CN109628572A - miR-99a在激素性股骨头坏死中的应用 - Google Patents

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Abstract

miR‑99a在激素性股骨头坏死中的应用。本发明公开了miR‑99a作为标志物在制备检测激素性股骨头坏死的产品中的应用。本发明还提供了miR‑99a抑制剂在制备治疗激素性股骨头坏死的药物中的应用；所述药物包含miR‑99a的抑制剂作为活性成分。本发明发现miR‑99a特异性强，灵敏度高，能够有效地用于早期检测激素性股骨头坏死，并且可用于基因治疗、药物治疗等临床应用。

Description

miR-99a在激素性股骨头坏死中的应用
技术领域
本发明涉及生物分子学及医学领域，具体涉及利用miR-99a在激素性股骨头坏死中的应用。
背景技术
股骨头坏死(osteonecrosis of femoral head，ONFH)因其主要病理系股骨头血运受阻，遭受破坏而引起的头部骨质缺血，故多称为股骨头缺血性坏死(avascμLarnecrosis，AVN)，是一种好发于中青年人群的骨科常见且难治性疾病，致残率极高。在我国，每年需要治疗的ONFH患者数为500～750万，每年新发患者数为15～20万，患者多为37-45岁的青壮年，男性发病例数多于女性，我国男女发病比例为3.8:1。其中激素性股骨头坏死(steroid-induced avascμLar necrosis of the femoral head，SANFH)占非创伤性股骨头坏死的66.7％。类糖皮质激素能够通过抑制成骨细胞的分化及活性，促进成骨细胞和骨细胞凋亡，抑制骨形成；另一方面，促进破骨细胞的分化及活性，延长其生存周期，加强对骨质的吸收，从而使骨形成与骨吸收偶联机制失去平衡，导致SANFH。该病初发时并无明显临床表现，随着病情加重，最终导致髋关节坏死和塌陷。目前，针对于SANFH的现有临床治疗方案收效甚微，这很大程度上归因于SANFH机制不明且诊断方法滞后。因此，探索SANFH的发病机制，了解及掌握更新、更有效的早期诊断及临床治疗方法，具有重要意义。
SANFH的研究一直是骨科研究中的热点，因其病因复杂，有关SANFH发病机制的假说也有很多种，如凝血功能紊乱学说、脂质代谢学说、股骨头内高压学说、血管内皮损伤学说、骨髓间充质干细胞功能紊乱学说等等，虽然这些研究有一些临床和实验研究依据，但均不能完全解释股骨头坏死的全部病理过程。因此，探索SANFH的发病机制，寻找相关的miRNA成为现代研究的重点和热点。
MicroRNA(miRNAs)是一类长约22～25个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子，可通过碱基互补配对的方式结合靶基因的3’非编码区(3’TTR)，从而抑制翻译或降解靶基因。MicroRNA在进化过程中高度保守，在生物体内分布广泛，并参与许多复杂的生物学过程，如胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、脂肪代谢、骨形成等。有研究表明：miRNAs通过调控成骨分化相关基因表达在骨形成中起关键作用，如miR-216促进人脂肪组织来源的间充质干细胞向成骨分化、miR-494通过调节Runx2的表达抑制成骨细胞分化等。
因此本领域迫切需要开展与激素性股骨头坏死相关联的特异性miRNA作为早期诊断的标记物的研究，以便提供新的有效的预防和治疗靶点。
早期的诊断和治疗是治疗SANFH的关键。随着生物信息学的不断发展，越来越多的和SANFH相关的基因见诸报道，证实了多种基因在ANFH的发生发展中的作用，为SANFH的早期诊断和治疗提供了理论依据。
发明内容
为了实现激素性股骨头坏死的早期诊断及早期治疗，本发明的目的在于提供一种新的与激素性股骨头坏死的标志物miR-99a，并提供其在制备激素性股骨头坏死的检测产品以及治疗药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
首先，本发明提供了miR-99a作为标志物在制备检测激素性股骨头坏死的产品中的应用。
优选的，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒。
优选的，所述miR-99a在检测激素性股骨头坏死患者的样本中表达水平上调。
进一步地，本发明提供了miR-99a抑制剂在制备治疗激素性股骨头坏死的药物中的应用。
优选的，所述药物包含miR-99a的抑制剂作为活性成分。
优选的，所述miR-99a抑制剂能够抑制miR-99a的功能。
优选的，所述miR-99a抑制剂选自：能降低miR-99a表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸；或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸的构建物。
优选的，所述miR-99a的反义寡核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述miR-99a的反义寡核苷酸序列是根据miR-99a序列设计出它的特异性反义寡核苷酸，将反义寡核苷酸转移到细胞内，它们能够明显抑制miR-99a的转录水平。
在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，优选地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(lockednucleicacid，LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2'氧原子和4'碳原子连接起来的修饰技术。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性、抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。
