CN109722237A - 一种基于稠环氧化噻吩的荧光探针及其在细胞成像中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物化学的技术领域，公开了一种基于稠环氧化噻吩的荧光探针及其在细胞成像中的应用。所述基于稠环氧化噻吩的荧光探针为包裹稠环氧化噻吩的纳米粒子。所述荧光探针在细胞成像中的应用，特别是在脂滴和溶酶体成像中的应用，用作溶酶体以及脂滴的荧光成像染料，脂滴‑溶酶体间相互作用的示踪剂以及脂滴形成、脂滴代谢的示踪剂。本发明的荧光探针进入细胞后在脂滴中呈现蓝色荧光，而在溶酶体中表现为红色荧光，通过荧光信号强度及颜色变化的监测，实现了短时间内脂滴的运动的高灵敏及高分辨示踪；通过长时间监测，示踪了脂滴的分布及代谢情况，首次发现了脂滴内成分能够被溶酶体回收。本发明的应用，灵敏度高，操作简单。

Description

一种基于稠环氧化噻吩的荧光探针及其在细胞成像中的应用

技术领域

本发明涉及有机化学和化学生物学领域，具体涉及一种基于稠环氧化噻吩的荧光探针及其在细胞成像中的应用，特别是在细胞的溶酶体和脂滴成像中的应用。

背景技术

脂滴和溶酶体在细胞中发挥了非常重要的作用。脂滴是细胞内贮存中性脂的一个重要细胞器且是能量物质及细胞膜成分的储存场所。近年来，大量的研究发现，脂滴与目前很多疾病有着密不可分的联系，例如肥胖、II型糖尿病、动脉硬化甚至癌症等，因此关于脂滴的研究得到了越来越多研究者的关注。溶酶体是细胞的“消化器官”，内含有一百多种水解酶，可以分解从外界进入到细胞内的物质，也可消化细胞自身的局部细胞质或细胞器。脂滴与溶酶体实际上也是高度相关的两种细胞器，溶酶体能够消化脂滴内的生物大分子及相关物质，被称为“噬脂”。目前对于脂滴-溶酶体间相互作用的研究主要利用分子生物学、遗传学等手段，虽然最近有利用荧光蛋白用于研究脂滴-溶酶体间相互作用，但是利用荧光探针用于研究两者之间相互作用的工作很少。

本发明利用一种对极性敏感的具有聚集诱导发光(AIE)性能的有机荧光材料制备成具有良好生物兼容性的纳米粒子，通过监测荧光信号的变化，实现了对脂滴形成、运动及代谢的示踪。该探针具有明显的聚集诱导发光性能，且其给-受体(D-A)结构赋予其极性敏感性。细胞成像实验显示该纳米粒子能够与细胞内溶酶体及脂滴结合，且会更倾向于进入脂滴，并在低极性的脂滴中为蓝光发射，而在溶酶体中表现为红色荧光，这表现出对环境敏感的双发射行为。通过对纳米粒子荧光信号的动态监测，发现该纳米粒子最开始通过细胞内吞先进入溶酶体，4小时后从溶酶体逃逸进入脂滴，最后从脂滴再次回到溶酶体。该体系对脂滴的形成、示踪及其功能研究有着非常重要的意义及潜在的应用价值。

发明内容

为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种基于稠环氧化噻吩的荧光探针及其在细胞成像中的应用，特别是溶酶体和脂滴成像中的应用。本发明的荧光探针操作简单、灵敏度高，本发明的荧光探针在脂滴中为蓝光发射，而在溶酶体中表现为红色荧光，通过监测荧光颜色的变化，就能监测脂滴-溶酶体之间的相互联系，实现溶酶体以及脂滴不同颜色的荧光成像。本发明的荧光探针用作溶酶体以及脂滴的荧光成像剂，特别是双色荧光成像剂。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于稠环氧化噻吩的荧光探针为包裹稠环氧化噻吩的纳米粒子；所述稠环氧化噻吩为以下结构式的一种：

其中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆为独立的氢，取代或未取代的具有1～20个碳原子的直链、支链或者环状烷基链，取代或未取代的芳基；R₁～R₆相同或者不同。

