CN109797152A - 肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术和医学领域,公开了一种肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染后人宿主miRNAs表达谱,利用筛查与肾移植术后早期发生人巨细胞病毒(hCMV)感染相关近期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱成功筛选得到肾移植术后早期hCMV感染后显著异性差异表达的宿主miRNAs共456个。通过生物信息学分析、miRNAs靶标基因预测及蛋白功能分析等。本发明首次发现宿主hsa‑miR‑495‑3p、hsa‑miR‑532‑3p和hsa‑miR‑1224‑5p是调控人细胞Wnt/β‑catenin信号通路的核心miRNAs簇;该发现为该疾病的诊断或防治提供了新的靶点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域,尤其涉及一种肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱。
背景技术
目前,业内常用的现有技术是这样的:
通过RT-PCR等技术验证某一种或几种已知的病毒或宿主候选miRNAs对其靶标蛋白或信号通路的影响;2.通过芯片或测序技术发现新的病毒或宿主候选miRNAs对其靶标蛋白或信号通路的影响。其中第1种技术是目前最常用的技术,但第2种技术较少使用。通过测序技术绘制CMV病毒感染宿主细胞后宿主细胞miRNAs表达谱改变为本发明特有的。
器官移植术后受体感染间质性肺炎是造成手术近期死亡的最主要原因之一,严重影响患者生存率。间质性肺炎多由病毒感染所致,其中以巨细胞病毒(HumanCytomegalovirus,hCMV)感染最为熟知。其中,肾移植术后的hCMV感染可以分为术后早期(3-6个月)感染(early-onset)和术后远期(大于6个月)感染(late-onset),其中以术后早期感染最为常见。由于术后早期剂量的免疫制剂的使用,移植受者极易发生hCMV机会感染。据统计,hCMV病在移植术后三个月内的发生率约为55%。大量且持续的研究表明,经典的Wnt/β-catenin信号通路是hCMV感染中非常重要的信号通路之一。阐明Wnt/β-catenin信号通路在hCMV感染中的分子机制,对于hCMV感染的早期预警和干预靶点的选择具有十分重要的研究意义。
近年来的研究表明,病毒自身也可以编码多种非编码RNAs(no-coding RNAs,ncRNAs),包括microRNAs和长非编码RNAs(long ncRNAs,lncRNAs)等,由病毒编码产生ncRNAs,对病毒的活化、复制和感染十分重要。Zhang等在2016年2月发表于Cell Research的一项最新的研究数据显示,埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)编码产生的miR-VP-3p在病毒感染初期就稳定表达,通过检测人体血清中miR-VP-3p的含量可以判断EBOV的感染情况。该研究说明,MicroRNAs可以作为病毒感染早期诊断的标志物。HCMV至少可以编码14种microRNAs,其中,HCMV-miR-UL22A-5p、hCMV-miR-UL112等已经证明能显著影响宿主免疫系统相关蛋白的表达水平。而hCMV感染中宿主细胞的miRNAs参与疾病的分子机制缺乏全面系统的研究,且均集中体外细胞学研究,尚缺乏体内研究证据支持。此外,miRNAs参与肾移植术后早期hCMV感染的具体分子机制尚待阐明。
综上所述,现有技术存在的问题是:
通过对某一个或某几个疾病发生相关的miRNAs的研究,无法系统地阐明病毒对宿主细胞转录组,尤其是非编码RNAs组的影响,更无法进一步全面地阐述非编码RNAs如miRNAs在病毒感染宿主细胞中作用机制。另一方面,目前已有的研究技术均集中体外细胞学研究,尚缺乏体内研究证据支持。
解决上述技术问题的难度:如需要解决上述问题,需要通过对疾病发生与健康群体样本进行整个非编码RNAs组的测序,才能全面绘制CMV病毒感染后宿主miRNAs的表达谱。
解决上述技术问题的意义:解决上述问题,有利于我们全面了解CMV病毒感染后宿主miRNAs的表达谱的改变;2.通过对表达谱的分析,我们进一步发现hsa-miR-495-3p/hsa-miR-532-3p/hsa-miR-1224-5p簇的表达显著影响宿主细胞Wnt/β-catenin信号通路中Wnts,APC,PKC和NFAT等多个核心蛋白的表达。阐明Wnt/β-catenin信号通路在hCMV感染中的分子机制,对于hCMV感染的早期预警和干预靶点的选择具有十分重要的研究意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明提供了肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱,为术后3-6个月。
