CN109731909A

CN109731909A - 芦苇-amf共生强化系统修复铜污染的方法

Info

Publication number: CN109731909A
Application number: CN201910112948.9A
Authority: CN
Inventors: 吴洁婷; 马放; 王立; 包红旭; 胡佳宁; 姜磊
Original assignee: Liaoning University
Current assignee: Liaoning University
Priority date: 2019-02-13
Filing date: 2019-02-13
Publication date: 2019-05-10

Abstract

本发明涉及芦苇‑AMF共生强化系统修复铜污染的方法。包括如下步骤：将AMF扩繁菌剂与铜污染土壤混合均匀，然后在其上种植芦苇，构建芦苇‑AMF共生强化系统。所述AMF扩繁菌剂的制备方法是：在土壤‑沙‑蛭石的混合基质中种植白三叶草，接种AMF菌剂，扩繁3个月后，将白三叶草的根剪至小于等于1cm的小段，连同混合基质一起自然风干，过9目筛，取筛下物为AMF扩繁菌剂。本发明通过构建芦苇‑AMF共生强化系统修复铜污染，克服以往常见的植物耐受性差及吸收效率低的瓶颈，并以生态友好的方式规避了传统物理化学强化方法及基因修饰所带来的环境风险。

Description

芦苇-AMF共生强化系统修复铜污染的方法

技术领域

本发明涉及铜污染土壤修复领域，特别涉及一种采用AMF菌剂接种处理芦苇强化其修复重金属铜污染效能的方法。

背景技术

目前，我国铜消费量已稳居世界前列。随着我国对铜巨大的消费量及需求量以及逐年增加的开采与排放，从而引发的环境污染压力也随之而来，铜已经成为了我国重金属污染土壤中主要的污染元素之一，铜矿开采及冶炼厂排放“三废”，含铜农药和化肥的过量使用和城市生活垃圾处理不当等，均会导致局部环境中的含铜量达到原始值的数倍甚至几十倍，远远超出了环境的承载力。其中，畜牧业作为东北老工业基地的主要支柱产业，在近几年的二次振兴中得以迅猛发展。与其它非必需元素的重金属污染物不同，铜对动物体内的红细胞和骨骼的形成起到重要作用，并参与着多种金属酶、铁代谢以及血红蛋白合成，因此目前禽畜饲料中有添加大量铜的趋势，旨在促进禽畜生长、达到提高饲料利用率的目的。但研究表明：添加过量的铜不仅无法促进增重和使耗料等问题有所改善，反而还会导致大量的铜随着粪便排出体外，进而造成环境污染。

用芦苇来构建芦苇床人工湿地，不仅可以为鸟类及哺乳动物提供良好生境，重要的是可以同时在重金属处理过程中发挥作用。首先，作为禾本科家族开花植物中最常见且地理分布最为广泛的一种地下茎植物，芦苇一般生长在湿地环境中，处在这种条件下的多种生境中，芦苇均可以繁荣茂盛地生长并成为该生境中的优势植物。其次，芦苇可以经受住极端的环境条件，这其中就包括重金属污染，例如锌、铅、镉及铜。以往研究表明，芦苇有能力在不利环境中，例如重金属胁迫存在的情况下存活并产生相当高的生物量。因此，可以认为芦苇具备湿地植物修复所需的关键特质。即使构建人工湿地进行植物修复可以采用多种植物，由于芦苇本身所具备的特殊属性，使其成为目前接受认可程度最高且被选择投入使用最多的物种。第三，作为植物修复的两大主要类型，植物提取技术及植物稳定化技术，后者由于其相对低廉(不需要收割并处理茎叶生物量)的成本及更易于操作已被一些研究者认为是更加合适的处理重金属污染的植物修复方法。从这一角度来说，那就更需要寻找一种耐受性高且根系发达并具有更大生物量的植物，且这种植物在高浓度金属胁迫存在下仍然能够吸收、螯合或者沉积金属污染物，但并不将其运输至茎叶，而芦苇又恰好满足这一点。芦苇作为一种具有分布广泛、适应性强、且对多种逆境胁迫具有较高耐受性的湿生植物可以将大量的铜吸收并固定在其体内，且主要将其控制在生物量庞大的发达根系内，这使得以芦苇为主的修复技术应向植物稳定化技术倾斜。