更进一步地，本发明提供了miR-99a抑制剂在促进骨分化产品中的应用。
优选的，miR-99a抑制剂能促进成骨分化标志物的表达。
优选的，所述成骨标志物包括ALP(碱性磷酸酶)、OPN(骨桥蛋白)、RUNX2(runt相关转录因子2)。
其中，ALP和OPN被认为是成骨分化的早期标志物；RUNX2被认为在成骨细胞分化过程中起关键作用，是成骨细胞分化的标志性转录因子，该基因的异常表达将导致骨发育不良或骨形成障碍。
有益效果
本发明公开了一种与激素性股骨头坏死相关的miR-99a，并进一步证实miR-99a在激素性股骨头坏死的样本中表达上调。进一步，本发明公开miR-99a抑制剂，以及在制备治疗激素性股骨头坏死的药物中的应用。利用miR-99a检测激素性股骨头坏死不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
附图说明
图1 miR-99a在激素性股骨头坏死患者表达水平；
图2 miR-99a低表达后对BMSC成骨分化标志物表达的影响。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓中一类具有多向分化潜能的细胞，可以分化为成骨细胞、成纤维细胞、网状细胞等，并在多种疾病发生发展过程中起到非常重要作用。
本发明通过在细胞水平通过现代分子生物学技术研究miRNA与SANFH病变的关系。本研究将有助于揭示SANFH发病机制，具有理论和临床价值。本发明的实施可能为SANFH的早期诊断及预防提供新思路，为SANFH的治疗提供新的药物靶点，使广大SANFH患者免受手术之苦。
本发明所述miR-99a选自以下组：初始miR-99a、前体miR-99a、成熟miR-99a；初始miR-99a能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA；前体miR-99a能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA；所述成熟miRNA为miR-99a-5p。所述miR-99a的核苷酸序列为SEQ ID No:4，所述miR-99a-5p的核苷酸序列为SEQ ID No:5。
实施例1高通量测序筛选差异表达基因
1、样本
收集5例激素性股骨头坏死患者血液样本，编号F1-F5；收集3例相对健康者，的血液样本。编号N1患有创伤性股骨头坏死，N2、N3患有髋臼发育不良。取样来源于2015年10月到2018年5月期间在北京协和医院骨科就诊的患者。本研究的所有临床样本，均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。
2、对样本进行总RNA提取
2.1 RNA提取样本处理
将EDTA抗凝全血按1:1比例与Trizol混合，如短时间内不进行RNA提取，可将样本于液氮中速冻30s-1min后，放于-80℃短期保存。
2.2 RNA提取方法
(1)按每1mL Trizol中加200μL氯仿(三氯甲烷)的比例加入氯仿，剧烈震荡混匀15s，室温放置5-10min。
(2)4℃、12000rpm、15min。
(3)离心后液体分为三层，小心吸取最上层水相到新的EP管中(<500μL)，注意不要吸到分界层白膜。
(4)每管加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀后室温放置10min。
(5)4℃、12000rpm、10min。
(6)弃上清，可见白色RNA沉淀，每管加入1mL 75％乙醇(预冷、DEPC水配制)，上下颠倒混匀后，低温离心。
(7)4℃、12000rpm、10min。
(8)重复步骤6、7，小心去除上清，将每个EP管依次排列倒扣于干净卫生纸上，让液体自动下流到卫生纸上片刻，用枪头轻拨壁上液珠到管口，蘸干管口液体，敞盖置于冰上，使剩余乙醇挥发。
(9)每管加入12μL DEPC水(或RNase free water)溶解RNA，加入1μL RNaseInhibitor。
(10)每管吸出1-2μL RNA溶液，适当稀释后测定浓度，其余暂存于-80℃冰箱或立即进行后续反应。
(11)用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
3、高通量测序
测序平台为IllTmina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.Tk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR dTplication含量，kmer的freqTency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1，FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Ontology和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献筛选了差异表达miRNAs:miR-99a-5p，所述miRNAs在激素性股骨头坏死患者样本中表达上调。
实施例2 Real-Time PCR验证激素性股骨头坏死患者中miR-99a-5p表达情况
1.材料
选取激素性股骨头坏死患者的血液样本15例及正常人的血液样本5例，对其进行分组及编号。所有样本均经过病理学检查证实。
2.RNA提取步骤参见实施例1
3.逆转录
以总RNA为模板，miRNA使用Transcript Reverse Transcriptase和RibonucleaseInhibitor反转录试剂盒进行cDNA的合成。
合成第一条cDNA链：
使用微量EP管，依次加入以下A体系(12μL)：
表1 A体系
RNA(2μg) XμL(x≤9)
miRNA RT Primer(RPrimer) 1μL
