CN109618699B - 一种拟南芥与本生烟草的远缘嫁接方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种拟南芥与本生烟草的远缘嫁接方法，包括如下步骤：(1)砧木的准备；(2)接穗的准备；(3)无菌环境下嫁接形成嫁接体；(4)嫁接体的培养；(5)嫁接体的移栽。本发明的方法以拟南芥作为接穗，以本生烟草作为砧木，简单快速的创建了跨物种远缘嫁接体系，且嫁接成活率高达90％，为远缘嫁接相关理论研究提供了新的科学研究基础。本发明选择植物幼苗期进行微嫁接，操作方法简单，嫁接苗成活率高。基于嫁接技术在农业中广泛应用，此嫁接技术将为创造种质资源提供有益的借鉴。

Description

一种拟南芥与本生烟草的远缘嫁接方法
技术领域
本发明涉及小体型植物的嫁接技术领域，特别涉及一种拟南芥与本生烟草的远缘嫁接方法。
背景技术
嫁接技术在农业生产中的起着重要的作用，已广泛应用于拟南芥，烟草，马铃薯，番茄，瓜果类等的研究与生产中。采用嫁接技术，可以在不同生物学过程中更深入的探索相关的分子机制，如：开花、芽分支，重金属解毒，营养状况，果实品质，作物抗逆性方面，小RNA运动，基因转录后沉默信号等等。综上所述，嫁接技术与现代生物技术相结合成为探索各种生物学相关研究的重要手段。
根据微嫁接所选用的接穗不同，可分为根-茎嫁接(root-shoot grafting)、Y-型嫁接(two shoot Y-graft)、茎-茎嫁接(shoot-shoot grafting)、子叶嫁接(Cot-grafting、愈伤组织嫁接(callus grafting)和细胞嫁接(cell grafting)等。通常研究中常用的则是前三种嫁接方法，目前嫁接主要是针对同源嫁接，即同一个物种进行嫁接，比如拟南芥，将不同基因型的拟南芥作为接穗嫁接到野生型的拟南芥砧木上；或者将不耐寒的西红柿接穗嫁接到抗寒的西红柿砧木上，这样就可以在青海等地种植等等。
嫁接在农业生产中的应用可谓层出不穷，但是囿于科内种间或种内嫁接的限制，很多物种的独有良好性状及特征不能被综合利用。虽然目前已有不同物种嫁接的相关报到，比如西红柿和本生烟草嫁接，但是它们同属于茄科。目前尚无跨物种嫁接尤其是不同科及不同目的相关研究远缘嫁接的方法与研究，因而找到科间及至目间植物的嫁接规律以及不亲和机制对于未来更加广泛的联合不同物种的优良性状有着非常重要的参考价值。
拟南芥属于被子植物门，双子叶植物纲，五桠果亚纲，十字花科，而烟草属于被子植物门，双子叶植物纲，菊亚纲，茄科。它们同属双子叶植物纲，隶属于不同科，不同目，以及不同亚纲，各自的形态及生长周期有着很大的差异，且烟草含有的尼古丁有较大的毒性，因而建立拟南芥与烟草的嫁接体系存在一定难度与风险。不过，由于二者均为模式植物，且基因组差异巨大，若能构建拟南芥烟草异源嫁接体，那么该远缘嫁接体系的建立将会更加清晰的阐明接穗与砧木间生物大分子长距离运输的分子机理。通过对拟南芥烟草这一远缘嫁接体的构建可能在种质资源创新方法与新材料创造方面提供有益的借鉴。目前还未有相关报道。
因而，如何成功开发一种拟南芥与本生烟草的远缘嫁接方法，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种拟南芥与本生烟草的远缘嫁接方法，该方法以拟南芥作为接穗，以本生烟草作为砧木，简单快速的创建了跨物种远缘嫁接体系，且嫁接成活率高达90％，为远缘嫁接相关理论研究提供了新的科学研究基础。
本发明是这样实现的：
本发明提供一种拟南芥与本生烟草的远缘嫁接方法，具体包括如下步骤：
步骤1、砧木的准备：将本生烟草种子经消毒处理后无菌接种于MS固体培养基上，长日照条件培养7-9天，选取生长健壮、完整的本生烟植株作为砧木苗，
