CN109715618A - 作为前列腺癌检测生物标志物的尿多胺 - Google Patents

作为前列腺癌检测生物标志物的尿多胺 Download PDF

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Abstract

提供了使用镧系配合物或DNA加帽的金纳米颗粒检测并量化尿多胺的新的高灵敏度、高特异性的方法。

Description

作为前列腺癌检测生物标志物的尿多胺
对相关申请的交叉引用
本申请要求2016年10月17日提交的美国临时专利申请序列号62/409,361和2017年3月16日提交的美国临时专利申请序列号62/471,989的优先权，其公开内容通过引用并入。
技术领域
本公开涉及用于检测和量化尿多胺的方法和用于其中的组合物。本文所述的方法和组合物可用于诊断患者的前列腺癌。
背景技术
前列腺癌(PCa)是男性中第二大常见癌症，并且是死亡的主要原因之一，其在包括许多西欧国家和美国在内的许多发达国家中造成了重大的公共卫生影响。
PCa是一种在全世界范围内越来越具有重要意义的疾病。香港在这个公共卫生问题上也不例外。根据香港特别行政区(HKSAR)医院管理局的香港癌症资料统计中心的统计数据，PCa在男性最常见的癌症中排名第3，在致命最严重的癌症中排名第5。鉴于早期可治疗PCa的潜伏期及其晚期可辨别阶段的致死性，迫切需要更加灵敏、精确的诊断方法来检测早期PCa，从而可以显著改善治疗效果，同时挽救更多生命。
目前对PCa的诊断依赖于直肠指检(DRE)和血清前列腺特异性抗原(PSA)测试，随后进行经直肠超声前列腺活检(TRUSPB)确认。虽然DRE是一个简单的程序，但它会给患者带来不适。DRE也是一项对研究者依赖性强的技术，导致PCa诊断的精确性较差。特别是，DRE不是用于PCa早期检测的好工具，因为大多数DRE阳性PCa结果都是晚分期的。虽然PSA测试在检测早期PCa方面表现出良好的灵敏性，但在患有良性前列腺增生(BPH)和前列腺炎等患者中也观察到PSA水平升高，这降低了PSA对PCa的特异性。
在PSA测试的灰色区域内，阳性预测值的平均值较小，为21％。已经开发了多种PSA方法，例如移行区的PSA密度、游离/总PSA比、p2PSA和前列腺健康指数，以提高PSA测量的性能。
经直肠超声引导的前列腺活检(TRUSPB)是目前最常见的用于组织学确认PCa诊断的诊断方法。然而，该手术非常耗费人力并且导致患者的明显不适和并发症。
由于血清PSA测试的特异性较差，许多未患有PCa的患者会进行TRUSPB，从而遭受其潜在的并发症。因此，必须开发一种更有效的检测试剂盒，用于对PCa进行精确早期筛查。
本公开的目的是提供用于诊断患者的PCa的方法，包括检测一种或多种尿多胺(例如，腐胺(Put)、亚精胺(Spd)和/或精胺(Spm))。尿多胺可用作PCa检测的生物标志物。通过比较诊断为PCa的患者、诊断为良性前列腺增生(BPH)的患者和健康对照(HC)的尿多胺浓度来确定尿多胺的诊断能力。本文还提供了用于检测和量化患者中尿多胺的量的组合物和方法。
发明概述
因此，本公开的目的是通过使用镧系配合物或AuNP开发新的高灵敏性和特异性的变色多胺示踪剂，并检查来自不同年龄组和前列腺癌阶段的患者的平均多胺尿浓度，以验证多胺作为早期前列腺癌筛查的值得信赖的生物标志物。
在本公开的第一方面，提供了式(1)的化合物：
其中，
Ln是镧系金属；且
每个M都独立地选自Na、Li和K；或两个M一起表示Mg或Ca。
在本公开第一方面的第一实施方案中，提供了式(1)的化合物，其中镧系元素是铕。
在本公开第一方面的第二实施方案中，提供了式(1)的化合物，其中M是Li。
在本公开的第二方面，提供了检测一种或多种尿多胺的方法，包括以下步骤：
a.提供尿样；
b.使尿样与式(1)的化合物接触，从而形成测试样品；以及
c.检测测试样品中一种或多种尿多胺的存在。
在本公开第二方面的第一实施方案中，提供了一种方法，其中从人获得尿样。
在本公开第二方面的第二实施方案中，提供了一种方法，其中从人获得尿样，并且一种或多种尿多胺的浓度用于确定人是否患有前列腺癌。
在本公开的第三方面，提供了检测一种或多种尿多胺的方法，包括以下步骤：
d.提供尿样；
e.使尿样与包含金纳米颗粒和至少两种配体的纳米颗粒接触，从而形成测试样品，所述至少两种配体包含柠檬酸盐和单链DNA，其中单链DNA与金纳米颗粒的摩尔比为约4:1至约3:1；
f.检测测试样品中一种或多种尿多胺的存在。
在本公开第三方面的第一实施方案中，提供了一种方法，其中单链DNA与金纳米颗粒的摩尔比为约3.2:1至约3.0:1。
在本公开第三方面的第二实施方案中，提供了一种方法，其中单链DNA与金纳米颗粒的摩尔比为约3.2:1至约3.0:1，且纳米颗粒的平均直径为约1nm至约100nm。
在本公开第三方面的第三实施方案中，提供了一种方法，其中单链DNA与金纳米颗粒的摩尔比为约3.2:1至约3.0:1，且纳米颗粒的平均直径为约2nm至约10nm。
在本公开第三方面的第四实施方案中，提供了一种方法，其中单链DNA具有约5至约50个核苷酸。
在本公开第三方面的第五实施方案中，提供了一种方法，其中在使尿样与纳米颗粒接触的步骤之前，已经使尿样经历了纯化步骤，以除去蛋白质或盐。
在本公开第三方面的第六实施方案中，提供了一种方法，其中在检测一种或多种尿多胺的存在的步骤中测试样品的pH为约2至约8。
在本公开第三方面的第七实施方案中，提供了一种方法，其中检测一种或多种尿多胺的存在的步骤还包括测定一种或多种尿多胺的浓度。
在本公开第三方面的第八实施方案中，提供了一种方法，其中检测一种或多种尿多胺的存在的步骤还包括测定一种或多种尿多胺的浓度，且确定浓度的步骤包括将测试样品的颜色与参考比色图表进行视觉比较或光谱方法。
在本公开第三方面的第九实施方案中，提供了一种方法，其中从人获得尿样。
在本公开第三方面的第十实施方案中，提供了一种方法，其中一种或多种尿多胺的浓度用来确定人是否患有前列腺癌。
在本公开第三方面的第十一实施方案中，提供了一种方法，其中，在测试样品中，单链DNA的浓度为约200nM至约300nM，并且金纳米颗粒的浓度为约50nM至约100nM。
在本公开第三方面的第十二实施方案中，提供了一种方法，其中在测试样品中，单链DNA的浓度为约240nM至约260nM，并且金纳米颗粒的浓度为约75nM至约87nM。
在本公开的第四方面，提供了包含纳米颗粒和用于实施第三方面的方法的说明书的试剂盒，其中纳米颗粒包含金纳米颗粒和至少两种配体，所述至少两种配体包含柠檬酸盐和单链DNA，其中单链DNA与金纳米颗粒的摩尔比为约4:1至约3:1。
本领域技术人员应当理解，除了具体描述的那些之外，本文描述的发明可进行变化和修改。
本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还包括本说明书单独或共同提及或指出的所有步骤和特征，以及所述步骤或特征的任何和所有组合或任何两个或更多个所述步骤或特征。
通过审阅随后的描述，本发明的其他方面和优点对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图简要说明
通过以下对本文描述的各种实施方案的描述，结合附图，本公开的上述目的和特征以及其他目的和特征将变得显而易见，在所述附图中：
图1显示了1000ppb混合多胺标准品的重叠UPLC-MS/MS SRM的色谱图(显示了0-10min(分钟))。Put(大峰，tR＝4.3min)、Put-d8(小峰，tR＝4.3min)、Spd(大峰，tR＝6.6min)、Spd-d8(小峰，tR＝6.6min)、Spm(大峰，tR＝7.8min)和Spm-d8(小峰，tR＝7.8min)。
图2A显示了PCa、BPH以及HC中归一化Put值的分布。
图2B显示了PCa、BPH以及HC中归一化Spd值的分布。
图2C显示了PCa、BPH以及HC中归一化Spm值的分布。
图3显示了归一化Put、Spd以及Spm值的接受者操作特征分析。
图4显示了多胺代谢途径(只侧重于Put、Spd以及Spm)。
图5A显示了put的校准图(r2＝0.9996)。
图5B显示了Spd的校准图(r2＝0.9993)。
图5C显示了Spm的校准图(r2＝0.9995)。
图6显示了血清PSA测试的接受者操作特征曲线。
图7A显示了化合物1(EuL1)的化学结构。
图7B显示了基于变色的镧系元素的多胺化学传感器的示意图，其中设计基于多胺激活的f-f发射。
图8A显示了化合物1(1μM)与Spm(1μM)结合后Eu发射增强。
图8B显示了化合物1(1μM)与Spd(50μM)结合后Eu发射增强。
图8C显示了化合物1相对于水性DMSO(3％-DMSO)中各种生物胺和阳离子对Spm和Spd的选择性。
图9A显示了对10份前列腺癌患者尿样中的Spm水平的校准。