sonRNA 202R Primer 1μL
dNTP(2.5mM) 1μL
DEPCwater 9-xμL
轻轻混匀，将体系放入PCR仪中，设置反应条件70℃，10min，反应结束立即转入冰上2-5min解离，使模板RNA/引物的变性溶液聚集于微量管底部；在反应后的微量管中加入B体系(8μL)：
表2 B体系
5x M-mLv Buffer 4μL
DTT(0.1M) 2μL
RNA Inhibitor(40u/μL) 1μL
M-mLV(200u/μL) 1μL
轻轻混匀，将体系放入PCR仪中，设置反应条件42℃，1h；70℃，15min，置于冰上冷却，得到RNA逆转产物cDNA溶液即可用于实时定量实验操作。
4.荧光定量PCR
(1)引物的设计与合成
从Pubmed获得目的基因miRNA的全长序列，利用Saccharomyces Genome Database设计引物序列。经过Blast分析，引物序列具有特异性。引物均委托生工生物工程股份有限公司合成。所用的引物序列如下所示：
hsa-miR-99a-5p-F：5'-GCGAACCCGTAGATCCGAT-3'(SEQ ID No:1)；
hsa-miR-99a-5p-RT：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACAAG-3'(SEQ ID No:2)。
(2)荧光定量PCR
在0.2mL PCR管内，按表3依次加入1μL反转录产物，各基因上游与下游引物各0.5μL，10μL PCR反应Mix，用ddH2O水补足体积至20μL。混匀后立即置PCR仪中按下列程序反应，反应结束后，样品保存于-20℃备用。
表3 PCR反应体系
组分 体积/μL 终浓度
cDNA 1
primer f(20μM) 0.5 10μM
primer r(20μM) 0.5 10μM
2×Mix 10 1×
ddH<sub>2</sub>O 8
PCR循环参数：48℃预变性30min；95℃变性10min；95℃变性15sec，60℃退火+延伸1sec，共循环40个。
(3)熔解曲线制备
在7500fast荧光定量PCR仪上选定溶解曲线程序。在爬坡过程中连续收集样品的荧光信号以获取熔解曲线，熔解曲线通过定量PCR仪自带的分析软件获取，程序结束后进行分析。
5.结果
结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中miR-99a-5p在激素性股骨头坏死患者中表达水平明显高于对照组，具体见图1。
实施例3人骨髓来源的间充质干细胞分离、培养、诱导及鉴定
分离培养：人骨髓间充质干细胞(BMSC)来源于实施例1中的N1患者，行人工全髋关节置换术中采用无菌骨髓穿刺针，于股骨侧假体试模开髓时抽取骨髓组织10mL，骨髓组织中分离的方法参照Pittenger等方法(Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,Jaiswal RK,Douglas R,Mosca JD,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymalstem cell[J].Science.1999,284(5411):143-147)分离BMSC细胞培养至第3代。
诱导分化：更换成骨诱导培养液(含10％胎牛血清、10nm的地塞米松，0.2mM抗坏血酸和10mMβ-甘油磷酸钠的H-DMEM培养基)继续培养，每隔两天换液1次。分别于诱导后的第0、6、12d用碱性磷酸酶染色(6d)和茜素红染色(12d)鉴定成骨情况。
所述碱性磷酸酶(ALP)染色：
①细胞爬片滴加数滴1号液，室温固定1min(不可以延长)，流水漂洗2分，晾干；
②滴加作用液数滴，置湿盒内于37℃孵育2h，流水冲洗2min；
③滴加5号液数滴，复染5min，流水冲洗2min，晾干；
④结果：阳性结果是胞浆内出现蓝色沉淀。
茜素红染色：
①培养皿用PBS冲洗2次，95％乙醇固定10min，双蒸水冲洗3次。
②0.1％茜素红-Tris-HCL(PH 8.3)37℃，30min。
③蒸馏水冲洗，干燥，封片。
④结果：阳性结果是在细胞外基质中可见被染成橘红色的矿化结节。
与同对照组相比，经地塞米松诱导后，骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞，成骨分化的BMSC成现多层、漩涡状生长，碱性磷酸酶染色和茜素红染色显示钙化和矿化基质产生。
实施例4 miR-99a抑制剂的转染
1、设计合成针对miR-99a的反义寡核苷酸(anti-miR-99a)
根据miR-99a的序列信息由大连宝生物生物技术有限公司设计合成miR-99a的反义寡核苷酸序列和随机对照序列，miR-99a的反义寡核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2、BMSC细胞培养
将上述培养至第3代的BMSC按照2x105/mL每孔均匀接种于6孔板中，过夜贴壁后，待细胞达到60％～70％汇合时进行转染。
3、转染
a.以250μL无血清无双抗转染专用Opti-MEM稀释5μL LipofectamineTM2000和anti-miR-99a；
b.轻轻混匀，室温下孵育5分钟；
c.将稀释的anti-miR-99a和LipofectamineTM 2000混合后在室温下孵育20分钟；
d.从培养箱中取出待转染细胞，弃培养液，用D-Hank’s洗一遍，每孔加入1.5mL的Opti-MEM培养液；
e.将孵育好的anti-miR-99a-LipofectamineTM2000复合物缓慢逐滴加入6孔板中。轻摇混匀后放入培养箱中继续培养；
f.转染6h后，弃转染液，用D-Hank’s洗去未转染复合物，更换相应培养液继续培养；
g.转染效率确定：在荧光显微镜下观察转染的阳性细胞率，检测转染效率。用miR-99a抑制剂的转染效率用miR-99a特异的Real-Time PCR鉴定。