步骤2、接穗的准备：将拟南芥种子经消毒处理后无菌接种在MS固体培养基上，长日照条件培养7-9天，选取生长健壮、完整的拟南芥植株作为接穗苗；
步骤3、无菌环境下嫁接形成嫁接体：将所述接穗苗浸在湿润且无菌的whatmanpaper上，并将所述接穗苗的子叶、下胚轴及以下部分全部切去，留下全部上胚轴作为接穗部分；将所述砧木苗放到含有接穗的培养皿里，将上胚轴以上部分全部切除，留下全部下胚轴作为砧木部分；将接穗部分和砧木部分两个伤面的形成层贴合并贴在培养皿内壁上，并进行封口；
步骤4、嫁接体的培养：将所述嫁接体在所述湿润且无菌的whatman paper上，长日照条件下培养3-4天，待伤口愈合；
步骤5、嫁接体的移栽：将嫁接成功的嫁接体移到新的固体培养基上，长日照条件培养，直至嫁接苗开花结果，收获种子。
所述whatman paper的厂家为：whatman，型号为:1001-070。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的一种拟南芥与本生烟草的远缘嫁接方法，通过对遗传背景相对简单、基因组差异较大、亲缘关系较远的模式植物拟南芥和本生烟草远缘嫁接体系的构建，首次利用两种不同科的物种进行远缘嫁接，为砧穗互作机制研究提供了一个有效的参考模型，为嫁接技术中的兼容性相关理论研究以及生物间大分子运输现象提供新的科学研究基础。由于接穗和砧木都是模式植物，嫁接成功后的嫁接体生长周期短，能够很快知道远缘嫁接的可行性，且嫁接技术在农业中广泛应用，为创造种质资源提供了有益的借鉴。
2、本发明的方法，操作简单、成活率高(嫁接成活率高达90％)，简单快速的创建了跨物种远缘嫁接体系，为远缘嫁接相关理论研究提供了新的科学研究基础。
3、本发明在幼苗期进行微嫁接，去除子叶并没有使用传统的硅胶套，操作简单且存活率高；本申请人经大量的创新性试验发现，嫁接操作时采用嫁接体在湿润且无菌的whatman paper上长日照条件下培养3-4天，待伤口愈合，这样操作伤口愈合快且嫁接存活率高。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的在whatman paper上的拟南芥与本生烟草远缘嫁接苗刚嫁接时的实物图；
图2为本发明实施例1提供的移栽前的拟南芥与本生烟草远缘嫁接苗的实物图。
具体实施方式
实施例1
(1)拟南芥和烟草种子的消毒与发芽：取1.5mL离心管中，在离心管管盖和管壁用铅笔标明拟南芥和本生烟草种子名称，取适量种子装入对应的离心管中用氯气处理1h，然后在超净工作台上将无菌种子种植在含固体培养基的无菌培养皿上，放在培养室生长7-9天，培养室生长条件为：温度控制在23±1℃，相对湿度70％，长日照条件，16h光照和8h暗处理。
(2)选取生长健壮、完整的拟南芥植株作为接穗；同等条件下，选取生长健壮、完整的烟草植株作为砧木。
(3)无菌条件下嫁接：在超净工作台上，将准备的拟南芥接穗放到湿润且无菌的whatman paper上，在解剖镜下用嫁接刀将子叶、下胚轴及以下部分全部切去；将准备的本生烟砧木放到含有接穗的培养皿里面，在解剖镜下用嫁接刀将上胚轴以上部分全部切除。将接穗部分紧靠砧木部分，使接穗和砧木部分形成层紧密接触。用parafilm封口膜将培养皿缠上，再在外面缠一层透气胶带。
所述湿润的whatman paper具体是指将2张70mm直径的灭菌后的whatman paper放在培养皿里面，多余的部分重叠在中间，加入1.5ml无菌水，再铺上两层15um的尼龙膜；或者将1张90mm直径的灭菌后的whatman paper放在培养皿里面，加入1.6ml无菌水，再铺上两层15um的尼龙膜。
