CN109679962A - Fbn2基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种突变的Fbn2基因,其与野生型Fbn2基因的差异在于1个突变,并且突变的Fbn2基因导致气管形成缺陷病的发生;突变是:Fbn2基因中c.2547T→A;本发明还公开了含有突变的Fbn2基因的载体和宿主细胞及其应用,以及能提高Fbn2基因的活性或/和表达量的试剂和基质金属蛋白酶的抑制剂在制备治疗气管形成缺陷病的药物中的应用。本发明构建了一种新的Fbn2基因突变的小鼠(Fbn2T2547A),即一种Fbn2无义突变导致Fbn2蛋白表达下降和基因失活的小鼠;同时发现Fbn2的失活削弱了小鼠气管的收缩,Fbn2的失活将导致气管平滑肌细胞排列的紊乱和极性的丧失,Fbn2的失活引起弹性蛋白形成的紊乱和纤维蛋白表达量的降低,Fbn2和纤维连接蛋白在气管塌陷的病人气管中的表达量明显下降。
Description
技术领域
本发明涉及分子遗传学领域以及疾病诊断和治疗领域;特别地,本发明提供了一种突变的Fbn2基因及其应用,包含突变的Fbn2基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。此外,本发明还提供了Fbn2基因在制备治疗气管形成缺陷病的药物中的应用。
背景技术
气管起始于喉结,延伸至肺部的支气管,是包括人在内的哺乳动物进行呼气交换的唯一通道。人类气管由软骨,平滑肌,结缔组织和上皮组成,长约13厘米,直径约2厘米,每分钟通过30至120升气体,起着净化,润湿和暖化吸入空气的作用。气管相关的疾病包括气管狭窄,气管塌陷等是威胁人类健康的主要因素之一。阐明气管的发育,功能及再生的细胞分子机制是生物医药领域面临的一个重要问题。
小鼠是目前研究哺乳动物气管发育的唯一且良好的模型:小鼠与人的亲缘关系接近,气管的结构和形态与人非常类似;小鼠交配时形成阴栓,可以很好的通过判断交配时间来确定发育的阶段;小鼠中成熟的细胞谱系示踪,基因敲除,化学诱变等技术能够快速有效的确定特定细胞和基因的体内功能。
微纤维蛋白(Fibrillin)是一种糖蛋白,分为微纤维蛋白1(Fbn1),微纤维蛋白2(Fbn2)和微纤维蛋白3(Fbn3),他们是细胞外微纤维的主要结构组分。研究表明微纤维不仅维持器官结构的完整性,而且还为弹性组织的弹性建立提供支架。小鼠和人类Fbn1和Fbn2基因的突变分别会导致马凡氏综合征和先天性挛缩型蜘蛛状指趾。相对于其它器官和系统开展的工作,微纤维蛋白在呼吸系统的发育及成体的生理功能方面的研究还非常有限。
发明内容
基于上述问题,本申请的发明人在研究微纤维蛋白在呼吸系统的发育及成体的生理功能的过程中发现了Fbn2基因在调节气管形成中的新功能。
本发明至少部分基于发明人的发现:Fbn2基因的突变可导致气管形成缺陷病。在此基础上,本发明提供了突变的Fbn2基因及其应用,包含突变的Fbn2基因的载体、宿主细胞以及试剂盒。此外,本发明还提供了Fbn2基因在制备治疗气管形成缺陷病的药物中的应用。
因此,在第一个方面,本发明提供了突变的Fbn2基因,其与野生型Fbn2基因的差异在于1个突变,并且所述突变的Fbn2基因导致气管形成缺陷病的发生;所述突变是:Fbn2基因中c.2547T→A。需要说明的是,所述突变是一个无义突变,导致Fbn2蛋白的合成提前终止,具体地,Fbn2蛋白质的氨基酸序列中第849位的半胱氨酸突变为终止位点。
在第二个方面,本发明提供了一种载体,所述载体包含上述突变的Fbn2基因。
在第三个方面,本发明提供了一种宿主细胞,所述宿主细胞包含上述突变的Fbn2基因或载体。
在第四个方面,本发明提供了上述突变的Fbn2基因、载体或宿主细胞的用途,其用于产生气管形成缺陷病动物模型,或用于制备试剂盒,所述试剂盒用于产生气管形成缺陷病动物模型。
在第五个方面,本发明提供了能够提高Fbn2基因的活性或/和表达量的试剂在制备治疗气管形成缺陷病的药物中的应用。其中,所述气管形成缺陷病具有以下症状中的至少一种:气管平滑肌细胞空间排列和细胞极性异常、软骨细胞分化水平降低、气管延长障碍、气管内腔面积减小、软骨环数量降低、平滑肌面积减少、软骨细胞分化的标志性蛋白AGC1和COL2A1表达显著下降、弹性蛋白排列和形成异常、纤维连接蛋白表达量降低、气管自主收缩幅度和频率大幅降低以及气管塌陷。
在第六个方面,本发明提供了受Fbn2蛋白调控的靶蛋白的抑制剂在制备治疗气管形成缺陷病的药物中的应用。
优选地,所述靶蛋白为基质金属蛋白酶2和/或9。
优选地,所述抑制剂为GM6001。
