CN109678922A - 降三萜类化合物及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种降三萜类化合物及其制备方法和应用。降三萜类化合物的结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示。该类化合物可以有效的抑制iNOS的表达,可用于防治炎症。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,特别是涉及一种降三萜类化合物及其制备方法、应用。
背景技术
灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.),是源于忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属植物,花蕾可入药,是山银花(Lonicerae Flos)的重要的来源之一。山银花具有清热解毒,疏散风热的作用,临床上用于痈肿疔疮,喉痹,丹毒,热毒血痢,风热感冒,温病发热的治疗。
山银花主含挥发油、三萜皂苷、有机酸、环烯醚萜苷以及黄酮类化合物。其中三萜皂苷在山银花中含量较高,是其区别于金银花的特征成分。灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙和灰毡毛忍冬皂苷甲是目前从山银花中发现的含量最高的三萜皂苷。
山银花在我国南方大量种植,资源丰富,具有很好的开发利用价值。目前已被广泛用于多种中成药复方制剂,如清肝利胆口服液、口炎清胶囊、银翘伤风胶囊等。
炎症是十分常见而又重要的基本病理过程,表现为红、肿、热、痛和功能障碍,外伤感染和各器官的大部分常见病和多发病(如疖、痈、关节炎、肺炎、肝炎、肾炎等)都属于炎症性疾病。机体受到损伤后,诱导型一氧化氮合酶(iNOS)被诱导表达,产生过量的一氧化氮(NO),导致炎症的发生。因此,通过抑制iNOS的表达,减少NO的产生,是抗炎药物的常见作用机制。尽管目前已经公开的一些iNOS抑制剂,如L-N6-(1-亚胺乙基)-赖氨酸,氨基胍。但开发新的具有更好药效的化合物依然具有重要的应用价值。
发明内容
基于此,本发明提供一种降三萜类化合物,该类化合物可以抑制LPS诱导的iNOS的表达,表现出潜在的抗炎活性。
具体技术方案如下:
具有式Ⅰ或式Ⅱ所示结构的降三萜类化合物或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体或者其前药分子:
本发明的另一目的是提供一种上述降三萜类化合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)取山银花药材,用提取液提取后,将提取液浓缩,得到浸膏;
(2)浸膏经大孔树脂分离,依次用水、10%-35%乙醇-水、40%-55%乙醇-水、70%-98%乙醇-水梯度洗脱,收集70%-98%乙醇-水洗脱部位;
(3)经正相硅胶柱色谱分离,依次用氯仿、96%-98%氯仿-甲醇、92%-95%氯仿-甲醇、85%-92%氯仿-甲醇、75%-85%氯仿-甲醇、65%-75%氯仿-甲醇、30%-65%氯仿-甲醇、甲醇梯度洗脱,收集92%-95%氯仿-甲醇洗脱部位;
(4)经ODS柱色谱分离,依次用30%-55%水-甲醇、60%-75%水-甲醇、80%-95%水-甲醇、水梯度洗脱,得到式Ⅰ化合物与60%-75%水-甲醇洗脱部位;
(5)步骤(4)中的60-75%水-甲醇洗脱部分经半制备高效液相色谱分离,得式Ⅱ化合物。
在其中一个实施例中,包括以下步骤:
(1)取山银花药材,用提取液提取,将提取液浓缩,得到浸膏;
(2)浸膏经大孔树脂分离,依次用水、10%-30%乙醇-水、40-50%乙醇-水、70%-95%乙醇-水梯度洗脱,收集70%-95%乙醇-水洗脱部位;
(3)经正相硅胶柱色谱分离,依次用氯仿、96%-98%氯仿-甲醇、92%-95%氯仿-甲醇、88%-92%氯仿-甲醇、78%-82%氯仿-甲醇、68%-72%氯仿-甲醇、45%-65%氯仿-甲醇、甲醇梯度洗脱,收集92%-95%氯仿-甲醇洗脱部位;
(4)经ODS柱色谱分离,依次用30%-50%水-甲醇、60%-70%水-甲醇、80%-90%水-甲醇、水梯度洗脱,得到式Ⅰ化合物与60%-70%水-甲醇洗脱部位;
(5)步骤(4)中的60%-70%水-甲醇洗脱部分经半制备高效液相色谱分离,得式Ⅱ化合物。
