CN109689093A - 适合于粘膜递送的冷适应的和毒力因子缺失的活减毒疫苗 - Google Patents
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Abstract
提供了适合于鼻部施用的活减毒流感疫苗的组合物和方法。该疫苗利用缺乏毒力因子的冷适应的流感病毒，并包括提供对于疫苗生产足够的复制能力的突变。如此生产的疫苗提供了对非种痘毒株的显著交叉保护。疫苗对于用于2岁以下的儿童和49岁以上的成年人是安全的。另外，冷适应的毒力因子缺失的流感病毒可以适合提供对非流感病原体的免疫力。
Description
本申请要求了2016年4月18日提交的美国临时专利申请号62/324,134的优先权。这些和所有其它引用的外来材料通过引用以其全部被并入本文。当通过引用被并入的参考文献中的术语的定义或用途与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，本文提供的该术语的定义被认为适用。
技术领域
本发明的领域是疫苗，具体地提供保护免受病毒性疾病的疫苗。
背景技术
下列描述包括可以用于理解本发明的信息。这不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者明确或暗示引用的任何出版物是现有技术。
流行性感冒(流感)的年度蔓延和大流行造成了重大的疾病和健康负担，其由于并发症而具有显著的死亡率。据估计，每年5-10％的成年人和20-30％的儿童受到季节性流感病毒的感染。在那些之中，如此被感染的2-5百万例可能患有严重疾病，同时每年多达500,000例是致命的。这代表了全球重大的健康负担。
接种流感疫苗被视为缓解由季节性流行性感冒引起的疾病负担和死亡率，以及阻止在人中的进一步/未来大流行的最有效方式。当前，在市场中存在两种类型的流感疫苗，片段(即，不能存活的病毒)疫苗(其可得自数个制造商)和冷适应的减毒(即，活病毒)疫苗(例如，来自的)。长期以来已经认识到这两种疫苗途径的缺点。
当前的片段流感疫苗不能在短时间内准备好，并且因此在响应快速出现的毒株中具有有限实用性。例如，在2009年的大流行中，其花费将近9-12个月来递送第一批人疫苗。而且，对于片段疫苗，弱免疫原性是公知的。在老年人和婴幼儿中，尤其是这样。另外，片段疫苗通常受限于具体亚型。它们在提供跨越基因型内(intra-genotypic)和跨基因型(cross-genotypic)亚型的保护中完全无效通常是不令人满意的。因此，迫切需要可以生成针对共同病毒表位的较高效价的中和抗体的更加免疫原性的疫苗途径，该抗体可以提供针对相同基因型或亚型内的两种病毒的保护。
相比之下，当前的冷适应的活减毒疫苗(LAIV)相对于片段疫苗具有改善的免疫原性。但是，这种活减毒疫苗当前仅被批准用于2-49岁的人(由于在小于2岁或大于49岁的那些人中的潜在临界点(breakthrough))。不幸的是，对于非常年轻的人和老年人而言，这种疫苗具有最值。还应当领会，基于CDC初始数据，从2013年到2016年，LAIV制剂显示相对差的或相对低的功效。这对最需要的群体而言已经限制了流感疫苗的好处。低成本、大量和有效疫苗(能够诱导稳健的免疫应答)的快速生产对于在婴幼儿和老年人中干预和预防流行性感冒，尤其是季节性流行性感冒，是重要的。
自从1997年在香港利用禽类H5N1病毒的人类感染的第一资讯，利用其他亚型的禽类流感病毒(包括H9N2、H7N7、H6N1、H7N9、H5N6和H10N8)的人类感染已经在许多国家中被报道，其中这些亚型的禽类流感病毒在家禽中流通。在这些新兴的流感病毒中，自2003年以来，已经在16个国家鉴定了利用H5N1病毒的858例人类感染；在这些之中，453例是致命的(http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/2017_03_16_tableH5N1.pdf？ua＝1)。所有出版物在此通过引用被并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请具体地和单独地被指示为通过引用被并入。当被并入的参考文献中的术语的定义或用途与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，本文提供的该术语的定义适用并且参考文献中的该术语的定义不适用。
在H5N1病毒和其衍生物(H5N6和H5N2)继续传播和引起人类感染的同时，在2013年在中国出现H7N9病毒也引起了超过一千人类病例，其中的大约30％是致命的(http://www.wpro.who.int/outbreaks_emergencies/H7N9/en/)。H7N9感染的散发病例在中国继续出现并且令人担忧的是这种亚型可能造成与H5N1病毒相比潜在大流行的更大威胁。在中国也报道了利用其它新兴亚型的禽类流感病毒(比如H10N8和H6N1)的人类感染。令人担忧的是这些亚型中的一些在人类中可能获得进一步的适应或者与季节性流感病毒重排列并引起新的大流行。
H1N1的2009年大流行的经验表明在可用于公众之前，从病毒的出现制备用于人种痘的疫苗有时花费多于6个月的时间。当前的流感疫苗研发将不满足大流行性流感的快速传播性质的要求。必然的是，在未来将存在新的大流行；但是预测时机和病毒的亚型是不可能的。
具有增强的免疫原性的活减毒流行性感冒(流感)疫苗具有满足季节性和大流行疫苗的要求的潜力。活减毒流感疫苗相对于片段或灭活疫苗具有数个优点。首先，活减毒疫苗能够诱导受体中较好的免疫应答。其次，活减毒疫苗可以使用较少疫苗用于免疫。最后，减毒的活流感疫苗可以容易地通过鼻部施用来施加。但是，当前的减毒流感疫苗不能提供完全保护，并且没有被批准用于最需要的非常年轻和老年群体中。