在第七个方面,本发明提供了能够提高Fbn2基因的活性或/和表达量的试剂和基质金属蛋白酶的抑制剂的联合使用在制备治疗气管形成缺陷病的药物中的应用。其中,Fbn2基因的活性指Fbn2基因经转录、翻译所得FBN2蛋白的活性。
在第八个方面,本发明提供了一种治疗气管形成缺陷病的药物,所述药物中含有能够提高Fbn2基因的活性或/和表达量的试剂和/或基质金属蛋白酶的抑制剂。
综上所述,本发明的有益效果为:
(1)构建了一种新的Fbn2基因突变的小鼠(Fbn2T2547A),即一种Fbn2无义突变导致Fbn2蛋白表达下降和基因失活的小鼠;
(2)首次揭示了Fbn2在呼吸系统中的功能,即Fbn2通过调控气管软骨和平滑肌的形成促进了气管的发育;
(3)首次分析了Fbn2的mRNA和蛋白质在呼吸系统中的时空表达模式,即Fbn2表达在包括气管软骨细胞和平滑肌细胞在内的间质细胞中;
(4)首次分析了Fbn2基因的失活对平滑肌排列和极性的影响,即Fbn2的失活将导致气管平滑肌细胞排列的紊乱和极性的丧失;
(5)首次建立了检测胚胎期与刚出生的小鼠气管收缩的方法,同时发现了Fbn2的失活削弱了小鼠气管的收缩;
(6)首次发现了Fbn2是维持弹性蛋白形成和纤维连接蛋白表达的功能,即Fbn2的失活引起弹性蛋白形成的紊乱和纤维蛋白表达量的降低;
(7)首次发现Fbn2在维持基质金属蛋白酶表达和活性方面的功能,即Fbn2基因的失活引起基质金属蛋白酶表达量和活性的升高,进而促进弹性蛋白和纤维连接蛋白形成的缺陷,最终导致气管发育的障碍;
(8)首次分析了Fbn2和纤维连接蛋白在健康人和气管塌陷的病人气管中的表达,发现与健康人相比,Fbn2和纤维连接蛋白在气管塌陷的病人气管中的表达量明显下降。
附图说明
图1为Fbn2在小鼠气管的软骨细胞和平滑肌细胞中表达时空模式的检测结果图;其中,图1a,1b和1c为原位杂交检测Fbn2 mRNA分别在小鼠胚胎期第14.5和16.5天气管中的表达结果,显示Fbn2 mRNA表达在包括软骨细胞和平滑肌细胞在内的间质细胞;图1d和1e为抗体染色检测FBN2蛋白分别在小鼠胚胎期第12.5至18.5天以及出生后气管中的表达结果,显示FBN2蛋白表达在包括软骨细胞和平滑肌细胞在内的间质细胞;
图2为Fbn2基因失活的小鼠表现症状的检测结果图,Fbn2基因失活的小鼠表现出气管形成的缺陷,其中,图2a和2b显示了刚出生的野生型和突变体小鼠的形态和体重;图2c,2d和2e为阿尔新蓝染色(Alcain blue)检测野生型和突变体小鼠气管软骨的形成及定量分析结果,显示突变体小鼠表现出气管的缩短和软骨环数量的减少;图2f和2g为苏木精-伊红染色(HE)检测野生型和突变体小鼠气管的形态及定量分析结果,显示突变体小鼠表现出气管内腔面积的减小;图2h为外显子测序结果,显示突变体小鼠Fbn2基因T2547A的突变;图2i为野生型和突变的FBN2蛋白的结构域示意图;图2j,2k和2l为阿尔新蓝染色检测野生型和Fbn2基因敲除小鼠气管软骨的形成及定量分析结果,显示Fbn2基因敲除小鼠表现出气管的缩短和软骨环数量的减少;
图3为Fbn2突变小鼠症状的检测结果图,突变小鼠表现出气管延伸,软骨环形成和平滑肌结构的缺陷;其中,图3a,3b和3c为野生型和突变体小鼠从胚胎期到成年的气管示意图及定量分析结果,显示从胚胎期第13.5天开始,突变体小鼠表现出气管延伸的缺陷;图3d,3e,3f,3g和3h为SOX9抗体染色和阿尔新蓝染色检测野生型和突变体小鼠气管软骨的形成及定量分析结果,显示突变体小鼠表现出软骨环数量的减少,软骨环间距的增加和软骨环宽度的降低;图3i和3j为α-SMA抗体染色检测野生型和突变体小鼠的平滑肌的排列及定量分析结果,显示突变体小鼠表现出气管平滑肌排列的缺陷和面积的减小;
图4为Fbn2突变小鼠症状检测结果图,突变小鼠表现出气管平滑肌细胞排列和极性的缺陷;其中,图4a和4b为α-SMA和CDH1抗体染色检测小鼠胚胎期第11.5到13.5气管平滑肌的形成及定量分析结果,显示在胚胎期第13.5天,小鼠气管平滑细胞表现楔形形状;图4c和4d为α-SMA抗体染色检测胚胎期野生型和突变体小鼠气管平滑肌细胞的排列及定量分析结果,显示突变体小鼠表现出平滑肌细胞排列的缺陷;图4e和4f为α-SMA和GM130抗体染色检测野生型和突变体小鼠的平滑肌细胞的极性及定量分析结果,显示突变体小鼠表现出气管平滑肌细胞极性的缺陷;
图5为Fbn2突变小鼠症状检测结果图,突变小鼠表现出气管软骨细胞分化的缺陷;其中,图5a和5b为AGC1抗体染色检测胚胎期第15.5天野生型和突变体小鼠气管软骨细胞的分化及定量分析结果,显示突变小鼠表现出气管软骨细胞分化的缺陷;图5c和5d为COL2A1抗体染色检测胚胎期第15.5天野生型和突变体小鼠气管软骨细胞的分化及定量分析结果,显示突变小鼠表现出气管软骨细胞分化的缺陷;