然而现有技术中采用芦苇修复铜污染存在植物耐受性差及吸收效率低的瓶颈。因此如何高效强化芦苇修复铜污染的效能是本领域不断探索的课题。

发明内容

本发明的目的是通过构建芦苇-AMF共生强化系统修复铜污染，克服以往常见的植物耐受性差及吸收效率低的瓶颈，并以生态友好的方式规避了传统物理化学强化方法及基因修饰所带来的环境风险。

本发明采用的技术方案是，芦苇-AMF共生强化系统修复铜污染的方法，包括如下步骤：将AMF扩繁菌剂与铜污染土壤混合均匀，然后在其上种植芦苇，构建芦苇-AMF共生强化系统。

优选的，所述AMF扩繁菌剂的制备方法是：在土壤-沙-蛭石的混合基质中种植白三叶草，接种AMF菌剂，扩繁3个月后，将白三叶草的根剪至小于等于1cm的小段，连同混合基质一起自然风干，过9目筛，取筛下物为AMF扩繁菌剂。

优选的，所述混合基质中，按体积比，土壤：沙：蛭石＝2：5：3。

优选的，每100g土壤-沙-蛭石的混合基质中接种8-12g AMF菌剂。

优选的，所述AMF菌剂为摩西球囊霉菌剂或根内球囊霉菌剂。

优选的，所述种植芦苇是，播种芦苇种子或种植芦苇幼苗。

优选的，于地表10-25cm深的污染土壤中，每100g铜污染土壤与8-12g AMF扩繁菌剂混合均匀，再种植芦苇。

本发明的有益效果是：

1、本发明通过投加AMF菌剂的方式构建芦苇-AMF共生强化系统，并通过观察芦苇生长发育、生理特征、根际土壤性质及微生物代谢，发现芦苇-AMF共生强化系统对于修复铜污染具有显著的的效果。

2、本发明的方法，通过AMF菌剂的引入，在巩固芦苇固有优势的基础上，弥补了其存在的局限性，首先，AMF菌剂通过显著增加芦苇根系生物量来使其根系的深度进一步拓宽；其次，通过功能性分子或其他作用机制增加芦苇对胁迫的耐受性并提高铜的生物有效性，在维持芦苇机能受到不良影响较小的情况下，反而吸收并富集了较多的铜；其三，本发明不需要引入外来植物物种，也无需进行基因工程类的改造，降低了外来物种入侵或基因污染。

3、在具备金属抗性的植物中，最适用于植物稳定化的物种是那些可以将金属积累于其根系，这会阻止重金属进入食物链。铜被认为是一种主要的环境污染物，其主要通过植物吸收进入食物链。而本发明选择芦苇作为物种，其可以将金属铜积累于其根系，从而阻止铜进入食物链。

具体实施方式

实施例1

AMF菌剂：原始AMF菌剂，摩西球囊霉(Funnelliformis mosseae，原名为Glomusmosseae)及根内球囊霉(Rhizophagus irregularis)，经镜下检测每克菌剂含孢子10-25g。

芦苇种子：播种所需的芦苇花序由盘锦市芦苇科学研究所友情提供。将芦苇花序中的小穗剥落后，再仔细手工将芦苇种子分离并收集起来。在芦苇植株培育实验开始前将所有收集好的芦苇种子自然风干，彻底混合后在室温下(20℃)放置于干燥避光处储存。在播种前将种子浸泡于浓度为2％的次氯酸钠中，持续搅拌15min至浸泡完全后再用去离子水洗涤5遍，备用。

AMF扩繁菌剂的制备：在温室(25℃)培养条件下，本发明采用白三叶草(Trifoliumrepens L.)作为AMF菌剂的宿主。向500g土壤-沙-蛭石(体积比为2：5：3)的混合基质中种植白三叶草，向白三叶草的根部加50g的摩西球囊霉菌菌剂或根内球囊霉菌菌剂，扩繁3个月后，将白三叶草的根剪至小于等于1cm的小段，连同混合基质一起自然风干，过9目筛，取筛下物，分别得到摩西球囊霉扩繁菌剂和根内球囊霉扩繁菌剂，备用。

