CN109679899A - 一种人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较方法 - Google Patents

一种人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109679899A
CN109679899A CN201811560030.2A CN201811560030A CN109679899A CN 109679899 A CN109679899 A CN 109679899A CN 201811560030 A CN201811560030 A CN 201811560030A CN 109679899 A CN109679899 A CN 109679899A
Authority
CN
China
Prior art keywords
umbilical cord
stem cell
stem cells
cord mesenchymal
mesenchymal stem
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201811560030.2A
Other languages
English (en)
Inventor
朱学义
徐峰波
李雯雯
王秋文
程志远
王彦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan Yinfeng Bioengineering Co Ltd
Yinfeng Biological Group Ltd
Original Assignee
Henan Yinfeng Bioengineering Co Ltd
Yinfeng Biological Group Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan Yinfeng Bioengineering Co Ltd, Yinfeng Biological Group Ltd filed Critical Henan Yinfeng Bioengineering Co Ltd
Priority to CN201811560030.2A priority Critical patent/CN109679899A/zh
Publication of CN109679899A publication Critical patent/CN109679899A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]

Abstract

本发明公开了一种人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较方法，包括脂肪干细胞分离与培养、脐带间充质干细胞分离与培养、脂肪干细胞成软骨诱导、脐带间充质干细胞成软骨诱导、脂肪干细胞与脐带间充质干细胞的检测和压力调控进行比对。本发明的有益效果是：分别对脂肪干细胞与脐带间充质干细胞建立完善的体外培养系统以及冻存方法，确保分离的脂肪干细胞与脐带间充质干细胞能在体外维持高活力，对脂肪干细胞与脐带间充质干细胞的细胞形态、生长增殖及成软骨能力进行检测，能够揭示二者骨分化能力的不同，均采用胶原酶消化法对脂肪干细胞与脐带间充质干细胞的组织中进行分离，能够分离出高活性、高纯度的脂肪干细胞。