图6为Fbn2突变小鼠症状检测结果图,突变小鼠表现出弹性蛋白纤维形成和纤维连接蛋白积累的缺陷;其中,图6a,6b和6c为α-SMA和Tropoelastin抗体染色检测胚胎期第14.5天野生型和突变体小鼠气管中的弹性蛋白纤维结果,显示突变小鼠表现出弹性蛋白纤维排列的紊乱和长度的缩短;图6d和6e为免疫印迹检测野生型和突变体小鼠纤维连接蛋白的表达和定量分析结果,显示突变小鼠表现出纤维连接蛋白水平的降低;图6f,6g和6h为α-SMA和Fibronectin抗体染色及荧光实时定量PCR检测胚胎期第14.5天野生型和突变体小鼠气管中纤维连接蛋白的水平结果,显示突变小鼠表现出纤维连接蛋白水平的降低;图6i和6j为免疫印迹检测溶酶体抑制剂MA对突变体小鼠纤维连接蛋白水平的影响结果,显示溶酶体抑制剂部分的抑制了突变体小鼠中纤维连接蛋白的降解;图6k,6l和6m为α-SMA抗体染色检测弹性蛋白酶对气管和平滑肌形成的影响结果,显示弹性蛋白酶抑制了气管的延伸和平滑肌细胞的有序排列;
图7为Fbn2突变小鼠气管中基质金属蛋白酶活性变化的检测结果图,显示基质金属蛋白酶活性的升高导致了气管和平滑肌形成的缺陷;其中,图7a,7b和7c为实时荧光定量PCR和免疫印迹检测野生型和突变体小鼠气管中基质金属蛋白酶2和9表达结果,显示突变体小鼠表现出基质金属蛋白酶2和9mRNA和蛋白水平的升高;图7d和7e为明胶酶谱分析野生型和突变体小鼠气管中基质金属蛋白酶2和9的活性结果,显示突变体小鼠表现出基质金属蛋白酶2和9活性的升高;图7f和7g为显微成像显示基质金属蛋白酶抑制剂GM6001对突变体小鼠气管形成的影响以及定量分析结果,显示GM6001处理后突变体小鼠气管形成的缺陷得到缓解;图7h,7i,7j,7k和7l为α-SMA,Tropoelastin和Fibronectin抗体染色检测基质金属蛋白酶抑制剂GM6001对突变体小鼠气管平滑肌,弹性蛋白和成纤维连接蛋白形成的影响以及定量分析结果,显示GM6001处理后突变体小鼠中气管平滑肌,弹性蛋白和纤维连接蛋白形成的缺陷得到缓解;
图8为Fbn2突变小鼠气管症状的检测结果图,突变小鼠气管表现自主性和乙酰胆碱诱导的收缩缺陷;其中,图8a,8b和8c为显微成像显示野生型和突变体小鼠气管自主性收缩的时间和幅度结果,显示突变体小鼠表现出收缩时间的延长和收缩幅度的减小;图8d为体外检测乙酰胆碱诱导的野生型和突变体小鼠气管的收缩力结果,显示乙酰胆碱诱导的突变体小鼠气管的收缩力降低;
图9为气管塌陷病人的气管FBN2和成纤维连接蛋白表达水平检测结果图,气管塌陷病人的气管表现出FBN2和成纤维连接蛋白表达水平的降低;其中,图9a显示苏木精-伊红染色检测健康人和气管塌陷病的人气管形态;9b和9c为SOX9和FBN2抗体染色检测体健康人和气管塌陷病人的气管中FBN2蛋白的表达及定量分析结果,显示气管塌陷病人的气管中FBN2蛋白的表达量下降;9d和9e为SOX9和纤维连接蛋白抗体染色检测体健康人和气管塌陷病人的气管中纤维连接蛋白的表达及定量分析结果,显示气管塌陷病人的气管中纤维连接蛋白的表达量下降。
具体实施方式
本发明涉及基因工程技术领域,尤其涉及利用Fbn2基因表达水平调节小鼠气管形成,以及受Fbn2调控的靶基因的抑制剂的应用。Fbn2基因是已知序列,具体的碱基序列参见NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi?REQUEST=CCDS&DATA= CCDS37827)。本申请的发明人在研究过程中发现了Fbn2基因的新功能:Fbn2基因的失活导致小鼠气管内径的缩小和气管收缩能力的下降,细胞水平上,Fbn2基因的失活导致小鼠气管平滑肌细胞排列和极性的缺陷以及软骨细胞分化水平的降低;分子水平上,Fbn2基因的失活导致小鼠气管平滑肌细胞周围的弹性蛋白形成紊乱和纤维连接蛋白表达水平降低;Fbn2基因的失活会导致基质金属蛋白酶(MMP)的表达量及活性的升高;人体气管塌陷的病人样本中FBN2蛋白和纤维连接蛋白的表达量明显降低。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明,本发明中实验方法均采用本领域的常规方法。
本发明中实施例涉及的抗体及其来源和稀释倍数如下:
