CN109771413A - 一种来源于蔬果和中草药的单体木犀草素的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种来源于蔬果和中草药的单体木犀草素的应用，具体来说是来源于天然蔬果和中草药的木犀草素对巨噬细胞极化模式的影响和机制及在抗炎方面的新用途。巨噬细胞的不同极化模式在肿瘤、心血管、肾病及炎症等的发展和转归中具有重要意义。以细菌内毒素脂多糖和干扰素‑γ刺激细胞诱导M1型极化；IL‑4刺激诱导M2型极化，木犀草素处理后，观察M1/M2型极化的巨噬细胞形态的变化及其标志分子的表达；免疫印迹技术检测蛋白通路的表达。本发明发现木犀草素能下调M1型致炎因子、上调M2型抗炎因子；同时蛋白p‑STAT3水平下调而p‑STAT6上调，即木犀草素通过蛋白通路STATs调节M1/M2巨噬细胞的极化，从而发挥抗炎作用。
Description
技术领域
本发明属于天然可食用植物来源的木犀草素的应用，确切的说是木犀草素调节小鼠巨噬细胞的极化及在抗炎方面的应用，属于生物医药领域。
背景技术
严重的病原感染能导致脓毒症，该病病情危险，发展迅猛，严重者能发展为多脏器功能衰竭甚至危及生命，此过程往往伴随重度炎症反应的发生。炎症是机体针对病原体感染的一种免疫防御性反应，有利于清除病原菌，控制感染，但是过度的炎症反应又会造成病理损伤。作为抗感染的炎症细胞的活化分泌的炎症因子还可激活静止的肿瘤细胞生长并衍变成恶性瘤。因此，研究炎症的精确调控至关重要。
巨噬细胞是触发炎症反应的重要免疫细胞，根据所处微环境的不同，可被诱导分化为致炎型(M1)巨噬细胞或抗炎型(M2)巨噬细胞。在脂蛋白多糖(LPS)、IFN-γ等因子的刺激下，巨噬细胞活化形成M1型，分泌诱导型NO合成酶(iNOS)、白介素1(IL-1)β、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等致炎因子，清除病原菌，但过量的致炎因子也加剧了炎症反应引起组织损伤；在IL-4或IL-l3等诱导下激活成M2型，分泌抑炎因子如精氨酸酶1(Arg1)、上调清道夫受体CD163和甘露糖受体CD206的表达，抑制炎症反应，促进组织再生等。巨噬细胞的不同极化方式，决定了其在炎症的发生发展和维持机体稳态等方面所发挥的重要作用。调控脓毒症时巨噬细胞的极化，进而控制疾病的转归具有十分重要的意义。
木犀草素(Luteolin,lut,L)属于天然黄酮类化合物，主要存在于芹菜，青椒，胡萝卜，苹果皮，花生壳，菊花，金银花，紫苏叶等蔬果和中草药中，具有很强的生物活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗感染、免疫调理、保护心脏等。文献(Wang SX,Cao M,Xu SH,Zhang JM,WangZG,Mao XD,Liu C,Yao XM.Effect of luteolin on inflammatory responses inRAW264.7macrophages activated with LPS and IFN-γ[J].J Funct Foods,2017,32:123-130.)报道木犀草素能显著减轻活化的巨噬细胞的炎性反应，下调IL-6、IL-1β和TNF-α等致炎因子的表达，但木犀草素是否影响了巨噬细胞的炎症极化，目前还未见报道。
发明内容
本发明运用LPS联合IFN-γ刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7，研究木犀草素对其炎症分子的表达及极化表型的影响，以探讨木犀草素调节巨噬细胞极化的机理并以此调节炎症反应。通过调节巨噬细胞的极化来抑制炎症反应，此研究具有一定的开发前景。
首先，本发明提供中药单体木犀草素通过调节巨噬细胞的极化从而抑制炎症反应。
其次，本发明证明中药单体木犀草素能抑制致炎因子如iNOS、IL-6、IL-1β和TNF-α的表达，促进抗炎分子如Arg1，CD206、CD163的表达，诱导致炎型的M1细胞向抗炎型的M2细胞极化，该机制是通过下调p-STAT3、上调p-STAT6而实现的。
本发明的应用范围包括因炎症时巨噬细胞的过度极化而分泌过量的致炎因子所导致的疾病如肿瘤、感染、肾病、动脉粥样硬化、Ⅱ型糖尿病等。
附图说明：
图1为木犀草素对活化的RAW264.7细胞活力的影响
图2为木犀草素对M1/M2极化的细胞标志分子表达的影响
图3为木犀草素对极化的细胞CD86表达的影响
图4为木犀草素对活化的细胞p-STAT3/6蛋白表达的影响
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案，但并不限于本发明。
实施例1：MTT法检测细胞活力
取对数期生长的细胞制备单细胞悬液，铺96孔板后过夜培养。LPS和IFN-γ刺激细胞诱导M1型极化，IL-4刺激诱导M2型极化，同时M1细胞用终浓度为5、10、20、40、80μmol/L的木犀草素处理，24h后，每孔加MTT(5g/L，PBS)20μL，4h后吸弃上清，每孔加DMSO 150μL，待结晶物完全溶解后，测定吸光度(A值)，计算生长率。根据上述生长曲线，选择对应的木犀草素浓度，用于后续步骤。
生长率＝(实验组A值/对照组A值)×100％。
浓度低于20μmol/L的木犀草素对极化的细胞的活力没有影响。MTT结果显示，IL-4诱导成的M2组细胞与正常对照组细胞相比，活性无显著性差异；M1组细胞相对于对照组活性降低，木犀草素处理后，细胞活性开始没有变化，但随着木犀草素浓度的增加，当浓度达到40μmol/L时，细胞活性开始降低，相对于M1组，有显著性差异。所以本实验选木犀草素5、10和20μmol/L为后续实验的浓度。见图1。