也已经尝试了在疫苗中使用通过在降低温度下传代而冷适应的流感病毒。例如，Seong的美国专利7758867描述了在疫苗中使用携带已经冷适应的H1N1流感病毒基因组的六个拷贝的病毒株。本文鉴定的所有出版物在此通过引用被并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请具体地和单独地被指示为通过引用被并入。当被并入的参考文献中的术语的定义或用途与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，本文提供的该术语的定义适用并且参考文献中的该术语的定义不适用。同样地，Maassab和Herlocher的美国专利号8282937描述了使用携带某些规定突变的冷适应的H1N1流感病毒作为用于生产针对地方性流感病毒的疫苗的工具。但是，这种冷适应的病毒是否提供对于除了亲本血清型之外的流感毒株的长期保护是不清楚的。
Yang和Kemble的美国专利号8591914讨论使用重排列流感病毒生产的多价疫苗，作为针对多种流感血清型的免疫的潜在途径，并提及这种重排列毒株可以冷适应。但是，这种途径对于非常年轻和老年群体是否可以提供足够安全性是不清楚的。
因而，对于适合用于防止人类感染，具体地利用流感病毒的人类感染，的安全和有效的减毒疫苗仍然存在需要。
发明内容
发明主题提供了用于生成减毒和冷适应的流感病毒的装置、系统和方法，该流感病毒缺少毒力因子，又有效地繁殖用于疫苗制造。这种病毒可以被用于制造适合于经由鼻部途径种痘的疫苗。该疫苗对于用于小于2岁和大于49岁的个体中是安全的，并提供显著的交叉保护。减毒和冷适应的病毒也可以通过基因修饰改变以提供对非流感病原体的免疫力。
本发明构思的一个实施方式是用于疫苗生产的突变的流感病毒。该病毒包括包含毒力因子活性缺失的H1N1流感病毒基因组、在不存在毒力因子活性的情况下在37℃下赋予(confer)复制的第一组的一种或多种突变、和在低于35℃的温度下赋予复制的第二组的一种或多种突变。毒力因子活性的缺失可以包括毒力因子基因的至少一部分的缺失。这种缺失可以是超过突变病毒的NS1区段的核苷酸57至528延伸的NS1基因的至少一部分的缺失。第一组的一种或多种点突变赋予复制能力，其可以位于突变的H1N1流感病毒的M区的外部(例如，H1N1流感病毒基因组的G346A突变)。第二组的一种或多种突变可以包括一种或多种点突变，比如H1N1流感病毒基因组中的T261G或A310G突变。
这种突变的流感病毒也可以包括在低于35℃的温度下赋予复制的第三组的一种或多种突变。这些可以包括与第二组的突变(一种或多种)不同的一种或多种点突变，比如H1N1流感病毒基因组中的T261G或A310G突变。突变的流感病毒在37℃或更高的温度下相对于35℃或更低的温度可以显示降低的复制能力。
在一些实施方式中，突变的流感病毒包括编码外源性抗原的基因的插入。这种外源性抗原可以源自人病原体，例如病毒(例如流感病毒、SARS病毒、MERS病毒、Zika病毒、肝炎病毒、乳头瘤病毒和埃博拉病毒)、细菌、真菌和/或寄生虫。在其它实施方式中，突变的流感病毒包括编码与疾病状态相关联的内源性抗原的基因的插入，比如癌症相关抗原和与阿尔茨海默病相关联的τ蛋白。
本发明构思的另一个实施方式是如上所述的突变的流感病毒，其中突变的流感病毒适合用于配制活减毒疫苗。这种活减毒疫苗适合于经由粘膜暴露于活减毒疫苗进行接种。
本发明构思的另一个实施方式是活减毒疫苗，其包括修饰的H1N1流感病毒，该流感病毒具有毒力因子活性缺失的基因组、在不存在毒力因子活性的情况下赋予复制的第一组的一种或多种突变、和在低于35℃的温度下赋予复制的第二组的一种或多种突变。修饰的H1N1流感病毒以足够的量存在于疫苗中以在免疫后提供保护作用。该疫苗包括载剂，并且被配制为通过将粘膜与活减毒疫苗接触来支持种痘。在一些实施方式中，毒力因子活性的缺失包括毒力因子基因的至少一部分的缺失，比如超过突变病毒的NS1区段的核苷酸57至528延伸的NS1基因的至少一部分的缺失。在一些实施方式中，第一组的一种或多种突变包括提供复制能力的第一组的一种或多种点突变；这些可以位于修饰的H1N1流感病毒的M区的外部(例如，H1N1流感病毒基因组中的G346A突变)。在一些实施方式中，第二组的一种或多种突变包括第二组的一种或多种点突变，比如H1N1流感病毒基因组中的T261G和/或A310G突变。在发明构思的活减毒疫苗中利用的修饰的病毒可以包括在低于35℃的温度下提供复制的第三组的一种或多种突变，比如H1N1流感病毒基因组中的T261G和/或A310G突变。这种突变的流感病毒在37℃或更高的温度下相对于35℃或更低的温度可以显示降低的复制能力。
在一些实施方式中，减毒疫苗包括突变的流感病毒，其具有编码外源性抗原的基因的插入，比如人病原体。适合的人病原体的实例包括病毒(例如流感病毒、SARS病毒、MERS病毒、Zika病毒、肝炎病毒、乳头瘤病毒和埃博拉病毒)、细菌、真菌和寄生虫。在其它实施方式中，减毒疫苗包括突变的流感病毒，其具有编码与疾病状态相关联的内源性抗原的基因，比如癌症相关抗原和/或τ蛋白。
如上面所提及的，本发明构思的疫苗可以包括载剂。在一些实施方式中，该载剂包括佐剂和/或免疫增强剂。适合的免疫增强剂的实例包括TLR-7激动剂，比如咪喹莫特。
至少部分地由于缺乏毒力因子和适应降低的温度，对于用于两岁以下和/或大于49岁的人，活减毒疫苗是安全的。活减毒疫苗在动物模型中提供至少20％存活率中是有效的，该动物模型已经接种有活减毒疫苗对其提供保护的高致死剂量的病原体，其中在利用活减毒疫苗鼻内种痘动物模型之后至少两周进行这种接种。
本发明构思的另一个实施方式是生成适合用于活减毒疫苗的修饰的流感病毒的方法。这种方法包括使毒力因子活性从H1N1流感病毒缺失以生成第一突变的病毒；在37°或更高温度下在哺乳动物细胞系中增殖第一突变的病毒以生成有复制能力的包括第一组的一种或多种突变的第二突变的病毒，和在低于35℃的温度下在禽类卵系统中增殖第二突变的病毒以生成包括第二组的一种或多种突变的冷适应的第三突变的病毒。在一些实施方式中，毒力因子活性的缺失包括NS1基因的至少一部分的缺失，并且其中该缺失延伸超过NS1区段的核苷酸57至258。在一些实施方式中，第一组的一种或多种突变是赋予复制能力的第一组的一种或多种点突变，其可以位于突变的H1N1流感病毒的M区的外部(例如，H1N1流感病毒基因组中的G346A突变)。第二组的一种或多种突变是第二组的一种或多种点突变，比如H1N1流感病毒基因组中的T261G和/或A310G突变。在一些实施方式中，第三突变的病毒包括与第二组的突变不同并在低于35℃的温度下赋予复制的第三组的一种或多种突变，比如H1N1流感病毒基因组中的T261G和/或A310G突变。第三突变体病毒在37℃或更高的温度下相对于35℃或更低的温度可以显示降低的复制能力。