所述取代或未取代的芳基为：苯基、联苯基、芴基、芘基、蒽基、咔唑苯基、咔唑基、噻吩基、联噻吩基、稠噻吩基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、噻吩并环戊二烯基、萘氨基苯基或二吡啶胺基、苯并三唑、米基硼、三苯基氧化膦、二苯胺基、三苯胺基、二苯并噻吩基、苯并双噻吩基、9,10-二氢-9,9-二甲基吖啶基、9,10-二氢-9,9-二苯基吖啶基或10-H-螺[吖啶-9,9’-芴]基。

所述取代或未取代的芳基为下述式a～r所示结构中的一种：

其中，n为自然数，R′为氢原子或者为相同或不同的，对称或者不对称的具有1～20个碳原子的直链、支链或者环状烷基链，或者烷基上的一个或多个碳被氧原子、烯基、炔基、芳基、羰基、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基或酯基取代，氢原子被氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、苯基、联苯基、芴基、芘基、蒽基、咔唑苯基、咔唑基、噻吩基、联噻吩基、稠噻吩基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、噻吩并环戊二烯基、萘氨基苯基或二吡啶胺基、苯并三唑、米基硼、三苯基氧化膦、二苯胺基、三苯胺基、二苯并噻吩基、苯并双噻吩基、9,10-二氢-9,9-二甲基吖啶基、9,10-二氢-9,9-二苯基吖啶基或10-H-螺[吖啶-9,9’-芴]基取代。

所述稠环氧化噻吩优选为式(I)中化合物(TPA-BTTDO)，此时能利用双模式荧光发射监测脂滴代谢：

所述荧光探针为采用基质包裹稠环氧化噻吩的纳米粒子。

所述基质为DSPE-PEG2000(聚乙二醇2000)(是指二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000)、壳聚糖、F127(泊洛沙姆)、PSMA(对苯乙烯-马来酸酐交替共聚物)中的至少一种，优选为DSPE-PEG2000(聚乙二醇2000)，此时与细胞结合最强，且能从细胞中逃逸。

所述基于稠环氧化噻吩的荧光探针在细胞成像中的应用。

所述基于稠环氧化噻吩的荧光探针在溶酶体和脂滴成像中的应用，特别是在示踪细胞中溶酶体和脂滴相互联系中的应用。用作溶酶体以及脂滴的荧光成像染料，特别是脂滴-溶酶体间相互作用的示踪剂。

所述应用具体是指荧光探针在监测脂滴形成、脂滴代谢以及监测脂滴-溶酶体间相互作用中的应用。用作脂滴形成、脂滴代谢的示踪剂。

所述应用，包括以下步骤：

(1)利用共沉淀法，采用基质包裹稠环氧化噻吩，制备纳米粒子，获得荧光探针；

(2)将得到的纳米粒子即荧光探针加入细胞培养体系与细胞共培养，实现脂滴和溶酶体的荧光成像。

步骤(1)中所述纳米粒子具体通过以下方法制备得到：在有机溶剂中，将稠环氧化噻吩与基质混合均匀，加入水，共沉淀，获得纳米粒子；

所述稠环氧化噻吩与基质的质量比为1:0.5～1:10。所述有机溶剂为四氢呋喃；所述水与有机溶剂的体积比为1：(0.1～100)，优选为1：(1～10)。稠环氧化噻吩与水的质量体积比为1mg:(0.1～20)mL。

共沉淀时，去除有机溶剂；所述去除有机溶剂是指采用惰性气体鼓吹。

步骤(2)中所述细胞培养体系为磷酸缓冲盐溶液、Hank’s缓冲液(无机盐溶液和平衡盐溶液)、Tris缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液)、HEPES缓冲液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液)、DMEM细胞培养基(Dulbecco's改良培养基)中的至少一种，优选为DMEM细胞培养基(Dulbecco's改良培养基)，此时与细胞作用最好。