α-SMA(1:1000,Sigma-Aldrich,C6198);anti-CDH1(1:500,Santa Cruz,sc-59778);anti-SOX9(1:400,Millipore,AB5535);anti-GM130(1:50,R&D systems,AF8199);anti-MMP-9(1:1000,Millipore,AB19016);MMP-2(1:1000,Millipore,AB19015);anti-FBN2(1:5000);anti-Tropoelastin(1:1000,Abcam,ab21600);anti-Fibronectin(1:1000,Novus Biologicals,AF1918);anti-AGC1(1:200,R&DSystems,AF1220);anti-COL2A1(1:50,Millipore,AB761);anti-GAPDH(1:3000,Cell Signaling Technologies,#2118)。
Fbn2基因编码的蛋白质氨基酸序列如下所示:
MGRRRRLCLQPYFVWLGCVALWAQGTDGQPQPPPPKTLRPQPPPQQVRPAVAGSEGGFMGPEYRDEGAVAASRVRRRGQQEILRGPNVCGSRFHSYCCPGWKTLPGGNQCIVPICRNSCGDGFCSRPNMCTCSSGQISPTCGAKSIQQCSVRCMNGGTCADDHCQCQKGYIGTYCGQPVCENGCQNGGRCIGPNRCACVYGFTGPQCERDYRTGPCFTQVNNQMCQGQLTGIVCTKTLCCATIGRAWGHPCEMCPAQPQPCRRGFIPNIRTGACQDVDECQAIPGLCQGGNCINTVGSFECRCPAGHKQSETTQKCEDIDECSVIPGVCETGDCSNTVGSYFCLCPRGFVTSTDGSRCIDQRAGTCFSGLVNGRCAQELPGRMAKAQCCCEPGRCWSIGTIPEACPVRGSEEYRRLCLDGLPMGGIPGSSVSRPGGTGSTGNGYGPGGTGFLPIPGDNGFSPGVGGAGVGAGGQGPIITGLTILNQTIDICKHHANLCLNGRCIPTVSSYRCECNMGYKQDANGDCIDVDECTSNPCSNGDCVNTPGSYYCKCHAGFQRTPTKQACIDIDECIQNGVLCKNGRCVNTDGSFQCICNAGFELTTDGKNCVDHDECTTTNMCLNGMCINEDGSFKCVCKPGFILAPNGRYCTDVDECQTPGICMNGHCINNEGSFRCDCPPGLAVGVDGRVCVDTHMRSTCYGEIKKGVCVRPFPGAVTKSECCCANPDYGFGEPCQPCPAKNSAEFHGLCSSGIGITVDGRDINECALDPDICANGICENLRGSYRCNCNSGYEPDASGRNCIDIDECLVNRLLCDNGLCRNTPGSYSCTCPPGYVFRTETETCEDVNECESNPCVNGACRNNLGSFHCECSPGSKLSSTGLICIDSLKGTCWLNIQDNRCEVNINGATLKSECCATLGAAWGSPCERCELDAACPRGFARIKGVTCEDVNECEVFPGVCPNGRCVNSKGSFHCECPEGLTLDGTGRVCLDIRMEHCFLKWDEDECIHPVPGKFRMDACCCAVGAAWGTECEECPKPGTKEYETLCPRGPGFANRGDILTGRPFYKDINECKAFPGMCTYGKCRNTIGSFKCRCNNGFALDMEERNCTDIDECRISPDLCGSGICVNTPGSFECECFEGYESGFMMMKNCMDIDECERNPLLCRGGTCVNTEGSFQCDCPLGHELSPSREDCVDINECSLSDNLCRNGKCVNMIGTYQCSCNPGYQATPDRQGCTDIDECMIMNGGCDTQCTNSEGSYECSCSEGYALMPDGRSCADIDECENNPDICDGGQCTNIPGEYRCLCYDGFMASMDMKTCIDVNECDLNPNICMFGECENTKGSFICHCQLGYSVKKGTTGCTDVDECEIGAHNCDMHASCLNVPGSFKCSCREGWVGNGIKCIDLDECANGTHQCSINAQCVNTPGSYRCACSEGFTGDGFTCSDVDECAENTNLCENGQCLNVPGAYRCECEMGFTPASDSRSCQDIDECSFQNICVFGTCNNLPGMFHCICDDGYELDRTGGNCTDIDECADPINCVNGLCVNTPGRYECNCPPDFQLNPTGVGCVDNRVGNCYLKFGPRGDGSLSCNTEVGVGVSRSSCCCSLGKAWGNPCETCPPVNSTEYYTLCPGGEGFRPNPITIILEDIDECQELPGLCQGGNCINTFGSFQCECPQGYYLSEETRICEDIDECFAHPGVCGPGTCYNTLGNYTCICPPEYMQVNGGHNCMDMRKSFCYRSYNGTTCENELPFNVTKRMCCCTYNVGKAWNKPCEPCPTPGTADFKTICGNIPGFTFDIHTGKAVDIDECKEIPGICANGVCINQIGSFRCECPTGFSYNDLLLVCEDIDECSNGDNLCQRNADCINSPGSYRCECAAGFKLSPNGACVDRNECLEIPNVCSHGLCVDLQGSYQCICNNGFKASQDQTMCMDVDECERHPCGNGTCKNTVGSYNCLCYPGFELTHNNDCLDIDECSSFFGQVCRNGRCFNEIGSFKCLCNEGYELTPDGKNCIDTNECVALPGSCSPGTCQNLEGSFRCICPPGYEVRSENCIDINECDEDPNICLFGSCTNTPGGFQCICPPGFVLSDNGRRCFDTRQSFCFTNFENGKCSVPKAFNTTKAKCCCSKMPGEGWGDPCELCPKDDEVAFQDLCPYGHGTVPSLHDTREDVNECLESPGICSNGQCINTDGSFRCECPMGYNLDYTGVRCVDTDECSIGNPCGNGTCTNVIGSFECTCNEGFEPGPMMNCEDINECAQNPLLCAFRCMNTFGSYECTCPVGYALREDQKMCKDLDECAEGLHDCESRGMMCKNLIGTFMCICPPGMARRPDGEGCVDENECRTKPGICENGRCVNIIGSYRCECNEGFQSSSSGTECLDNRQGLCFAEVLQTMCQMASSSRNLVTKSECCCDGGRGWGHQCELCPLPGTAQYKKICPHGPGYATDGRDIDECKVMPSLCTNGQCVNTMGSFRCFCKVGYTTDISGTACVDLDECSQSPKPCNFICKNTKGSYQCSCPRGYVLQEDGKTCKDLDECQTKQHNCQFLCVNTLGGFTCKCPPGFTQHHTACIDNNECGSQPSLCGAKGICQNTPGSFSCECQRGFSLDASGLNCEDVDECDGNHRCQHGCQNILGGYRCGCPQGYVQHYQWNQCVDENECSNPGACGSASCYNTLGSYKCACPSGFSFDQFSSACHDVNECSSSKNPCSYGCSNTEGGYLCGCPPGYFRVGQGHCVSGMGFNKGQYLSVDAEAEDDENALSPEACYECKINGYTKKDGRRKRSAQEPEPASAEEQISLESVAMDSPVNMKFNLSGLGSKEHILELVPAIEPLNNHIRYVISQGNEDGVFRIHQRNGLSYLHTAKKKLAPGTYTLEITSIPLYGKKELRKLEEHNEDDYLLGVLGEALRMRLQIQLY(SEQ ID NO.2)
实施例1 Fbn2基因序列具有新功能
使用原位杂交和抗体染色的方法鉴定Fbn2在气管发育过程中的时空表达模式。原位杂交具体步骤如下:
小鼠气管在PBS中分离,用4%多聚甲醛于4℃固定过夜,用OCT包埋,并做10μm厚度的冷冻切片。切片在5μg/ml蛋白酶K溶液中孵育15分钟,然后乙酰化2分钟,并于70℃下在杂交缓冲液中孵育3小时,与DIG标记的RNA反义探针在70℃孵育过夜,然后洗涤,与碱性磷酸酶偶联的抗地高辛配基的抗体在4℃孵育过夜,洗涤,用NBT-BCIP染色检测信号。
抗体染色具体步骤如下:
气管在4%多聚甲醛中于4℃固定过夜,在10%蔗糖和30%蔗糖溶液中于4℃孵育24小时,OCT包埋,并做10μm厚度的冰冻切片。将切片在4%多聚甲醛中于4℃固定10分钟,然后在通透溶液(0.3%Triton X-100/PBS)中在室温下孵育15分钟,在封闭溶液(5%FBS/PBS/3%BSA)中孵育1小时,在一抗中于4℃孵育过夜,洗涤,在二抗体中于室温下孵育2小时,洗涤,然后封片用于成像。
利用体外转录的方法,合成了用于原位杂交检测的Fbn2特性的mRNA探针,mRNA探针序列如下所示:
CTACTTCGTGTGGCTGGGTTGCGTGGCGCTCTGGGCGCAGGGCACAGATGGCCAGCCCCAGCCTCCTCCACCAAAGACGCTCCGGCCCCAGCCGCCCCCGCAACAGGTCCGACCCGCAGTAGCGGGCTCCGAAGGTGGCTTCATGGGGCCTGAGTATCGGGACGAGGGCGCGGTAGCAGCGAGCCGGGTCCGCAGGCGAGGACAGCAGGAAATACTCCGAGGGCCCAACGTGTGCGGTTCTAGATTCCACTCCTATTGCTGCCCAGGATGGAAGACGCTCCCTGGAGGAAATCAATGCATTGTCCCCATTTGCAGGAACAGTTGTGGAGATGGATTCTGTTCCCGCCCCAACATGTGTACTTGTTCCAGTGGACAAATATCCCCGACATGCGGAGCCAAATCAATTCAGCAGTGTAGCGTGAGGTGCATGAACGGCGGGACCTGTGCAGACGACCACTGTCAGTGCCAGAAGGGATACATCGGAACTTACTGTGGACAACCTGTCTGTGAGAATGGATGCCAGAACGGGGGGCGTTGTATCGGCCCTAACCGCTGTGCTTGCGTTTATGGATTCACCGGGCCGCAGTGCGAAAGAGATTACAGGACAGGCCCGTGTTTCACTCAAGTCAATAATCAGATGTGCCAGGGGCAGCTGACAGGCATCGTCTGCACAAAGACACTGTGTTGTGCCACCATCGGACGAGCCTGGGGCCATCCTTGTGAGATGTGTCCAGCCCAGCCTCAGCCCTGCCGCCGGGGCTTCATTCCTAACATCCGCACTGGA(SEQ ID NO.1)。
结果如图1所示,原位杂交的结果显示胚胎期第14.5和16.5天Fbn2 mRNA特异性的表达在气管的间质区域。FBN2与成软骨细胞标记蛋白SOX9和平滑肌细胞标记蛋白α-SMA的抗体双染色表明从胚胎期第12.5(E12.5)天到出生后第7天(P7)Fbn2基因表达于气管的成软骨细胞和平滑肌细胞中;请参阅图1,其显示Fbn2基因在小鼠的气管软骨和平滑肌中有着特异性的表达。
实施例2
利用N-乙基-N-亚硝基脲化学诱变和全外显子测序的方法筛选和鉴定出Fbn2的无义突变小鼠(Fbn2T2547A,第849位的半胱氨酸变为终止位点,即SEQ ID NO.2中有下划线的C发生了无义突变)。
N-乙基-N-亚硝基脲诱导小鼠基因突变具体步骤如下:
用100mg/kg剂量的N-乙基-N-亚硝基脲腹腔连续注射C57BL/6J的雄性小鼠3次。10周后,将注射过N-乙基-N-亚硝基脲的小鼠与C57BL/6J的雌性小鼠交配产生G1代小鼠。G1代雄性小鼠与C57BL/6J雌性小鼠交配产生G2代雌性。将G2代雌性小鼠与其G1代雄性小鼠交配得到G3代的幼鼠进行气管和肺的分析来筛选突变体。
全外显子测序分析具体步骤如下:
使用Agilent SureSelect Mouse All Exon kit V1捕获野生型和突变的小鼠外显子,并使用Illumina HiSeq 2000测序。将序列读数与C57BL/6J小鼠基因组(mm10)做比对,并使用CLCBio Genomic Workbench和GATK软件进行分析,找出突变体中基因的突变位点。
使用阿尔新蓝染色(Alcain blue)和苏木精—伊红染色(H&E)的方法检测小鼠气管发育和形成的异常。
阿尔新蓝染色具体步骤如下:
将解剖的气管在95%乙醇中固定12小时,然后用溶解在80%乙醇和20%乙酸中的0.03%阿尔新蓝染色过夜,气管在2%KOH中清洗除去背景染色。
苏木精—伊红染色具体步骤如下:
冰冻切片在苏木精溶液中染色10分钟,使用去离子水清洗三次,每次5分钟,使用1%的盐酸乙醇分化,使用去离子水清洗切片三次,每次5分钟。切片在伊红染液中染色3分钟,然后切片用浓度为25%,50%,75%、95%和无水乙醇进行梯度脱水。脱水后的组织样本切片使用二甲苯浸泡三次,最后使用中性树胶封片。
结果如图2所示,可以看到Fbn2的失活能强烈抑制刚出生小鼠气管的形成,包括气管延长的障碍和软骨形成的缺陷;同时这样的表型在Fbn2基因删除的小鼠(Fbn2-/-)里也被观察到,这有利的证明了本发明所观察到的气管形成的表型是特异性的由Fbn2基因的失活造成的;请参阅图2,其显示Fbn2基因的无义突变小鼠和Fbn2基因删除的小鼠均表现出气管延长的障碍和软骨形成的缺陷。
实施例3
SOX9和α-SMA分别是软骨细胞和平滑肌细胞的标记性蛋白。SOX9的表达贯穿于气管形成的整个过程,α-SMA的表达起始于胚胎期第11.5天。本实施例利用抗体免疫染色(参见实施例1)的方法分析了气管的延长,软骨和平滑肌形成的整个过程。
结果如图3所示,本实施例观察到Fbn2基因突变的小鼠在胚胎期第13.5天表现出气管延长的缺陷,同时突变体小鼠在这个时期也表现出软骨环数量的下降和平滑肌面积的减少;请参阅图3,其显示Fbn2基因突变的小鼠自胚胎期第13.5天表现出气管延长的缺陷,软骨环数量的降低和平滑肌面积的减少。