一些实施方式包括将编码外源性抗原的基因插入H1N1流感病毒的步骤。在这类实施方式中，外源性抗原可以源自人病原体，比如病毒(例如流感病毒、SARS病毒、MERS病毒、Zika病毒、肝炎病毒、乳头瘤病毒和埃博拉病毒)、细菌、真菌和/或寄生虫。在其它实施方式中，插入编码与疾病状态相关联的内源性抗原的基因，比如癌症相关抗原和/或τ蛋白。
本发明主题的各个目标、特征、方面和优点根据优选实施方式的下列详细描述连同附图将变得显而易见，在附图中相同的数字表示相同的组分。
附图说明
图1示意性地描绘用于生成有复制能力和冷适应的DelNS1流感病毒(冷适应的CA04-DelNS1)的示例性方法。
图2描绘示出在G346A(D101N)位置处NP中的突变的测序数据，该突变已经被发现为支持在MDCK细胞和鸡胚卵中的DelNS1病毒复制，尽管毒力因子缺失。
图3描绘示出在T261G(L79V)和A310G(E95G)位置处NEP中的突变的测序数据，这些突变已经被发现支持冷适应的DelNS1病毒复制。
图4图形地描绘冷适应的CA4-DelNS1病毒在33℃和39℃下的生长性质。
图5示出展示在不同温度下培养的冷适应的CA4-DelNS1病毒的斑块大小的照片。
图6示出通过本发明构思的疫苗保护小鼠适应的PR8(H1N1)病毒的致死攻击相关的数据。
图7示出通过本发明构思的疫苗保护A/越南/1194/04(H5N1)病毒的致死攻击相关的数据。
图8示出通过本发明构思的疫苗保护A/越南/1194/04(H5N1)病毒的高致死攻击相关的数据。
图9示出在单次滴鼻免疫之后通过本发明构思的疫苗保护A/浙江/1/RG/2013(H7N9)病毒的高致死攻击相关的数据。
图10示出在两次滴鼻免疫之后通过本发明构思的疫苗保护A/浙江/1/RG/2013(H7N9)病毒的高致死攻击相关的数据。
图11示出通过利用携带编码本发明构思的MERS抗原的基因的冷适应的DelNS1流感病毒免疫保护MERS相关的数据。
图12示出Adv-PP4处理的小鼠的肺组织学的照片，该小鼠在利用MERS冠状病毒感染之后，接受作为疫苗的携带MERS抗原基因的冷适应的DelNS1流感病毒或PBS假(sham)疫苗。
具体实施方式
下列描述包括可以用于理解本发明的信息。这不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者明确地或暗示地引用的任何出版物是现有技术。下列讨论提供了发明主题的许多实例实施方式。虽然每个实施方式表示本发明要素的单一组合，但是本发明主题被视为包括公开的要素的所有可能的组合。因而，如果一个实施方式包括要素A、B和C，并且第二实施方式包括要素B和D，则本发明主题也被视为包括A、B、C或D的其他剩余组合，即使其没有被明确地公开。
本发明主题描述描述研发对DelNS1病毒具有有效复制必要的突变，以及用于提供DelNS1病毒的冷适应的突变。NS1是流感病毒的毒力基因，其中NS1蛋白在拮抗宿主抗病毒应答和支持病毒复制中起重要作用。由这些特异性突变提供的有效复制对于高病毒生产是必要的，所述高病毒生产是流感疫苗研发的必要要素。由这些特异性突变提供的免疫病毒的冷适应促进用作减毒活疫苗，例如可以便利地和安全地通过呼吸道(例如，鼻部或通过吸入)施用的疫苗。
本发明还描述将新发现的和研发的病毒开发为疫苗。本发明还描述该新开发的疫苗的改善的安全性以及令人惊讶地大的功效。发明人考虑基于具有这些特异性突变的DelNS1病毒的疫苗也可以安全地用于两岁以下和50岁以上的人中。
应当领会，本公开的技术提供了许多有益的技术效果，包括改善的对流感病毒的各种毒株的保护以及对非常年轻和老年群体的改善的安全性情况(profile)。
还应当领会，鼻内或粘膜应用(在没有与注射相关联的不适的情况下提供保护方面)的便利性与公开的改善的安全性和对流感病毒的各种毒株的较好功效/保护相结合，尤其是当进一步与免疫增强剂的使用相结合时。适合的免疫增强剂包括TLR-7激动剂。在优选的实施方式中，免疫增强剂是咪喹莫特(其已经被证明进一步增强对流感疫苗的免疫应答)。这种鼻内或粘膜应用的使用进一步增强了对普通群体——包括非常年轻(即小于2岁)和老年(即大于49岁)群体——的总体实用性和保护。
在一些实施方式中，用于描述和要求保护本发明的某些实施方式的表达成分量、性质的数字——比如浓度、反应条件等，将被理解为在一些情况下被术语“大约”修饰。因此，在一些实施方式中，在书面描述和所附权利要求书中陈述的数值参数是近似值，其可以根据通过具体实施方式寻求获得的期望性质而改变。在一些实施方式中，数值参数应当根据报道的有效数字的数目并通过应用四舍五入技术来解释。虽然阐明本发明的一些实施方式的宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中陈述的数值尽可能精确地报道。在本发明的一些实施方式中呈现的数值可以包含某些误差，所述误差必然地源自在它们各自的测试测量中发现的标准偏差。
如在本文说明书中和遍及所附权利要求书使用的，“一个(a,an)”和“该(the)”的含义包括复数指代对象，除非上下文明确地另外指示。而且，如在本文说明书中所使用的，“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”，除非上下文明确地另外指示。
