CN109724857A - 一种胶原纤维定量分析的分段染色测量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种胶原纤维定量分析的分段染色测量方法，包括以下具体步骤：选材、分段染色、静置和计算，提出基于HE染色的分段染色方法，通过不同染色段获取的二次谐波信号经过理论计算准确测定胶原纤维含量，实现了在分子水平上胶原纤维的定量检测和生物组织纤维化的定量分级评价，采用二次谐波信号，准确的获取对胶原纤维含量进行定量分级的非线性光学指标，定量分析不同组织胶原纤维含量，通过对染色后不同染色段的信号强度计算可以准确获得胶原纤维含量。
Description
技术领域
本发明涉及组织染色处理技术领域，特别是涉及一种胶原纤维定量分析的分段染色测量方法。
背景技术
胶原纤维广泛分布于人体和动物的各种组织内，在皮肤、巩膜和肌腱最为丰富，真皮中全部纤维质量的95％-98％都是胶原纤维，它在维持皮肤组织的弹性方面起着重要的作用。胶原纤维还广泛分布于心肌细胞和毛细血管之间，呈网状环绕心肌细胞周围，形成心肌细胞胶原鞘，相邻鞘膜之间互连成网，其含量随年龄、机体状况的变化而变化。除此之外纤维化是组织损伤修复的必然结果，不同的纤维化器官在细胞外基质的构成及结构特点上表现出一定的特殊性，胶原纤维就是其最基本的构成单位。由此能够定量的测量和分析组织中的胶原纤维含量显得尤为重要。
发明内容
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：一种胶原纤维定量分析的分段染色测量方法，包括以下具体步骤：
S1.选材：选取纤维化组织，进行切片处理，形成组织切片，且选取酸性染料；
S2.分段染色：对所述组织切片部分放置于所述酸性染料中进行HE染色，部分外露于空气中，染色完毕后，形状半成品切片；
S3.静置：将所述半成品切片静置一段时间后，形成染色切片；
S4.计算：在所述染色切片上获取二次谐波和双光子荧光信号，经过理论计算准确测定胶原纤维含量。
进一步地，S1中，选取的酸性染料为苏木精和伊红。
进一步地，S2中，所述半成品切片形成染色区和非染色区。
进一步地，S3中，所述染色切片形成染色区、过渡区和非染色区。
进一步地，S4中，采用二次谐波成像技术，准确的获取对胶原纤维含量进行定量分级的非线性光学指标。
本发明的有益效果为：(1)提出基于HE染色的分段染色方法，通过不同染色段获取的SHG信号经过理论计算准确测定胶原纤维含量。
(2)实现了在分子水平上胶原纤维的定量检测和生物组织纤维化的定量分级评价。
(3)采用二次谐波信号，准确的获取对胶原纤维含量进行定量分级的非线性光学指标。
(4)定量分析不同组织胶原纤维含量，通过对染色后不同染色段的信号强度计算可以准确获得胶原纤维含量。
附图说明
附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制。
图1为一实施例提供的一种胶原纤维定量分析的分段染色测量方法的HE染色效果示例图；
图2为图1的成像光谱图。
具体实施方式
以下将结合本发明实施例的附图，对本发明的技术方案做进一步描述，本发明不仅限于以下具体实施方式。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
如图1和图2所示，一种胶原纤维定量分析的分段染色测量方法，包括以下具体步骤：
S1.选材：选取纤维化组织，进行切片处理，形成组织切片，且选取酸性染料。
具体地，由于基于产生二次谐波的I型原胶原分子相互呈阶梯式平行排列，相邻的胶原蛋白分子排列形成右手超螺旋的胶原原纤维，相邻的胶原原纤维相互交叉形成胶原纤维，这种交叉形成了胶原分子晶格，其甘氨酸和羟脯氨酸是胶原纤维的主要成分，能够产生晶格的二次谐波。因此，选取具有I型胶原分子的纤维化组织用于切片。进一步地，用I型胶原纤维保存在-80℃的制冷机中准备切片。从-80℃的制冷机中取出并放入-18℃的冰箱中6小时，然后切片。通过低温恒温器依次平行于胶原纤维切割每个尾部，切片厚度为4-6μm。