图9B显示了用于UV测试的10份选择的前列腺癌患者尿样中的Spm水平的浓度。
图10所示的铕化合物1(10μM，在水溶液中)的照片显示了在UV激发下、在存在10份前列腺癌患者尿样的情况下的颜色变化。检查了一份来自研究生的尿样作为对照实验。
图11显示了定义尿样中多胺浓度的标准添加方法。
图12显示了柠檬酸盐-AuNP溶液的TEM图像。
图13显示了目前开发的适体传感器(aptasensor)的示意图。
图14显示了DNA对Spm校准图的影响。
图15显示了pH对Spm校准图的影响。
图16所示的吸收光谱显示了DNA长度效应(DNA序列：
12mer:CGA CAA CCA CAA；24mer:CGA CAA CCA CAA CAC ACA ATC TGA；
36mer:CGA CAA CCA CAA CAC ACA ATC TGA CGA CAA CCA CAA)。
图17显示了Spm诱导的DNA-AuNP(AuNP:80nM；DNA:25nM；Spm:6μM)聚集的动力学。插图：Abs610、Abs512及其与时间的比例。
图18A所示的吸收光谱显示了Spm在空白基质中的DNA加帽(DNA capped)的AuNP上诱导的聚集。插图：归一化Abs610/Abs512对Spm浓度的图。
图18B显示了Spm对AuNP溶液视觉颜色的影响。
图19所示的DLS和ζ-电势测量结果显示了Spm诱导的DNA-AuNP的聚集。
图20所示的吸收光谱显示了在不存在DNA的情况下Spm诱导的聚集。
图21A显示了在0μM DNA浓度下每次注射的热流量随时间的变化。
图21B显示了在0.5μM DNA浓度下每次注射的热流量随时间的变化。
图21C显示了在1μM DNA浓度下每次注射的热流量随时间的变化。
图21D显示了在3μM DNA浓度下每次注射的热流量随时间的变化。
图21E显示了在0μM DNA浓度下每个峰的积分随Spm与AuNP摩尔比的变化。
图21F显示了在0.5μM DNA浓度下每个峰的积分随Spm与AuNP摩尔比的变化。
图21G显示了在1μM DNA浓度下每个峰的积分随Spm与AuNP的摩尔比的变化。
图21H显示了在3μM DNA浓度下每个峰的积分随Spm与AuNP的摩尔比的变化。
图22显示了目前的适体传感器在不同DNA浓度下的选择性特征。在每种情况下，将对照(仅水)和Spm分别归一化为0和100％。
图23A显示了每次向DNA注射Spm的热流量随时间的变化。
图23B显示了每个峰的积分随Spm与DNA摩尔比的变化。插图：热力学参数。
图24显示了在加入不同稀释因子的人工尿后DNA-AuNP的吸收光谱。
图25所示的吸收光谱显示了Spm在人工尿基质中的DNA加帽的AuNP上诱导的聚集。插图：Abs512对Spm浓度的图。
图26通过开发的适体传感器显示了尿组分与Spm的交叉反应性。在每种情况下，将对照(水)和Spm分别归一化为0和100％(所用浓度＝4μ4)。
图27显示了开发的适体传感器通过两种不同途径进行Spm感测的示意图。
图28A显示了尺寸为4nm的柠檬酸盐-AuNP的TEM图像。插图：放大的TEM图像。
图28B显示了尺寸为13nm的柠檬酸盐-AuNP的TEM图像。插图：放大的TEM图像。
图28C显示了尺寸为27nm的柠檬酸盐-AuNP的TEM图像。插图：放大的TEM图像。
图29显示了DNA吸附对AuNP的DLS结果的影响。(AuNP:80nM，在4mM BR-缓冲液中，pH＝3.29)
图30显示了在不同NaCl浓度下防止4nm AuNP聚集的DNA保护作用。(DNA浓度：0nM、50nM和250nM)
图31显示了AuNP尺寸对Spm校准图的影响。(DNA浓度：25nM；pH＝3.29；AuNP浓度：对于4nm，80nM；对于13nm，2.38nM；对于27nm，0.24nM；选择浓度使得它们在其等离子体峰值处产生相似的吸光度值；等离子体峰值波长：对于4nm，512nm；对于13nm，523nm；对于27nm，532nm)
图32A显示了脱蛋白前四份尿样的基质效应。
图32B显示了脱蛋白后四份尿样的基质效应。
图32C显示了脱蛋白并将DNA浓度增加至100nM后四份尿样的基质效应。
图33显示了尿、空白(H2O)和人工尿的基质效应的比较。
发明详述
本公开的范围并不限于本文描述的任何具体实施方案。提供以下实施方案仅用于举例说明。
通过比较诊断为PCa的患者、BPH患者和健康患者的每一患者中的浓度，评估作为用于PCa检测的生物标志物的三种尿多胺(Put、Spd和Spm)。通过经过充分验证的色谱方法，已证明尿Spm可用于区分PCa与包括BPH在内的非癌症疾病状态，并当使用4.0ng/ml作为截止点时，其可有助于作为血清PSA测试的二级筛查工具，以解决血清PSA测试高假阳性率的问题。然后针对该新型生物标志物开发了两种试剂盒，并在本文中进行了描述。
第一部分：评估多胺作为PCa生物标志物的作用
临床样品
用于临床样品采集的三个患者子集如下指定：诊断为PCa的患者、诊断为BPH的患者和HC。从所有受试者获得了书面同意。香港中文大学临床研究伦理委员会审查并批准将患者纳入临床研究中，并且该研究严格按照该委员会制定的指南进行。在2014年10月至2016年3月间，在前列腺活检前的午餐后中午时间，从165名血清PSA水平大于4.0ng/ml的男性患者(年龄>50)获得尿样。只有在这些患者未患有可能会产生偏倚效应的临床活性尿路感染时，才接受他们的尿样。当患者不同意该研究，或他们在临床上显示其他类型癌症的证据时，则将他们排除在抽样方案之外。
在这165例患者中，使用TRUSPB作为参考标准，66例被诊断为患有PCa，其余99例没有恶性肿瘤的证据(NEM)。为了进一步对这99例NEM患者进行分类，使用前列腺体积>30ml的标准作为标准，发现88例患有BPH，而其他患者被认为是HC。所有病理学检查均在经验丰富的泌尿病理学家的监督下，在香港的香港中文大学威尔斯亲王医院进行。
表1显示了样品的所有临床病理学特征。所有样品均储存在-20℃直至测量。所有测量均在采集后三个月内进行。
表1.患者的临床病理学特征
材料和化学品
从TEDIA获得甲醇(HPLC/光谱级，≥99.9％)。从ACS获得乙腈(HPLC级，≥99.9％)。在MilliQ Direct Water Purification System(Millipore,USA)中纯化水。所有的标准化合物，包括1,4-丁二胺(Put，99％)、亚精胺(Spd，≥99.0％)、精胺(Spm，≥99.0％)、1,4-二氨基(丁烷-d8)二盐酸盐(98原子％D)、亚精胺-(丁烷-d8)三盐酸盐(98原子％D，95％CP)、精胺-(丁烷-d8)四盐酸盐(97原子％D，95％CP)以及七氟丁酸(HFBA，≥99.0％)，均购自Sigma-Aldrich(中国香港)，并在未进一步纯化的情况下使用。强阴离子交换固相萃取(SPE)柱获得自Phenomenex(Strata，100mg/3mL，USA)。使用从Eppendorf(5417R，中国香港)获得的冷冻离心机进行离心。
肌酐的测定
利用LabAssayTM肌酐测定(Wako，日本)，测定尿样中的肌酐浓度。简而言之，使尿样和标准品解冻、脱蛋白并离心。分离上清液，并使之在碱性溶液中与苦味酸反应，以通过Jaffe反应产生橘色冷凝物，所述Jaffe反应如在Bonsnes RW,Taussky HH.On thecolorimetric determination of creatinine by the Jaffé reaction.J BiolChem.1945；158(3):581-9中所报道的。通过利用Clariostar Monochromator酶标仪(Clariostar Monochromator Microplate Reader，BMG Labtech，香港)测量吸光度来量化样品中的总肌酐。在样品制备之前，以适当的稀释因子用水稀释超过校准点的浓缩尿样。每个样品至少测定两次，其相对标准偏差(RSD)小于15％。
用于测定多胺的标准制品
在水中单独制备每一种多胺(Put、Spm、Spd)的储备液(5000μg/ml)。将三种储备液混合并稀释，得到中间标准品(50μg/ml)，然后将中间标准品用于制备一系列工作标准品，其中多胺在水中的浓度为10、25、50、100、250、500、1000ng/ml。对于内标，在水中单独制备每种多胺(Put-d8、Spm-d8、Spd-d8)的储备液(5000μg/ml)。将三种储备液混合并稀释，得到在水中的内标(IS)工作溶液(1μg/ml)。
用于测定多胺的样品/标准品预处理