在其中一个实施例中,包括以下步骤:
(1)取山银花药材,用提取液提取,将提取液浓缩,得到浸膏;
(2)浸膏经大孔树脂分离,依次用水、30%乙醇-水、50%乙醇-水、95%乙醇-水梯度洗脱,收集95%乙醇-水洗脱部位;
(3)经正相硅胶柱色谱分离,依次用氯仿、98%氯仿-甲醇、95%氯仿-甲醇、90%氯仿-甲醇、80%氯仿-甲醇、70%氯仿-甲醇、60%氯仿-甲醇、氯仿梯度洗脱,收集95%氯仿-甲醇洗脱部位;
(4)经ODS柱色谱分离,依次用50%水-甲醇、70%水-甲醇、90%水-甲醇、水梯度洗脱,得到式Ⅰ化合物与70%水-甲醇洗脱部位;
(5)步骤(4)中的70%水-甲醇洗脱部分经半制备高效液相色谱分离,得式Ⅱ化合物。
在其中一个实施例中,步骤(5)中,所述半制备高效液相色谱分离的色谱条件为:流动相为45%乙腈-水,检测波长为210nm,流速为4ml/min,在半制备高效液相色谱上的保留时间为(15.5±1)min。
在其中一个实施例中,步骤(1)中,所述提取液为乙醇水溶液。
在其中一个实施例中,步骤(1)中,所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为60-80%。
在其中一个实施例中,步骤(1)中,所述提取的方法为加热回流;所述浓缩的方法为减压浓缩。
本发明的另一目的是提供一种上述的降三萜类化合物或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体或者其前药分子在制备iNOS抑制剂中的应用。
本发明的另一目的是提供一种上述的降三萜类化合物或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体或者其前药分子在制备防治炎症的药物中的应用。
在其中一些实施例中,所述炎症为iNOS表达诱导的炎症。
本发明的另一目的是提供一种治疗炎症的药物组合物,包括活性成分以及药学上可接受的载体,所述活性成分包括有上述的降三萜类化合物或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体或者其前药分子。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明从山银花中首次制备了2个新的降三萜类化合物,通过NMR、IR、UV、HR-ESI-MS等现代波谱学手段确证了这两个降三萜类化合物的化学结构、理化性质、光学活性。本发明的降三萜类化合物对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7具有良好的iNOS抑制活性,可抑制由LPS诱导的iNOS的表达,可作为研制新型的抗炎药物的先导化合物。
本发明降三萜类化合物的制备方法简单快速,所得到的降三萜类化合物纯度高。
附图说明
图1为化合物Ⅰ和Ⅱ的分离流程图;
图2为化合物Ⅰ的HR-ESI-MS谱图;
图3为化合物Ⅰ的UV谱图;
图4为化合物Ⅰ的IR谱图;
图5为化合物Ⅰ的1H-NMR谱图;
图6为化合物Ⅰ的13C-NMR谱图;
图7为化合物Ⅰ的13C-NMR谱图(B)和DEPT 135谱图(A);
图8为化合物Ⅰ的1H-1H COSY谱图;
图9为化合物Ⅰ的HSQC谱图;
图10为化合物Ⅰ的HMBC谱图;
图11为化合物Ⅰ的NOESY谱图;
图12为化合物Ⅱ的HR-ESI-MS谱图;
图13为化合物Ⅱ的UV谱图;
图14为化合物Ⅱ的IR谱图;
图15为化合物Ⅱ的1H-NMR谱图;
图16为化合物Ⅱ的13C-NMR谱图;
图17为化合物Ⅱ的13C-NMR谱图(B)和DEPT 135谱图(A);
图18为化合物Ⅱ的1H-1H COSY谱图;
图19为化合物Ⅱ的HSQC谱图;
图20为化合物Ⅱ的HMBC谱图;
图21为化合物Ⅱ的NOESY谱图;
图22为化合物Ⅰ和Ⅱ的iNOS活性测试结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述,以下给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
