CN109596588A - 一种基于光片照明的高分辨率四维光场显微成像系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于光片照明的高分辨率四维光场显微成像系统，包括光片照明模块、运动控制模块和探测采集模块，其中，光片照明模块用于产生强度可调节、波长可调节、且厚度可调节的高斯光片，从而用于对待观测样本的层析照明；运动控制模块用于实现待观测样本在三维空间中的运动；探测采集模块用于采集来自待观测样本的信号，对待观测样本进行光场探测，并利用图像传感器对采集得到的信号进行记录存储。本发明中给出了综合光片照明与光场探测优点的四维显微成像系统，可有效解决显微成像问题中观测三维活体运动样本的困难，同时在不牺牲空间分辨率的情况下实现高帧率、高时间分辨率。
Description
技术领域
本发明属于显微成像领域，更具体地，涉及一种基于光片照明的高分辨率四维光场显微成像系统，该系统是一种高帧率、高信噪比的三维显微成像系统，尤其适用于运动样本的实时三维观察与成像。
背景技术
光片荧光显微镜是本世纪兴起的一种新型显微成像技术。与传统的荧光显微镜不同，光片荧光显微镜采用层析的照明方式，即照明光源和探测采集相互垂直，利用一种片状的光源从侧面去激发样品的荧光，利用宽场采集照明层的激发的荧光图像，通过扫描获取二维图像序列来重构三维。相比普通的宽场荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜，光片显微镜具有较低的光毒性和光漂白性，较高的轴向分辨率，较快的成像速度。同时，由于抑制了焦外激发，所获得的图像具有更高的信噪比。光片荧光显微镜的这些特点使得对生物组织/生物体的三维、动态观察成为可能，已在生物医学成像领域得到广泛的关注。但由于光片的层析特性，在获取三维图像时需要依靠扫描的方式进行，因此不具有较好的实时性。
光场成像是一种实时三维成像方法。传统的图像采集方式仅记录光线的强度信息，因此通过一张图像只能获得成像系统物面上的信号信息。光场成像通过在探测光路中添加特殊的光学元件，使得在一张图像中不仅保存了光线的强度信息，也同时保存了光线的角度信息，后期通过特殊的图像处理方法，就可以从这一张图像中获取系统物面附近一定区域内所有的信号信息。由于光场成像具有实时三维成像的特点，常用于对时间分辨率有要求的三维成像场景。但高时间分辨率的特点，注定导致相对于传统的成像系统，光场成像的空间分辨率在一定程度上受到了牺牲。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种基于光片照明的高分辨率四维光场显微成像系统，其中通过对构成四维光场显微成像系统的各个功能模块(尤其是光片照明模块及探测采集模块)所采用的细节组件及它们的配合工作方式等进行改进，得到同时结合光片照明与光场探测优点的四维显微成像系统，可有效解决显微成像问题中观测三维活体运动样本的困难，同时在不牺牲空间分辨率的情况下实现高帧率、高时间分辨率。并且，本发明同时具有光场探测和正常探测两种模式，具有结构紧凑，易于搭建，实现成本低，图像质量高等特点。
为实现上述目的，按照本发明，提供了一种基于光片照明的高分辨率四维光场显微成像系统，其特征在于，包括光片照明模块、运动控制模块和探测采集模块，其中，
所述光片照明模块用于产生强度可调节、波长可调节、且厚度可调节的高斯光片，从而用于对待观测样本的层析照明；
所述运动控制模块用于实现所述待观测样本在三维空间中的运动，从而实现对所述待观测样本不同位置的光片照明和探测采集；
所述探测采集模块用于采集来自所述待观测样本的信号，对所述待观测样本进行光场探测，并利用图像传感器对采集得到的信号进行记录存储，该光场探测具体用于采集四维光场图像数据。
作为本发明的进一步优选，所述探测采集模块还用于对所述待观测样本进行宽场探测，并同样利用图像传感器对采集得到的信号进行记录存储；所述宽场探测具体是用于采集普通的光片成像荧光数据。