样品制备程序遵循等(等.Analysis of free,mono-anddiacetylated polyamines from human urine by LC-MS/MS.J Chromatogr B AnalytTechnol Biomed Life Sci.2013；941:81-9)开发的方法，其中进行了稍许改良。首先，将尿样/标准品自然解冻并在13000rpm和室温离心5分钟。将120μL尿样/标准品上清液和60μL的IS工作溶液与420μL水混合。使550μL该充分混合的溶液通过已经分别用1mL甲醇和水调节和平衡的SPE柱(SPE cartridge)。然后使450μL水通过所述柱以洗脱出所有多胺。然后将400μL的这些SPE处理的样品与100μL的10％HFBA混合，并且最终的混合物准备用于仪器分析。在制备样品之前，以适当的稀释因子用水稀释超过校准点的浓缩尿样。
用于测定多胺的质量控制样品
对于每批样品分析，分析了三种质量控制(QC)工作溶液，以验证校准曲线的准确性并确保批次之间的可比性。使用来自我们研究组的经分析的对照尿样制备溶液。测定对照尿样的多胺浓度，然后平均混合，得到合并的尿样。然后，通过将该合并的尿样与标准溶液混合，制备具有不同多胺浓度范围(低、中和高)的三种QC工作溶液。对于多胺浓度低的QC工作溶液，将SPE处理的合并尿样与SPE处理的10ng/ml标准品以1:7的比例混合。对于多胺浓度中等的QC工作溶液，将SPE处理的合并尿样与SPE处理的100ng/ml标准品以1:1的比例混合。对于多胺浓度高的QC工作溶液，将SPE处理的合并尿样品与SPE处理的1000ng/ml标准品以1:1的比例混合。
稳定性研究
对于稳定性研究，等之前已经证明，标准混合物和QC样品在以下情况中是稳定的：在室温储存6小时后(短期稳定性)、分别在-20℃和-80℃储存两个月后(长期稳定性)、以及在制备样品前进行三轮冷冻和解冻循环后(冻融稳定性)。为了进一步验证，分析了标准品和选定尿样中多胺和肌酐的含量。发现在5轮冷冻和解冻循环后，当在-20℃储存时，所有内容物在6个月的时间内仍然稳定。对于SPE处理的样品，当在4℃储存时，其稳定至少两天，并且，当在-20℃储存时，其稳定高达一年。
仪器和统计分析
通过超高效液相色谱法联合三重四极杆质谱仪(UPLC-MS/MS)进行多胺的量化。利用Agilent 1290 Infinity Quaternary LC System进行LC分离，而质量分析则由配备有Agilent射流技术电喷雾电离源(Agilent Jet Stream technology electrosprayionization source)的Agilent 6460三重四极杆质谱仪进行。使用的柱是通过AgilentSB-C18保护柱(2.1x5mm，1.8μm)保护的Agilent EclipsePlus C18 RRHD(2.1x50mm，1.8μm)。
如下优化LC洗脱曲线：洗脱液A是具有0.1％HFBA的水，而洗脱液B是具有0.1％HFBA的乙腈。在10分钟内使洗脱液A从95％降至60％。然后在1分钟内使洗脱液A的梯度从60％降低至10％。然后使梯度保持恒定5分钟。然后在1分钟内使梯度从10％增加至95％，然后保持恒定8分钟。(总运行时间＝25分钟)。
将自动进样器和柱温度分别设定为4℃和35℃。通过用洗脱液B以Flush Port模式进行5秒针洗(5-second needle wash)3次完成注射。每次注射10μL。
对于源参数(source parameter)，干燥气体(氮气)温度设定为300℃，流速为5l/min。雾化器压力为45psi。将保护气体(sheath gas)温度设定为250℃，流速为11l/min。将毛细管电压设定为3500V。对于质量检测，进行了预定的多反应监测(MRM)。MRM转换的信息见表2。
表2.Put、Spm、Spd的MRM转换、驻留时间、裂解电压、碰撞能量和细胞加速器电压及其相应的内标(*表示计量转换(quantifier transition))
使用Agilent MassHunter Workstation软件计算结果。线性拟合校准曲线，而没有任何加权。相关系数不应小于0.995。为了确保准确性，每个校准点和质量控制工作溶液的允收值为±30％。对于精度验证，在每次每一个10-样品注射后，注射250ng/ml标准品并检查其是否可以复制(±15％)。
对于统计分析，通过使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software，国加利福尼亚洲圣地亚哥)，获得接收者操作特征(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)。在基于学生t检验的比较期间，p值小于0.05(双尾)被认为是统计学上显著的。
结果
尿多胺含量
通过UPLC-MS/MS从所有样品中成功分离和量化Put、Spd、Spm及其相应的氘代内标(图1)。校准曲线均令人满意，其中r2不小于0.995(图5A-图5C)，并且所有QC测量均通过，这保证了不同日期分析的样品之间的可比性。然后将每位患者的平均尿多胺浓度归一化至其尿肌酐水平，并表示为μmol/g肌酐。(肌酐结果，参见表3)这是为了补偿阻碍实际量测量的任何利尿过程，参考Jung K.Enzyme activities in urine:how should we expresstheir excretion？A critical literature review.Eur J Clin Chem ClinBiochem.1991；29:725-9。
表3.所有患者的肌酐结果概要
表4和图2A至图2C显示了不同子集的归一化多胺水平的数据和图形比较：
表4.不同子集中归一化的多胺含量的列统计信息。SEM表示平均值的标准误差。
图2A至图2C中的黑条表示每个子集的平均值，而误差条表示相应的SEM。
在所监测的三种多胺中，与包括BPH患者和HC的非癌症病例相比，在PCa患者中归一化的Spm在统计学方面(未配对学生t检验)表现出显著降低。详细地，PCa的平均值为1.47，相比而言，BPH的为5.87、HC的为5.43。t检验中p值<0.0001，这意味着在p<0.05的预设标准下的显著差异。对于归一化的Put和Spd，通过观察它们的分布或通过t检验比较它们的平均值，没有观察到明显的增强或抑制。(Put：在PCa中为1.63，在BPH中为1.21，在HC中为0.65；Spd：在PCa中为0.52，在BPH中为0.94，在HC中为2.71)。
接收者操作特征分析
图3显示了三种归一化的多胺的ROC曲线，用于评估入选的多胺对PCa诊断的诊断能力。归一化的Put、Spd和Spm的AUC分别为0.63±0.05、0.65±0.05和0.83±0.03。Spm的阈值和相应灵敏度和特异性列于表5中。
表5.不同阈值下归一化的Spm的灵敏度和特异性
科学家已经对多胺与癌症之间的关系进行了长期研究。一般认为，血液或尿中多胺水平的增加反映了快速生长的癌组织/细胞中多胺合成水平的提高，因为它们与细胞增殖增加、凋亡减少以及影响肿瘤浸润和转移的基因表达增加有关。
Russell DH.Increased polyamine concentrations in the urine of humancancer patients.Nat New Biol.1971；233(39):144-5首先报道了各种实体瘤中尿多胺水平的增加，所述实体瘤包括卵巢畸胎瘤、直肠癌、淋巴肉瘤、骨原性肉瘤和急性髓细胞白血病。Kyoko Hiramatsu等,N1,N12-Diacetylspermine as a Sensitive and Specific NovelMarker for Early-and Late-Stage Colorectal and Breast Cancers.Clin CancerRes.2005；11(8):2986-90报道了患有早期和晚期结肠直肠癌和乳腺癌的患者的N1,N12–二乙酰精胺的增加，并确认了其作为这些癌症的新标志物的作用。在宫颈癌的情况下，Lee等,Altered urinary profiles of polyamines and endogenous steroids in patientswith benign cervical disease and cervical cancer.Cancer Lett.2003；201(2):121-31已证明Put、Spd和Spm中多胺水平的显着升高。对于肝癌，Liu等,Determination ofpolyamine metabolome in plasma and urine by ultrahigh performance liquidchromatography-tandem mass spectrometry method:Application to identifypotential markers for human hepatic cancer.Anal Chim Acta.2013；791:36-45监测了患者血浆和尿中多胺、多胺前体和分解代谢物之间的水平差异。通过仔细分析这些结果，确实可观察到不同种类的多胺基于癌症的类型显示出不同的变化。在癌症病例中尿多胺水平升高的主张不够具体。
