CN109821029A

CN109821029A - Zdhhc21基因在制备白血病诱导分化治疗药物中的应用

Info

Publication number: CN109821029A
Application number: CN201910277098.8A
Authority: CN
Inventors: 应美丹; 邵雪晶; 何俏军; 杨波; 曹戟; 朱虹
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-04-08
Filing date: 2019-04-08
Publication date: 2019-05-31
Anticipated expiration: 2039-04-08
Also published as: CN109821029B

Abstract

本发明提供一种ZDHHC21基因在制备白血病诱导分化治疗药物中的应用，以及靶向DHHC21基因的多肽、小分子抑制剂以及干扰siRNAs在制备白血病诱导分化剂中的应用。研究表明在采用RNA干扰技术降低ZDHHC21后，对白血病HL60和NB4细胞的增殖有显著抑制作用，细胞表面分化特异性抗原CD11b的表达明显升高、细胞的NBT还原能力增强以及细胞核质比减少，细胞核形态向马蹄形或半月形转变。通过下调ZDHHC21可有效诱导人白血病细胞的分化，为目前白血病的治疗药物的开发提供了新的方向，为诱导分化治疗白血病提供了新的治疗靶点，为白血病治疗及提高疗效、改善耐药开辟了新的研究领域。

Description

ZDHHC21基因在制备白血病诱导分化治疗药物中的应用

技术领域

本发明属医药生物技术领域，具体涉及一种ZDHHC21基因在制备白血病诱导分化治疗药物中的应用。

背景技术

白血病是骨髓祖细胞的克隆性疾病，其特征在于临床和生物学的异质性。经过数十年的研究，虽然研究者对于急性髓性白血病的病理学以及基因组学上的理解有了长足的进步，但因其复发性和难治性，白血病的治疗仍然是当今肿瘤治疗学中最严峻的挑战之一。虽然针对白血病分化障碍的重要特征，科学家们提出了诱导分化疗法，全反式维甲酸也在APL亚型白血病上取得了巨大的成功，但是目前临床诱导分化疗法只局限在APL亚型上，且可选择的药物品种极少。因此，寻找AML分化治疗的新型潜在靶标和干预手段是目前较为迫切的需求。

ZDHHC蛋白作为棕榈酰基转移酶，催化棕榈酸与底物蛋白的半胱氨酸残基形成硫脂键。ZDHHC蛋白与多种疾病密切相关，包括肿瘤和神经系统疾病，提示其具有非常重要的生物学功能。许多研究表明ZDHHC蛋白在特定的肿瘤中发挥促进肿瘤发生发展或是抑制肿瘤的作用。ZDHHC2在乳腺癌、肺癌和前列腺癌中广泛缺失；ZDHHC3在肾透明细胞瘤(51例/448例)以及宫颈鳞状细胞瘤(4例/191例)存在部分缺失；ZDHHC13自发截断性缺失导致小鼠患侵入性皮肤乳头状瘤的风险增加等。此外，8～26％的前列腺癌病例中，H-Ras和N-Ras的棕榈酰转移酶ZDHHC9存在基因异常扩增；在14～17％肺腺癌、10％膀胱癌、19％前列腺癌、8％头颈癌和15％胰腺癌中可以观察到ZDHHC11的异常扩增。这些研究均提示ZDHHC蛋白对肿瘤的起始和发展具有重要调控作用，但是ZDHHC21基因与白血病细胞分化之间的关系尚没有文献报道，有待进一步研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种ZDHHC21基因在制备白血病诱导分化治疗药物中的应用，所述的ZDHHC21基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，以及靶向ZDHHC21基因的多肽在制备白血病诱导分化治疗药物中的应用，所述的靶向ZDHHC21基因的多肽序列如SEQ ID NO:2所示；以及靶向ZDHHC21的小分子抑制剂在制备白血病诱导分化治疗药物中的应用；以及靶向ZDHHC21基因的干扰siRNAs在制备白血病诱导分化剂中的应用。

所述的干扰siRNAs的核苷酸序列分别为：

SEQ ID NO:3：5’GCAGCCTTTATGGGCATTACT 3’(﹟1)

SEQ ID NO:4：5’GTTGGAATAACTGGACTCTTT 3’(﹟2)

SEQ ID NO:5：5’GAAAGGGAGTTCTGGGAATTA 3’(﹟3)

以上所述药物的制剂形式为液体制剂或固体制剂。

本发明通过应用针对ZDHHC21基因的siRNAs达到下调ZDHHC21的作用，从而研究ZDHHC21在诱导白血病细胞分化中的作用。3个针对ZDHHC21基因的siRNAs(SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:5)均能抑制ZDHHC21的表达，进而诱导白血病细胞发生分化。具体表现为对白血病HL60和NB4细胞的增殖有抑制作用，细胞表面分化特异性抗原CD11b的表达明显升高、细胞的NBT还原能力增强以及细胞核质比减少，细胞核形态向马蹄形或半月形转变。

