid>CD47KO Il2rg<tm1Wjl>Tg(hMD2)Sz/Sz(NSGMD2)。
与BL/6RagγMD4小鼠相似，NSG MD2小鼠具有编码敲除的CD47的鼠版本的基因。除了这种遗传修饰之外，CD47的人类版本已被敲入它们各自的基因组中。
为了产生这些小鼠，CD47敲除等位基因(参见例如Oldenborg et al.,Lethalautoimmune hemolytic anemia in CD47-deficient nonobese diabetic(NOD)mice,Blood,2002May 15；99(10):3500-4)被回交到NSG背景以产生NSG CD47敲除小鼠。将编码人CD47的细菌人工染色体BAC RP11-121A9注射到NOD x NOD scid受精卵中。32只潜在首建者中的一只转基因成员出现。该首建者与NSG杂交以建立NSG人CD47Tg品系。为了使NSG品系对小鼠CD47KO和人CD47转基因纯合，将两个品系杂交并将所有CD47等位基因固定成纯合子。
图4描绘了与NSG对照小鼠比较时的这些NSG MD2小鼠。
在使用小鼠NSG MD2品系的多个实验中，获得了显著性数据，将人CD47转基因引入NSG小鼠中有效地改善了RBC存活。正如可以在图4中，虽然在NSG小鼠中人RBC生存只持续刚刚超过40小时，但在NSG MD2小鼠中人RBC存活持续近100小时(P值：0.009)。
图4：NSG对比NSG MD2。该图显示与NSG MD2小鼠(虚线)比较时NSG内的RBC存活(实线)。NSG MD2小鼠确实以比NSG更高的比率保留了人。数据是显著性的(P值<0.001)。腹腔注射。
图5显示了比较多种不同的经遗传修饰的免疫缺陷品系中的人RBC存活的结果。可以看出，数据显示在NSG MD1和MD2小鼠中循环的人RBC长达96小时。
图5：NSG对比NSG MD1对比NSG MD2对比BL/6RagγMD4。该比较显示一次测试多个品系。腹腔注射。
本说明书中提及的任何专利或出版物通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物被具体和单独地指出通过引用并入。
本文所述的组合物和方法目前是优选实施方式的代表，是示例性的，并且不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员将想到其中的变化和其他用途。在不脱离权利要求所述的本发明的范围的情况下，可以进行这些改变和其他用途。
Claims (17)
1.一种制备经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的方法，所述方法包括向所述小鼠的基因组中引入遗传修饰，其中所述遗传修饰使所述小鼠缺乏巨噬细胞和/或巨噬细胞抗人类红血细胞活性，从而在施用于所述小鼠时人类红血细胞的存活得以延长，所述遗传修饰是溶酶体运输调节因子基因的突变，使得所述小鼠不表达功能性溶酶体运输调节蛋白，其中所述小鼠是Lystnull免疫缺陷型小鼠。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述小鼠是NRG，NSG或NOG小鼠。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述小鼠是NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Lystem1Mvw/Sz(NSG Lyst敲除)小鼠。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的基因组包含Lyst基因的外显子5的25bp序列缺失：GAGCCGGTAGCTTTGGTTCAACGGA(SEQ ID NO:1)。
5.根据权利要求1所述的方法，还包括将人类红血细胞引入所述经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠的血液系统中。
6.根据权利要求1所述的方法，还包括将人类造血细胞引入所述经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠中。
7.根据权利要求1所述的方法，其中人类红血细胞在所述小鼠中比在其基因组不包含所述遗传修饰的相同类型的免疫缺陷型小鼠中存活更久。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述人类红血细胞被感染剂感染。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述感染剂是疟原虫寄生虫。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述感染剂是恶性疟原虫(P.falciparum)。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述感染剂是卵形疟原虫(P.ovale)，间日疟原虫(P.vivax)，或三日疟原虫(P.malariae)。
12.根据权利要求5所述的方法，其还包括施用能够感染人类红血细胞的感染剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述感染剂是疟原虫寄生虫。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述感染剂是恶性疟原虫(P.falciparum)。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述感染剂是卵形疟原虫(P.ovale)，间日疟原虫(P.vivax)，或三日疟原虫(P.malariae)。
16.根据权利要求5所述的方法，其中所述人类红血细胞来自个体人类或人类个体的群体，其中所述个体人类或人类个体的群体具有镰状细胞贫血症。
17.一种测定推定的治疗剂或推定的治疗处理的效果的方法，其包括：
将一定量的所述推定的治疗剂或所述推定的治疗处理施用于权利要求5或8-16中任一项中定义的包含人类红血细胞的经遗传修饰的免疫缺陷型小鼠；和测量所述推定的治疗剂的效果；
其中所述方法不是用于治疗目的和诊断目的。
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