实施例2：ELISA检测上清细胞因子的含量
细胞按每孔2×105个/mL的密度铺板，过夜培养后，LPS和IFN-γ或IL-4诱导极化，然后加入不同剂量的木犀草素。24h后，收集上清，检测IL-6和TNF-α的水平，具体操作依据ELISA试剂盒检测说明书。
活化的M1细胞分泌的IL-6和TNF-α明显上调，相对于正常对照组有显著性差异；木犀草素处理后，细胞因子的分泌减少，相对于M1组，有显著性差异；IL-4活化的M2细胞分泌的IL-6和TNF-α明显下调，与M1组比较，有显著性差异，与对照组相比无显著性差异。结果如下：
| 组别 | IL-6(pg/mL) | TNF-α(pg/mL) |
| 对照组(control) | 35.21±5.00 | 320.12±28.28 |
| M1组 | 3203.33±221.04<sup>***</sup> | 2004.25±39.59<sup>**</sup> |
| M2组 | 68.34±2.83<sup>###</sup> | 348.16±42.22<sup>##</sup> |
| M1+5L组 | 2257.61±61.38<sup>#</sup> | 1608.02±22.63<sup>#</sup> |
| M1+10L组 | 516.63±18.78<sup>###</sup> | 78.38±8.65<sup>#</sup> |
| M1+20L组 | 87.26±8.46<sup>###</sup> | 366.20±36.66<sup>##</sup> |
与对照组比较,**P<0.01,***P<0.001；与M1组比较,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001.
实施例3：荧光定量PCR检测炎症因子的表达
与实施例2同法处理细胞过夜，收集细胞，Trizol法提取总RNA并逆转录成cDNA，荧光定量PCR扩增目的基因，计算致炎因子和抗炎因子的相对表达量。
不同浓度的木犀草素干预M1极化的巨噬细胞后，M1型致炎因子如iNOS、IL-6和IL-1β的分泌明显下调，与M1组相比有显著性差异；M2型相关的抗炎分子如Arg1、CD206和CD163的表达上调，并且呈浓度依赖性，与M1组相比有显著性差异。见图2。
实施例4：流式细胞术检测分化群CD86的表达
木犀草素能降低M1极化的细胞表面分化群CD86的表达。流式细胞术结果显示，LPS和IFN-γ诱导成的M1细胞的表面分化群CD86的平均荧光强度(127.23％)增强，表明CD86的表达上调，相对于对照组(27.60％)，峰明显右移；而IL-4诱导成的M2细胞CD86的平均荧光强度(26.18％)减弱，表明CD86的表达下调，峰左移，与对照组的曲线几乎重叠；在加入不同浓度的木犀草素后，M1细胞表达的CD86的荧光强度逐渐减弱，在木犀草素浓度为20μmol/L时，CD86的荧光强度低至44.38％，较木犀草素浓度为10μmol/L时的72.23％下降明显，峰明显左移。说明木犀草素能明显降低M1极化的细胞表面分化群CD86的表达。见图3。
实施例5：Western-blot检测蛋白的表达
同法处理细胞后提蛋白，SDS-PAGE电泳，转膜，5％脱脂奶粉的TBST封闭后加入一抗，4℃过夜。覆二抗，ECL显影，用Quantity One软件分析灰度值，计算p-STAT3/STAT6的表达。Western-blot结果显示，STATs信号通路的活化参与巨噬细胞极化表型的调控。LPS和IFN-γ诱导RAW264.7细胞M1极化，p-STAT3上调、p-STAT6下调；而IL-4诱导的细胞M2极化，p-STAT6上调、p-STAT3下调。木犀草素处理后，M1源性的p-STAT3逐渐下调，而p-STAT6逐渐上调，并具有浓度依赖性。见图4。
Claims (6)
1.一种来源于蔬果和中草药的木犀草素，其特征在于能调节巨噬细胞的M1/M2极化。
2.如权利要求1所述的木犀草素，其特征在于能下调M1型致炎因子，上调M2型抗炎因子的表达。
3.如权利要求2所述的木犀草素，其特征在于能明显下调M1极化的细胞膜表面分化群CD86的表达。
4.如权利要求2所述的木犀草素，其特征在于能下调M1极化的细胞致炎因子IL-6和TNF-α的分泌。
5.如权利要求2所述的木犀草素，其特征在于能下调M1极化的细胞蛋白通路p-STAT3，上调M2极化的蛋白通路p-STAT6。
6.如权利要求1所述的木犀草素，其特征在于通过调节巨噬细胞的极化而调节炎症因子的表达从而改变疾病的治疗和预后的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN116036285A (zh) * | 2023-02-07 | 2023-05-02 | 河北大学附属医院 | 抑制stat6位点泛素化的物质在调控巨噬细胞极化中的应用 |
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2019
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| CN116036285A (zh) * | 2023-02-07 | 2023-05-02 | 河北大学附属医院 | 抑制stat6位点泛素化的物质在调控巨噬细胞极化中的应用 |
| CN116036285B (zh) * | 2023-02-07 | 2024-02-02 | 河北大学附属医院 | 抑制stat6位点泛素化的物质在调控巨噬细胞极化中的应用 |
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