实施例4
利用α-SMA抗体免疫染色(参见实施例1)的方法结合激光共聚焦显微镜成像分析,本实施例检测了平滑肌细胞的空间排列,利用顺式高尔基体基质蛋白GM130抗体免疫染色(参见实施例1)的方法,本发明检测了平滑肌细胞中高尔基体的位置,以此比较野生型和Fbn2突变体中平滑肌细胞的极性。
结果如图4所示,本实施例观察到Fbn2的失活导致了平滑肌细胞空间排列和细胞极性表现出随机化的趋势,这些结果表明Fbn2介导的平滑肌异常是通过改变平滑肌细胞的空间排列和极性来实现;请参阅图4,其显示Fbn2基因突变的小鼠的气管平滑肌细胞表现出空间排列和细胞极性的异常。
实施例5
利用抗体免疫染色(参见实施例1)的方法结合激光共聚焦显微镜成像分析,检测气管软骨细胞分化的标记性蛋白AGC1和COL2A1的表达,比较野生型和Fbn2突变体中软骨细胞的分化状态。
结果如图5所示,本实施例发现Fbn2基因突变引起了AGC1和COL2A1蛋白表达水平的下降,从而证明了Fbn2基因突变介导的小鼠气管的异常是通过抑制软骨细胞分化而不是通过细胞增殖或细胞凋亡来实现;请参阅图5,其显示Fbn2基因突变的小鼠的气管软骨细胞的分化标记性蛋白AGC1和COL2A1的表达显著下降。
实施例6
针对特定的细胞外基质蛋白(即弹性蛋白和纤维连接蛋白),利用抗体染色(参见实施例1)和免疫印迹的方法检测它们在Fbn2突变的小鼠的气管中的结构和蛋白表达量。
免疫印迹检测具体步骤如下:
使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解分离的气管。将裂解物以10,000g离心10分钟,样品电泳后转移到硝酸纤维素膜上。用一抗和HRP偶联的二抗各孵育1小时,使用ECL检测系统显影。
结果如图6所示,本实施例发现Fbn2的失活能引起气管平滑肌细胞中弹性蛋白(Elastin)排列和形成的异常,同时引起纤维连接蛋白(Fibronectin)表达量的降低,进一步利用溶酶体的抑制剂(甲胺盐酸盐,MA)处理,突变体小鼠气管中纤维连接蛋白的表达量与对照组相比有所提高,这表明Fbn2通过保护纤维连接蛋白免于溶酶体途径的降解来维持它稳定的蛋白量;弹性蛋白酶破坏掉气管中的弹性蛋白,气管平滑肌表现出类似于Fbn2突变体小鼠的表型,这说明,Fbn2通过调控弹性蛋白的形成来促进气管和平滑肌的发育;请参阅图6,其显示Fbn2突变体鼠的气管表现出弹性蛋白的形成缺陷,纤维连接蛋白表达量下降,同时弹性蛋白酶处理后,气管的形成和平滑肌的排列发生异常。
实施例7
基质金属蛋白酶2和9是弹性蛋白和纤维连接蛋白最主要的降解酶。运用荧光实时定量PCR的方法和明胶酶谱法分别对基质金属蛋白酶2(MMP2)和9(MMP9)的表达量和活性进行了分析。
荧光实时定量PCR具体方法为:
使用miRNeasy Mini Kit(Qiagen)提取小鼠气管的总RNA。利用Maxima FirstStrand cDNA Synthesis Kit(ThermoFisher Scientific)合成cDNA。使用Eco实时PCR系统(Illumina)和Maxima SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix试剂(ThermoFisherScientific)进行实时定量PCR的检测。反应程序如下:步骤一,55℃,2分钟;步骤二,95℃,10分钟;步骤三95℃,10秒;步骤四,60℃,30秒;从步骤三到步骤四循环40次;步骤五,95℃,15秒;步骤六,55℃,15秒,步骤七,95℃,15秒。
明胶酶谱分析具体步骤如下:
将分离的气管放入含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(0.025M Tris-HCl,pH7.5,0.1MNaCl和1%v/v Nonidet P-40(NP-40))中于冰上孵育30分钟,裂解液以16,000g离心10分钟,收集上清,测定蛋白质浓度,每道明胶酶谱凝胶加入等量的蛋白质进行电泳,然后将凝胶在复性溶液中孵育30分钟,室温下,在300ml去离子水中洗涤两次,在反应缓冲液中孵育30分钟,换入新鲜的反应缓冲液再孵育16小时,用考马斯蓝染色,最后于脱色液中脱色后扫描胶片。
利用已知的基质金属蛋白酶的抑制剂GM6001处理Fbn2突变的小鼠,给药时间为胚胎期第12.5,13.5和14.5天,每天给药一次,给药量是50mg/kg,同时以DMSO处理的野生型和突变小鼠作为对照,气管样本分析时间是胚胎期第15.5天。