步骤(2)中所述共培养的温度为4～37℃。

步骤(2)中所述共培养的时间为1～96h，优选为8～12h。

步骤(2)中所述纳米粒子在细胞培养体系中的浓度为0.0001～100μg/mL，优选为0.1～10μg/mL。

步骤(2)中所述细胞为肿瘤细胞，为肿瘤细胞时，本发明的方法具有灵敏度更高。

激光共聚焦成像，激发光源为405nm。

本发明的荧光探针能够研究脂滴-溶酶体相互作用是由于该纳米粒子(荧光探针)通过细胞内吞途径进入细胞，定位在溶酶体中，继续培养后纳米粒子在溶酶体中结构被破坏，稠环氧化噻吩从溶酶体中逃逸进入脂滴，随着脂滴代谢最后又进入溶酶体的过程。该稠环氧化噻吩D-A结构赋予其极性敏感性，使其在脂滴中通过激发呈现蓝色荧光，而在溶酶体中表现为红色荧光，通过监测荧光颜色的变化，就能监测脂滴-溶酶体之间的相互联系。

本发明的荧光探针进入细胞后在脂滴中呈现蓝色荧光，而在溶酶体中表现为红色荧光，通过荧光信号强度及颜色变化的监测，实现了短时间内脂滴的运动的高灵敏及高分辨示踪；通过长时间监测，示踪了脂滴的分布及代谢情况，首次发现了脂滴内成分能够被溶酶体回收。本发明的示踪脂滴和溶酶体相互作用的方法，灵敏度高，操作简单，有望用于研究脂滴的运动及功能探索。

与现有技术相比，本发明具有如下特点：

1、本发明直接利用稠环氧化噻吩制备了纳米粒子即荧光探针，利用纳米粒子实现了对脂滴-溶酶体相互作用的动态示踪。

2、本发明的荧光探针在细胞成像中的应用，生物兼容性高，操作简单。

3、本发明的应用，无需通过基因工程，引入探针，能够快速标记细胞。

4、本发明的应用，利用稠环氧化噻吩的双发射特性，通过简单监测荧光颜色的变化，就能检测脂滴和溶酶体之间的相互作用。

附图说明

图1为化合物TPA-BTTDO及所制备纳米粒子(TPA-BTTDONPs)紫外吸收(Abs对应曲线)及荧光发射光谱(PL对应的曲线)(A)，TPA-BTTDO在不同比例四氢呋喃和水的混合溶剂中的荧光发射光谱(B)及其荧光强度点线图(C)，TPA-BTTDO在不同溶剂(正己烷、甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺)中荧光发射光谱(D)，纳米粒子TPA-BTTDONPs的细胞毒性实验结果(E)，TPA-BTTDONPs的光稳定性图(F)；

图2(A～C)为TPA-BTTDONPs与HeLa细胞作用12h后，与溶酶体染料Lysotracker进行激光共聚焦成像(A)、共定位分析(B)及线性分析图(C)；

图2(D～F)为TPA-BTTDO NPs与HeLa细胞作用12h后与脂滴染料BODIPY进行激光共聚焦成像(D)、共定位分析(E)及线性分析图(F)；

图2(G～I)为HeLa细胞用油酸诱导6h时后，与TPA-BTTDONPs共培养12h后，再与BODIPY进行激光共聚焦成像(G)、共定位分析(H)及线性分析图(I)；其中标尺为10μm；

图3为TPA-BTTDONPs与HeLa细胞分别作用2h(A)、4h(B)、12h(C)和24h(D)后，分别与溶酶体Lysotracker和脂滴染料BODIPY进行激光共聚焦成像及共定位分析；标尺为10μm；图A为作用2h，B为作用4h，C为作用12h，D为作用24h(D)；图A～D中都包括TPA-BTTDONPs荧光通道成像图、溶酶体染料lysotracker荧光通道成像图、脂滴染料BODIPY荧光通道成像图、叠加图、TPA-BTTDONPs与Lysotracker共定位分析、TPA-BTTDONPs与BODIPY共定位分析；

图4(A～C)为HeLa细胞用油酸诱导6h后，与TPA-BTTDONPs共培养12h后与脂滴染料BODIPY激光共聚焦成像(A)、与BODIPY共定位分析(B)及对应的PL光谱(C)；图A中分别为TPA-BTTDONPs荧光通道成像图、脂滴染料BODIPY荧光通道成像图和叠加场；

图4(D～F)为HeLa细胞与TPA-BTTDONPs共培养2h后与溶酶体染料Lysotracker共定位成像(D)、与Lysotracker共定位分析(E)及对应的PL光谱(F)；标尺为10μm；图D中分别为TPA-BTTDONPs荧光通道成像图、溶酶体染料lysotracker荧光通道成像图和叠加场；