本文中值的范围的叙述仅意欲用作单独地提及落入该范围的每个单独值的速写方法。除非本文中另外指示，每个单独的值通过引用被并入说明书，如同其在本文中被单独地叙述。本文描述的所有方法可以以任何适合的顺序执行，除非本文另外指示或上下文另外明确地矛盾。关于本文中某些实施方式提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“比如”)的使用仅仅意欲更好地阐明本发明并且不对另外要求保护的发明的范围强加限制。说明书中没有语言应当被解释为表明对本发明的实践必要的任何非要求保护的要素。
本文公开的发明的可选要素或实施方式的分组不应当被解释为限制。每个组成员可以单独地或以与该组的其他成员或本文中发现的其他要素的任何组合被提及和要求保护。组的一个或多个成员可以出于便利性和/或可专利性的原因包含在组中或从组中删除。当任何这样的包含或删除发生时，说明书在本文中被视为包含修改的组，因而满足在所附权力要求书中使用的所有马库什组的书面描述。
在本发明构思的一些实施方式中，毒力因子的表达可以在免疫病毒株中减少和/或消除。在优选的实施方式中，这通过使毒力因子基因的所有或部分(例如，编码NS1蛋白的基因)缺失来完成。毒力因子已经从其缺失的流感病毒株的实例是Del1NS1，编码NS1蛋白的内含子已经从其切除。这种缺失必然地对所得病毒复制和增殖的能力具有有害影响。令人惊讶地，发明人已经发现了通过在37℃下哺乳动物细胞系的传代导致这种毒力因子缺失的流感病毒的增殖，该流感病毒具有在缺乏毒力因子的情况下赋予有效复制的额外突变。这些突变对于在不存在毒力因子基因的情况下支持复制是独特的。
虽然具有复制能力情况下的毒力缺乏对于意欲用作疫苗的流感病毒是有用的特征，但是在接种之后可以降低系统感染概率的额外特征可以是有用的。发明人已经发现，在降低温度下携带这种毒力因子缺失突变的病毒的后续传代(例如，在30℃下通过鸡胚卵)允许冷适应的DelNS1病毒的隔离。这种冷适应的病毒株的复制在正常体温下(例如，37℃)被抑制，将复制群体有效地隔离至具有相对低温的身体区域(比如鼻腔)。
发现这种冷适应的DelNS1病毒是无毒性的，并且与现有技术(即商业可得的)冷适应的活减毒流感疫苗相比对来自异亚型(heterosubtypic)病毒的致死攻击能够提供更有效保护。由于毒力元件从这种冷适应的DelNS1病毒基因组缺失并且该病毒另外地适应于与现有技术减毒病毒流感疫苗毒株中发现的那些相比在更低的温度下复制，因此使用本发明构思的病毒制备的疫苗是更安全的并且能够在最易受伤害的群体——老年人和婴幼儿——中使用。
具体地，本发明人已经发现，在常规温度(例如37℃)下通过毒力基因(例如，NS1)的缺失工程化的流感病毒通过哺乳动物细胞系(例如MDCK细胞)的传代可提供支持病毒有效复制的突变，尽管缺乏毒力因子。发明人已经进一步发现在降低温度下(即低于37℃)通过宿主细胞(比如在胚胎卵中发现)的这种突变病毒的传代可以提供赋予冷适应的额外突变。这种降低温度可以是大约35℃、大约33℃、大约30℃、大约27℃或低于27℃。
本发明主题提供了装置、系统和方法，其中疫苗毒株可以克服当前流感疫苗的限制并且将满足需要的群体对季节性流感和对大流行预防(preparedness)的要求。这种疫苗可以使用携带突变的活减毒病毒研发，这些突变：(1)缺失毒力因子，(2)在不存在毒力因子的情况下提供有效复制，和(3)提供冷适应。本发明构思包括三大构成。第一，研发DelNS1减毒流感病毒(例如非结构基因1缺失的流感病毒)，其令人惊讶地包括基因组的M区段中的新型突变，该突变允许在不存在毒力因子的情况下病毒有效繁殖。这种有效的繁殖对于流感疫苗的实际制造是必要的。第二，令人惊讶地发现，这种突变体病毒可以进一步冷适应。该发现允许一系列新突变的研发，这些新突变提供了毒力因子缺失的流感病毒的冷适应。这种冷适应可以赋予通过呼吸或粘膜途径有效地递送病毒的疫苗制品的能力。更令人惊讶的是，通过这样的两部分(two pronged)修饰过程(即NS1缺失和具有新发现突变的冷适应)研发的病毒株仍然可以产生高病毒效价；这是对于疫苗生产非常有用的特征。最后，利用这样的双重修饰和允许当鼻内递送时使用这样的高度修饰的病毒制备的疫苗有用的冷适应，发明人发现这种方式生产的疫苗显示了在动物研究中优异的安全性情况、令人惊讶地改善的针对其他(即非免疫)流感毒株的交叉反应性、和与现有的鼻内疫苗金标准(包括可用于人对象的仅有的鼻内流感疫苗)相比是更有效的。
发明人还发现，对于相同毒株和跨种二者，这种流感疫苗的免疫原性可以利用咪喹莫特的伴随使用来增强。使用咪喹莫特和类似化合物来增强各种种痘组合物的免疫原性在2015年7月17日提交的美国临时专利申请号62/194,136中描述。
在本发明构思的一个实施方式中，已经通过毒力因子的缺失，然后在不存在毒力因子的情况下允许有效复制的至少一种突变和提供冷适应的至少一种额外突变的研发，修饰的流感病毒用作用于插入源自非流感病原体的一种或多种基因的载剂或“骨架(backbone)”。这种修饰的病毒可以用作活减毒疫苗的基础，该疫苗提供针对非流感病原体感染的临床上有效的保护和/或非流感病原体感染的有效治疗。在优选的实施方式中，这样的疫苗可以经由粘膜有效地施用。适合的非流感病原体的实例包括SARS、MERS、Zika病毒、肝炎病毒、乳头瘤病毒、埃博拉病毒等。具体而言，发明人发现了将MERS RBD结构域插入这种修饰的流感病毒骨架可以用于鼻内施用的疫苗中，该疫苗赋予保护免于MERS感染DPP4转导的小鼠。这种DPP4转导的小鼠通常被用作MERS疫苗研发的鼠模型。发明人还成功地将Zika病毒RBD结构域并入这种修饰的流感病毒骨架。虽然上面提及了病毒抗原的使用，但是编码源自细菌、原生动物、真菌和/或寄生性生物体的抗原的基因也可以并入这种修饰的流感病毒骨架，用于疫苗制品。还考虑其他免疫靶标——包括与疾病状态相关联的内源性(即人)抗原(例如，癌症相关抗原和/或τ蛋白)——可以被并入该载体并由该载体表达。因此，该平台可以被用于在一级预防和防止癌症复发二者或任一者中充当癌症疫苗(治疗性地和/或预防性地)，或可选地，充当阿尔茨海默病和与τ蛋白斑块相关联的其他疾病的治疗。