仪器:核磁共振谱:瑞士Burker AVANCE-600全数字化超导核磁共振仪;紫外谱图:日本分光JASCOV-550紫外-可见光谱仪;红外谱图:日本分光JASCO FT/IR-480 plus红外光谱仪,KBr压片;ESI-MS:FINIGAN LCQ Advantage MAX质谱仪;HR-ESI-MS以及UPLC-Q-TOF-MS:Waters Synapt G2 Q-TOF-MS;高效液相色谱(美国):Waters e2695+2998(分析型),Waters 1515+2489(制备型);蒸发光散射检测器:Alltech 3300;色谱柱:ODS,PhenomenexGemini,5μm,4.6×250mm(分析型);ODS,Phenomenex Gemini,5μm10×250mm(制备型),ODS,Waters,BEH 1.7μm,3.0×150mm UPLC);旋转蒸发系统(上海艾朗):水浴锅N-1092V-W,旋转蒸发仪N-1100V-W,冷阱CA-1111,水泵A-100S;真空干燥箱(DZF-6030,上海一恒);电热鼓风干燥箱(DHG-9140A,上海一恒);冷冻干燥机(ALPHA2-4LD plus,德国CHRIST);天平(BSA224S,北京赛多利斯;SE2001F,上海奥豪斯)。
材料及试剂:金银花大批药材35kg,产地山东,采收加工时间为2014年10月26日,供货单位为亳州市坤源医药有限公司,到货日期为2014年11月18日。药材经鉴定为忍冬科灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.)的干燥花蕾,药材标本保存于广州香雪制药股份有限公司院士工作站。硅胶薄层预制板(烟台市化学工业研究所);柱层析硅胶(100-200目、200-300目,青岛海洋化工);Diaion HP20(Mitsubishi Chemical公司)RP-18(12nm,S-50um,YMC,日本);Sephadex LH-20(GE Healthcare Biosciences AB,瑞典);氘代试剂(CIL,美国);色谱甲醇(BCR,美国),色谱乙腈(Merck,美国)。其余色谱层析用化学试剂(分析纯,广州化学试剂厂);DMEM培养基、胎牛血清、其他组织培养剂(Gibco,美国);脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、地塞米松(DEX)购自Sigma(美国);诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抗体、环氧合酶(COX-2)抗体购自Cell Signaling Technology(美国);β-肌动蛋白(β-actin)抗体购自Santa Cruz Biotechnology(U美国);小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7购自American Type Culture Collection(美国)。
实施例1降三萜类化合物的制备
(1)山银花药材(35kg)经70%乙醇水加热回流提取,提取液减压浓缩除去乙醇,得到浸膏(LM,8.5kg)。
(2)LM经大孔树脂用乙醇-水(0:100,30:70,50:50,95:5,v/v)梯度洗脱,收集95%乙醇洗脱部位(LM-4,340.0g)。
(3)LM-4经正相硅胶柱色谱用氯仿-甲醇梯度洗脱(100:0,98:2,95:5,90:10,80:20,70:30,60:40,0:100,v/v),得到23个馏分;收集95%乙醇-水洗脱部位(Fr.10,9.9g);
(4)经ODS柱色谱分离用水-甲醇(50:50,70:30,90:10,100:0,v/v)洗脱,得6个馏分以及化合物Ⅰ(2α,24-dihydroxy-23-nor-ursolic acid,159.0mg);
(5)收集70%甲醇水洗脱部位(Fr.10.6,411.8mg)经半制备高效液相色谱分离制备;液相色谱条件为:流动相:45%乙腈-水;柱温:室温;流速:4ml/min;检测波长:210nm;进样体积:200μL;收集保留时间为15.5min的成分,得到化合物Ⅱ(2α,4α-dihydroxy-23-nor-ursolic acid,4.7mg)。
实施例2降三萜类化合物的结构鉴定