Description

一种人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较 方法
技术领域
本发明涉及一种比较方法，具体为一种人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较方法，属于干细胞成软骨技术领域。
背景技术
随着国内老龄化社会的到来，膝关节软骨损伤患者数量将会极大增加，研究干细胞软骨组织工程能力，对推动软骨疾病临床医疗技术发展有极大技术意义，组织工程软骨能否成功构建，种子细胞的选择是关键因素之一。
目前软骨组织工程中，以间充质干细胞作为种子细胞，是在基因治疗和免疫治疗及组织工程方面有着最大应用前景，脂肪干细胞和脐带间充质干细胞虽然都属于间充质干细胞，生物学特性基本相似，但是二者之间生长增殖及其成软骨能力区别仍然值得探讨。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较方法，包括以下步骤
步骤A：脂肪干细胞分离与培养，从组织中分离出脂肪干细胞，经贴壁筛选法纯化细胞、并采用无血清培养基进行体外培养扩增；
步骤B：脐带间充质干细胞分离与培养，从组织中分离出脐带间充质干细胞，经贴壁筛选法纯化细胞、并采用无血清培养基进行体外培养扩增；
步骤C：脂肪干细胞成软骨诱导，将培养后的脂肪干细胞以细胞浓度5×105细胞/ml种于24孔板中，贴壁后24小时后用骨诱导液进行诱导，每3天换液一次，共诱导2周；
步骤D：脐带间充质干细胞成软骨诱导，将培养后的脐带间充质干细胞以细胞浓度5×105细胞/ml种于24孔板中，贴壁后24小时后用骨诱导液进行诱导，每3天换液一次，共诱导2周；
步骤E：脂肪干细胞与脐带间充质干细胞的检测，利用甲苯胺蓝染色检测脂肪干细胞和脐带间充质干细胞成软骨诱导后胞中糖胺聚糖的表达；利用免疫细胞化学染色鉴定脂肪干细胞和脐带间充质干细胞成软骨诱导后细胞中Ⅱ型胶原的表达；
步骤F：压力调控进行比对，通过压力调控，对人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞的细胞增殖基因以及各成软骨相关基因的表达水平进行比较，进而实现人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较。
优选的，为了确保分离的脂肪干细胞与脐带间充质干细胞能在体外维持高活力，所述步骤A与步骤B中，分别对脂肪干细胞与脐带间充质干细胞建立完善的体外培养系统以及冻存方法。
优选的，为了确保在分离过程中操作人员的安全并避免细胞的污染，所述步骤A与步骤B中，制定有安全、有效的脂肪干细胞与脐带间充质干细胞分离规程。
优选的，为了对脂肪干细胞和脐带间充质干细胞作为软骨组织工程种子细胞效果进行了比较，所述步骤E中，分别对脂肪干细胞与脐带间充质干细胞的细胞形态、生长增殖及成软骨能力进行检测。
优选的，为了能够分离出高活性、高纯度的脂肪干细胞，所述步骤A与步骤B中，均采用胶原酶消化法对脂肪干细胞与脐带间充质干细胞的组织中进行分离。
本发明的有益效果是：该人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较方法设计合理，步骤A与步骤B中，分别对脂肪干细胞与脐带间充质干细胞建立完善的体外培养系统以及冻存方法，确保分离的脂肪干细胞与脐带间充质干细胞能在体外维持高活力，步骤A与步骤B中，制定有安全、有效的脂肪干细胞与脐带间充质干细胞分离规程，确保在分离过程中操作人员的安全并避免细胞的污染，保证后续应用的细胞的质量并保证对动物模型的安全性，步骤E中，分别对脂肪干细胞与脐带间充质干细胞的细胞形态、生长增殖及成软骨能力进行检测，对脂肪干细胞和脐带间充质干细胞作为软骨组织工程种子细胞效果进行了比较,进而能够揭示二者骨分化能力的不同，步骤A与步骤B中，均采用胶原酶消化法对脂肪干细胞与脐带间充质干细胞的组织中进行分离，能够分离出高活性、高纯度的脂肪干细胞，保证后续实验中所需的高密度的种子细胞数量。
附图说明
图1为本发明结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，一种人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较方法，包括以下步骤
步骤A：脂肪干细胞分离与培养，从组织中分离出脂肪干细胞，经贴壁筛选法纯化细胞、并采用无血清培养基进行体外培养扩增；
步骤B：脐带间充质干细胞分离与培养，从组织中分离出脐带间充质干细胞，经贴壁筛选法纯化细胞、并采用无血清培养基进行体外培养扩增；
步骤C：脂肪干细胞成软骨诱导，将培养后的脂肪干细胞以细胞浓度5×105细胞/ml种于24孔板中，贴壁后24小时后用骨诱导液进行诱导，每3天换液一次，共诱导2周；
步骤D：脐带间充质干细胞成软骨诱导，将培养后的脐带间充质干细胞以细胞浓度5×105细胞/ml种于24孔板中，贴壁后24小时后用骨诱导液进行诱导，每3天换液一次，共诱导2周；
步骤E：脂肪干细胞与脐带间充质干细胞的检测，利用甲苯胺蓝染色检测脂肪干细胞和脐带间充质干细胞成软骨诱导后胞中糖胺聚糖的表达；利用免疫细胞化学染色鉴定脂肪干细胞和脐带间充质干细胞成软骨诱导后细胞中Ⅱ型胶原的表达；
步骤F：压力调控进行比对，通过压力调控，对人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞的细胞增殖基因以及各成软骨相关基因的表达水平进行比较，进而实现人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较。
所述步骤A与步骤B中，分别对脂肪干细胞与脐带间充质干细胞建立完善的体外培养系统以及冻存方法，确保分离的脂肪干细胞与脐带间充质干细胞能在体外维持高活力，所述步骤A与步骤B中，制定有安全、有效的脂肪干细胞与脐带间充质干细胞分离规程，确保在分离过程中操作人员的安全并避免细胞的污染，保证后续应用的细胞的质量并保证对动物模型的安全性，所述步骤E中，分别对脂肪干细胞与脐带间充质干细胞的细胞形态、生长增殖及成软骨能力进行检测，对脂肪干细胞和脐带间充质干细胞作为软骨组织工程种子细胞效果进行了比较,进而能够揭示二者骨分化能力的不同，所述步骤A与步骤B中，均采用胶原酶消化法对脂肪干细胞与脐带间充质干细胞的组织中进行分离，能够分离出高活性、高纯度的脂肪干细胞，保证后续实验中所需的高密度的种子细胞数量。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (5)