可以使用本发明方法研发多种突变。例如，A14U和G917A突变——其位于流感病毒基因组的M区段内，可以分别支持DelNS1A/WSN/33(H1N1)和DelNS1H7N9病毒的复制，尽管NS1毒力因子基因的一部分缺失。但是，应当领会，可以使用在病毒基因组的其他非M区段部分中的突变。例如，在本发明构思的一些实施方式中，流感病毒基因组的NP区段中的突变可以支持流感病毒的复制，其中编码NS1毒力因子的内含子已经被切除。这类DelNS1病毒在小鼠中是无毒的并且可以导致对流感病毒的各种亚型的交叉保护。赋予类似性质的突变可以由流感病毒的当前季节性流通的毒株研发(例如，2009年的H1N1病毒株，其已经成为自2009年大流行以来在人中流通的季节性流感病毒之一)。
在本发明构思的一个实施方式中，DelNS1毒株由这种2009H1N1毒株——编码内含子的NS1的延伸部分或全部(例如延伸超过由核苷酸57至258涵盖的区段)已经从其缺失的A/加利福尼亚/04/09——研发。利用本发明构思的方法，这种流感病毒的DelNS1毒株利用NP区内的G345A突变研发，其能够使得DelNS1病毒在细胞培养物和卵中有效地复制。令人惊讶地，该新型适应性突变不同于和独特于DelNS1A/WSN/33和H7N9病毒的M区突变，并且之前没有作为DelNS1流感病毒中的突变被报道。
使用源自A/加利福尼亚/04/09毒株的有复制能力的DelNS1 2009H1N1病毒，本发明构思的方法已经成功地生产了DelNS1冷适应的H1N1疫苗毒株，例如冷适应的CA4-DelNS1。令人惊讶地，该双重修饰可以提供这样的流感病毒：其产生高病毒效价，例如病毒效价在可以适合于疫苗生产的范围内。应当领会，现有技术(即商业化的)活减毒流感疫苗(除外)依赖于源自H2N2病毒株(A/Ann Arbor/6/60)的“骨架”的冷适应特征的性质。源自该骨架的冷适应的活减毒疫苗仅被FDA批准用于2岁-49岁年龄组。在限制使用中，FDA引文涉及在这些年龄组和具有某些潜在病症的组中的使用，因为仅有的减毒条件是疫苗毒株聚藏(harbor)在较高温度下限制下呼吸道的复制的突变。不幸的是，这些年龄组对流感感染遭受相对高的致命性。应当领会，给接受根据本发明构思研发的疫苗的对象提供双重保护机制，因为新型疫苗毒株中的DelNS1突变与赋予冷适应的突变的组合在不牺牲效力的情况下提供了较高水平的安全性。
如上面所提及的，具有在低(即低于37℃)温下通过胚胎卵提供复制的突变的流感病毒的DelNS1毒株的传代允许赋予冷适应的突变的研发。在这方面，存在可以有用的多种突变。例如，NEP、T261G和A310G中的新型突变已经与DelNS1H1N1疫苗毒株的冷适应特征相关联。显著地，这些突变独特于和不同于被用作现有技术商业化的活减毒疫苗的骨架的A/Ann Arbor/6/60毒株中存在的突变。令人惊讶地，这种DelNS1冷适应的H1N1病毒(例如Ca4-DelNS1病毒)能够有效地复制，并且可以得到允许在胚胎卵中这种病毒的疫苗毒株稳定复制的方案。令人惊讶地，可以实现与在卵中野生型病毒的复制水平类似的复制水平。
有利地，发现这种冷适应突变在升高(例如生理学)温度下赋予对DelNS1冷适应的流感病毒的生长限制。例如，发现这种病毒在30℃至33℃下复制，但是发现其在37℃至39℃下生长被限制，这表明冷适应的CA4-DelNS1病毒的复制可以在较高温度比如37℃至39℃下被限制。这种生长限制表明本发明构思的冷适应的Del1NS1流感病毒适合用于活减毒疫苗，特别适合用作可以通过施加至粘膜组织被有效地施用的活减毒疫苗毒株。已经发现使用本发明构思的冷适应的DelNS1生产的疫苗制剂在小鼠中不产生明显的致病作用。
如下面所示出的，使用本发明构思的冷适应的DelNS1流感病毒制备的疫苗在利用各种高度致病流感病毒株的致死剂量攻击的小鼠中提供交叉保护。在多次攻击中，冷适应的DelNS1疫苗毒株与通过现有技术冷适应的H1N1疫苗所提供的相比提供显著更好的保护。例如，与利用冷适应的CA7疫苗毒株免疫的那些小鼠相比，利用冷适应的CA4-DelNS1病毒免疫的小鼠展现更少的体重减轻和更高的存活率。当利用H5N1或H7N9病毒的高致死剂量攻击小鼠时，效果甚至更明显。
实施例
加利福尼亚(CA)/04/09毒株被用于通过在56-529处缺失内含子的反向遗传程序构建CA4-DelNS1病毒。传代拯救病毒(rescued virus)，直到通过在MDCK细胞中在37℃下复制稳定化DelNS1病毒。在突变的序列确认之后，使CA(冷适应的)4-DelNS1病毒进一步适应通过在鸡胚卵中在30℃下传代在低温下复制，直到稳定化病毒效价。在图1中示出了该过程的示意性描绘。
在MDCK细胞中传代之后对CA4-DelNS1进行序列分析。确认在NP区段中位置G346A(蛋白质序列中的D101N)处的G到A的一种适应性置换。发现这种置换支持MDCK细胞中和卵中的CA4-DelNS1病毒复制。图2中示出了CA4-DelNS1病毒的非突变(P1)和突变毒株的序列分析的结果。
在通过传代冷适应和在鸡胚卵中在30℃下复制稳定化之后，对CA4-DelNS1病毒进行序列分析。两种适应性置换T261G(L79V)和A310G(E95G)被鉴定并且在NS区段的NEP编码区中验证。图3中示出了CA4-DelNS1病毒的非突变(P1)和突变毒株的序列分析的结果。
分别在低温(33℃)和高温(39℃)下的多循环复制之后，在MDCK细胞中检查冷适应的CA4-DelNS1病毒的生长动力学。图4中示出了结果。
图4.在33℃和39℃下冷适应的CA4-DelNS1病毒的生长性质。
使用MDCK细胞在软琼脂板上评估在33℃、37℃和39℃下冷适应的CA4-DelNS1病毒的斑块形成性质。结果在图5中示出。
利用单次剂量的冷适应的CA4-DelNS1病毒和H1N1疫苗使用滴鼻程序免疫6只小鼠的组。免疫后两周，利用PR8(H1N1)病毒的致死接种物(10MLD50)攻击小鼠。在病毒攻击后持续两周记录体重改变和存活率，并在图6中示出。利用冷适应的CA4-DelNS1病毒的滴鼻免疫的保护作用是明显的，提供几乎80％存活率。