方法：实验采用底直径为10cm、上直径为11cm和高为10cm的塑料盆来构建芦苇-AMF共生强化体系。实验以高温灭菌(121℃，2h)后的蛭石作为培养基质，以避免蛭石中的固有微生物影响实验结果。一共设计三组，分别为：接种摩西球囊霉组；接种根内球囊霉组；对照组。

接种摩西球囊霉组：每个塑料盆中，依次放入100g蛭石、100粒已消毒的芦苇种子和10g摩西球囊霉扩繁菌剂。

接种根内球囊霉组：每个塑料盆中，依次放入100g蛭石、100粒已消毒的芦苇种子和10g根内球囊霉扩繁菌剂。

对照组：于土壤-沙-蛭石(体积比为2：5：3)的混合基质中种植白三叶草，3个月后，将白三叶草的根剪至小于等于1cm的小段，连同混合基质一起自然风干得空白对照料。为了消除白三叶草和土壤-沙-蛭石混合基质中成分带来的差异，在对照组中每个塑料盆中依次加入100g蛭石、100粒已消毒的芦苇种子和10g空白对照料。

每种处理设置3盆重复，为了保证幼苗数量的均一性，所有塑料盆均播种100粒种子。播种及接菌结束后，将所有处理组的芦苇随机摆放在温室内，且每隔一周左右将所有盆栽的摆放位置调整一次以尽量减少外界环境因素对实验结果的干扰。实验期间采用1/4强度的Hoagland改良营养液来每天浇灌植物，用量为100mL/盆/周。植物培养过程中为避免每个实验盆的固定位置对植物生长有影响，对所有的实验盆采取随机完全区集设计，并且每周随机旋转各个实验盆。每隔2-3d对所有处理补充等量的霍格兰营养液(Hoaglandnutrient solution以防止芦苇在生长发育阶段缺少必须的营养元素。

在植物生长到第4周的时候，为避免塑料盆较小影响已萌发植株的生长发育，从每一个塑料盆中挑选十株长势相似的幼苗，然后将上述幼苗随即转移到相同规格的塑料盆中培养，培养基质与之前实验设置相同，每个处理一共设置3组重复。当植物生长到五叶期(约为9周)的时候，将塑料盆分别浸入铜浓度分别为0.02mg/L、1mg/L及5mg/L的40％霍格兰营养液中，培养21天后进行检测。

(一)芦苇-AMF共生强化系统对芦苇种子萌发的影响

不同接菌处理下芦苇种子萌发相关数据如表1所示。

表1不同处理下芦苇种子萌发相关参数

不同字母表示不同铜胁迫处理组之间存在显著性差异。显著性检验采用单因素方差性分析(Duncan检验)。箭头用于辅助说明AMF处理组与对照组之间的大小关系：处理组更高(↑)、差异不显著(→)、空白对照组更高(↓)。n＝3。

不同接菌处理下芦苇种子萌发相关参数如表1所示。在有铜胁迫下，AMF处理组的芦苇种子在萌发速率上优于对照组，在铜处理浓度为1mg l^-1时，摩西球囊霉处理组的种子萌发速率提升了26.2％，萌发速率系数提升了27.1％；根内球囊霉处理组的种子萌发速率提升了63.83％，萌发速率系数提升了22.8％。在铜处理浓度为5mg l^-1时，根内球囊霉处理组的种子萌发速率提升了68.38％。在铜处理浓度为5mg l^-1时种子萌发被接种AMF促进的效果较1mg l^-1更显著，且两种AMF间，根内球囊霉的促进作用更为显著。