图5为实施例2中TPA-BTTDONPs示踪脂滴细胞内运动，分别为0min、2min、4min、7min、8min和10.5min时的激光共聚焦成像图，其中左上角方框中的图像为圆圈所指示部分的放大图；其中标尺为5μm；

图6A为实施例3中TPA-BTTDONPs进入细胞内，1、2、3、4天在HeLa细胞中的激光共聚焦成像图；

图6B～C为TPA-BTTDONPs与HeLa细胞作用第四天后，与Lysotracker(B)和线粒体染料Mitotracker(C)共定位成像结果及Lambda成像结果图；其中标尺为10μm；图B中分别为TPA-BTTDONPs荧光通道成像图、细胞器染料(脂滴染料BODIPY)通道成像图、叠加图、Lambda成像；图C中分别为TPA-BTTDONPs荧光通道成像图、细胞器染料(线粒体染料Mitotracker)通道成像图、叠加图、Lambda成像。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行具体地描述，但本发明的保护范围不限于以下实施例。

本发明的稠环氧化噻吩优选为TPA-BTTDO，其结构为：

TPA-BTTDO的合成路线如下：

TPA-BTTDO的制备步骤为：

(1)中间体1的合成

将3,6-二溴噻吩[3,2-b]并噻吩(1.49g，5mmol)、苯硼酸(2.44g，20mmol)、四(三苯基膦)钯(0.58g，0.5mmol)和碳酸钾(3.45g，20mmol)，加入250mL两口瓶中，抽换氮气三次，在氮气保护下注入THF(80mL)和H₂O(20mL)，注入完毕后80℃反应回流24h。加水淬灭反应，萃取、浓缩、做粉，用柱层层析法分离提纯得到中间产物1，产率75％。

(2)中间体2的合成

将中间体1(5.84g，20mmol)加入到250mL的单口瓶中，用100mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)进行溶解，将N-溴代丁二酰亚胺(NBS)(7.12g，40mmol)加入到反应瓶中，搅拌过夜，加水淬灭反应，萃取、浓缩、做粉，用柱层层析法分离提纯得到中间产物2，产率90％。

(3)中间体3的合成

将中间体2(4.51g，10mmol)加入到250mL的单口瓶中，用100mL的二氯甲烷(DCM)进行溶解，将间氯过氧苯甲酸(mCPBA)(13.56g，55mmol)加入到反应瓶中，搅拌过夜。用饱和硫代硫酸钠溶液进行还原，然后萃取、浓缩、做粉，用柱层层析法分离提纯得到中间产物3，产率67％。

(4)TPA-BTTDO的合成

将中间体3(0.18g，0.38mmol)、4-硼酸三苯胺(0.33g，1.14mmol)、四(三苯基膦)钯(37mg，0.05mmol)和碳酸钾(208mg，1.51mmol)加至100mL的两口瓶中，抽换氮气三次，在氮气保护下注入THF(40mL)和H₂O(10mL)，注入完毕后80℃反应回流24h。加水淬灭反应，萃取、浓缩、做粉，用柱层层析法分离提纯得到最终产物TPA-BTTDO，产率89％。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃),δ(ppm):7.60-7.57(m,2H),7.54-7.51(m,2H),7.45-7.41(m,3H),7.40-7.31(m,5H),7.30-7.23(m,9H),7.15-7.01(m,13H),6.92-6.87(m,4H).HRMS(C₅₄H₃₈N₂O₂S₂):m/z 810.1033[M⁺,calcd 810.2375]。

各实施例中各荧光探针TPA-BTTDONPs(纳米粒子)具体制备步骤为：称取1mg稠环氧化噻吩溶于300μL的THF中，称取2mgDSPE-PEG2000溶于600μL四氢呋喃(THF)中，将上述两种THF溶液混在一起，超声条件下加入9mL超纯水中，用氮气鼓吹上述混合体系2小时除去THF后，置于透析袋(截留分子量为3.5kd)中透析2天后，置于4摄氏度备用。