然而，很少有报道侧重于检测PCa对尿多胺水平的影响，这反过来可为这种日益增加的常见癌症提供潜在的诊断工具。在1975年，Fair等,Urinary polyamine levels inthe diagnosis of carcinoma of the prostate.J Urol.1975；114(1):88-92报道了通过电泳PCa患者尿Spd含量显著升高，但Put和Spm则没有。Horn等,Relationship of urinarypolyamines to tumor activity and tumor volume in patients.Cancer Res.1984；44(10):4675-8在1984年通过LC和荧光检测器分析了患有乳腺肿瘤、胃肿瘤、前列腺肿瘤、女性生殖道肿瘤或未知来源的转移性癌症患者的尿Spd和Put含量，得出了不确定的结论。随着分析领域的进步，在本公开中，通过UPLC-MS/MS评估了三种天然多胺(Put、Spd和Spm)作为用于筛查PCa的尿生物标志物的潜在能力。通过经过充分验证的方法(其使用单独的氘代内标来校正每种多胺的基质效应)，认为分析性能更可靠。
根据以前关于PCa研究的文献的结果，观察到尿Spm水平下降实际上是合理的。虽然只检查了有限数量的组织样本，但是van der Graaf等,Proton MR spectroscopy ofprostatic tissue focused on the detection of spermine,a possible biomarker ofmalignant behavior in prostate cancer.MAGMA 2000；10(3):153-9报道了，与正常和良性增生前列腺组织相比，通过高效液相色谱和荧光检测器，肿瘤前列腺组织中的Spm含量降低。Swanson等,Proton HR-MAS spectroscopy and quantitative pathologic analysisof MRI/3D-MRSI-targeted postsurgical prostate tissues.Magn Reson Med.2003；50(5):944-54还报道了，通过质子高分辨率魔角旋转核磁共振光谱和定量组织病理学，前列腺组织样品中Spm水平降低。如GF 等,Spermine and citrate asmetabolic biomarkers for assessing prostate cancer aggressiveness.PLoS One2013；8(4):e62375所报道，通过Spm和柠檬酸盐的浓度降低，可以将高级别癌症前列腺组织与低级别癌症组织区分开来。除直接监测前列腺组织外，Serkova等,The metabolitescitrate,myo-inositol,and spermine are potential age-independent markers ofprostate cancer in human expressed prostatic secretions.Prostate.2008；68(6),620-8报道了，在人类表达的前列腺分泌物中，柠檬酸盐、肌醇和Spm是PCa的潜在重要标志物，并且与对照样品相比，它们在PCa患者中都表现出水平降低。关于这些先前的研究项目，可以预见尿Spm含量降低，因为尿代表了与来自前列腺的脱落的癌细胞和分泌的前列腺产物密切相关的流体。实质上，尿具有易于获得的优点，并且其采集是非侵入性的。因此，有用的尿PCa生物标志物的发现对于当前的医疗状况是令人鼓舞的，以减少不必要的活检并安排患者进行适当治疗。
要解释PCa患者Spm水平的下降，确切的机制缺乏明确的证据，因此仍在研究中。Schipper等,Polyamines and prostatic cancer.Biochem Soc Trans.2003；31(2):375-80提出了可能的解释，即由癌细胞增殖引起的细胞组织变化最终导致腔体积减小，其进而减少前列腺组织、前列腺液或甚至尿中分泌的化合物的量。但这很难解释为什么只有尿Spm水平下降。Leo等,Non-destructive quantitation of spermine in human prostatetissue samples using HRMAS 1H NMR spectroscopy at 9.4 T.FEBS Letters.2001；494(1-2):112-6报道了Spm是提议的前列腺癌生长的内源性抑制剂，并且发现Spm含量与正常前列腺上皮细胞的体积百分比之间存在组织病理学量化的线性相关性。而且，最近的研究提出，多胺代谢失调，或更具体地说多胺分解代谢失调，可能与癌变有关。在前体前列腺炎性萎缩病变和早期前列腺上皮内肿瘤性病变中观察到精胺氧化酶(SMO)和亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶(SSAT)表达增加，这导致Spm含量的消耗(图4)。
这一假设也得到了SSAT酶促作用导致患有泌尿生殖系统恶性肿瘤患者的尿二乙酰精胺含量显著增加这一观察结果的支持，如Hiramatsu,等,Diagnostic and prognosticusefulness of N1,N8-diacetylspermidine and N1,N12-diacetylspermine in urine asnovel markers of malignancy.J Cancer Res Clin Oncol.1997；123(10):539-45所报道。因此，如本文所述，尿Spm降低的观察结果与先前的发现和建议的机制一致。在不受理论束缚的情况下，假设SMO和SSAT的作用相互抵消，因此没有发现Spd的重大变化。
GF等,Spermine and citrate as metabolic biomarkers forassessing prostate cancer aggressiveness.PLoS One 2013；8(4):e62375报道了前列腺Spm含量可以作为评估PCa侵袭性的生物标志物，然而，与此不同，有关尿Spm是否显示相似的癌症分级能力的决定性确定结论可根据本文公开的数据确立。根据结果，与低级别癌症(GS≤6)相比，观察到高级别癌症中的下降(GS＝8-10)，尽管不是那么显著。(高级别中1.23，而低级别中1.47；p＝0.611)。相反，它的作用类似于根据用于PCa诊断的TRUSPB发挥作用的诊断生物标志物。
PSA检测作为初步筛查检测还有很多不足之处。它已被证明会引起过度诊断，特别是在灰色区域显示值的患者中。例如，单独的血清PSA分别表现出65％和47％的适当的灵敏度和特异性。Li等,Macrophage inhibitory cytokine 1 biomarker serum immunoassayin combination with PSA is a more specific diagnostic tool for detection ofprostate cancer.PLoS One.2015；10(4):e0122249在他们的研究中报道它的灵敏度和特异性甚至更差(灵敏度＝54.8％，特异性＝57.1％，AUC＝0.684)。Ferro等,ProstateHealth Index(Phi)and Prostate Cancer Antigen 3(PCA3)significantly improveprostate cancer detection at initial biopsy in a total PSA range of 2-10 ng/ml.PLoS One 2013；8(7):e67687进行的另一项大规模研究表明，总PSA仅给出0.52±0.07的AUC值。当侧重于PSA>4.0ng/ml的患者时，PSA检测表现出最佳的筛查性能(AUC＝0.73±0.04；参见图6)，但它仍然比本文所述的尿Spm测试方法差。灵敏度和特异性分别为67.05％和68.75％。因此，尿Spm能够作为血清PSA>4.0ng/ml的男性的二级筛查检测来区分PCa和非癌症病例(包括BPH)，用于补充PSA检测。
为了基于本公开的第一部分得出结论，评价了三种主要的尿多胺作为PCa生物标志物的潜在作用。在Put、Spd和Spm中，在比较了它们在PCa和BPH患者中的水平之后，Spm表现出突出的PCa诊断性能，特别是对于血清PSA水平升高的患者。其AUC值为0.83±0.03。这可能有助于应对目前由血清PSA检测的特异性差而带来的医学挑战。通过我们开发的基于镧系元素的生物探针，我们可以实现PCa筛查的简单快速定量。
第二部分：用于Spm感测的合成镧系配合物
开发了一系列可用于尿多胺的比色定量分析和定性分析的镧系化合物(1)。
其中，