化合物Ⅰ:白色无定型粉末,(c,0.5,CH3OH)。Liebermann-Burchard反应呈红色,提示该化合物可能为甾体或三萜类化合物。HR-ESI-MS给出m/z 473.3259[M-H]+(C29H45O5,计算值为473.3267),确定分子式为C29H46O5,计算其不饱和度为7。UV图谱(CH3OH)显示λmax:206,234nm(logε3.62,3.47)。IR图谱中(KBr)νmax 1691cm-1为C=O的特征吸收峰,3412cm-1为OH的特征吸收峰。1H-NMR(600MHz,in C5D5N)图谱中较低场区可见1个烯氢质子信号[δH 5.45(1H,t,J=3.5Hz,H-12)];高场区可见5组甲基质子信号[δH 1.18(3H,s,CH3-27),0.99(3H,s,CH3-26),0.98(3H,d,J=6.7Hz,CH3-29),0.97(3H,d,J=6.2Hz,CH3-30),0.82(3H,s,CH3-25)]。13C-NMR(150MHz,in C5D5N)图谱结合DEPT135以及HSQC图谱共显示29个碳信号,包括1个羰基碳信号(δC 180.2),5个甲基碳信号(δC 24.2,21.8,17.9,17.8,17.0),9个亚甲基碳信号(δC 62.1,48.6,37.8,33.3,31.4,28.9,25.2,24.3,24.1),9个次甲基碳信号(δC 125.8,80.3,69.2,53.9,50.5,48.9,47.3,39.8,39.7)和5个季碳信号(δC139.7,48.4,42.9,40.4,38.4)。综合以上1H-NMR、13C-NMR数据推测化合物Ⅰ可能为降碳三萜酸。通过1H-1H COSY、HSQC和HMBC对碳氢信号进行归属(表1)。1H-1H COSY图谱显示了自旋耦合片段H2-1/H-2/H-3/H-4(H2-24)/H-5/H2-6/H2-7,H-9/H2-11/H-12,H2-15/H2-16和H-18/H-19(H3-29)/H-20(H3-30)/H2-21/H2-22,分别提示结构C-1-C-2-C-3-C-4(C-24)-C-5-C-6-C-7,C-9-C-11-C-12,C-15-C-16和C-18-C-19(C-29)-C-20(C-30)-C-21-C-22。结合HMBC图谱中显示的CH3-25与C-1,C-5,C-9,C-10相关,CH3-26与C-7,C-8,C-9,C-14相关,CH3-27与C-8,C-13,C-14,C-15相关以及H-18与C-12,C-13,C-14,C-16,C-17,C-20,C-28,C-29相关,推断出化合物Ⅰ的平面结构。NOESY实验显示的相关片段H-5/H-9/H3-27/H-19/H3-30,H3-25/H3-26和H-18/H3-29提示A/B,B/C环为反式骈合,D/E环为顺式骈合,以及CH3-27为α-构型1。此外,根据NOESY相关(H3-25/H-2/H2-24和H-3/H-5)以及偶合常数(J2,3=9.3Hz,J3,4=6.0Hz),推出化合物Ⅰ的2和3位的-OH,以及4位的-CH2OH相对构型分别为2α,3β,4β。从而将化合物Ⅰ鉴定为2α,24-dihydroxy-23-nor-ursolic acid。以上化合物Ⅰ的HR-ESI-MS、UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、NOESY图谱详见附图1-附图11。
化合物Ⅱ:白色无定型粉末,(c 0.5,CH3OH),Liebermann-Burchard反应呈阳性。HR-ESI-MS给出m/z:473.3260[M-H]-(C29H45O5,计算值为473.3288),确定该化合物分子式为C29H46O5。1H-NMR(600MHz,C5D5N)较低场区可见1个烯氢信号[δH 5.48(1H,t,J=3.5Hz,H-12)];高场区可见6组甲基质子信号[δH 1.51(3H,s,CH3-24),1.14(3H,s,CH3-27),1.07(3H,s,
CH3-26),0.99(3H,s,CH3-25),0.98(3H,d,J=6.3Hz,CH3-29),0.96(3H,d,J=6.3Hz,CH3-30)]。13C-NMR(150MHz,in C5D5N)图谱结合DEPT 135以及HSQC图谱共显示29个碳信号,包括6个甲基碳信号,8个亚甲基碳信号,8个次甲基碳信号和7个季碳信号,综上,推测化合物Ⅱ可能为降碳三萜酸。通过1H-1H COSY、HSQC、HMBC和NOESY,对碳氢信号进行归属(表1)并确定了化合物Ⅱ的结构,命名为2α,4α-dihydroxy-23-nor-ursolic acid。以上化合物Ⅱ的HR-ESI-MS、UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、NOESY图谱详见附图12-附图21。