1.一种人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较方法，其特征在于：包括以下步骤
步骤A：脂肪干细胞分离与培养，从组织中分离出脂肪干细胞，经贴壁筛选法纯化细胞、并采用无血清培养基进行体外培养扩增；
步骤B：脐带间充质干细胞分离与培养，从组织中分离出脐带间充质干细胞，经贴壁筛选法纯化细胞、并采用无血清培养基进行体外培养扩增；
步骤C：脂肪干细胞成软骨诱导，将培养后的脂肪干细胞以细胞浓度5×105细胞/ml种于24孔板中，贴壁后24小时后用骨诱导液进行诱导，每3天换液一次，共诱导2周；
步骤D：脐带间充质干细胞成软骨诱导，将培养后的脐带间充质干细胞以细胞浓度5×105细胞/ml种于24孔板中，贴壁后24小时后用骨诱导液进行诱导，每3天换液一次，共诱导2周；
步骤E：脂肪干细胞与脐带间充质干细胞的检测，利用甲苯胺蓝染色检测脂肪干细胞和脐带间充质干细胞成软骨诱导后胞中糖胺聚糖的表达；利用免疫细胞化学染色鉴定脂肪干细胞和脐带间充质干细胞成软骨诱导后细胞中Ⅱ型胶原的表达；
步骤F：压力调控进行比对，通过压力调控，对人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞的细胞增殖基因以及各成软骨相关基因的表达水平进行比较，进而实现人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较。
2.根据权利要求1所述的一种人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较方法，其特征在于：所述步骤A与步骤B中，分别对脂肪干细胞与脐带间充质干细胞建立完善的体外培养系统以及冻存方法。
3.根据权利要求1所述的一种人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较方法，其特征在于：所述步骤A与步骤B中，制定有安全、有效的脂肪干细胞与脐带间充质干细胞分离规程。
4.根据权利要求1所述的一种人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较方法，其特征在于：所述步骤E中，分别对脂肪干细胞与脐带间充质干细胞的细胞形态、生长增殖及成软骨能力进行检测。
5.根据权利要求1所述的一种人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较方法，其特征在于：所述步骤A与步骤B中，均采用胶原酶消化法对脂肪干细胞与脐带间充质干细胞的组织中进行分离。
CN201811560030.2A 2018-12-20 2018-12-20 一种人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较方法 Withdrawn CN109679899A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811560030.2A CN109679899A (zh) 2018-12-20 2018-12-20 一种人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811560030.2A CN109679899A (zh) 2018-12-20 2018-12-20 一种人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109679899A true CN109679899A (zh) 2019-04-26

Family

ID=66186947

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811560030.2A Withdrawn CN109679899A (zh) 2018-12-20 2018-12-20 一种人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109679899A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110132690A (zh) * 2019-06-05 2019-08-16 河南城建学院 一种大脑组织冰冻切片的甲苯胺蓝快速染色方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110132690A (zh) * 2019-06-05 2019-08-16 河南城建学院 一种大脑组织冰冻切片的甲苯胺蓝快速染色方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7122371B1 (en) Modular cell culture bioreactor
WO2019161591A1 (zh) 间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法
WO2010040302A1 (zh) 从人或动物胚胎提取间质性干细胞及提取其分泌物的方法
CN105969720B (zh) 一种人类血管内皮细胞培养液及其培养方法
US11339372B2 (en) Serum-free medium inducing differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cell into insulin-secretion-like cell and preparation method and use thereof
WO2016049986A1 (zh) 一种脐带间充质干细胞的分离方法
Fink et al. Isolation and expansion of adipose-derived stem cells for tissue engineering
JP2010539970A5 (zh)
CN108220229A (zh) 一种提高脐带来源间充质干细胞原代细胞产量的制备方法
CN107557331A (zh) 一种分离和培养人脂肪干细胞的方法
CN107267453A (zh) 一种用于培养脂肪间充质干细胞的培养基及其应用
CN110564675A (zh) 一种毛囊干细胞的分离提取方法
CN102732586A (zh) 一种间充质干细胞分泌素的培养方法
CN108220230A (zh) 一种人脂肪干细胞的分离与培养方法
CN106929470A (zh) 一种用于间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基
CN109679899A (zh) 一种人脂肪干细胞与脐带间充质干细胞成软骨能力的比较方法
CN107287158A (zh) 从小鼠致密骨中高效获取间充质干细胞的方法
CN108048395B (zh) 一种脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法及其培养基
CN108034634B (zh) 一种从经血中分离宫内膜间充质干细胞的方法
CN109153963B (zh) 粘附状态的细胞培养物的改变方法
CN104195100A (zh) 一种乳腺上皮细胞的体外培养方法
CN109771697B (zh) 一种真皮成纤维细胞皮片及其构建方法和应用
CN112210528A (zh) 一种提高脐血内皮细胞增殖能力及性能的方法
CN111304163A (zh) 脐带间充质干细胞的规模化培养方法
CN105112360A (zh) 脐带间充质干细胞的大量培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20190426

WW01 Invention patent application withdrawn after publication