结果如图7所示,本实施例观察到它们(基质金属蛋白酶2和9)均表达于小鼠胚胎期和出生后的气管中;本实施例还观察到Fbn2的失活同时导致了基质金属蛋白酶2和9的表达量和活性的升高;本实施例还观察到GM6001药物处理后,利用α-SMA,Elastin和Fibronectin抗体染色结合激光共聚焦显微镜成像分析,Fbn2基因突变的小鼠气管延伸,平滑肌细胞排列,弹性蛋白形成,纤维连接蛋白表达量缺陷的表型均被不同程度的挽救。
以上结果表明,Fbn2通过调控基质金属蛋白酶2和9的表达量和活性来维持平滑肌的排列和细胞外基质的稳态,最终促进气管的正常发育;请参阅图7,其显示与野生型相比Fbn2突变的小鼠基质金属蛋白酶2和9的mRNA,蛋白质和酶活性均升高,同时基质金属蛋白酶的抑制剂GM6001处理过的Fbn2突变体小鼠的气管延长缺陷,平滑肌细胞排列,弹性蛋白的形成以及纤维连接蛋白的表达量均有不同程度的恢复。
实施例8
为了检测Fbn2基因失活对气管生理上的影响,本实施例分别检测了气管的自主性收缩和乙酰胆碱诱导的收缩。在气管的自主性收缩实验中,取小鼠胚胎期第13.5天的胚胎放于PBS中,在显微镜下移除胚胎头部,打开胚胎胸腔,取出小鼠的气管和肺脏,去除肺脏得到小鼠气管,分离到的胚胎期13.5天的小鼠气管保存在PBS中,利用蔡司LSM800倒置激光扫描显微镜扫描10分钟,扫描间隔为1秒,记录气管收缩的幅度和频率。在乙酰胆碱诱导的气管收缩实验中,气管装在金属肌动扫描仪上,在通入氧气37℃的条件下,记录气管的收缩力。
其中,乙酰胆碱诱导气管收缩的具体步骤如下:
分离到的气管制作成2mm厚的气管环并保持在Krebs溶液(119mM NaCl,4.7mMKCl,2.5mM CaCl2,1.17mM MgSO4,20mM NaHCO3,1.18mM KH2PO4,0.027mM EDTA,11mM葡萄糖)中。将气管环安装在线状肌电图系统(610-M,Danish Myo Technology)上,并对于每个气管环施加2mN的静息张力。通过加入乙酰胆碱来诱导气管收缩,同时记录气管的收缩力。
结果如图8所示,本实施例观察到Fbn2突变小鼠的气管自主收缩幅度和频率大幅降低,同时乙酰胆碱诱导的气管收缩力也很大程度的降低;请参阅图8,其显示Fbn2突变的小鼠气管的自主性和乙酰胆碱诱导的收缩均受到削弱。
实施例9
FBN2功能在进化上具有保守性。请参阅图9,本实施例应用FBN2抗体免疫染色(参见实施例1)结合激光共聚焦显微镜成像分析,检测了来源于健康人和由于气管软骨形成缺陷而导致的气管塌陷的病人的气管样本。
结果如图9所示,本实施例观察到FBN2蛋白在健康的气管中高表达,然而病人来源的气管中表达量大幅度降低,同时,还观察到与健康人相比,受FBN2调控的纤维连接蛋白的表达量在病人气管中也大幅降低,这意味着FBN2的异常是气管形成缺陷这类病人的病因之一;请参阅图9,其显示FBN2和纤维连接蛋白在健康人和由于气管软骨形成缺陷而导致的气管塌陷的病人的气管样本。
最后应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.突变的Fbn2基因,其特征在于,其与野生型Fbn2基因的差异在于1个突变,并且所述突变的Fbn2基因导致气管形成缺陷病的发生;
所述突变是:Fbn2基因中c.2547T→A。
2.一种载体,其特征在于,所述载体包含权利要求1的突变的Fbn2基因。
3.一种宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞包含权利要求1的突变的Fbn2基因或权利要求2的载体。
4.权利要求1的突变的Fbn2基因、权利要求2的载体或权利要求3的宿主细胞的用途,其用于产生气管形成缺陷病动物模型,或用于制备试剂盒,所述试剂盒用于产生气管形成缺陷病动物模型。
5.能够提高Fbn2基因的活性或/和表达量的试剂在制备治疗气管形成缺陷病的药物中的应用。
6.受Fbn2蛋白调控的靶蛋白的抑制剂在制备治疗气管形成缺陷病的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述靶蛋白为基质金属蛋白酶2和/或9。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述抑制剂为GM6001。
9.能够提高Fbn2基因的活性或/和表达量的试剂和基质金属蛋白酶的抑制剂的联合使用在制备治疗气管形成缺陷病的药物中的应用。
10.一种治疗气管形成缺陷病的药物,其特征在于,所述药物中含有能够提高Fbn2基因的活性或/和表达量的试剂和/或基质金属蛋白酶的抑制剂。
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