表1.化合物Ⅰ和Ⅱ的碳氢核磁数据归属(in C5D5N)
鉴定数据的归属:
23-降碳乌苏酸-2α,24-二醇(2α,24-dihydroxy-23-nor-ursolic acid,Ⅰ)
白色无定型粉末;(c 0.5,CH3OH);IR(KBr)vmax:3412,2928,1691,1455,1377,1279,1065cm-1;1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)and 13C-NMR(150MHz,pyridine-d5):见表1;HR-ESI-MS:m/z 473.3259[M-H]-(calcd for C29H45O5,473.3267)。
23-降碳乌苏酸-2α,4α-二醇(2α,4α-dihydroxy-23-nor-ursolic acid,Ⅱ)
白色无定型粉末;(c 0.5,CH3OH);IR(KBr)vmax:3427,2925,2861,1691,1638,1455,1382,1264,1093,564cm-1;1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)and 13C-NMR(150MHz,pyridine-d5),见表1;HR-ESI-MS:m/z 473.3260[M-H]-(calcd for C29H45O5,473.3267)。
iNOS活性测试方法:
将化合物Ⅰ和化合物Ⅱ用DMSO溶解并稀释至30mM,保存备用。
(1)小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7的培养及处理
小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7培养于含10%热灭活胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素G、100mg/mL链霉素、2mM左旋谷酰胺的DMEM培养基中,37℃、的恒温培养箱中孵育生长。小鼠巨噬细胞RAW 264.7以8×104cells/mL的浓度,接种于24孔细胞培养板中。培养24h后,每孔加入测试样品(用无血清培养基稀释至30μΜ)和阳性对照地塞米松培养1h,随后加入100ng/mL的LPS培养18h。同时设空白对照组(不加入被测试样品)和正常对照组(细胞培养于DMEM培养基)。
(2)蛋白质印迹法(Western Blot)分析
小鼠单核巨噬细胞RAW264.7加入LPS培养18h后,用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取细胞总蛋白,用Bio-Rad蛋白浓度测定法测定蛋白质浓度。用10%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)稀释蛋白质,转移至硝酸纤维膜,4℃下,用第一抗体(iNOSand COX-2)和小鼠β-肌动蛋白(β-actin)抗体培养过夜。随后在室温下用第二抗体培养硝酸纤维膜1h。用Odyssey v3.0软件测定蛋白表达水平。
(3)iNOS活性测试结果(1和2分别为化合物Ⅰ和Ⅱ):如图22所示。
从图22的结果可知,本发明的化合物Ⅰ和Ⅱ对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7具有良好的iNOS抑制活性,可抑制由LPS诱导的iNOS的表达,进而表现出潜在的抗炎活性。进一步阐明了山银花的抗炎活性的理论和物质基础,也为其质控和抗炎活性的结合提供了重要的参考。可作为研制新型的抗炎药物的先导化合物。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.具有式Ⅰ或式Ⅱ所示结构的降三萜类化合物或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体或者其前药分子:
2.一种权利要求1所述的降三萜类化合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取山银花药材,提取液提取后,将提取液浓缩,得到浸膏;