上述现象亦可论证当植株处于在基质中初步建立阶段(该阶段或为决定植物修复能否实际应用原位修复的重要环节)，菌根效应也会发挥一定作用。分析其原因，由于AMF在芦苇种子萌发过程中构建共生关系的同时在种子萌发所在的“微空间”内分担了一部分金属离子，对金属胁迫起到了一定程度的缓冲作用。除此之外，芦苇这类植物由于种子呈灰尘状，导致其营养储备极少。在这种情况下，真菌可以触发种子萌发，并且/或者通过改善其周围环境中的营养元素的生物有效性来为种子胚芽发育提供所需资源。且比较两种AMF在铜胁迫下对种子萌发的影响，发现根内球囊霉对芦苇种子的保护作用，或者说对胁迫的缓冲效应要整体优于摩西球囊霉。

(二)芦苇-AMF共生强化系统对芦苇植株生长的影响

在胁迫阶段处理前，三组植物就表现出不同的生长发育情况，而生长率参数可以在一定程度上排除初始差异对结果造成的干扰，不同梯度胁迫及AMF接菌处理的芦苇生长发育相关数据如表2所示。

表2不同处理下芦苇生长发育相关参数

从表2结果中可以看出，在铜处理浓度为1mg/L时，接种AMF主要对芦苇根系生长率、根长、根系干重、幼苗活力指数、比根长、存活指数产生显著影响，具体来说，根系生长率被接种摩西球囊霉提升了71.42％，被接种根内球囊霉提升107.8％。幼苗活力指数被接种摩西球囊霉提升了34.46％，被接种根内球囊霉提升5.74％。比根长被接种摩西球囊霉降低了16.2％，被接种根内球囊霉降低了25.2％。存活指数被接种摩西球囊霉提升了59.2％，被接种根内球囊霉提升37.6％。而在铜处理浓度为5mg/L时，AMF表现出对铜胁迫更明显的缓解作用，具体表现为除了上述参数外，茎叶生长率、株高、茎粗、叶面积、叶轴长、茎叶干重也由于接种AMF而显著增高，且与根内球囊霉相比，由于接种摩西球囊霉而发生显著改变的参数种类更多。而从菌根依赖性来看，根内球囊霉接种组在三个浓度的铜处理下，分别为1.24、1.22及1.16，普遍高于摩西球囊霉的1.1、1.09及1.05。此外，从0到1mg/L，与对照组相比，摩西球囊霉与根内球囊霉处理组的芦苇的相关参数表现出更明显的下降趋势，这一点可以从茎叶生长率的变化趋势更明显地看出。分析其原因，是由于较低浓度下，较低水平的铜胁迫处理并未对芦苇的相关生理机能造成明显的损伤，因此各项指标在此条件下并不敏感，但是AMF造成的发达根系会使植株吸收更多的铜，因此表现出相对较明显的抑制作用。但是在较强的胁迫作用下，植物的很多生理活动会受到明显的抑制，对照组从1mg l^-1到5mgl^-1的变化趋势看出来。在这种情况下AMF对宿主植物抗逆性的增强作用就表现的较为明显。在以往研究中，AMF与宿主植物相互作用，形成共生强化系统，提升植物对重金属的耐受性及抗性、减缓逆境对植物的胁迫效应、进而有助于宿主植物在极端条件下的存活或者促进其在金属污染环境下的生长

尤其是根系的生长发育，接种摩西球囊霉及根内球囊霉使根长分别增加了90.59％和51.3％，且根系生长率分别提高了91.7％，和51.19％。

在营养元素吸收方面，摩西球囊霉促进了芦苇对P，S，B，Mg，K，Ca，Cu，Zn，Mo的吸收，而根内球囊霉促进了S，K，Ca，Cu及Zn的吸收。

芦苇茎叶及根系的生长发育均会受到铜胁迫的抑制，且抑制作用随铜浓度的升高而增大，然而与茎叶相比，芦苇根系受到铜胁迫的影响更显著。1mg l-1及5mg l-1分别接近于铜胁迫对芦苇根系及茎叶造成损伤的两个临界点。从菌根依赖性角度来看，根内球囊霉在铜处理浓度为1mg l-1和5mg l-1时，分别为1.22及1.16，均高于摩西球囊霉。