本发明是这样实现的,提供了一种肾移植术后早期(术后3-6个月)发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱,并首次发现发生人巨细胞病毒感染显著影响人宿主miRNAs hsa-miR-495-3p、hsa-miR-532-3p和hsa-miR-1224-5p的表达。Hsa-miR-495-3p、hsa-miR-532-3p和hsa-miR-1224-5p是人机体内源表达的非编码小RNAs,其具体的序列分别为:aaacaaacauggugcacuucuu(hsa-miR-495-3p);ccucccacacccaaggcuugca(hsa-miR-532-3p)和gugaggacucgggaggugg(hsa-miR-1224-5p)。
本发明的另一目的在于提供一种肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱的绘制方法包括:
所述近肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱的绘制方法包括:
步骤一:筛选得到肾移植术后早期hCMV感染后显著异性差异表达的宿主miRNAs;
步骤二:生物信息学分析;
步骤三:miRNAs靶标基因预测及蛋白功能分析;
步骤四:得到调控细胞Wnt/β-catenin信号通路的hsa-miR-495-3p、hsa-miR-532-3p和hsa-miR-1224-5p核心miRNAs簇。
进一步,所述近期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱的制备方法进一步包括:
根据测序结果获得所有非编码RNA片段序列与基因组序列进行对比,并进行生物信息学分析,绘制hCMV感染时期及正常情况下宿主miRNAs表达谱;
对比病例组和对照组样本中病毒microRNAs表达谱,确定表达差异显著的宿主miRNAs;
对显著差异性表达的宿主miRNAs及其所预测的靶标基因(Wnts,APC,PKC和NFAT等)进行功能学分类KEGG分析,hsa-miR-495-3p/hsa-miR-532-3p/hsa-miR-1224-5p簇的表达显著影响宿主细胞Wnt/β-catenin信号通路中Wnts,APC,PKC和NFAT多个核心蛋白的表达。
本发明的另一目的在于提供一种包含所述肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱的疾病诊断靶点。
本发明的另一目的在于提供一种包含所述肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱的疾病防治靶点包含所述肾移植术后早期(3-6个月)发生人巨细胞病毒感染疾病的诊断靶点。
综上所述,本发明的优点及积极效果为:
本发明对肾移植术后早期发生人巨细胞病毒(hCMV)感染的样本进行RNA测序,并与正常样本对照,首次描绘了hCMV对人宿主细胞miRNAs组改变的表达谱;为人们认知hCMV对人宿主细胞miRNAs的影响提供了理论依据;
通过生物信息学分析,成功获得了肾移植术后早期hCMV感染后显著异性差异表达的宿主miRNAs共456个,(176个下调miRNAs,280个上调miRNAs);为人们进一步研究hCMV感染人宿主细胞的分子机制提供了可研究的靶点;
本发明通过生物信息学分析、miRNAs靶标基因预测及蛋白功能分析等,首次发现宿主hsa-miR-495-3p、hsa-miR-532-3p和hsa-miR-1224-5p是调控人细胞Wnt/β-catenin信号通路的核心miRNAs簇。该发现为该疾病的诊断或防治提供了新的靶点。
附图说明
图1是本发明实施例提供的肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱的绘制方法流程图。
图2是本发明实施例提供的肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱的绘制的工作原理流程图。
图3是本发明实施例提供的肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱绘制的技术路线图。
图4是本发明实施例提供的本发收集的2016.01-2017.12期间肾移植术后3个月内确定感染hCMV(hCMV DNA病毒载量>103拷贝)的16例病人(病例组)及肾移植术后3个月内未感染hCMV(hCMV DNA病毒载量<103拷贝)的5例病人(对照组)的外周血样本,通过第二代全基因组测序技术,绘制肾移植术后早期hCMV感染病人的宿主miRNAs表达谱图。
图5是本发明实施例提供的对显著差异性表达的宿主miRNAs及其靶标基因进行功能学分类KEGG分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
hCMV已被证实可以通过自身编码的miRNAs和改变宿主细胞的miRNAs表达对宿主细胞进行调控,引起hCMV增殖、感染和疾病的发生。其中,hCMV感染中宿主细胞的miRNAs参与疾病的分子机制尚缺乏全面系统的研究,且均集中体外细胞学研究,尚缺乏体内研究证据支持。
为解决上述问题,下面结合具体方案对本发明作详细描述。