Ln是镧系金属，且每个M都独立地选自Na、Li和K；或两个M一起表示Mg或Ca。在某些实施方案中，两个M一起表示Mg、Ca、Sr或Ba。
在某些实施方案中，Ln选自La、Ce、Pr、Nd、Pr、Nd、Pm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb以及Lu。在某些实施方案中，Ln是Eu3+。
在某些实施方案中，M是Li，且Ln是Eu3+。
在结合多个聚(对-亚苯基亚乙炔基)(PPE)链(即式(I)化合物的上部)而形成紧密结合的链内激子迁移(inter-chain exciton migration)增强的聚集体方面，Put和正丁胺明显不如Spm和Spd有效。因此，基于非特异性静电相互作用的化学传感器仍然可以在相似分析物之间表现出一定的选择性，以较高的平均值，它与Spm(带4个正电荷)和Spd(带个3正电荷)结合得更好，但与腐胺(带2个正电荷)和正丁胺(带1个正电荷)结合得较差(图7A-7B)。
新开发的发色团与镧系配合物的连接通过线性/双光子激发揭示了对多胺的强结 合和特异性选择性
合成具有多胺特异性结合位点的化合物1。(化合物1，图7B)共轭系控制三嗪基配体的三重态并产生配体的绿色发射。化合物1的两个阴离子基团(图7B)用作与带正电荷的多胺的结合，这在热力学上是有利的。多阳离子分析物可以干扰配合物中的共轭系。在390nm激发时，可以从化合物1获得四个结构性红色f-f(5D0→7FJ，J＝1-6)发射带(图8A-8C)。在DMSO:H2O溶液中，化合物1的量子产率(Φ)和寿命分别为0.05和0.83ms。在配合物与Spm和Spd(50M)结合后，发射强度和量子产率增加超过30％(肿瘤血液样品中Spm和Spd的浓度分别为约10M和46M)。
用Spm和Spd滴定铕化合物(1)
在化合物1与多胺结合后，可以在UV激发下显示显著的f-f发射增强(图8A和8B)。已用铕化合物2进行了对照实验(图7A)；加入多胺后，没有观察到明显的发射变化。(图8C的插图-化合物1的基序(motif)结构，没有针对多胺的阴离子结合位点)化合物1和多胺之间的结合比(1:1)和常数(3x 10-5M)已经通过各种浓度的Spm的5D0→7F2发射强度测定。已经监测了多胺结合的寿命变化而不是发射。(在时间门控系统的帮助下，响应性毫秒寿命变化对新一代原位多胺传感器具有巨大潜力；它可以消除流体/血液样品中的纳秒/微秒干扰)。
铕化合物(1)对Spm和Spd的选择性
图8B显示了化学传感器相对于其他生物活性阳离子例如K+、Na+、Ca2+和其他生物胺对Spm和Spd的选择性。这是特别重要的，因为这些生物胺能够原位干扰多胺对所提议的配合物的响应。未观察到其他生物胺和阳离子的明显干扰。化合物1对Spm和Spd的选择性明显高于对其他常见生物活性阳离子和生物胺的选择性(图8B)。还使用对照铕配合物进行了对照实验，所述对照铕配合物在所有测试的生物胺和阳离子存在的情况下未显示出任何显著的5D0→7F2发射增强。
用10份前列腺癌患者尿样进行的初步临床试验
从前列腺癌患者采集了150多份尿样，并通过标准方案分析其Spm水平。(通过Jaffe的方法分析水肌酐水平，用LC-MS/MS检查多胺水平)。已经制定出许多多胺(图9A)，例如Spm(图9B)和Spd，的校准曲线，并且已经分选出这些多胺水平的浓度。测定的水平与博士2014年的发现相似。
选择一系列前列腺癌患者的尿样进行临床前试验。通过LC预先测定它们的多胺含量并显示在图9A-9B中。在图10中，在UV光下，仅在10份前列腺癌患者的尿样都存在的情况下，化合物1(在水溶液中10mM)的照片才显示颜色变化。通过LCMS和内标评估尿样的多胺浓度。
在实验方面(Experiment-wise)，将2mL患者尿样加入1mL铕传感器溶液中(Eu传感器的最终浓度为50μM)。将样品置于分光荧光计中，并监测响应性发射和发射寿命信号变化。本发明人还监测所提议的配合物的发射光谱，以来自健康志愿者的尿作为对照。
如图11所示，标准添加方法用于通过我们开发的生物探针进行量化，这是解决基质效应问题的常用方法。简而言之，测量尿样中多胺的信号，并以浓度＝x将结果作图。测量2个加标水平(spiked level)的读数，通常是原始浓度的1倍和2倍。分别以x+A和x+B记录加标水平的浓度。在x轴上外推至零信号时，可以在x轴上测定尿液样品中多胺的浓度。
利用学生t检验比较通过两种方法获得的平均值，其中P<0.05被认为是统计学上显著的。从发光配合物和HPLC-MS/MS获得的读数之间没有太大差异(P<0.05)，并且这些读数在小范围内变化(％RSD<10)。本发明人可以推断，本发明人的发光配合物对于检测尿样中的多胺是敏感且可靠的。使用在Origin中运行的标准统计软件包分析样品频率随Spm/Spd浓度的变化。用方程式模拟高斯分布。
化合物1与Spm/Spd在水溶液中的结合亲和力和选择性的测定
在靶Spm/Spd在溶液和生物介质中的不同浓度(尿/血液中的Spm-1.2μM/Spd-11.9μM的模拟水平)下，通过荧光和荧光寿命滴定检验开发的化合物1。还确定了这些用于Spm/Spd的传感器的生理特性和检测限度。在达到平衡后进行测量，并监测铕的发射。以I0/(I–I0)(其中I和I0分别是测量的发光强度和空白发光强度)表示的发光响应绘制为分析物浓度的函数。为了测定各种分析物加合物的结合强度，将一系列已知浓度的分析物溶液与各种浓度的Spm/Spd溶液混合。根据y轴截距与使用Benesi-Hildebrand方程式从最佳拟合线获得的斜率之间的比例估算结合常数KB。可以通过各种机制，例如电子转移过程(Rehm-Weller方程式)和氧化还原电势，诱导与Spm/Spd结合后的镧系配合物的信号变化，并且应用闪光光解瞬态吸收(transient absorption with flash photolysis)来理解造成发明人的镧系体系标记Spm/Spd之后的信号改变的机制。
本公开的另一个实施方案涉及使用适体传感器金纳米颗粒(AuNP)检测Spm的改良方法。
金纳米颗粒(AuNP)作为生物相容性纳米材料出现，并已广泛用于生物医学工程和生物分析应用。例如，基于各种化学种类的独特的表面等离子体共振带的红移，已经开发了可用于检测各种化学种类的比色生物感测探针。在靶分析物对聚集状态进行任何调节时，肉眼可以直接观察响应。
本文公开了与尿多胺相关的这种现象的综合研究。评估了诊断探针的不同参数，包括AuNP尺寸、DNA长度、浓度和pH值(toward)。基于这些实验，确定了适体传感器的两种感测机制：根据添加的DNA的量，它基于DNA-AuNP的聚集感测，这导致等离子体带红移；或基于DNA-AuNP的沉淀感测，这导致等离子体带下降。开发的适体传感器可以通过仅仅改变DNA浓度而无需复杂程序经由两种不同的感测机制智能检测Spm。(图26)适体传感器在人工尿样和临床尿样的加标分析中也表现出良好的结果，并且能够为SPM的快速检测提供有用的二次筛查工具，从而补充常规使用的血清PSA检验并潜在地改善PCa筛查的结果。
为了本公开的目的，术语“DNA”、“DNA适体”和“单链DNA”可互换使用，其是指基本上以不与互补序列结合的单链形式存在的多核苷酸(例如，大于>60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或99.9％以单链形式存在)。本文公开的单链DNA的实例包括DNA适体12mer:CGACAACCACAA(SEQ ID NO:1)；DNA适体24mer:CGACAACCACAACACACAATCTGA(SEQ IDNO:2)；以及DNA适体36mer:CGACAACCACAACACACAATCTGACGACAACCACAA(SEQ ID NO:3)。
材料和仪器
所有化学品均来自Aldrich(中国香港)和Meryer(中国上海)。DNA适体(12mer:CGACAACCACAA(SEQ ID NO:1)；24mer:CGACAACCACAACACACAATCTGA(SEQ ID NO:2)；36mer:CGACAACCACAACACACAATCTGACGACAACCACAA(SEQ ID NO:3))来自Invitrogen(中国香港)。通过混合等摩尔比的磷酸、硼酸和乙酸制备Britton-Robinson(BR)缓冲液，然后使用氢氧化钠溶液调节pH。根据其他配方制备人工尿。所有标准溶液均在Milli-Q水中制备。对于尿样，其是从香港中文大学威尔斯亲王医院采集的。
使用JEOL Model JEM-2011(JEOL，中国北京)捕获所制备的AuNP的透射电子显微镜(TEM)图像。通过Zetasizer Nano-ZS90系统(Malvern Instruments，中国上海)实现动态光散射(DLS)和ζ电势测量。使用Cary8453UV-Vis光谱仪(Agilent，中国香港)记录UV-Vis吸收光谱。使用MicroCal PEAQ-ITC自动化系统(Malvern Instruments，中国上海)实现等温滴定量热研究。