(2)浸膏经大孔树脂分离,依次用水、10%-35%乙醇-水、40%-55%乙醇-水、70%-98%乙醇-水梯度洗脱,收集70%-98%乙醇-水洗脱部位;
(3)经正相硅胶柱色谱分离,依次用氯仿、96%-98%氯仿-甲醇、92%-95%氯仿-甲醇、85%-92%氯仿-甲醇、75%-85%氯仿-甲醇、65%-75%氯仿-甲醇、30%-65%氯仿-甲醇、甲醇梯度洗脱,收集92%-95%氯仿-甲醇洗脱部位;
(4)经ODS柱色谱分离,依次用30%-55%水-甲醇、60%-75%水-甲醇、80%-95%水-甲醇、水梯度洗脱,得到式Ⅰ化合物与60%-75%水-甲醇洗脱部位;
(5)步骤(4)中的60%-75%水-甲醇洗脱部分经半制备高效液相色谱分离,得式Ⅱ化合物。
3.根据权利要求2所述的降三萜类化合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取山银花药材,用提取液提取后,将提取液浓缩,得到浸膏;
(2)浸膏经大孔树脂分离,依次用水、10%-30%乙醇-水、40%-50%乙醇-水、70%-95%乙醇-水梯度洗脱,收集70%-95%乙醇-水洗脱部位;
(3)经正相硅胶柱色谱分离,依次用氯仿、96%-98%氯仿-甲醇、92%-95%氯仿-甲醇、88%-92%氯仿-甲醇、78%-82%氯仿-甲醇、68%-72%氯仿-甲醇、45%-65%氯仿-甲醇、甲醇梯度洗脱,收集92-95%氯仿-甲醇洗脱部位;
(4)经ODS柱色谱分离,依次用30%-50%水-甲醇、60%-70%水-甲醇、80%-90%水-甲醇、水梯度洗脱,得到式Ⅰ化合物与60%-70%水-甲醇洗脱部位;
(5)步骤(4)中的60%-70%水-甲醇洗脱部分经半制备高效液相色谱分离,得式Ⅱ化合物。
4.根据权利要求3所述的降三萜类化合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取山银花药材,用提取液提取,将提取液浓缩,得到浸膏;
(2)浸膏经大孔树脂分离,依次用水、30%乙醇-水、50%乙醇-水、95%乙醇-水梯度洗脱,收集95%乙醇-水洗脱部位;
(3)经正相硅胶柱色谱分离,依次用氯仿、98%氯仿-甲醇、95%氯仿-甲醇、90%氯仿-甲醇、80%氯仿-甲醇、70%氯仿-甲醇、60%氯仿-甲醇、氯仿梯度洗脱,收集95%氯仿-甲醇洗脱部位;
(4)经ODS柱色谱分离,依次用50%水-甲醇、70%水-甲醇、90%水-甲醇、水梯度洗脱,得到式Ⅰ化合物与70%水-甲醇洗脱部位;
(5)步骤(4)中的70%水-甲醇洗脱部分经半制备高效液相色谱分离,得式Ⅱ化合物。
5.根据权利要求2-4任一项所述的降三萜类化合物的制备方法,其特征在于,步骤(5)中,所述半制备高效液相色谱分离的色谱条件为:流动相为45%乙腈-水,检测波长为210nm,流速为4ml/min,在半制备高效液相色谱上的保留时间为(15.5±1)min。
6.根据权利要求2-4任一项所述的降三萜类化合物的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述提取液为乙醇水溶液,所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为60%-80%。
7.根据权利要求1所述的降三萜类化合物或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体或者其前药分子在制备iNOS抑制剂中的应用。
8.根据权利要求1所述的降三萜类化合物或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体或者其前药分子在制备防治炎症的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述炎症为iNOS表达诱导的炎症。
10.一种治疗炎症的药物组合物,其特征在于,包括活性成分以及药学上可接受的载体,所述活性成分包括有权利要求1所述的降三萜类化合物或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体或者其前药分子。
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