利用单次剂量的冷适应的CA4-DelNS1病毒和H1N1疫苗使用滴鼻程序免疫6只小鼠的组。免疫后两周，利用A/越南/1194/04(H5N1)病毒的致死接种物(100MLD50)攻击小鼠。病毒攻击后持续两周记录体重改变和存活率。结果在图7中示出。利用冷适应的CA4-DelNS1病毒的滴鼻免疫的保护作用是明显的，提供几乎80％存活率并且没有显著的体重损失。
利用两次剂量的冷适应的CA4-DelNS1病毒和H1N1疫苗间隔两周使用滴鼻程序免疫6只小鼠的组。第二次剂量后两周，利用A/越南/1194/04(H5N1)病毒的高致死接种物(1000MLD50)攻击小鼠。病毒攻击后持续两周记录体重改变和存活率。结果在图8中示出。利用冷适应的CA4-DelNS1病毒的滴鼻免疫的保护作用是明显的，提供几乎80％存活率。
利用单次剂量的冷适应的CA4-DelNS1病毒和H1N1疫苗使用滴鼻程序免疫6只小鼠的组。免疫后两周，利用A/浙江/1/RG/2013(H7N9)病毒的高致死接种物(6MLD50)攻击小鼠。病毒攻击后持续两周记录体重改变和存活率。结果在图9中示出。
利用冷适应的CA4-DelNS1病毒的滴鼻免疫的保护作用是明显的，其中如此免疫的小鼠仅显示体重的较小的最初损失，然后快速并完全恢复。
利用两次剂量的冷适应的CA4-DelNS1病毒和H1N1疫苗间隔两周使用滴鼻程序免疫6只小鼠的组。第二次剂量后两周，利用A/浙江/1/RG/2013(H7N9)病毒的高致死接种物(15MLD50)攻击小鼠。病毒攻击后持续两周记录体重改变和存活率。结果在图10中示出。利用冷适应的CA4-DelNS1病毒的滴鼻免疫的保护作用是明显的，其中如此免疫的小鼠显示将近20％存活率。
如上面所提及的，本发明构思的冷适应的有复制能力的DelNS1流感病毒可以被用作对非流感免疫病毒株研发的载剂或骨架。例如，编码与人类病原体(比如细菌、真菌和/或寄生虫)相关联的外源性抗原或与人类疾病(比如癌症、自身免疫疾病和神经退行性疾病比如阿尔茨海默病和帕金森病)相关联的内源性(即人)抗原的基因可以被并入本发明构思的冷适应的DelNS1流感病毒的基因组。使用携带编码MERS冠状病毒抗原的外源性基因的冷适应的DelNS1流感病毒制备的疫苗的研究结果在图11和12中示出。如在图11中所示出的，利用Adv-DPP4处理的小鼠的接种赋予对MERS CoV的敏感性提供了针对用MERS-CoV的后续感染的保护，如通过相对于类似处理的未种痘的小鼠降低的体重损失和更快的恢复所证明的。保护的进一步证据通过肺组织的组织学研究示出，如在图12中示出的。如示出的，接受利用PBS的假种痘的小鼠显示在用MERS感染之后严重肺炎的证据，而接受疫苗的小鼠——该疫苗包括携带编码MERS抗原的基因的冷适应的DelNS1流感病毒——仅发展中等的肺炎。
方案
DelNS1病毒适应
1.NS1缺失质粒的构建：
2009H1N1A/加利福尼亚/04/09(CA4)被用作骨架来构建DelNS1疫苗毒株。没有NS1表达的质粒通过利用如下引物的反向PCR构建：
CA04-DelNS1-529F：GACATACTTATGAGGATGTC
CA04-DelNS1-56R：CTGAAAGCTTGACATGGTGTTG
2.CA04-DelNS1病毒的拯救：
九种质粒：pHW2000-CA04-PB2、pHW2000-CA04-PB1、pHW2000-CA04-PA、pHW2000-CA04-NP、pHW2000-CA04-HA、pHW2000-CA04-NA、pHW2000-CA04-M、pHW2000-CA04-DelNS1和pCX-CA04-NS1在一个管中被混合在一起。每种以1μg存在。利用混合质粒的转染在6孔板中平板接种的80％汇合的293T细胞中进行。在转染期间，用不含青霉素和链霉素的1ml Opti-MEM替换旧的培养基。16小时后，丢弃上清液并加入包含1μg/ml胰蛋白酶的2ml MEM。转染后70小时，在细胞碎片被去除之后收集上清液。
3.DelNS1病毒的传代：
将200微升拯救的DelNS1病毒注入9-10天龄受精卵并在37℃培养箱中温育48小时。收集卵尿囊液并测量HA效价。通过在1500g下离心10分钟去除血细胞和其他碎片。将上清液转移入Millipore 100K超滤器并在3000g的速度下离心10分钟。将PBS加入过滤器以给出10ml的体积来洗涤浓缩的病毒，并且在3000g下再次离心悬浮液10分钟。200微升的所得病毒制品被用于接种9-10天龄受精卵并且重复该过程，直到病毒HA效价急剧增加。
4.DelNS1病毒的序列分析：
在病毒HA效价变得稳定之后，提取病毒RNA并且对全基因组进行测序以便检查突变位点。
5.将在适应的病毒中发现的突变(一种或多种)引入骨架质粒：
使用标准定点诱变方案将鉴定的适应性突变引入野生型CA4病毒以确认该置换在支持病毒复制中的作用。
6.利用突变的质粒重新拯救DelNS1病毒。
细胞和卵中的生长动力学对于MDCK细胞：
使平板接种在24孔板中的100％汇合的MDCK细胞在37℃下在0.05的MOI下用DelNS1病毒感染。吸收后一小时，去除上清液，然后利用500μl PBS/孔洗涤细胞一次。利用补充有1μg/ml胰蛋白酶的MEM覆盖细胞；然后在37℃或33℃下温育细胞。在相应的时间点下收集上清液并且然后进行离心以去除细胞并将其在-80℃下储存用于斑块测试。
对于卵：
9-10天龄的卵利用1000PFU的DelNS1病毒接种。在37℃或33℃下温育卵。在相应时间点下收集尿囊液。
斑块测试
十倍稀释的DelNS1病毒被用于感染平板接种在六孔板中的100％汇合的MDCK细胞并在37℃下温育细胞。吸收后一小时，丢弃上清液并用1ml的PBS洗涤细胞一次。利用补充有1μg/ml胰蛋白酶的1％MEM琼脂糖覆盖细胞，并且然后在33℃培养箱中内部颠倒放置。48小时后，利用10％福尔马林固定细胞至少1小时，并且然后丢弃福尔马林和琼脂糖凝胶。利用1％结晶紫染色细胞以可视化斑块。
小鼠研究
将6-8周龄雌性BALB/C小鼠麻醉，然后鼻内接种包含1.35×105PFU的DelNS1病毒的25μl PBS。在接种后持续两周每天记录小鼠体重和其他参数。为了测定感染后的肺效价，感染后3天处死小鼠。免疫后两周，利用相应的致死剂量病毒攻击小鼠。持续两周每天记录小鼠体重。在病毒攻击后，当体重损失大于25％时处死小鼠。