对于尿样分析，利用Agilent 1290Infinity Quaternary LC System进行液相色谱分离，而质量分析则由配备了Agilent射流技术电喷雾电离源的Agilent 6460三重四极杆质谱仪(Agilent，中国香港)进行。所有孵育均在KS 260 Basic Orbital Shaker(IKA，中国香港)上进行。
柠檬酸盐-AuNP的合成
制备了三种不同尺寸(4nm、13nm、27nm)的AuNP。对于4nm的柠檬酸盐-AuNP，根据先前公开的文献Gu,Y.J.；Cheng,J.；Lin,C.C.；Lam,Y.W.；Cheng,S.H.；Wong,W.T.Toxicol.Appl.Pharm.2009,237(2),196，进行胶体柠檬酸盐-AuNP的合成。简而言之，将氯金酸溶液与柠檬酸三钠溶液混合，然后加入新制备的硼氢化钠溶液并放置2小时。对于13nm和27nm AuNP，通过众所周知的Turkevich方法进行合成，其中在回流条件下使用柠檬酸三钠作还原剂和加帽配体。由TEM测定的最终尺寸为4.09±0.65nm、12.8±1.3nm和27.2±4.2nm。(图28A-28C)。(图12)对于4nm AuNP，使用由Liu,等,Colloid.Surface.B 2007,58(1),3提出的方程式，经计算浓度为114.54nM。使用Liu等人提出的方程式，经计算13nmAuNP和27nm AuNP的浓度分别为14.15nM和1.53nM。大多数实验采用4nm AuNP，不同批次的等离子体带的吸光度和波长没有显示出明显的偏差。
在某些实施方案中，AuNP的尺寸为约1nm至约100nm。在某些实施方案中，AuNP的尺寸为约1nm至约90nm、约1nm至约80nm、约1nm至约70nm、约1nm至约60nm、约1nm至约50nm、约1nm至约40nm、约1nm至约30nm、约1nm至约20nm、约1nm至约10nm、约2nm至约10nm、或约2nm至约7nm。
利用AuNP定量检测Spm
首先，将80nM所制备的AuNP与25nM DNA适体在4mM BR缓冲液(pH＝3.29)内涡旋混合，以进行选择性吸附。然后加入Spm标准品/样品溶液并孵育40分钟。然后，混合物即可用于UV-Vis吸收度、DLS和ζ电势测量。在人工尿和临床尿等复杂基质中，将DNA浓度升高至100nM，以提供更好的保护。
工作条件的优化
基于对Spm的灵敏度，优化几个参数，包括AuNP尺寸(4、13、27nm)、DNA适体浓度(12.5、25、50、100和200nM)、DNA长度效应(12mer、24mer和36mer)、pH(1.81、3.29、4.96、6.99、8.98和11.0)以及孵育时间的长度。
样品预处理程序
简而言之，将尿样自然解冻并在13000rpm和25℃离心5分钟。然后将其通过强阴离子交换固相萃取柱(Phenomenex,Strata,100mg/3ml,USA)以保留不需要的有机酸、酚类化合物和碳水化合物。然后用浓缩的高氯酸处理该溶液，用于进一步脱蛋白，然后通过使用氢氧化钾溶液中和将其除去以形成不溶性高氯酸钾盐。最后将其再次离心以获得上清液，用0.22uM PES过滤器过滤并进一步在水中稀释。
等温滴定量热研究
为了研究DNA/柠檬酸盐AuNP与Spm之间的相互作用，首先使用Amicon Ultra-1530K离心过滤器(Millipore，中国香港)预浓缩AuNP。然后，首先将0.5μM AuNP和不同浓度的DNA适体(0、0.5、1和3μM)混合并置于样品池中。然后逐渐加入0.25mM Spm溶液以记录每次注射的温度变化(在25℃，以150s间隔，每次注射2μL)。
为了研究柠檬酸盐对多胺类似物的选择性，首先将1mM柠檬酸三钠溶液置于样品池中，然后独立注入0.8mM不同的多胺类似物溶液，以在上述条件下记录温度。
然后将数据拟合到一个结合位点的结合模型，并通过MicroCal PEAQ-ITC分析软件进行分析。
利用UPLC-MS/MS定量检测Spm
通过超高效液相色谱联合三重四极杆质谱仪(UPLC-MS/MS)进行Spm的量化。利用Agilent 1290 Infinity Quaternary LC System进行LC分离，而质量分析则由配备了Agilent射流技术电喷雾电离源的Agilent 6460三重四极杆质谱仪进行。使用的柱是利用Agilent SB-C18保护柱(2.1x5mm,1.8μm)保护的Agilent EclipsePlus C18 RRHD(2.1x50mm,1.8μm)。
LC洗脱曲线如下优化：洗脱液A是具有0.1％HFBA的水，而洗脱液B是具有0.1％HFBA的乙腈。使洗脱液A在10分钟内从95％降至60％。然后在1分钟内使洗脱液A的梯度从60％降低至10％。然后使梯度保持恒定5分钟。然后在1分钟内使梯度从10％增加至95％，然后保持恒定8分钟。(总运行时间＝25分钟)。
自动进样器和柱温度分别设定为4℃和35℃。通过用洗脱液B以Flush Port模式进行5秒针洗3次完成注射。每次注射10μL。
对于源参数，将干燥气体(氮气)温度设定为300℃，流速为5L/min。雾化器压力为45psi。将保护气体温度设定为250℃，流速为11L/min。将毛细管电压设定为3500V。对于质量检测，进行了预定的多反应监测(MRM)。
结果和讨论
工作原理
利用目前开发的适体传感器，通过如下两个阶段实现对Spm的灵敏性和特异性感测：第一阶段，如图27所示，开始于将DNA适体选择性吸附到柠檬酸盐-AuNP的表面上，这是由低pH工作条件和随后添加用于中和AuNP表面上的负电荷的Spm诱导的。Zhang等,Langmuir 2012,28,3896系统地研究了吸附过程，并提出了之前的结合模型。由于DNA可以采用延伸构象来加强与AuNP表面的结合，因此柠檬酸盐配体被置换。通过研究DLS结果可以观察到这种现象，即随着DNA越多，AuNP的流体动力学尺寸变得越来越小，这是由于更紧凑的DNA分子置换了柠檬酸盐层。(图29)在酸性条件中Z-平均值的降低也反映了更好的DNA稳定效果，所述酸性条件可使得AuNP聚集。另一个实验也证明了这种防聚集的保护作用(图30)，该实验清楚地证明由盐的存在驱动的聚集在高DNA加帽条件下减慢。第二阶段是添加带正电荷的SPM，用于通过屏蔽AuNP和DNA适体上的负电荷来诱导进一步的DNA吸附，结果是削弱了AuNP聚集的排斥力。图13显示了适体传感器的工作原理。因此，聚集程度允许以方便快捷的方式间接量化SPM含量。
为了进一步研究DNA置换柠檬酸盐的驱动力，之前已经充分研究了，盐的存在会屏蔽(screen)带负电荷的AuNP和DNA之间的电荷排斥。在本发明人的情况中，直接使用AuNP而无需任何清理。因此，许多游离的柠檬酸盐分子和来自硼氢化钠的副产物将充当DNA吸附的这类屏蔽源。进行概念验证实验以通过超滤除去这些游离的盐。发现没有它们，DNA不能附着，并且即使在DNA存在的情况下，加入酸性BR缓冲液以使柠檬酸盐基团质子化时，AuNP也会立即聚集。反之亦然，当使用AuNP储备液时，并未发生聚集。这证实了游离的柠檬酸盐和其他盐对适体传感器正常运行的重要性。
工作条件的优化
仔细研究并优化如下所述的工作条件参数，以使用于尿中SPM感测的适体传感器的分析性能最大化。这是通过研究SPM校准曲线图的斜率来实现的，SPM校准曲线图反映了每种情况下的相应灵敏度，以及拟合SPM尿含量的线性工作范围。本发明人研究的第一个参数是AuNP的尺寸效应。如图31所示，通过取610nm处的吸光度比值及其等离子体峰的对数，随着AuNP尺寸的增加，灵敏度变得更大并且线性范围变得更窄。考虑到大多数尿样的尿Spm含量范围为0-15μM这样的事实，通过提供最宽和最合适的线性工作范围，4nm AuNP似乎是后期实验的最佳选择。在不希望受理论束缚的情况下，据信在AuNP较大的情况下AuNP的数量较小，这导致在将相同浓度的Spm加入AuNP溶液中时更倾向于聚集。
第二个参数是DNA浓度。(图14和表6)基本上，在所有情况下，观察到的曲线最初是线性的，然后逐渐趋于平稳。并且随着DNA的增加，以灵敏度为代价获得了更宽的线性工作范围。由于该方法中非交联聚集途径的性质，不需要通过繁琐的靶引导的表面修饰来制备DNA-AuNP。因此，仅通过改变添加到AuNP的DNA量，就赋予用户调整工作范围的灵活性。最后，用于检测Spm/Spd的DNA适体浓度范围为20nM至500nM，并选择25nM作为最佳浓度。
表6.有关不同DNA浓度下Spm校正曲线图的线性方程式、R2和线性范围的总结结果。
可以部分地基于测试样品的复杂性来选择单链DNA与金纳米颗粒的比例。