本发明采用RNA干扰技术降低ZDHHC21后，白血病细胞增殖受到显著的抑制，并且发生非常明显的分化。因此，本发明不仅公开了ZDHHC21基因的应用，而且为诱导分化治疗白血病提供了新的治疗靶点。

本发明利用siRNA干扰技术，通过降低ZDHHC21的表达可以直接诱导不同类型的白血病细胞(HL60和NB4)发生分化。因此首次提出ZDHHC21基因是白血病诱导分化治疗的关键基因，ZDHHC21的siRNAs分子可以作为白血病诱导分化剂，在白血病的治疗中发挥重要作用。

本发明提供ZDHHC21基因在制备诱导分化治疗白血病药物中的用途，特别是ZDHHC21siRNA在制备诱导分化治疗人白血病药物中的用途。下调ZDHHC21可以有效诱导人白血病细胞的分化，为目前白血病的治疗药物的开发提供了新的方向，一定程度上解决临床上白血病诱导分化药物的可用药物少、机制单一等尴尬局面。总之，下调ZDHHC21可以诱导白血病细胞分化为白血病治疗开辟了新的研究领域，为制备新的诱导分化白血病药物，提高白血病患者的疗效，改善耐药及相关预后情况提了可能性。

附图说明

图1是3个针对ZDHHC21基因的siRNA(SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:5)均具有显著下调ZDHHC21的mRNA表达的作用。

图2是将针对ZDHHC21基因的siRNA(SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5)应用于白血病HL60和NB4细胞，白血病细胞的增殖受到明显的抑制。

图3是将针对ZDHHC21基因的siRNA(SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5)应用于白血病细胞HL60和NB4，白血病细胞的表面分化抗原CD11b的表达水平明显提高。

图4是将针对ZDHHC21基因的siRNA(SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5)应用于白血病细胞HL60和NB4，白血病细胞的NBT还原能力明显增强。

图5是将针对ZDHHC21基因的siRNA(SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5)应用于白血病细胞HL60和NB4，白血病细胞的核形态发生明显的变化。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明所述的ZDHHC21基因的应用，可参考常规的药物配置方法和实际开发。药物剂型和生物制剂为医学上认可的任何一种剂型，例如为粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。

实施例1：

将靶向不同序列的3个ZDHHC21siRNA(SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:5)以及阴性对照nc，通过脂质体转染法将其导入HL60细胞中(购自中国科学院细胞库)，72小时后收取细胞，并用Trizol裂解液裂解细胞提取mRNA，然后用荧光定量RT-PCR进行mRNA水平检测。结果发现，以上所有的ZDHHC21siRNA均能有效的抑制ZDHHC21的mRNA表达。结果参见图1。

实施例2：

将2个靶向不同序列的ZDHHC21siRNA(如SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5)以及阴性对照nc，通过电转法导入白血病HL60和NB4细胞(美国南加州大学Lingtao Wu博士)中，在处理D3，D5和D7后，采用血细胞计数板计数。结果显示，ZDHHC21siRNA均能显著地抑制白血病HL60和NB4细胞的增殖。结果参见图2。

实施例3：

将2个靶向不同序列的ZDHHC21siRNA(如SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5)以及阴性对照nc，通过电转法导入白血病HL60和NB4细胞中，在处理后D7天收集细胞，检测细胞表面分化特异性抗原CD11b的表达。细胞用冰PBS漂洗3次后用3％BSA在室温下封闭30min，然后用CD11b-PE标记的单克隆抗体避光孵育45min，经PBS洗涤后用流式细胞仪进行检测，并用CellQuestPro软件分析。结果发现ZDHHC21siRNA可以明显促进白血病细胞表面特异性抗原CD11b表达。结果参见图3。

实施例4：

将2个靶向不同序列的ZDHHC21siRNA(如SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5)以及阴性对照nc，通过电转法导入白血病HL60和NB4细胞中，在处理后D7天收集细胞，检测细胞对NBT的还原能力。细胞采用冰PBS漂洗3次后用200ul PBS重悬，而后加入200ul NBT反应液(1ml PBS中含有2mg NBT与2ug TPA)，避光37℃反应40min。之后加入PBS 1ml终止，离心后去上清，采用甲醇固定后涂于24孔板中，显微镜下观察拍照。结果发现ZDHHC21siRNA可以明显促进白血病细胞的NBT还原能力。结果参见图4。

实施例5：

将2个靶向不同序列的ZDHHC21siRNA(如SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5)以及阴性对照nc，通过电转法导入白血病HL60和NB4细胞中，在处理后D7天收集细胞，采用瑞氏-吉木萨染色法观察细胞核形态变化。ZDHHC21siRNA作用后，细胞核质比明显减小，并且细胞核形态从原先的圆形或椭圆形向马蹄形或半月形转变。结果参见图5。