MERS疫苗方案
pHW2000-MERS-RBD-NEP质粒的构建
为了生成表达MERS受体结合结构域(RBD)的重组NS1缺失的流感病毒，构建pHW2000-MERS-RBD-NEP质粒。其具有开放阅读框，该开放阅读框由NS1的CA04N末端、MERSRBD结构域、PTV1-2A切割位点、具有突变的N末端NS1序列的CA04NEP组成。MERS-RBD-PTV1-2A的序列由质粒pcDNA-MERS-SPIKE通过PCR扩增。然后通过使用核酸外切酶III的连接独立克隆(ligation independent cloning)，将PCR产物插入pHW2000-CA04-DelNS1，其仅包含CA04NEP开放阅读框。在转化之后，质粒从正确(right)克隆提取并随后测序以确认序列。
CA04-delNS1-RBD病毒的拯救
将九种质粒：pHW2000-CA04-PB2、pHW2000-CA04-PB1、pHW2000-CA04-PA、pHW2000-CA04-NP,pHW2000-CA04-HA、pHW2000-CA04-NA、pHW2000-CA04-M、pHW2000-MERS-RBD-NEP和pCX-CA04-NS1——每种具有1μg——混合并用于转染在6孔板中80％汇合的293T细胞。在转染期间，用不含抗生素的1ml Opti-MEM替换旧的培养基。16小时后，丢弃上清液并加入包含1μg/ml胰蛋白酶的2ml MEM。转染后70小时，在去除细胞碎片之后收集上清液。将上清液注入9-10天龄的受精卵中并在37℃下温育48小时。收集卵尿囊液，并通过离心清除。然后对病毒进行测序并在MDCK细胞中通过斑块测试测定效价。CA04-delNS1-RBD病毒的最高效价是2×107pfu/ml。
动物研究
将两个组(每组六只)的6-8周龄雌性BALB/C小鼠麻醉，然后鼻内接种包含5×105TCID50的MERS-RBD-DelNS1病毒的25μl PBS，间隔两周进行两次。在MERS冠状病毒攻击之前五天，利用在50μl PBS中的2.5×108PFU的Adv-DPP4接种小鼠。Adv-DPP4感染后第5天，利用5×105TCID50MERS冠状病毒攻击小鼠。持续两周每天记录一组小鼠的体重改变。在MERS冠状病毒攻击后第3天处死另一组小鼠并且获得肺组织进行组织病理学检查和病毒效价分析。
对于本领域技术人员应当显而易见的是除了已经描述的之外的许多修改是可能的，而不背离本文的发明构思。因此，除了所附权利要求书的精神，本发明构思不被限制。而且，在解释说明书和权利要求书中，所有术语应当以与上下文一致的最宽的可能方式被解释。具体而言，术语“包括(comprise、comprising)”应当被解释为以非排他性方式指元件、组分或步骤，这表明提及的元件、组分或步骤可以存在或利用，或与未明确提及的其他元件、组分或步骤组合。当说明书和权利要求书提及选自A、B、C……和N的事物中的至少一种时，该文本应当被解释为要求来自该组的仅一个要素，而不是A加N、或B加N等。
Claims (59)
1.一种用于疫苗生产的突变的流感病毒，其包括：
修饰的H1N1流感病毒基因组，其包括毒力因子活性的缺失；
第一组的一种或多种突变，其在不存在所述毒力因子活性的情况下在37℃下赋予复制；和
第二组的一种或多种突变，其在低于35℃的温度下赋予复制。
2.权利要求1所述的突变的流感病毒，其中所述毒力因子活性的缺失包括毒力因子基因的至少一部分的缺失。
3.权利要求2所述的突变的流感病毒，其中所述缺失包括超过所述突变的病毒的NS1区段的核苷酸57至528延伸的NS1基因的至少一部分的缺失。
4.权利要求1-3中一项所述的突变的流感病毒，其中所述第一组的一种或多种突变包括赋予复制能力的第一组的一种或多种点突变。
5.权利要求4所述的突变的流感病毒，其中所述第一组的一种或多种点突变位于所述突变的H1N1流感病毒的M区的外部。
6.权利要求4所述的突变的流感病毒，其中所述第一组的一种或多种点突变的至少一种是所述H1N1流感病毒基因组中的G346A突变。
7.权利要求1-6中一项所述的突变的流感病毒，其中所述第二组的一种或多种突变包括第二组的一种或多种点突变。
8.权利要求7所述的突变的流感病毒，其中所述第二组的一种或多种点突变的至少一个成员选自在所述H1N1流感病毒基因组中的T261G和A310G突变。
9.权利要求1-8中一项所述的突变的流感病毒，包括在低于35℃的温度下赋予复制的第三组的一种或多种突变。
10.权利要求9所述的突变的流感病毒，其中所述第三组的一种或多种突变包括与所述第二组的一种或多种点突变不同的第三组的一种或多种点突变，并且选自在所述H1N1流感病毒基因组中的T261G和A310G突变。
11.权利要求1-10中一项所述的突变的流感病毒，其中所述突变的流感病毒在37℃或更高的温度下相对于35℃或更低的温度显示了降低的复制能力。
12.权利要求1-11中一项所述的突变的流感病毒，进一步包括编码外源性抗原的基因的插入。
13.权利要求12所述的突变的流感病毒，其中所述外源性抗原源自人病原体。
14.权利要求13所述的突变的流感病毒，其中所述人病原体选自病毒、细菌、真菌和寄生虫。
15.权利要求14所述的突变的流感病毒，其中所述病毒选自流感病毒、SARS病毒、MERS病毒、Zika病毒、肝炎病毒、乳头瘤病毒和埃博拉病毒。
16.权利要求1所述的突变的流感病毒，进一步包括编码与疾病状态相关联的内源性抗原的基因的插入。
17.权利要求16所述的突变的流感病毒，其中所述内源性抗原选自癌症相关抗原和与阿尔茨海默病相关联的τ蛋白。
18.权利要求1-17中一项所述的突变的流感病毒，其中所述突变的流感病毒适合用于配制活减毒疫苗。
19.权利要求18所述的突变的流感病毒，其中所述活减毒疫苗适合经由将粘膜暴露于所述活减毒疫苗的种痘。
20.一种活减毒疫苗，其包括：