在某些实施方案中，例如，当测试样品由复杂基质(例如，临床样品、人工尿、人工血或具有大量干扰分析物的其他样品)组成时，在测试样品中，单链DNA与金纳米颗粒的摩尔比为约4:1至约3:1。在某些实施方案中，在测试样品中，单链DNA与金纳米颗粒的摩尔比为约4:1至约3:1、约3.9:1至约3:1、约3.8:1至约3:1、约3.7:1至约3:1、约3.6:1至约3:1、约3.5:1至约3:1、约3.4:1至约3:1、约3.3:1至约3:1、约3.2:1至约3:1或3.2:1至约3.1:1。
在其他实施方案中，例如，当测试样品由简单基质组成时，在测试样品中，单链DNA与金纳米颗粒的摩尔比为约1:3至约1:4。在某些实施方案中，在测试样品中，单链DNA与金纳米颗粒的摩尔比为约1:3至约1:4、约1:3至约1:3.9、约1:3至约1:3.8、约1:3至约1:3.7、约1:3至约1:3.6、约1:3至约1:3.5、约1:3至约1:3.4、约1:3.1至约1:3.4或约1:3.1至约1:3.3。
在某些实施方案中，例如，当测试样品由复杂基质(例如，临床样品、人工尿、人工血或具有大量干扰分析物的其他样品)组成时，在测试样品中，单链DNA的浓度为约200nM至约300nM，且金纳米颗粒的浓度为约50nM至约100nM。在某些实施方案中，在测试样品中，单链DNA的浓度为约220nM至约280nM，且金纳米颗粒的浓度为约60nM至约100nM；单链DNA的浓度为约240nM至约260nM，且金纳米颗粒的浓度为约70nM至约100nM；单链DNA的浓度为约245nM至约255nM，且金纳米颗粒的浓度为约70nM至约90nM；或单链DNA的浓度为约245nM至约255nM，且金纳米颗粒的浓度为约75nM至约85nM。
在某些实施方案中，在测试样品中，单链DNA的浓度为约240nM至约260nM，且金纳米颗粒的浓度为约75nM至约87nM。
第三个参数是pH。(图15和表7)观察到的数据表明，适体传感器在酸性介质中运行良好，这对于维持+4电荷状态的Spm(pKa＝7.90、8.83、9.97和10.79)是必需的。低pH条件也有助于DNA更容易地吸附到AuNP上。最后，用于检测Spm/Spd的介质的pH值范围为3-8，并选择3.29作为最佳pH。
表7.有关不同pH下Spm校正曲线图的线性方程式、R2和线性范围的总结结果。
在某些实施方案中，所述方法在约2至约8、约2至约7、约2至约6、约2至约5、约2至约4、约3至约4、或约3至约3.5的pH下进行。
在某些实施方案中，所述方法在约3至约8、约3至约7、约3至约6、约3至约5、约3至约4、或约3至约3.5的pH下进行。
对于DNA长度的影响，较长的适体产生更稳定的AuNP配合物，并更好地保护AuNP免于聚集。(图16)当考虑吸光度变化时，24-mer是最好的，因此选择它。最后一个参数是聚集动力学的监测，并且确定40分钟足以达到平衡。(图17)
在某些实施方案中，单链DNA长度为约5个核苷酸至约50个核苷酸、约5个核苷酸至约45个核苷酸、约5个核苷酸至约40个核苷酸、约5个核苷酸至约35个核苷酸、约5个核苷酸至约30个核苷酸、约10个核苷酸至约30个核苷酸、约15个核苷酸至约30个核苷酸、或约20个核苷酸至约30个核苷酸。
在最终的最佳条件下，0-5μM的线性Spm校准曲线可以通过最小二乘方线性回归拟合。(图18A和18B)方程式为y＝0.129x-0.4941，检测限度(LOD)经利用无Spm的AuNP溶液的3σ计算为15.25nM(3.09ng/ml)，量化限度(LOQ)为50.82nM。在换成4nm AuNP后，它在灵敏度和工作范围方面都表现出值得注意的改善。还在所述条件下测量了DLS和ζ电势。(图19)粒径随着Spm浓度的增加而增加，以引起更大程度的聚集，但与Liu等人(Liu等,Talanta2013,106,255)的关于13nm AuNP的结果不同，本发明人的结果显示，用于检测Spm/Spd的柠檬酸盐-Au纳米颗粒的尺寸范围为1nm至100nm，并且4nm AuNP的ζ电势几乎保持恒定，而不是逐渐恢复到更阳性的水平。这可能是由于大多数SPM分子包埋于聚集体核心之故。
关于AuNP聚集的机理研究
在DNA浓度优化期间，当在测定期间添加更多DNA时，令人惊讶地观察到对Spm的灵敏度下降。这与利用离子桥接效应通过DNA分子发生Spm诱导的聚集这一公认理论相矛盾。在没有DNA的情况下进行对照实验，以获得更多信息。令人惊讶的是，与存在DNA的情况下进行的测定相比，Spm诱导的聚集过程仍然可以检测得到并且表现出更快的初始动力学速率。(图20)最初在AuNP上加帽的柠檬酸盐基团的存在似乎是不可忽视的，并且它们对聚集过程做出了重大贡献。
为了更深入地了解该机理，发明人进行了几个ITC实验：首先将相同量的柠檬酸盐加帽的AuNP分别与不同的DNA浓度(0、0.5、1和3μM)混合。然后逐渐加入Spm溶液，并测量每次注射的温度变化。结果显示在图21A-21H和表8中。在每种情况下，结合等温线显示偏离拟合模型的焓峰(enthalpic peak)。Rautaray等,Langmuir 2005,21,5185报道了类似的观察结果，那时他们研究Ca2+和天冬氨酸加帽的AuNP的相互作用，表明所述峰值是由于Ca2+离子电荷中和导致的AuNP聚集。
表8.不同DNA浓度下Spm与AuNP结合的热力学参数。
当添加更多DNA时，焓峰随着更高的SPM与AuNP摩尔比而逐渐向右移位，这意味着AuNP聚集可能仅在较高的SPM浓度下开始。该数据与UV-Vis吸收测量的结果很好地匹配，该结果揭示在较高DNA浓度下对SPM的灵敏度下降。在分析热力学参数后，可以推断出，Spm诱导的聚集主要通过焓驱动的与DNA和柠檬酸盐的静电/氢键合相互作用而发生，如从ΔH的相对大的负值所反映的。随着DNA浓度的增加，熵成分逐渐变得更加有利，但焓仍然是主要的驱动力。因此，随着DNA浓度的增加，ΔH强度下降意味着这种静电/氢键合相互作用的弱化(表9)。根据这些结果，假定Spm主要通过表面柠檬酸盐配体而不是通过DNA适体与AuNP静电相互作用。DNA在目前的适体传感器中的作用是置换表面柠檬酸盐配体，以为AuNP提供保护，同时控制柠檬酸盐-Spm相互作用的程度，从而控制AuNP的聚集速率，并因此控制适体传感器的分析性能。
*尸胺吸热途径后尸胺与DNA相互作用
表9.DNA与不同多胺类似物结合的热力学参数。
为了进一步证实表面柠檬酸盐在聚集过程中的重要性，进行了另外的ITC实验以研究纯柠檬酸盐配体与其他多胺类似物之间的相互作用。(表10)尽管在游离柠檬酸盐中存在三个用于相互作用的羧酸盐基团，但是当在AuNP上加帽时仅剩下一个；且ΔH强度序列(精胺>亚精胺>组胺>腐胺>精氨酸>酪胺＝尸胺＝鸟氨酸＝肌酐＝对照)与由UV-Vis吸收测量确定的交叉反应序列(精胺>亚精胺>组胺>腐胺＝精氨酸＝酪胺＝尸胺＝鸟氨酸＝肌酐＝对照)非常相似，但与DNA的不相似。表9和10总结了从ITC获得的游离柠檬酸盐和DNA的热力学数据；(图22)该结果表明柠檬酸盐在实现聚集中的重要性。
表10.柠檬酸盐与不同多胺类似物结合的热力学参数。
最后，为了研究DNA是否真的参与了相互作用，监测了AuNP在不同DNA浓度下对多胺类似物的选择性特征。通过比较它们与Spm的Abs610/Abs512，测定其各自的交叉反应性。通过添加更多用于置换柠檬酸盐的DNA来调节加帽率之后，预期AuNP的总选择性特征发生变化。然而，在归一化后，图22表明在不同条件之间没有太大变化，这意味着在造成AuNP的总选择性发生任何变化方面，DNA确实与Spm和其他类似物没有或几乎没有相互作用。虽然单独的纯DNA在等温滴定量热(ITC)实验中显示出与Spm的一些静电相互作用(图23A-23B)，但据信吸附在AuNP表面上的DNA已经适应了延伸的构象，从而使其表面接触最大化并加强与AuNP的结合。这种DNA压缩过程可能不利于与Spm的进一步相互作用。
适体传感器在实际样品中的应用
为了证明目前开发的适体传感器符合其检测Spm的预期目的，在最涉及Spm含量的样品之一—尿中测试其适用性。制备人工尿以在早期研究中模拟临床尿。不幸的是，在所述的最佳条件下，适体传感器不能正常工作，因为人工尿含有可有效屏蔽用于聚集的负电荷的高盐浓度。即使没有Spm，AuNP也不能容忍它。这种不希望的聚集的起因是表面活性剂对AuNP保护不充分的结果。显然，仅添加25nM DNA不足以在这种复杂的基质中工作并提供进一步的保护，将工作DNA浓度升高至250nM。图24显示了DNA-AuNP吸收光谱针对不同稀释因子的人工尿的滴定曲线。随着基质成分(主要是无机盐)增多，等离子体峰的吸光度由于更大的DNA吸附程度而逐渐下降。结果显示，250nM DNA足以保护AuNP免于聚集高达2倍稀释的人工尿。