实施例1

一种基于稠环氧化噻吩的荧光探针在细胞成像中的应用，包括以下步骤：

(1)在1mL的细胞培养体系(DMEM溶液)中，加入TPA-BTTDONPs，与HeLa细胞37℃共培养8h；TPA-BTTDONPs在细胞培养体系中的浓度为2.4μg/mL；

(2)用PBS洗3次后去除未与细胞作用的TPA-BTTDONPs，分别与溶酶体染料Lysotracker和脂滴染料BODIPY作用20min；Lysotracker和BODIPY在细胞培养体系中的浓度分别为100nM和10μg/mL，用激光共聚焦显微镜成像。

图1为化合物TPA-BTTDO及所制备纳米粒子(TPA-BTTDONPs)紫外吸收(Abs对应曲线)及荧光发射光谱(PL对应的曲线)(A)，TPA-BTTDO在不同比例四氢呋喃和水的混合溶剂中的荧光发射光谱(B)及其荧光强度点线图(C)，TPA-BTTDO在不同溶剂(正己烷、甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺)中荧光发射光谱(D)，纳米粒子TPA-BTTDONPs的细胞毒性实验结果(E)，TPA-BTTDONPs的光稳定性图(F)。图F中BODIPY为脂滴染料。

本发明将TPA-BTTDO制备成纳米粒子，使用的TPA-BTTDONPs，其发光行为基本没有受到影响(图1A)，并且通过溶剂化效应发现TPA-BTTDO对溶剂极性比较敏感(图1B)，且其具有良好的AIE性能(图1C和1D)。进一步研究发现该TPA-BTTDONPs具有良好的光稳定性及生物兼容性(图1F和1E)，能用于长时间示踪研究。

图2(A～C)为TPA-BTTDO NPs与HeLa细胞作用12h后，与溶酶体染料Lysotracker进行激光共聚焦成像(A)、共定位分析(B)及线性分析图(C)；图2(D～F)为TPA-BTTDO NPs与HeLa细胞作用12h后与脂滴染料BODIPY进行激光共聚焦成像(D)、共定位分析(E)及线性分析图(F)；图2(G～I)为HeLa细胞用油酸诱导6h时后，与TPA-BTTDONPs共培养12h后，再与BODIPY进行激光共聚焦成像(G)、共定位分析(H)及线性分析图(I)；其中标尺为10μm。

成像实验显示该TPA-BTTDONPs与细胞作用12小时以后，能成功跨过细胞膜进入到细胞内，通过与溶酶体染料(Lysotracker)共定位分析发现其与Lysotracker共定位效果一般，共定位系数仅有0.55，这说明仅有部分纳米粒子分布在溶酶体中。进一步分析发现，未进入溶酶体的纳米粒子与脂滴染料有着较好的共定位效果，由此说明该TPA-BTTDONPs主要分布在溶酶体和脂滴中。为了研究该TPA-BTTDONPs对脂滴及溶酶体的结合倾向性，我们用油酸处理细胞诱导脂滴的生成，细胞与纳米粒子共培养后CLSM成像结果及共定位分析显示，该TPA-BTTDONPs几乎全部分布在脂滴中(图2)。说明该TPA-BTTDONPs对脂滴具有选择性成像。

研究了随着时间的变化该TPA-BTTDONPs在细胞内的分布情况。鉴于纳米粒子是通过细胞内吞进入细胞内，我们利用CLSM研究该TPA-BTTDONPs与溶酶体、脂滴共定位情况。图3为TPA-BTTDONPs与HeLa细胞分别作用2h(A)、4h(B)、12h(C)和24h(D)后，分别与溶酶体Lysotracker和脂滴染料BODIPY进行激光共聚焦成像及共定位分析；标尺为10μm；图A为作用2h，B为作用4h，C为作用12h，D为作用24h(D)；图A～D中都包括TPA-BTTDONPs荧光通道成像图、溶酶体染料lysotracker荧光通道成像图、脂滴染料BODIPY荧光通道成像图、叠加图、TPA-BTTDONPs与Lysotracker共定位分析、TPA-BTTDONPs与BODIPY共定位分析。