(4)嫁接体的培养：标明嫁接名称和日期，放在生长室生长3-4天，长日照条件下培养，培养室生长条件为：温度控制在23±1℃，相对湿度70％，长日照条件，16h光照和8h暗处理。
(5)嫁接体的移栽：3-4天后将嫁接成功的远缘嫁接体移到新的生长培养基上面，嫁接完成。
对比例1
该对比例不一样的地方在于：无菌嫁接操作时采用1/2无糖MS培养基，其他操作步骤均与所述实施例1相同，具体为：
(1)拟南芥和烟草种子的消毒与发芽：取1.5mL离心管中，在离心管管盖和管壁用铅笔标明拟南芥和本生烟草种子名称，取适量种子装入对应的离心管中用氯气处理1h，然后在超净工作台上将无菌种子种植在含固体培养基的无菌培养皿上，放在培养室生长7-9天，培养室生长条件为：温度控制在23±1℃，相对湿度70％，长日照条件，16h光照和8h暗处理。
(2)选取生长健壮、完整的拟南芥植株作为接穗；同等条件下，选取生长健壮、完整的烟草植株作为砧木。
(3)无菌条件下嫁接：在超净工作台上，将准备的拟南芥接穗放到1/2无糖MS培养基上，在解剖镜下用嫁接刀将子叶、下胚轴及以下部分全部切去；
将准备的本生烟砧木放到含有接穗的培养皿里面，在解剖镜下用嫁接刀将上胚轴以上部分全部切除。将接穗部分紧靠砧木部分，使接穗和砧木部分形成层紧密接触。用parafilm封口膜将培养皿缠上，再在外面缠一层透气胶带。
(4)嫁接体的培养：标明嫁接名称和日期，放在生长室生长3-4天，长日照条件下培养，培养室生长条件为：温度控制在23±1℃，相对湿度70％，长日照条件，16h光照和8h暗处理。
(5)嫁接体的移栽：3-4天后将嫁接成功的远缘嫁接体移到新的生长培养基上面，嫁接完成。
对比例2
该对比例不一样的地方在于：无菌嫁接操作时采用1/4无糖MS培养基，其他操作步骤均与所述实施例1相同，具体为：
(1)拟南芥和烟草种子的消毒与发芽：取1.5mL离心管中，在离心管管盖和管壁用铅笔标明拟南芥和本生烟草种子名称，取适量种子装入对应的离心管中用氯气处理1h，然后在超净工作台上将无菌种子种植在含固体培养基的无菌培养皿上，放在培养室生长7-9天，培养室生长条件为：温度控制在23±1℃，相对湿度70％，长日照条件，16h光照和8h暗处理。
(2)7-9天后，选取生长健壮、完整的拟南芥植株作为接穗；同等条件下，选取生长健壮、完整的烟草植株作为砧木。
(3)无菌条件下嫁接：在超净工作台上，将准备的拟南芥接穗放到1/4无糖MS培养基上，在解剖镜下用嫁接刀将子叶、下胚轴及以下部分全部切去；将准备的本生烟砧木放到含有接穗的培养皿里面，在解剖镜下用嫁接刀将上胚轴以上部分全部切除。将接穗部分紧靠砧木部分，使接穗和砧木部分形成层紧密接触。用parafilm封口膜将培养皿缠上，再在外面缠一层透气胶带。
(4)嫁接体的培养：标明嫁接名称和日期，放在生长室生长3-4天，长日照条件下培养，培养室生长条件为：温度控制在23±1℃，相对湿度70％，长日照条件，16h光照和8h暗处理。
(5)嫁接体的移栽：3-4天后将嫁接成功的远缘嫁接体移到新的生长培养基上面，嫁接完成。
对比例3
该对比例不一样的地方在于：无菌嫁接操作时采用1/5无糖MS培养基，其他操作步骤均与所述实施例1相同，具体为：
(1)拟南芥和烟草种子的消毒与发芽：取1.5mL离心管中，在离心管管盖和管壁用铅笔标明拟南芥和本生烟草种子名称，取适量种子装入对应的离心管中用氯气处理1h，然后在超净工作台上将无菌种子种植在含固体培养基的无菌培养皿上，放在培养室生长7-9天，培养室生长条件为：温度控制在23±1℃，相对湿度70％，长日照条件，16h光照和8h暗处理。
(2)7-9天后，选取生长健壮、完整的拟南芥植株作为接穗；同等条件下，选取生长健壮、完整的烟草植株作为砧木。