S2.分段染色：对所述组织切片部分放置于所述酸性染料中进行HE(Hematoxylin-Eosin)染色，部分外露于空气中，染色完毕后，形状半成品切片。
具体地，将整个组织切片放置于95％乙醇中固定半分钟，然后将乙醇浸泡过的组织切片的一部分进行HE染色3分钟，其余部分直接外露于空气中，染色完毕后，形成所述半成品切片，且最终所述半成品切片形成染色区和非染色区。
S3.静置：将所述半成品切片静置一段时间后，形成染色切片。
具体地，将所述半成品切片直接在空气中放置5～10分钟，形成染色切片。随着染料分子的自由扩散，在染色与非染色区域间会形成一个狭小的过渡区域，也就是说，所述染色切片形成染色区、过渡区和非染色区。
S4.计算：在所述染色切片上获取获取二次谐波(Second Harmonic Generation，SHG)和双光子荧光(Two-photon excited fluorescence,TPEF)信号，经过理论计算准确测定胶原纤维含量。
具体地，获取SHG信号后，由于SHG总的极化强度可用公式表示为：
其中为光电场，为二阶极化强度，χ(2)为二阶极化率。在生物体系中，χ(2)＝Ns<β>，Ns为信号源分子密度，β为分子的超极化率，它表征了介质的微观特性，反映了介质的电子态、分子的对称性、旋向及排列等，因此可以通过对介质非线性光学现象的探测来了解介质的微观结构信息，具有动态表现生物组织生化状态的能力。同时SHG信号随分子的状态发生改变，也就是说，通过测量对应的数据，HE染色区域由于染料破坏了胶原分子等二次谐波信号源分子的结构，SHG几乎被淹没，而TPEF信号非常强；在过渡区内TPEF和SHG信号共存；而在非染色区内，出现强的SHG信号，TPEF信号几乎探测不到。通过分析不同纤维化程度的非线性图像与光谱，再辅以常见的经验公式，如定义LSHG＝(ITPEF-ISHG)/(ITPEF+ISHG)，可以得到具有定量分级测量的非线性光学系数，定量分析胶原纤维含量。具体地，通过测量得到相应的数据，在横坐标的数据相同的情况下，三个不同区域的纵坐标的数据如下，以下数据为若干实验数据中随机挑选的几个数据：
| 横坐标 | HE染色区 | 过渡区 | 非染色区 |
| 400.33 | 6.40 | 18.83 | 36.51 |
| 450.66 | 11.73 | 8.53 | 3.73 |
| 500.99 | 13.32 | 18.12 | 7.99 |
| 550 | 83.15 | 64.49 | 12.79 |
| 600.33 | 182.81 | 133.78 | 14.39 |
| 650.66 | 128.98 | 89.01 | 12.26 |
| 700.99 | 56.90 | 35.18 | 9.59 |
通过HE染色的分段染色方法，通过不同染色段获取的SHG信号经过理论计算准确测定胶原纤维含量，实现了在分子水平上胶原纤维的定量检测和生物组织纤维化的定量分级评价，且采用SHG这种二次谐波成像技术，准确的获取对胶原纤维含量进行定量分级的非线性光学指标，最终通过对染色后不同染色段的信号强度计算可以准确获得胶原纤维含量。且本发明的测量方法不是以疾病诊断作为目的，而是只针对目前现有技术中，胶原纤维的定量检测没有很好的检测方法而提出的具体检测方案。
实施例1
S1.选材：选取胶原纤维化组织，进行切片处理，形成组织切片，且选取酸性染料。
具体地，由于基于产生二次谐波的I型原胶原分子相互呈阶梯式平行排列，相邻的胶原蛋白分子排列形成右手超螺旋的胶原原纤维，相邻的胶原原纤维相互交叉形成胶原纤维，这种交叉形成了胶原分子晶格，其甘氨酸和羟脯氨酸是胶原纤维的主要成分，能够产生晶格的二次谐波。因此，选取具有I型胶原分子的纤维化组织用于切片。进一步地，用I型胶原纤维保存在-80℃的制冷机中准备切片。从-80℃的制冷机中取出并放入-18℃的冰箱中6小时，然后切片。通过低温恒温器依次平行于胶原纤维切割每个尾部，切片厚度为4-6μm。