本发明实施例提供的肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱,首次发现发生人巨细胞病毒感染显著影响人宿主miRNAs hsa-miR-495-3p、hsa-miR-532-3p和hsa-miR-1224-5p的表达,该hsa-miR-495-3p/hsa-miR-532-3p/hsa-miR-1224-5p簇的表达显著影响宿主细胞Wnt/β-catenin信号通路;Hsa-miR-495-3p、hsa-miR-532-3p和hsa-miR-1224-5p是人机体内源表达的非编码小RNAs,其具体的序列分别为:aaacaaacauggugcacuucuu SEQ ID NO:1(hsa-miR-495-3p);ccucccacacccaaggcuugca(hsa-miR-532-3p)SEQ ID NO:2和gugaggacucgggaggugg SEQ ID NO:3(hsa-miR-1224-5p)。
该发现为该疾病的诊断或防治提供了新的靶点。
如图1所示,本发明实施例提供的肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱的绘制方法包括:
S101:筛选得到肾移植术后早期hCMV感染后显著异性差异表达的宿主miRNAs。
S102:生物信息学分析。
S103:miRNAs靶标基因预测及蛋白功能分析。
S104:得到调控人细胞Wnt/β-catenin信号通路的核心miRNAs簇。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例:
通过病例-对照研究,绘制肾移植术后早期hCMV感染病人的宿主miRNAs表达谱,并确定差异性表达的miRNAs;
hCMV已被证实可以通过自身编码的miRNAs和改变宿主细胞的miRNAs表达对宿主细胞进行调控,引起hCMV增殖、感染和疾病的发生。其中,hCMV感染中宿主细胞的miRNAs参与疾病的分子机制尚缺乏全面系统的研究,且均集中体外细胞学研究,尚缺乏体内研究证据支持。
本发明收集了2016.01-2017.12期间肾移植术后3个月内确定感染hCMV(hCMV DNA病毒载量>103拷贝)的16例病人(病例组)及肾移植术后3个月内未感染hCMV(hCMV DNA病毒载量<103拷贝)的5例病人(对照组)的外周血样本,通过第二代全基因组测序技术,绘制肾移植术后早期hCMV感染病人的宿主miRNAs表达谱,并确定差异性表达的miRNAs。
如图2所示,本实施例的具体实施方式为:
S201:测序结果获得了所有非编码RNA片段序列与人类基因组序列进行对比,并进行生物信息学分析,绘制hCMV感染时期及正常情况下宿主miRNAs表达谱。
S202:对比病例组和对照组样本中病毒microRNAs表达谱,确定表达差异显著(|log2Ratio|)≥4,病例和对照组序列读数≥1000,Q值<0.0001)的宿主miRNAs共51个。
S203:对显著差异性表达的宿主miRNAs及其靶标基因进行功能学分类KEGG分析,首次确定宿主hsa-miR-495-3p、hsa-miR-532-3p和hsa-miR-1224-5p可能是调控人细胞Wnt/β-catenin信号通路的核心miRNAs簇。
图3是本发明实施例提供的近期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达芯片制备技术路线图。
下面结合具体实验对本发明作进一步描述。
图4本发明收集了2016.01-2017.12期间肾移植术后3个月内确定感染hCMV(hCMVDNA病毒载量>103拷贝)的16例病人(病例组)及肾移植术后3个月内未感染hCMV(hCMV DNA病毒载量<103拷贝)的5例病人(对照组)的外周血样本,通过第二代全基因组测序技术,绘制肾移植术后早期hCMV感染病人的宿主miRNAs表达谱,对比病例组和对照组样本中病毒microRNAs表达谱,确定表达差异显著(|log2Ratio|)≥4,病例和对照组序列读数≥1000,Q值<0.0001)的宿主miRNAs共51个。
图5对显著差异性表达的宿主miRNAs及其靶标基因进行功能学分类KEGG分析,首次确定宿主hsa-miR-495-3p、hsa-miR-532-3p和hsa-miR-1224-5p可能是调控人细胞Wnt/β-catenin信号通路的核心miRNAs簇。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学同济医学院附属同济医院
<120> 肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaacaaacau ggugcacuuc uu 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccucccacac ccaaggcuug ca 22
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gugaggacuc gggaggugg 19
Claims (5)
1.一种肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱,其特征在于,所述肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱包括:分析发生人巨细胞病毒感染显著影响人宿主miRNAs hsa-miR-495-3p、hsa-miR-532-3p和hsa-miR-1224-5p的表达;
