CN109663931B - 一种基于三七皂苷合成纳米金颗粒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于制造金属粉末或其悬浮物技术领域，公开了一种基于三七皂苷还原法制备纳米金颗粒的方法；首先在圆底烧瓶中，配置50mL的0.25mM的氯金酸HAuCl4和0.2mg/mL的三七皂苷R1混合溶液中；然后加入1M的氢氧化钠(NaOH)溶液，加热搅拌至沸腾，在回流状态保持沸腾反应至少30min，然后自然冷却至室温备用；最后以制备好的胶体溶液为基础分别进行紫外可见分光光度计，透射电子显微镜和生物毒性测试实验。本发明成本低廉、操作简单、工艺过程可调控、可重复性好且稳定可靠。该方法的核心是通过调控不同量的反应物，精细控制合成过程，达到调控制备不同粒径和形状的纳米金颗粒。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料科学领域，尤其涉及一种基于三七皂苷还原制备纳米金颗粒的方法和纳米颗粒特征的分析研究。
背景技术
纳米金颗粒(AuNPs：gold nanoparticles)具有独特的物理和化学性质。基于这些特征，纳米金颗粒在生物传感与成像、化学测定与分析、催化和表界面科学等领域产生了广泛和深远的影响。合成大小、形状可控的纳米金颗粒是拓展和加强其应用领域的关键。通常制备纳米颗粒的主要方法有化学法与物理法。物理方法往往需要耗费大量的能源来实现高温高压或需要耗时的过程以实现纳米颗粒合成。而且以物理方法制备的纳米金粒子往往表面存在一定的惰性，不容易进行下一步的标记和修饰。相比而言，化学方法制备纳米材料具有操作更加简单、尺寸可控、分散性好和更有利于颗粒表面修饰等优势，可极大促进纳米技术在生物医学、电磁学、能源科学等领域的应用。近年来，绿色合成纳米粒子已经成为纳米技术的一个重要分支。为扩展纳米金颗粒的合成途径和应用范围，寻找合适植物提取物、生物大分子等来合成纳米粒子已经成为目前绿色合成化学的重要研究部分之一。加之，应用这些绿色合成的纳米粒子可开展如B型慢性淋巴细胞性白血病的治疗，抑制细菌和真菌的活性，阻止烧烫伤或者开放性伤口的感染等方面的研究。如Elavazhagan应用佛手瓜叶提取物生物还原的制备了银和金纳米粒子，通过分析表明该提取物的主要成分为生物皂苷，证明了生物皂苷合成纳米粒子的可行性。同样，Arunachalam则以海葵叶提取物绿色合成了银和金纳米粒子，以UV-Vis和TEM对合成的纳米粒子进行了表征分析，其结果也表明该提取物中皂苷化合物、植物甾醇和酚类化合物在形成纳米粒子的过程中起主要作用。Sarada直接使用五芒菊叶提取皂苷合成了金纳米粒子，并对合成的纳米粒子进行了表征分析和抗菌活性研究。因此，绿色来源、成本可靠，简单方便的生物材料合成纳米金颗粒仍具有巨大的发展前景。
综上所述，现有技术存在的问题是：目前，部分化学合成纳米材料的方法是采用价格高昂且有毒性的试剂作为还原剂、稳定剂或结构导向试剂，不利于纳米颗粒的表面修饰和进一步的在生物医学、食品安全检测和环境检测等领域的应用。
解决上述技术问题的难度和意义：
采用常见的生物分子或者是已经证明具有很好的生物活性和生理功能的分子为基础合成纳米颗粒，则可以有利促进纳米生物医药的研究和大健康产业的发展。而三七是云南独具特色的中药材资源，且三七皂苷R1(Notoginsenoside R1，NGR1)是三七总皂苷的主要成分之一。以三七皂苷合成纳米金颗粒，一方面能够加强云南特色中药材三七在生物医学领域应用的进一步发展，促进三七深加工行业的健康发展，具有重要的社会经济价值；另一方面可以促进生物技术与纳米技术两大领域的结合，促进绿色化学合成生物纳米粒子的实际应用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于三七皂苷还原制备纳米金颗粒的方法。本发明可以一步方便的制备如金纳米球颗粒或金纳米纺丝状结构。在加入较多的三七皂苷时，不论是否添加氢氧化钠溶液均可获得20nm左右大小的纳米金球颗粒，且溶液最大光谱吸收峰位于570nm左右。而在加入少量的三七皂苷时，均可获得微米级的纺丝状结构的纳米金颗粒。纳米金颗粒表面能够吸附三七皂苷及其氧化产物，而球形颗粒可更好的进入细胞内部，实现生物学效应。通过对比球形纳米金颗粒的生物活性可知，添加有氢氧化钠的纳米金颗粒具体更好的抗癌活性，对人肺癌细胞(NCl-H292)具有更好的的杀伤作用。纳米金颗粒在进入肺癌细胞时，可以促进三七皂苷及其氧化产物进入肺癌细胞内，实现纳米颗粒和三七皂苷及其氧化产物协同的诱导肺癌细胞凋亡和抑制肺癌细胞生长的过程，从而实现更好的抗癌活性。