S2.分段染色：对所述组织切片部分放置于所述酸性染料中进行HE(Hematoxylin-Eosin)染色，部分外露于空气中，染色完毕后，形状半成品切片。
具体地，将整个组织切片放置于95％乙醇中固定半分钟，然后将乙醇浸泡过的组织切片的一部分进行HE染色3分钟，其余部分直接外露于空气中，染色完毕后，形成所述半成品切片，且最终所述半成品切片形成染色区和非染色区。
进一步地，S1中，选取的酸性染料为苏木精和伊红。伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使嗜酸型的胶原纤维、结缔组织等被染成不同程度的红色或粉红色，可清楚地分辨出胶原纤维。
S3.静置：将所述半成品切片静置一段时间后，形成染色切片。
具体地，将所述半成品切片直接在空气中放置5～10分钟，形成染色切片。随着染料分子的自由扩散，在染色与非染色区域间会形成一个狭小的过渡区域，也就是说，所述染色切片形成染色区、过渡区和非染色区。
S4.计算：在所述染色切片上获取二次谐波(Second Harmonic Generation，SHG)和双光子荧光(Two-photon excited fluorescence,TPEF)信号，经过理论计算准确测定胶原纤维含量。
具体地，获取SHG信号后，由于SHG总的极化强度可用公式表示为：
其中为光电场，为二阶极化强度，χ(2)为二阶极化率。在生物体系中，χ(2)＝Ns<β>，Ns为信号源分子密度，β为分子的超极化率，它表征了介质的微观特性，反映了介质的电子态、分子的对称性、旋向及排列等，因此可以通过对介质非线性光学现象的探测来了解介质的微观结构信息，具有动态表现生物组织生化状态的能力。同时SHG信号随分子的状态发生改变，也就是说，通过测量对应的数据，HE染色区域由于染料破坏了胶原分子等二次谐波信号源分子的结构，SHG几乎被淹没，而TPEF信号非常强；在过渡区内TPEF和SHG信号共存；而在非染色区内，出现强的SHG信号，TPEF信号几乎探测不到。通过分析不同纤维化程度的非线性图像与光谱，再辅以常见的经验公式，如定义LSHG＝(ITPEF-ISHG)/(ITPEF+ISHG)，可以得到具有定量分级测量的非线性光学系数，定量分析胶原纤维含量。
综上所述，上述实施方式并非是本发明的限制性实施方式，凡本领域的技术人员在本发明的实质内容的基础上所进行的修饰或者等效变形，均在本发明的技术范畴。
Claims (5)
1.一种胶原纤维定量分析的分段染色测量方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
S1.选材：选取纤维化组织，进行切片处理，形成组织切片，且选取酸性染料；
S2.分段染色：对所述组织切片部分放置于所述酸性染料中进行HE染色，部分外露于空气中，染色完毕后，形状半成品切片；
S3.静置：将所述半成品切片静置一段时间后，形成染色切片；
S4.计算：在所述染色切片上获取二次谐波信号和双光子荧光信号，经过理论计算准确测定胶原纤维含量。
2.根据权利要求1所述的胶原纤维定量分析的分段染色测量方法，其特征在于：S1中，选取的酸性染料为苏木精和伊红。
3.根据权利要求1所述的胶原纤维定量分析的分段染色测量方法，其特征在于：S2中，所述半成品切片形成染色区和非染色区。
4.根据权利要求1所述的胶原纤维定量分析的分段染色测量方法，其特征在于：S3中，所述染色切片形成染色区、过渡区和非染色区。
5.根据权利要求1所述的胶原纤维定量分析的分段染色测量方法，其特征在于：S4中，采用二次谐波成像技术，准确的获取对胶原纤维含量进行定量分级的非线性光学指标。
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