修饰的H1N1流感病毒，其具有包括下列的基因组：毒力因子活性的缺失、在不存在所述毒力因子活性的情况下在37℃下赋予复制的第一组的一种或多种突变、和在低于35℃的温度下赋予复制的第二组的一种或多种突变，其中所述修饰的H1N1流感病毒以在免疫后提供保护效果的足够量存在；和
载剂，
其中所述活减毒疫苗被配制以通过使粘膜与所述活减毒疫苗接触来支持种痘。
21.权利要求20所述的活减毒疫苗，其中所述毒力因子活性的缺失包括毒力因子基因的至少一部分的缺失。
22.权利要求21所述的活减毒疫苗，其中所述缺失包括超过所述突变的病毒的NS1区段的核苷酸57至528延伸的NS1基因的至少一部分的缺失。
23.权利要求20-22中一项所述的活减毒疫苗，其中所述第一组的一种或多种突变包括赋予复制能力的第一组的一种或多种点突变。
24.权利要求4所述的活减毒疫苗，其中所述第一组的一种或多种点突变位于所述修饰的H1N1流感病毒的M区的外部。
25.权利要求24所述的活减毒疫苗，其中所述第一组的一种或多种点突变中的至少一个成员是所述H1N1流感病毒基因组中的G346A突变。
26.权利要求20-25中一项所述的活减毒疫苗，其中所述第二组的一种或多种突变包括第二组的一种或多种点突变。
27.权利要求26所述的活减毒疫苗，其中所述第二组的一种或多种点突变中的至少一个成员选自所述H1N1流感病毒基因组中的T261G和A310G突变。
28.权利要求20-27中一项所述的活减毒疫苗，包括在低于35℃的温度下赋予复制的第三组的一种或多种突变。
29.权利要求28所述的活减毒疫苗，其中所述第三组的一种或多种点突变不同于所述第二组的一种或多种点突变，并且其中所述第三组的一种或多种点突变中的至少一个成员选自所述H1N1流感病毒基因组中的T261G和A310G突变。
30.权利要求20-29中一项所述的活减毒疫苗，其中所述突变的流感病毒在37℃或更高的温度下相对于35℃或更低的温度显示了降低的复制能力。
31.权利要求20-30中一项所述的活减毒疫苗，进一步包括编码外源性抗原的基因的插入。
32.权利要求31所述的突变的流感病毒，其中所述外源性抗原源自人病原体。
33.权利要求32所述的活减毒疫苗，其中所述人病原体选自病毒、细菌、真菌和寄生虫。
34.权利要求33所述的活减毒疫苗，其中所述病毒选自流感病毒、SARS病毒、MERS病毒、Zika病毒、肝炎病毒、乳头瘤病毒和埃博拉病毒。
35.权利要求20所述的活减毒疫苗，进一步包括编码与疾病状态相关联的内源性抗原的基因的插入。
36.权利要求35所述的活减毒疫苗，其中所述内源性抗原选自癌症相关抗原和τ蛋白。
37.权利要求20-36中一项所述的活减毒疫苗，其中所述载剂包括佐剂。
38.权利要求20-37中一项所述的活减毒疫苗，其中所述载剂进一步包括免疫增强剂。
39.权利要求38所述的活减毒疫苗，其中所述免疫增强剂是TLR-7激动剂。
40.权利要求39所述的活减毒疫苗，其中所述TLR-7激动剂是咪喹莫特。
41.权利要求20-40中一项所述的活减毒疫苗，其中所述活减毒疫苗对于用于两岁以下的人是安全的。
42.权利要求20-41中一项所述的活减毒疫苗，其中所述活减毒疫苗对于用于大于49岁的人是安全的。
43.权利要求20-42中一项所述的活减毒疫苗，其中所述活减毒疫苗在动物模型中提供至少20％存活率中是有效的，所述动物模型已经接种所述活减毒疫苗为其提供保护的高致死剂量的病原体，其中在利用所述活减毒疫苗鼻内种痘所述动物模型之后至少两周进行接种。
44.一种生成适合用于活减毒疫苗的修饰的流感病毒的方法，其包括：
使毒力因子活性从H1N1流感病毒缺失以生成第一突变的病毒；
在37℃或更高下在哺乳动物细胞系中增殖所述缺失突变病毒以生成包括第一组的一种或多种突变的有复制能力的第二突变的病毒；
在低于35℃的温度下在禽类卵系统中增殖所述第二突变的病毒以生成包括第二组的一种或多种突变的冷适应的第三突变的病毒。
45.权利要求44所述的方法，其中所述毒力因子活性的缺失包括NS1基因的至少一部分的缺失，并且其中所述缺失延伸超过NS1区段的核苷酸57至528。
46.权利要求44-45中一项所述的方法，其中所述第一组的一种或多种突变是赋予复制能力的第一组的一种或多种点突变。
47.权利要求46所述的突变的流感病毒，其中所述第一组的一种或多种点突变位于所述突变的H1N1流感病毒的M区的外部。
48.权利要求46所述的方法，其中所述第一组的一种或多种点突变中的至少一个成员是所述H1N1流感病毒基因组中的G346A突变。
49.权利要求44-48中一项所述的方法，其中所述第二组的一种或多种突变是第二组的一种或多种点突变。
50.权利要求49所述的方法，其中所述第二组的一种或多种点突变的至少一个成员选自在所述H1N1流感病毒基因组中的T261G和A310G突变。
51.权利要求44-50中一项所述的方法，其中所述第三突变的病毒包括在低于35℃的温度下赋予复制的第三组的一种或多种突变。
52.权利要求51所述的方法，其中所述第三组的一种或多种突变包括第三组的一种或多种点突变，并且其中所述第三组的一种或多种点突变中的至少一个成员不同于所述第二组的一种或多种点突变，并且选自在所述H1N1流感病毒基因组中的T261G和A310G突变。
53.权利要求44-52中一项所述的方法，其中所述第三突变病毒在37℃或更高的温度下相对于35℃或更低的温度显示了降低的复制能力。
54.权利要求44-53中一项所述的方法，进一步包括将编码外源性抗原的基因插入H1N1流感病毒。
55.权利要求54所述的方法，其中所述外源性抗原源自人病原体。
56.权利要求55所述的方法，其中所述人病原体选自病毒、细菌、真菌和寄生虫。
57.权利要求56所述的方法，其中所述病毒选自流感病毒、SARS病毒、MERS病毒、Zika病毒、肝炎病毒、乳头瘤病毒和埃博拉病毒。
58.权利要求44所述的方法，进一步包括编码与疾病状态相关联的内源性抗原的基因的插入。
59.权利要求58所述的方法，其中所述内源性抗原选自癌症相关抗原和τ蛋白。
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