本发明是这样实现的，一种基于三七皂苷还原制备纳米金的方法，主要包括：首先在圆底烧瓶中，配置50mL的0.25mM的氯金酸(HAuCl4)和0.2mg/mL的三七皂苷R1(NGR1)混合溶液中，然后加入一定量的1M的氢氧化钠(NaOH)溶液，然后加热搅拌至沸腾，在回流状态保持沸腾反应至少30min，然后自然冷却至室温备用。最后以制备好的胶体溶液为基础分别进行紫外可见分光光度计(UV-Vis)，透射电子显微镜(TEM)和生物毒性测试实验。
具体步骤为：
1)分别以超纯水配置好1％的氯金酸溶液，1mg/mL的三七皂苷R1(NGR1)溶液和1M的氢氧化钠溶液，4℃冰箱保存备用。
2)分别取适量的上述溶液，稀释成50mL的混合溶液，随后在集热磁力搅拌反应器上加热至沸腾，在回流状态保持沸腾反应至少30min，获得砖红色或酒红色的胶体溶液，自然冷却到室温备用。
3)分别取适量的胶体分别进行紫外可见分光光度计(UV-Vis)，透射电子显微镜(TEM)和生物毒性测试实验。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明总体成本低廉、操作过程简单、工艺过程参数可调控、可重复性好且稳定可靠。以三七皂苷R1还原制备纳米金颗粒，能够在30min左右完成反应。依据反应物加入量的不同，可以实现不同形状如线条纺丝状纳米金和球形纳米金颗粒的合成，也可以实现不同大小如粒径从3nm到25nm之间的纳米金颗粒的合成制备。以回流加热控制温度条件，以加入不同量的反应物控制试剂含量参数，实现了反应过程的整体可控。总之，该方法的核心是通过调控不同量的反应物，精细控制合成过程，达到调控制备不同粒径大小的纳米金颗粒。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基于三七皂苷还原制备纳米金的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的基于三七皂苷还原制备纳米金的方法原理过程示意图。
图3是本发明实施例提供的以不同量的三七皂苷制备的纳米金颗粒的紫外可见光谱图(UV-Vis)。其中：A)不添加氢氧化钠纳米金胶体溶液的紫外可见光谱图，B)添加氢氧化钠纳米金胶体溶液的紫外可见光谱图。
图4是本发明实施例提供的不添加氢氧化钠以不同量三七皂苷还原所制备的不同大小的纳米金颗粒的透射电子显微图(TEM)，其中：A)2mL三七皂苷，B)5mL三七皂苷，C)10mL三七皂苷。
图5是本发明实施例提供的在添加氢氧化钠以不同量三七皂苷还原所制备的不同大小的纳米金颗粒的透射电子显微图(TEM)，其中：A)2mL三七皂苷，B)5mL三七皂苷，C)10mL三七皂苷。
图6是本发明实施例提供的纳米金颗粒的细胞毒性测试示意图，其中；A)不添加氢氧化钠纳米金细胞毒性实验，B)添加氢氧化钠纳米金细胞毒性实验。
图7是本发明实施例提供的添加氢氧化钠以三七皂苷还原制备纳米金颗粒的细胞毒性测试显微镜照片，其中：A)对照组细胞照片，B)以纳米金颗粒处理组细胞照片。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明可以一步方便的制备如金纳米球颗粒或金纳米纺丝状结构。在加入较多的三七皂苷时，不论是否添加氢氧化钠溶液均可获得20nm左右大小的纳米金球颗粒，且溶液最大光谱吸收峰位于570nm左右。而在加入少量的三七皂苷时，均可获得微米级的纺丝状结构的纳米金颗粒。纳米金颗粒表面能够吸附三七皂苷及其氧化产物，而球形颗粒可更好的进入细胞内部，实现生物学效应。通过对比球形纳米金颗粒的生物活性可知，添加有氢氧化钠的纳米金颗粒具体更好的抗癌活性，对人肺癌细胞(NCl-H292)具有更好的的杀伤作用。纳米金颗粒在进入肺癌细胞时，可以促进三七皂苷及其氧化产物进入肺癌细胞内，实现纳米颗粒和三七皂苷及其氧化产物协同的诱导肺癌细胞凋亡和抑制肺癌细胞生长的过程，从而实现更好的抗癌活性。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的基于三七皂苷还原制备纳米金的方法包括以下步骤：