结果显示，阴性对照组对骨髓间充质干细胞中miR-99a表达无明显抑制作用，和空白对照组无统计学差异，转染的anti-miR-99a组对骨髓间充质干细胞中miR-99a表达起到一定抑制作用抑制率为56％。
实施例5抑制miR-99a的表达可以促进BMSC成骨分化
同样，通过将miR-99a抑制剂((anti-miR-99a))转入BMSC，进行诱导分化培养，观察miR-99a低表达后对BMSC成骨分化的影响。在BMSC成骨诱导第6天，进行Real-Time PCR对成骨分化标志基因ALP、OPN、RUNX2检测显示，低表达miR-99a后(miR-99aI)，ALP、OPN、RUNX2等成骨标志基因mRNA的表达明显高于miR-NC转染的对照组(miR-NCI)(图2)。
所述Real-Time PCR检测ALP、OPN、RUNX2成骨标志物的表达，使用TranscriptFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒进行cDNA的合成，具体实验步骤见说明书。Real-Time PCR实验方法参见实施例2中的步骤。所述ALP基因的引物序列如SEQ IDNO.6-7所示，所述OPN基因的引物序列如SEQ ID NO.8-9所示，所述RUNX2基因的引物序列如SEQ ID NO.10-11所示。所有mRNA的PCR反应皆以GAPDH为内参。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国医学科学院北京协和医院
<120> miR-99a在激素性股骨头坏死中的应用
<130> P18146
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gcgaacccgt agatccgat 19
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccacaag 50
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
uugggcaucu aggcuagaac ac 22
<210> 4
<211> 81
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
cccauuggca uaaacccgua gauccgaucu uguggugaag uggaccgcac aagcucgcuu 60
cuaugggucu gugucagugu g 81
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
aacccguaga uccgaucuug ug 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
ccacgtcttc acatttggtg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
agactgcgcc tggtagttgt 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
actcgaacga ctctgatgat gt 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
gtcaggtctg cgaaacttct ta 22
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
tgtcatggcg ggtaacgat 19
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
aagacggtta tggtcaaggt gaa 23

Claims (10)

1.miR-99a作为标志物在制备检测激素性股骨头坏死的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述miR-99a在检测激素性股骨头坏死患者的样本中表达水平上调。
4.miR-99a抑制剂在制备治疗激素性股骨头坏死的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物包含miR-99a的抑制剂作为活性成分。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述miR-99a抑制剂能够抑制miR-99a的功能。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述miR-99a抑制剂选自：能降低miR-99a表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸；或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸的构建物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述miR-99a的反义寡核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
9.miR-99a抑制剂在促进骨分化产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，miR-99a抑制剂能促进成骨分化标志物的表达，所述成骨标志物包括ALP、OPN、RUNX2。
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CN108904487A (zh) * 2018-06-25 2018-11-30 淮安康宜莱干细胞生物科技有限公司 一种促进骨髓间充质干细胞分化的miR-99a-5p表达促进剂及应用

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