序列表

<110> 浙江大学

<120> ZDHHC21基因在制备白血病诱导分化治疗药物中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 798

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

atgggtctcc ggattcactt tgttgttgac ccacatggtt ggtgctgcat gggtttgatt 60

gtctttgttt ggttatacaa tattgtttta attcccaaaa ttgtcctctt tcctcactat 120

gaagaaggac atattccagg catattaata ataatattct atggcatttc catattctgt 180

ctggttgcct tagtgagggc ctccataact gatccaggaa gactccctga gaaccccaag 240

atcccacatg gagaaaggga gttctgggaa ttatgtaaca agtgtaattt gatgagacca 300

aagcgttccc atcactgtag ccgctgcggc cactgtgtga ggagaatgga tcatcactgt 360

ccatggatta acaattgtgt tggtgaagat aatcattggc tctttctgca gttgtgtttc 420

tacactgaac ttcttacttg ctacgcactg atgttttctt tctgccacta ttactatttt 480

cttccactaa aaaagcgtaa tttggacctc tttgttttta gacatgaatt ggccataatg 540

agactagcag cctttatggg cattactatg ttagttggaa taactggact cttttacact 600

caactaattg gcatcatcac agatacaaca tctattgaaa agatgtcaaa ctgttgtgaa 660

gatatatcga ggccccgaaa gccatggcag cagaccttct cagaagtttt tggcactcgt 720

tggaagatcc tgtggttcat tcctttcagg cagaggcaac cactgcgagt tccctaccac 780

tttgccaatc atgtctaa 798

<210> 2

<211> 265

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Gly Leu Arg Ile His Phe Val Val Asp Pro His Gly Trp Cys Cys

1 5 10 15

Met Gly Leu Ile Val Phe Val Trp Leu Tyr Asn Ile Val Leu Ile Pro

20 25 30

Lys Ile Val Leu Phe Pro His Tyr Glu Glu Gly His Ile Pro Gly Ile

35 40 45

Leu Ile Ile Ile Phe Tyr Gly Ile Ser Ile Phe Cys Leu Val Ala Leu

50 55 60

Val Arg Ala Ser Ile Thr Asp Pro Gly Arg Leu Pro Glu Asn Pro Lys

65 70 75 80

Ile Pro His Gly Glu Arg Glu Phe Trp Glu Leu Cys Asn Lys Cys Asn

85 90 95

Leu Met Arg Pro Lys Arg Ser His His Cys Ser Arg Cys Gly His Cys

100 105 110

Val Arg Arg Met Asp His His Cys Pro Trp Ile Asn Asn Cys Val Gly

115 120 125

Glu Asp Asn His Trp Leu Phe Leu Gln Leu Cys Phe Tyr Thr Glu Leu

130 135 140

Leu Thr Cys Tyr Ala Leu Met Phe Ser Phe Cys His Tyr Tyr Tyr Phe

145 150 155 160

Leu Pro Leu Lys Lys Arg Asn Leu Asp Leu Phe Val Phe Arg His Glu

165 170 175

Leu Ala Ile Met Arg Leu Ala Ala Phe Met Gly Ile Thr Met Leu Val

180 185 190

Gly Ile Thr Gly Leu Phe Tyr Thr Gln Leu Ile Gly Ile Ile Thr Asp

195 200 205

Thr Thr Ser Ile Glu Lys Met Ser Asn Cys Cys Glu Asp Ile Ser Arg

210 215 220

Pro Arg Lys Pro Trp Gln Gln Thr Phe Ser Glu Val Phe Gly Thr Arg

225 230 235 240

Trp Lys Ile Leu Trp Phe Ile Pro Phe Arg Gln Arg Gln Pro Leu Arg

245 250 255

Val Pro Tyr His Phe Ala Asn His Val

260 265

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknow)

<400> 3

gcagccttta tgggcattac t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknow)

<400> 4

gttggaataa ctggactctt t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknow)

<400> 5

gaaagggagt tctgggaatt a 21

Claims

1.一种ZDHHC21基因在制备白血病诱导分化治疗药物中的应用，其特征在于，所述ZDHHC21基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种靶向ZDHHC21基因的多肽在制备白血病诱导分化治疗药物中的应用，其特征在于，所述的靶向ZDHHC21基因的多肽序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种靶向ZDHHC21的小分子抑制剂在制备白血病诱导分化治疗药物中的应用。

4.一种靶向ZDHHC21基因的干扰siRNAs在制备白血病诱导分化剂中的应用，其特征在于，所述的干扰siRNAs的核苷酸序列分别为：

SEQ ID NO:3：5’GCAGCCTTTATGGGCATTACT3’

SEQ ID NO:4：5’GTTGGAATAACTGGACTCTTT3’

SEQ ID NO:5：5’GAAAGGGAGTTCTGGGAATTA 3’。

5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述药物的制剂形式为液体制剂或固体制剂。