S101：分别以超纯水配置好1％的氯金酸溶液，1mg/mL的三七皂苷R1(NGR1)溶液和1M的氢氧化钠溶液，4℃冰箱保存备用；
S102：分别取适量的上述溶液，稀释成50mL的混合溶液，随后在集热磁力搅拌反应器上加热至沸腾，在回流状态保持沸腾反应至少30min，获得砖红色或酒红色的胶体溶液，自然冷却到室温备用；
S103：分别取适量的胶体分别进行紫外可见分光光度计(UV-Vis)，透射电子显微镜(TEM)和生物毒性测试实验。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1
具体步骤为：
1)分别取515μL的1％的氯金酸溶液和10mL的1mg/mL的三七皂苷R1(NGR1)溶液稀释至50mL得到氯金酸和三七皂苷的混合溶液，并在集热磁力搅拌反应器上搅拌均匀。
2)取10μL的1mol/L浓度的氢氧化钠溶液加入到上述混合溶液中，随后在集热磁力搅拌反应器上维持搅拌并加热至沸腾，在回流状态保持沸腾反应30min，获得砖红色或酒红色的胶体溶液，自然冷却到室温备用。
3)分别取适量的胶体溶液分别进行紫外可见分光光度计(UV-Vis)和透射电子显微镜(TEM)测试分析。其中UV-Vis光谱图如图3B所示，从图中可以看出，该纳米金胶体溶液的最大吸收峰位于557nm，而TEM图如图5C所示，其粒径大小为20±5nm。
4)取适量纳米金胶体溶液进行细胞毒性实验(MTT法)，具体实验过程为：
①首先复苏NCL-H292细胞，用含10％FBS，1％PBS和RPMI-medium培养基进行培养，在5％CO2、37℃饱和湿度条件下培养，隔天更换1次培养液。
②其次将NCL-H292细胞接种于96孔板，每孔加90μL的10％FBS，1％PBS和RPMI-medium培养基进行培养24h，待细胞贴壁后将NCL-H292细胞分为：空白组(有细胞的培养基+MTT)、阳性对照组(有细胞的培养基+MTT+顺铂)、实验组(有细胞培养基+MTT+不同浓度的纳米金胶体溶液)，经过给药培养48h后，每孔加入MTT 10μL，4h后吸去96孔板中液体，加入150ul DMSO，避光室温轻轻摇晃孵育10min，用酶标仪490nm波长下检测吸光度值或细胞形貌观察，然后进行数据分析和画图处理，具体结果如图6B所示，在纳米金颗粒浓度大于6.08×108个/mL时，该纳米金溶胶显示出与1×105mol/L浓度的顺铂具有相同好的抗癌活性效果。
实施例2
具体步骤为：
1)分别取515μL的1％的氯金酸溶液和5mL的1mg/mL的三七皂苷R1(NGR1)溶液稀释至50mL得到氯金酸和三七皂苷的混合溶液，并在集热磁力搅拌反应器上搅拌均匀。
2)取10μL的1mol/L浓度的氢氧化钠溶液加入到上述混合溶液中，随后在集热磁力搅拌反应器上维持搅拌并加热至沸腾，在回流状态保持沸腾反应30min，获得砖红色或酒红色的胶体溶液，自然冷却到室温备用。
3)分别取适量的胶体溶液分别进行紫外可见分光光度计(UV-Vis)和透射电子显微镜(TEM)测试分析，结果分别如图3B和图5B所示。从图中可以看出，该纳米金胶体溶液的吸收光谱较弱，但仍有一个吸收峰位于542nm左右，而从TEM图可以看出，该类型纳米金为纺丝状结构，粒径分布较宽，可能在表面增强拉曼光谱或者电化学传感器方面有一定的应用潜力。
实施例3
具体步骤为：
1)分别取515μL的1％的氯金酸溶液和2mL的1mg/mL的三七皂苷R1(NGR1)溶液稀释至50mL得到氯金酸和三七皂苷的混合溶液，并在集热磁力搅拌反应器上搅拌均匀。
2)取5μL的1mol/L浓度的氢氧化钠溶液加入到上述混合溶液中，随后在集热磁力搅拌反应器上维持搅拌并加热至沸腾，在回流状态保持沸腾反应1h，获得砖红色或酒红色的胶体溶液，自然冷却到室温备用。
3)分别取适量的胶体溶液分别进行紫外可见分光光度计(UV-Vis)和透射电子显微镜(TEM)测试分析，结果分别如图3B和图5A所示。从图中可以看出，该纳米金胶体溶液的吸收光谱变得很弱，但仍有一个吸收峰位于535nm左右，而从TEM图可以看出，该类型纳米金为更长的纺丝状结构，最大长度可达数微米，可能在表面催化、表面增强拉曼散射、微电极和生物传感等方面有一定的应用潜力。