(3)无菌条件下嫁接：在超净工作台上，将准备的拟南芥接穗放到1/5无糖MS培养基上，在解剖镜下用嫁接刀将子叶、下胚轴及以下部分全部切去；将准备的本生烟砧木放到含有接穗的培养皿里面，在解剖镜下用嫁接刀将上胚轴以上部分全部切除。将接穗部分紧靠砧木部分，使接穗和砧木部分形成层紧密接触。用parafilm封口膜将培养皿缠上，再在外面缠一层透气胶带。
(4)嫁接体的培养：标明嫁接名称和日期，放在生长室生长3-4天，长日照条件下培养，培养室生长条件为：温度控制在23±1℃，相对湿度70％，长日照条件，16h光照和8h暗处理。
(5)嫁接体的移栽：3-4天后将嫁接成功的远缘嫁接体移到新的生长培养基上面，嫁接完成。
对比例4
该对比例不一样的地方在于：无菌嫁接操作时采用湿润且无菌的普通滤纸，其他操作步骤均与所述实施例1相同，具体为：
(1)拟南芥和烟草种子的消毒与发芽：取1.5mL离心管中，在离心管管盖和管壁用铅笔标明拟南芥和本生烟草种子名称，取适量种子装入对应的离心管中用氯气处理1h，然后在超净工作台上将无菌种子种植在含固体培养基的无菌培养皿上，放在培养室生长7-9天，培养室生长条件为：温度控制在23±1℃，相对湿度70％，长日照条件，16h光照和8h暗处理。
(2)7-9天后，选取生长健壮、完整的拟南芥植株作为接穗；同等条件下，选取生长健壮、完整的烟草植株作为砧木。
(3)无菌条件下嫁接：在超净工作台上，将准备的拟南芥接穗放到湿润且无菌的普通滤纸上，在解剖镜下用嫁接刀将子叶、下胚轴及以下部分全部切去；将准备的本生烟砧木放到含有接穗的培养皿里面，在解剖镜下用嫁接刀将上胚轴以上部分全部切除。将接穗部分紧靠砧木部分，使接穗和砧木部分形成层紧密接触。用parafilm封口膜将培养皿缠上，再在外面缠一层透气胶带。
(4)嫁接体的培养：标明嫁接名称和日期，放在生长室生长3-4天，长日照条件下培养，培养室生长条件为：温度控制在23±1℃，相对湿度70％，长日照条件，16h光照和8h暗处理。
(5)嫁接体的移栽：3-4天后将嫁接成功的远缘嫁接体移到新的生长培养基上面，嫁接完成。
对比例5
该对比例不一样的地方在于：无菌嫁接操作时采用湿润且无菌的A4打印纸，其他操作步骤均与所述实施例1相同，具体为：
(1)拟南芥和烟草种子的消毒与发芽：取1.5mL离心管中，在离心管管盖和管壁用铅笔标明拟南芥和本生烟草种子名称，取适量种子装入对应的离心管中用氯气处理1h，然后在超净工作台上将无菌种子种植在含固体培养基的无菌培养皿上，放在培养室生长7-9天，培养室生长条件为：温度控制在23±1℃，相对湿度70％，长日照条件，16h光照和8h暗处理。
(2)7-9天后，选取生长健壮、完整的拟南芥植株作为接穗；同等条件下，选取生长健壮、完整的烟草植株作为砧木。
(3)无菌条件下嫁接：在超净工作台上，将准备的拟南芥接穗放到湿润且无菌的A4打印纸上，在解剖镜下用嫁接刀将子叶、下胚轴及以下部分全部切去；将准备的本生烟砧木放到含有接穗的培养皿里面，在解剖镜下用嫁接刀将上胚轴以上部分全部切除。将接穗部分紧靠砧木部分，使接穗和砧木部分形成层紧密接触。用parafilm封口膜将培养皿缠上，再在外面缠一层透气胶带。
(4)嫁接体的培养：标明嫁接名称和日期，放在生长室生长3-4天，长日照条件下培养，培养室生长条件为：温度控制在23±1℃，相对湿度70％，长日照条件，16h光照和8h暗处理。
(5)嫁接体的移栽：3-4天后将嫁接成功的远缘嫁接体移到新的生长培养基上面，嫁接完成。
实验例
以上实施例1以及对比例1-对比例5中均嫁接20株，分别观察嫁接成活株数并统计如下:
表1
Figure BDA0001958271140000101