如图3所示，由于其通过细胞内吞跨过细胞膜进入细胞质，所以该TPA-BTTDONPs首选进入到溶酶体，这与我们预期的一致。继续观察发现，4小时后，该TPA-BTTDONPs与溶酶体染料共定位降低，结合之前的实验结果可以知道此时部分TPA-BTTDO开始从溶酶体逃逸并进入脂滴。随着培养时间延长，进入脂滴的TPA-BTTDO逐渐增加(与BODIPY的共定位系数增加)，但因为正常情况下，脂滴数目较少，所以TPA-BTTDO并未全部进入脂滴，仍有部分定位在溶酶体内。

图4(A～C)为HeLa细胞用油酸诱导6h后，与TPA-BTTDONPs共培养12h后与脂滴染料BODIPY激光共聚焦成像(A)、与BODIPY共定位分析(B)及对应的PL光谱(C)；图A中分别为TPA-BTTDONPs荧光通道成像图、脂滴染料BODIPY荧光通道成像图和叠加场；图4(D～F)为HeLa细胞与TPA-BTTDONPs共培养2h后与溶酶体染料Lysotracker共定位成像(D)、与Lysotracker共定位分析(E)及对应的PL光谱(F)；标尺为10μm；图D中分别为TPA-BTTDONPs荧光通道成像图、溶酶体染料lysotracker荧光通道成像图和叠加场。

通过研究该TPA-BTTDONPs在溶酶体及脂滴中的发光光谱，发现其发光颜色具有明显的差异，在溶酶体内时呈红色荧光(Em＝610nm)；而进入脂滴后呈蓝光发射，发射波长明显蓝移(Em＝500nm)。而发射红光和蓝光时，分别与溶酶体染料Lysotracker和脂滴染料BODIPY共定位效果很好，进一步证明发射蓝光时分布在脂滴中，而发射红色荧光时则分布在溶酶体中(图4)，在溶酶体及脂滴中的双发射模式，有利于开展对脂滴的形成及功能进行特异性示踪研究。

实施例2

一种稠环氧化噻吩用于示踪脂滴运动，包括以下步骤：

(1)将HeLa细胞与混有油酸(100μM)的培养基共培养6h；

(2)用PBS洗3次后，在1mL的细胞培养体系(DMEM溶液)中，加入TPA-BTTDONPs)与HeLa细胞37℃共培养8h；TPA-BTTDONPs在细胞培养体系中的浓度为2.4μg/mL；

(3)用PBS洗3次后去除未与细胞作用的TPA-BTTDONPs，激光共聚焦显微镜观察。

图5为实施例2中TPA-BTTDONPs示踪脂滴细胞内运动，分别为0min、2min、4min、7min、8min和10.5min时的激光共聚焦成像图，其中左上角方框中的图像为圆圈所指示部分的放大图；其中标尺为5μm。

图5为实施例2中HeLa细胞通过油酸诱导，细胞内出现了大量脂滴，且TPA-BTTDONPs成功进入脂滴内。通过检测荧光信号，可以清晰监测到脂滴在细胞内的快速运动及分布，具有很高的灵敏度及分辨率，且能清晰看到脂滴的分裂和融合。

实施例3

一种稠环氧化噻吩用于示踪脂滴和溶酶体的相互作用，包括以下步骤：

(1)将HeLa细胞与混有油酸(100μM)的培养基共培养6h；

(2)用PBS洗3次后，在1mL的细胞培养体系(DMEM溶液)中，加入TPA-BTTDONPs与HeLa细胞37℃共培养8h；TPA-BTTDONPs在细胞培养体系中的浓度为2.4μg/mL；

(3)用PBS洗3次后去除未与细胞作用的TPA-BTTDONPs，激光共聚焦显微镜观察，每隔12h观察一次。

图6A为实施例3中TPA-BTTDONPs进入细胞内，1、2、3、4天在HeLa细胞中的激光共聚焦成像图；图6B～C为TPA-BTTDONPs与HeLa细胞作用第四天后，与Lysotracker(B)和线粒体染料Mitotracker(C)共定位成像结果及Lambda成像结果图；其中标尺为10μm；图B中分别为TPA-BTTDONPs荧光通道成像图、细胞器染料(脂滴染料BODIPY)通道成像图、叠加图、Lambda成像；图C中分别为TPA-BTTDONPs荧光通道成像图、细胞器染料(线粒体染料Mitotracker)通道成像图、叠加图、Lambda成像。