将Spm添加到人工尿中，图25显示了吸收光谱和相应的校准曲线。令人惊讶的是，与空白基质相比，AuNP以完全不同的机制响应Spm。正如吸收模式所揭示的，随着Spm浓度越高，等离子体峰值逐渐下降，与之前人工尿基质效应的滴定研究相似。它证实了Spm也可有助于屏蔽像盐这样的负电荷并诱导进一步的DNA吸附。因此，在加入Spm后观察到更大程度的DNA吸附或甚至AuNP沉淀，并且它们都造成了等离子体带的下降。还发现降低与Spm浓度相关，具有线性关系，并且Spm的LOD经计算为473.29nM。可以获得0-18μM的更宽的线性校准曲线，其与一般尿Spm含量的校准曲线完全匹配。通过基质匹配校准方法对人工尿进行的加标分析得到了令人满意的重现率(recovery)和再现性。(表11)
表11.人工尿样本中添加的SPM的测定。(N＝3)
为了进一步证明适体传感器对快速尿Spm筛查的适用性，选择来自癌症患者的三个临床尿样用于进一步的加标分析。在此之前，测试常见的尿成分(尿素、尿酸、谷胱甘肽、人血清白蛋白、钙盐和肌酐)，以检查它们是否严重干扰Spm感测。(图26)结果表明，只有人血清白蛋白会引起轻微的AuNP聚集，因为蛋白质趋于成为高度带电的分子。因此，使所有预先加标的临床尿液样品都通过Amicon离心过滤器以除去任何大蛋白质分子，然后再次通过基质匹配校准方法经适体传感器进行分析。令人满意的准确度和相对标准偏差值证明了适体传感器在实际样品中的适用性。(表12)
表12.临床尿样本中加标SPM的测定。(N＝3)
为了证明目前开发的适体传感器的有用性，评估了低浓度Spd人尿的Spm含量。选择通过UPLC-MS/MS测定具有不显著的Spm水平(<5ppb)的四个尿样，用于研究基质效应。不幸的是，基质效应因样品而异，特别是尿样3(图32A-32C中的绿色曲线)，即使在没有Spm的情况下其也会导致AuNP上的严重聚集。据信蛋白质可能是尿中干扰的原因，因此在方法中使用高氯酸进行脱蛋白以沉淀不需要的蛋白质。图32A-32C显示了该方法中对尿样进行脱蛋白质的益处。然而，仍然观察到小的差异，而这可能会对实际样品分析产生负面影响。这样的不等的初始聚集状态的起因是由于对AuNP的保护不足，因此进一步优化了DNA浓度。在将DNA浓度从25nM升高至100nM后，结果最终相同。图25显示了尿基质内的校准曲线。通过最小二乘方线性回归可拟合0-10μM的较宽的线性Spm校准曲线。方程式为y＝0.03843x-0.4344，其中LOD和LOQ经计算分别为178nM和594nM。当与空白基质相比时，还注意到完全不同的聚集模式。
比较了尿与空白和人工尿溶液的基质效应，但没有观察到明显的差异。(图33)因此，在稍后的加标分析中，采用了基质匹配校准方法。表13显示了在两个不同日期，两个加标水平下，三份尿样本中的加标分析结果。重现率和再现性都是令人满意的。
表13.尿样本的加标分析(n＝2)。
为了进一步证明适体传感器适合于快速尿Spm筛查的预期目的，测定了所选尿样中存在的原始Spm水平。将结果与作为参考方法的UPLC-MS/MS的结果进行比较。(表14)
表14.利用UPLC-MS/MS和目前开发的方法对尿样本中的Spm进行量化
通过金属有机骨架(MOF)测定尿生物胺的光学方法
对生物胺，特别是Spd和Spm评估的兴趣迅速兴起，对有效的技术方法提出了新的要求。这些胺大量存在于人尿排泄物中。为了同时量化水相和尿相中的Spd和Spm，目前正在开发依赖于有效应用金属有机框架(MOF)的光学方法。传感器被设计成使得框架提供不饱和金属离子配位层(coordination sphere)，用于小阳离子种类的渗透和结合。生物胺中存在的结合位点的互补性和阳离子配位层的空间要求会控制生物胺的选择性，从而提供对靶胺的良好特异性。
该方法允许肉眼视觉测定作为单独添加Spd和Spm时MOF水溶液的颜色。进行MOF传感器对Spd和Spm浓度增加的进一步滴定实验，以检验用于量化目的的吸光度的线性关系。最终，使用人工尿和前列腺癌患者的临床尿样验证所提出的MOF传感器的实际样品应用。观察显色信号的任何调节；即，当与尿生物胺反应时，传感器溶液的颜色变化将允许简单且直接量化这些用于癌症筛查的高兴趣分析物。
工业应用
本发明涉及用于前列腺癌生物标志物的尿多胺。特别是，本发明提供了新的高灵敏度、高特异性的变色多胺示踪剂，以及使用镧系配合物或柠檬酸盐-AuNP与DNA适体作为用于早期前列腺癌筛查的前列腺癌诊断生物标志物的用途，其在未来的临床诊断应用中具有巨大的潜力。
序列表
<110> 香港浸会大学
<120> 作为前列腺癌检测生物标志物的尿多胺
<130> P9364US01
<160> 3
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中合成的人工DNA序列
<400> 1
cgacaaccac aa 12
<210> 2
<211> 24
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<213> 人工序列
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<223> 在实验室中合成的人工DNA序列
<400> 2
cgacaaccac aacacacaat ctga 24
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中合成的人工DNA序列
<400> 3
cgacaaccac aacacacaat ctgacgacaa ccacaa 36

Claims (20)

1.一种式(1)的化合物：
其中，
Ln是镧系金属；且
每个M独立地选自由以下各项组成的组：Na、Li和K；或两个M一起表示Mg或Ca。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述镧系元素是铕。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中M是Li。
4.一种检测一种或多种尿多胺的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供尿样；
b.使所述尿样与权利要求1所述的化合物接触，从而形成测试样品；和
c.检测所述测试样品中一种或多种尿多胺的存在。
5.根据权利要求4所述的方法，其中从人获得所述尿样。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述一种或多种尿多胺的浓度被用于确定所述人是否患有前列腺癌。
7.一种检测一种或多种尿多胺的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供尿样；
b.使所述尿样与纳米颗粒接触，从而形成测试样品，其中所述纳米颗粒包含金纳米颗粒和至少两种包含柠檬酸盐和单链DNA的配体，其中单链DNA与金纳米颗粒的摩尔比为约4:1至约3:1；
c.检测所述测试样品中一种或多种尿多胺的存在。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述单链DNA与所述金纳米颗粒的摩尔比为约3.2:1至约3.0:1。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述纳米颗粒的平均直径为约1nm至约100nm。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述纳米颗粒的平均直径为约2nm至约10nm。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述单链DNA具有约5至约50个核苷酸。
12.根据权利要求8所述的方法，其中在使所述尿样与纳米颗粒接触的步骤之前，所述尿样已经经历了纯化步骤，以除去蛋白质或盐。
13.根据权利要求8所述的方法，其中在检测所述一种或多种尿多胺的存在的步骤中，所述测试样品的pH为约2至约8。
14.根据权利要求8所述的方法，其中检测所述一种或多种尿多胺的存在的步骤还包括测定所述一种或多种尿多胺的浓度。
15.根据权利要求14所述的方法，其中测定所述浓度的步骤包括将所述测试样品的颜色与参考比色图表进行视觉比较或光谱方法。
16.根据权利要求8所述的方法，其中从人获得所述尿样。
17.根据权利要求8所述的方法，其中所述一种或多种尿多胺的浓度被用于确定所述人是否患有前列腺癌。
18.根据权利要求8所述的方法，其中在所述测试样品中，所述单链DNA的浓度为约200nM至约300nM，且所述金纳米颗粒的浓度为约50nM至约100nM。
19.根据权利要求8所述的方法，其中在所述测试样品中，所述单链DNA的浓度为约240nM至约260nM，且所述金纳米颗粒的浓度为约75nM至约87nM。
20.一种试剂盒，所述试剂盒包含纳米颗粒和用于实施权利要求8所述方法的说明书，其中所述纳米颗粒包含金纳米颗粒和至少两种包含柠檬酸盐和单链DNA的配体，其中单链DNA与金纳米颗粒的摩尔比为约4:1至约3:1。
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