由上表1可知，嫁接体完成后的生长条件对嫁接体的愈合影响很大，对比例1-3都是在无糖培养基上完成，但是嫁接4天后并没有愈合完整的嫁接体出现。实施例4-6都是在无菌纸上完成，由于对比例4中采用的普通滤纸保湿性不好，没有愈合完整的嫁接体出现；对比例5(采用湿润且无菌的A4打印纸)虽然有愈合完整的嫁接体出现，但是嫁接体后期生长影响较大。实施例1，愈合完整的嫁接体的成活率高达90％。由上表可知，远缘嫁接体的构建除了无菌条件外，还需要在whatman paper上操作，才能大大提高成活率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种拟南芥与本生烟草的远缘嫁接方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤1、砧木的准备：将本生烟草种子经消毒处理后无菌接种于MS固体培养基上，长日照条件培养7-9天，选取生长健壮、完整的本生烟草植株作为砧木苗，生长健壮、完整的本生烟草植株是指整个胚轴部分不弯曲，出现两片子叶且整个本生烟草的长度不超过0.8 cm；
步骤2、接穗的准备：将拟南芥种子经消毒处理后无菌接种在MS固体培养基上，长日照条件培养7-9天，选取生长健壮、完整的拟南芥植株作为接穗苗；生长健壮、完整的拟南芥植株是指整个胚轴部分不弯曲，两片子叶部分完全展开，出现两片真叶且整个拟南芥植株的长度不超过3 cm；所述步骤1和步骤2中消毒处理的步骤为：用氯气处理1h，再用蒸馏水处理3-6次；
步骤3、无菌环境下嫁接形成嫁接体：将所述接穗苗浸在湿润且无菌的whatman paper上，并将所述接穗苗的子叶、下胚轴及以下部分全部切去，留下全部上胚轴作为接穗部分；将所述砧木苗放到含有接穗的培养皿里，将上胚轴以上部分全部切除，留下全部下胚轴作为砧木部分；将接穗部分和砧木部分两个伤面的形成层贴合并贴在培养皿内壁上，并进行封口；
步骤4、嫁接体的培养：所述嫁接体在所述湿润且无菌的whatman paper上，并将含有所述嫁接体的培养皿垂直放在生长室，长日照条件下培养3-4天，待伤口愈合；
步骤5、嫁接体的移栽：将嫁接成功的嫁接体移到新的固体培养基上，长日照条件培养，直至嫁接苗开花结果，收获种子；
所述步骤1、步骤2、步骤4和步骤5中长日照条件为：16h 光照和8h 暗处理，光照条件下温度23±1℃；黑暗条件下的温度为23±1℃，光强为6000-8000 lux，相对湿度70%。
2.如权利要求1所述的拟南芥与本生烟草的远缘嫁接方法，其特征在于，所述步骤1和步骤2中消毒处理前，分别在装有拟南芥和本生烟草种子的离心管管盖或管壁上用铅笔标明名称进行区分。
3.如权利要求1所述的拟南芥与本生烟草的远缘嫁接方法，其特征在于，所述步骤3中封口的具体步骤为：用封口膜将培养皿缠上，再在外面缠一层透气胶带。
4.如权利要求1所述的拟南芥与本生烟草的远缘嫁接方法，其特征在于，所述步骤3中，湿润且无菌的whatman paper为将购买的whatman paper灭菌后放在培养皿里面，在whatman paper上加入适量无菌水后，再铺上两层15um 的尼龙膜。
5.如权利要求1所述的拟南芥与本生烟草的远缘嫁接方法，其特征在于，所述步骤3中嫁接步骤在显微镜下用嫁接刀进行操作；步骤3中贴合时采用弯头镊子将接穗部分提起后紧靠砧木部分。
6.如权利要求1所述的拟南芥与本生烟草的远缘嫁接方法，其特征在于，所述步骤5中所用固体培养基为MS培养基，且嫁接体在MS培养基上生长2个星期及以上更换新的MS培养基。
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