(三)芦苇-AMF共生强化系统对芦苇生理学特征的影响

在铜处理浓度为5mg/L时，接种摩西球囊霉及根内球囊霉处理均会促进芦苇的光合作用，使其净光合速率分别升高53.83％及75.26％，但是蒸腾速率及气孔导度变化并不显著。此外，在同一铜浓度下，营养元素在芦苇茎叶及根系中的浓度均由于接种根内球囊霉及摩西球囊霉而下降或不发生显著变化。然而与对照组相比，芦苇对营养元素吸收受胁迫影响而变化的幅度却由于接种AMF处理而减小。在芦苇根系组织中，SOD、POD、CAT及APX的含量相对较高。在铜处理浓度为1mg l-1和5mg l-1时，与对照组相比，摩西球囊霉接种组的芦苇根系中的SOD活性分别增高了26.25％及42.3％，而根内球囊霉接种组的SOD活性则呈现出下降趋势。

(四)芦苇-AMF共生强化系统对铜在芦苇中分布的影响

表3不同处理下铜在芦苇中分布情况

不同字母表示不同处理组之间存在显著性差异。显著性检验采用单因素方差性分析(Duncan检验)。箭头用于辅助说明AMF处理组与对照组之间的大小关系：处理组更高(↑)、差异不显著(→)、空白对照组更高(↓)。n＝3。

由表3可以看出，不同处理下铜在芦苇中分布情况，在铜处理浓度的梯度变化过程中，接种根内球囊霉使芦苇营养器官中的铜浓度升高，在铜处理浓度为1mg l^-1时其茎叶及根系中的铜浓度已分别高于对照组80.03％及33.6％，而在5mg l^-1时，则分别高于对照组49.43％及8.53％，且升高程度较之摩西球囊霉接种组显著。为了更好地评价芦苇的吸收转运效能，即其对铜的富集及稳定化能力，计算了单株植物中的铜总量，发现在较低浓度的铜胁迫下(1mg l^-1)，尽管摩西球囊霉处理组根系中的铜浓度与非接菌对照组相比差别并不显著，但是其单株吸收的铜总量仍然显著高于非接菌组34.16％(1mg l^-1)及42.5％(5mg l^-1)。

综上所述，由(一)至(四)可以得出，本发明的芦苇-AMF共生强化系统较空白对照组，可缓解铜胁迫对芦苇生长造成的胁迫影响，并提升芦苇抗性、促进其对铜吸收转运，对于提升铜的修复效能显著，这对强化芦苇修复铜污染环境具有重要意义，因此可以利用芦苇-AMF共生强化系统修复铜污染环境。

Claims

1.芦苇-AMF共生强化系统修复铜污染的方法，其特征在于，包括如下步骤：将AMF扩繁菌剂与铜污染土壤混合均匀，然后在其上种植芦苇，构建芦苇-AMF共生强化系统。

2.根据权利要求1所述的芦苇-AMF共生强化系统修复铜污染的方法，其特征在于，所述AMF扩繁菌剂的制备方法是：在土壤-沙-蛭石的混合基质中种植白三叶草，接种AMF菌剂，扩繁3个月后，将白三叶草的根剪至小于等于1cm的小段，连同混合基质一起自然风干，过9目筛，取筛下物为AMF扩繁菌剂。

3.根据权利要求2所述的芦苇-AMF共生强化系统修复铜污染的方法，其特征在于，所述混合基质中，按体积比，土壤：沙：蛭石＝2：5：3。

4.根据权利要求2所述的芦苇-AMF共生强化系统修复铜污染的方法，其特征在于，每100g土壤-沙-蛭石的混合基质中接种8-12g AMF菌剂。

5.根据权利要求2、3或4所述的芦苇-AMF共生强化系统修复铜污染的方法，其特征在于，所述AMF菌剂为摩西球囊霉或根内球囊霉。

6.根据权利要求1所述的芦苇-AMF共生强化系统修复铜污染的方法，其特征在于，所述种植芦苇是，播种芦苇种子或种植芦苇幼苗。

7.根据权利要求1所述的芦苇-AMF共生强化系统修复铜污染的方法，其特征在于，于地表10-25cm深的污染土壤中，每100g铜污染土壤与8-12g AMF扩繁菌剂混合均匀，再种植芦苇。