hsa-miR-495-3p/hsa-miR-532-3p/hsa-miR-1224-5p簇的表达显著影响宿主细胞Wnt/β-catenin信号通路;Hsa-miR-495-3p、hsa-miR-532-3p和hsa-miR-1224-5p为人机体内源表达的非编码小RNAs;
hsa-miR-495-3序列为aaacaaacauggugcacuucuu;
hsa-miR-532-3p序列为ccucccacacccaaggcuugca;
hsa-miR-1224-5p序列为gugaggacucgggaggugg。
2.一种如权利要求1所述肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱的绘制方法,其特征在于,所述近肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱的绘制方法包括:
步骤一:筛选得到肾移植术后早期hCMV感染后显著异性差异表达的宿主miRNAs;
步骤二:生物信息学分析;
步骤三:miRNAs靶标基因预测及蛋白功能分析;
步骤四:得到调控细胞Wnt/β-catenin信号通路的hsa-miR-495-3p、hsa-miR-532-3p和hsa-miR-1224-5p核心miRNAs簇。
3.如权利要求2所述近肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱的绘制方法,其特征在于,所述近期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱的制备方法进一步包括:
根据测序结果获得所有非编码RNA片段序列与基因组序列进行对比,并进行生物信息学分析,绘制hCMV感染时期及正常情况下宿主miRNAs表达谱;
对比病例组和对照组样本中病毒microRNAs表达谱,确定表达差异显著的宿主miRNAs;
对显著差异性表达的宿主miRNAs及其所预测的靶标基因进行功能学分类KEGG分析,hsa-miR-495-3p/hsa-miR-532-3p/hsa-miR-1224-5p簇的表达显著影响宿主细胞Wnt/β-catenin信号通路中Wnts,APC,PKC和NFAT多个核心蛋白的表达。
4.一种包含如权利要求1所述肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱的疾病诊断靶点。
5.一种包含如权利要求1所述肾移植术后早期发生人巨细胞病毒感染相关宿主miRNAs表达谱的疾病防治靶点。
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Citations (3)
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---|---|---|---|---|
US20110151430A1 (en) * | 2007-09-06 | 2011-06-23 | University Of Massachusetts | VIRUS-SPECIFIC miRNA SIGNATURES FOR DIAGNOSIS AND THERAPEUTIC TREATMENT OF VIRAL INFECTION |
CN105567805A (zh) * | 2015-12-07 | 2016-05-11 | 中山大学附属第一医院 | 一种检测器官移植患者巨细胞病毒感染的试剂盒 |
CN105567804A (zh) * | 2015-12-07 | 2016-05-11 | 中山大学附属第一医院 | Nr_073415.2在检测器官移植患者巨细胞病毒感染中的应用及试剂盒 |
-
2019
- 2019-02-22 CN CN201910133601.2A patent/CN109797152A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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US20110151430A1 (en) * | 2007-09-06 | 2011-06-23 | University Of Massachusetts | VIRUS-SPECIFIC miRNA SIGNATURES FOR DIAGNOSIS AND THERAPEUTIC TREATMENT OF VIRAL INFECTION |
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Title |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN111733157A (zh) * | 2020-07-01 | 2020-10-02 | 上海嘉慷生物工程有限公司 | 一种靶向病毒的特异性miRNA的获得方法 |
CN111733157B (zh) * | 2020-07-01 | 2023-12-19 | 上海嘉慷生物工程有限公司 | 一种靶向病毒的特异性miRNA的获得方法 |
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