实施例4
具体步骤为：
1)分别取515μL的1％的氯金酸溶液和10mL的1mg/mL的三七皂苷R1(NGR1)溶液稀释至50mL得到氯金酸和三七皂苷的混合溶液，并在集热磁力搅拌反应器上搅拌均匀并加热至沸腾，在回流状态保持沸腾反应2h，获得砖红色或酒红色的胶体溶液，自然冷却到室温备用。
2)分别取适量的胶体溶液分别进行紫外可见分光光度计(UV-Vis)和透射电子显微镜(TEM)测试分析，结果分别如图3A和图4C所示。从图中可以看出，该纳米金胶体溶液的最大吸收峰位于577nm左右，而从TEM图可以看出，其粒径大小为21±3nm，与同条件下添加氢氧化钠合成的纳米金颗粒大小相当，从而为研究这两种类型的纳米金颗粒的生物学效应打下基础。
3)取适量纳米金胶体溶液进行细胞毒性实验(MTT法)，具体实验过程为：
①首先复苏NCL-H292细胞，用含10％FBS，1％PBS和RPMI-medium培养基进行培养，在5％CO2、37℃饱和湿度条件下培养，隔天更换1次培养液。
②其次将NCL-H292细胞接种于96孔板，每孔依次加90μL的10％FBS，1％PBS和RPMI-medium培养基进行培养24h，待细胞贴壁后将NCL-H292细胞分为：空白组(有细胞的培养基+MTT)、阳性对照组(有细胞的培养基+MTT+顺铂)、实验组(有细胞培养基+MTT+不同浓度的纳米金胶体溶液)，经过给药培养48h后，每孔加入MTT 10μL，4h后吸去96孔板中液体，加入150ul DMSO，避光室温轻轻摇晃孵育10min，用酶标仪490nm波长下检测吸光度值或细胞形貌观察，然后进行数据分析和画图处理，具体结果如图6A和图7所示。从图中可以看出，相比于对照组癌细胞的存活率，这种类型的纳米金颗粒仍有具有一定的抗癌活性。
实施例5
具体步骤为：
1)分别取515μL的1％的氯金酸溶液和5mL的1mg/mL的三七皂苷R1(NGR1)溶液稀释至50mL得到氯金酸和三七皂苷的混合溶液，并在集热磁力搅拌反应器上搅拌均匀并加热至沸腾，在回流状态保持沸腾反应2h，获得砖红色或酒红色的胶体溶液，自然冷却到室温备用。
2)分别取适量的胶体溶液分别进行紫外可见分光光度计(UV-Vis)和透射电子显微镜(TEM)测试分析，结果分别如图3A和图4B所示。从图中可以看出，该纳米金胶体溶液的吸收光谱较弱，但吸收峰红移至592nm左右，而从TEM图中可以看出，纳米颗粒为球形和丝状共存的团簇状结构。
实施例6
具体步骤为：
1)分别取515μL的1％的氯金酸溶液和2mL的1mg/mL的三七皂苷R1(NGR1)溶液稀释至50mL得到氯金酸和三七皂苷的混合溶液，并在集热磁力搅拌反应器上搅拌均匀并加热至沸腾，在回流状态保持沸腾反应2h，获得浅红色的胶体溶液，自然冷却到室温备用。
2)分别取适量的胶体溶液分别进行紫外可见分光光度计(UV-Vis)和透射电子显微镜(TEM)测试分析，结果分别如图3A和图4A所示。从图中可以看出，该纳米金胶体溶液的吸收光谱变得非常弱，几乎看不到吸收峰，而从TEM图中可以看出，有很小的未成形颗粒和团聚的颗粒结构。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种基于三七皂苷还原法制备纳米金颗粒的方法，其特征在于，所述基于三七皂苷还原法制备纳米金颗粒的方法包括：
首先在圆底烧瓶中，配置50mL的0.25mM的氯金酸HAuCl4和0.2mg/mL的三七皂苷R1混合溶液中；
然后加入1M的氢氧化钠溶液，加热搅拌至沸腾，在回流状态保持沸腾反应至少30min，自然冷却至室温备用；
最后，取纳米金颗粒溶胶以MTT法研究其对人肺癌细胞NCl-H292的杀伤作用，获取纳米金颗粒对细胞存活率和细胞形貌的影响和变化；
所述基于三七皂苷还原法制备纳米金颗粒的方法具体包括：
1)分别以超纯水配置好1％的氯金酸溶液，1mg/mL的三七皂苷R1溶液和1M的氢氧化钠溶液，4℃冰箱保存备用；
2)分别取适量的上述溶液，稀释成50mL的混合溶液，随后在集热磁力搅拌反应器上加热至沸腾，在回流状态保持沸腾反应至少30min，获得砖红色或酒红色的胶体溶液，自然冷却到室温备用。
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