通过长时间监测，我们发现TPA-BTTDONPs在进入脂滴第一天，细胞内的发射呈蓝光。从第二天开始，大部分荧光依然为蓝色，但是开始有很少量的红色荧光出现。第四天以后，基本全部变成红色。考虑到脂滴是重要的储能细胞器，所以将从脂滴中代谢出来的TPA-BTTDO与线粒体染料共定位分析，发现与线粒体定位效果很不好，说明在脂滴中被代谢的TPA-BTTDO并没有进入线粒体。进一步与溶酶体染料定位分析发现，与其有非常好的定位效果，说明TPA-BTTDO在脂滴中代谢最后进入溶酶体。通过对TPA-BTTDO荧光信号的追踪，有效示踪了脂滴的形成及代谢过程。

Claims (10)

1.一种基于稠环氧化噻吩的荧光探针，其特征在于：为包裹稠环氧化噻吩的纳米粒子；所述稠环氧化噻吩为以下结构式的一种：

其中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆为独立的氢，取代或未取代的具有1～20个碳原子的直链、支链或者环状烷基链，取代或未取代的芳基；R₁～R₆相同或者不同。

2.根据权利要求1所述基于稠环氧化噻吩的荧光探针，其特征在于：

所述取代或未取代的芳基为下述式a～r所示结构中的一种：

其中，n为自然数，R′为氢原子或者为相同或不同的，对称或者不对称的具有1～20个碳原子的直链、支链或者环状烷基链，或者烷基上的一个或多个碳被氧原子、烯基、炔基、芳基、羰基、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基或酯基取代，氢原子被氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、苯基、联苯基、芴基、芘基、蒽基、咔唑苯基、咔唑基、噻吩基、联噻吩基、稠噻吩基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、噻吩并环戊二烯基、萘氨基苯基或二吡啶胺基、苯并三唑、米基硼、三苯基氧化膦、二苯胺基、三苯胺基、二苯并噻吩基、苯并双噻吩基、9,10-二氢-9,9-二甲基吖啶基、9,10-二氢-9,9-二苯基吖啶基或10-H-螺[吖啶-9,9’-芴]基取代。

3.根据权利要求1所述基于稠环氧化噻吩的荧光探针，其特征在于：所述稠环氧化噻吩为式(I)中化合物TPA-BTTDO：

4.根据权利要求1所述基于稠环氧化噻吩的荧光探针，其特征在于：

所述荧光探针为采用基质包裹稠环氧化噻吩的纳米粒子。

5.根据权利要求4所述基于稠环氧化噻吩的荧光探针，其特征在于：

所述基质为DSPE-PEG2000(聚乙二醇2000)、壳聚糖、F127、PSMA中的至少一种。

6.根据权利要求1～5任一项所述基于稠环氧化噻吩的荧光探针在细胞成像中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述基于稠环氧化噻吩的荧光探针在溶酶体和脂滴成像中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述基于稠环氧化噻吩的荧光探针用作溶酶体以及脂滴的荧光成像染料，脂滴-溶酶体间相互作用的示踪剂以及脂滴形成、脂滴代谢的示踪剂。

9.根据权利要求6～8任一项所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：

(1)利用共沉淀法，采用基质包裹稠环氧化噻吩，制备纳米粒子，获得荧光探针；

(2)将得到的纳米粒子即荧光探针加入细胞培养体系与细胞共培养，实现脂滴和溶酶体的荧光成像。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：步骤(1)中所述纳米粒子具体通过以下方法制备得到：在有机溶剂中，将稠环氧化噻吩与基质混合均匀，加入水，共沉淀，获得纳米粒子；所述稠环氧化噻吩与基质的质量比为1:0.5～1:10；所述有机溶剂为四氢呋喃；

步骤(2)中所述细胞培养体系为磷酸缓冲盐溶液、Hank’s缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、DMEM细胞培养基中的至少一种；

步骤(2)中所述共培养的温度为4～37℃；

步骤(2)中所述共培养的时间为1～96h；

步骤(2)中所述纳米粒子在细胞培养体系中的浓度为0.0001～100μg/mL；

步骤(2)中所述细胞为肿瘤细胞。