作为本发明的进一步优选，所述光片照明模块包括光轴均相互重合的多波长激光器(11)、光纤(12)、光纤准直器(13)、光束整形模块(15)和光片生成模块，其中，所述光纤(12)和所述光纤准直器(13)用于将所述多波长激光器(11)的出射光耦合至所述光束整形模块(15)；所述光束整形模块(15)包括依次位于光轴上的可调节狭缝(14)、可更换的第一透镜(151)、以及可更换的第二透镜(152)；其中，所述可调节狭缝(14)用于对耦合进该光束整形模块(15)的光束进行压缩，实现在成像过程中光片厚度的动态调整；所述可更换的第一透镜(151)与所述可更换的第二透镜(152)两者共焦平行放置，所述可更换的第一透镜(151)与所述可更换的第二透镜(152)独立的选自圆透镜或柱透镜，通过选择不同焦距的圆透镜或柱透镜实现对光束不同程度、不同维度的压缩与扩束；
优选的，经过所述光束整形模块(15)整形后得到的光束再经过所述光片生成模块形成用于照明的一束压成片状的高斯光束，得到高斯光片。
作为本发明的进一步优选，所述光片生成模块包括位于光轴上的可更换的柱透镜(16)及位移器；其中，所述柱透镜(16)用于控制生成的所述高斯光片的厚度；所述位移器则用于控制所述柱透镜(16)沿光轴的移动，从而控制生成的所述高斯光片的瑞利范围位置。
作为本发明的进一步优选，所述探测采集模块包括无限远成像模块、分束4F模块(34)、光场探测模块、以及宽场探测模块；其中，
所述无限远成像模块依次包括显微物镜(31)、滤色片(32)以及无限远校正套筒透镜(33)，这些显微物镜(31)、滤色片(32)以及无限远校正套筒透镜(33)依次放置在与高斯光片平面相垂直的第二光轴上；
所述分束4F模块(34)包括三个全同透镜以及分路模块(342)，记这三个全同透镜分别第一透镜(341)、第二透镜(343)、第三透镜(344)，则所述第一透镜(341)与所述第二透镜(343)两者同轴等焦放置，它们的光轴与所述第二光轴重合；所述第一透镜(341)与所述第二透镜(343)的光轴还经过所述分路模块(342)，且所述分路模块(342)放置在所述第一透镜(341)与所述第二透镜(343)之间，所述分路模块(342)具体为分束光路或翻转平面镜，用于将光束分为两路或者使光束发生90°偏折；所述第三透镜(344)的光轴与所述第二光轴相垂直，经过所述分束光路得到的两路光束相互垂直；
对于所述光场探测模块及所述宽场探测模块，其中任意一个位于所述分束4F模块(34)中所述第三透镜(344)后方的光路上，另一个位于所述分束4F模块(34)中所述第二透镜(343)后方的光路上；其中，所述光场探测模块包括依次位于所述第三透镜(344)或所述第二透镜(343)后方光路且均位于所述第三透镜(344)光轴或均位于所述第二透镜(343)光轴上的微透镜阵列(35)、微距镜头(36)及探测器(37)，所述微距镜头(36)还能够被分光计或滤光片代替；所述宽场探测模块则包括位于所述第二透镜(343)或所述第三透镜(344)后方光路上的探测器(37)。
作为本发明的进一步优选，在所述分束4F模块(34)的傅里叶平面上还设置有光学掩模。
作为本发明的进一步优选，所述运动控制模块具体包括样品夹持元件及三维运动模块；其中，所述样品夹持元件用于固定所述待观测样本，所述三维运动模块则用于控制所述待观测样本实现空间三维方向上的运动；
优选的，所述三维运动模块包括三维位移台、以及能够驱动该三维位移台沿空间三个两两相互垂直的方向独立运动的直线电机；这些直线电机均优选为压电陶瓷电机。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，由于采用特定组件构成的光片照明模块及探测采集模块，利用两者的有效配合，可实现基于光片照明的高分辨率四维光场显微成像系统。本发明引入了光片照明的方法对光场探测进行了优化，可以获取更好的图像质量。并且，本发明提供的基于光片照明的光场显微成像系统，在设计上具有易于搭建、成本低、高空间利用率以及紧凑的特点，获取的三维图像具有较高的时间分辨率，三维分辨率，高成像速度等优点。本发明采用光片照明的方式，能够避免空间分辨率上的牺牲，具体说来，通过光片照明的方式，仅在样本区域激发信号，避免了其他区域的噪声对图像的干扰，提高了图像的信噪比从而提高了分辨率；此外，通过光片照明的方式，使激发能量集中，避免的非信号区域能量的浪费。
本发明通过对光场显微镜进行改进和创新，尤其创造性的将光片荧光显微镜与光场显微镜结合起来，利用光片照明的优势来获取三维图像的分辨率，信噪比；利用光场探测的优势提高时间分辨率，使实时运动样本三维动态成像成为可能。相比较常规的光片荧光显微镜，本发明在不改变照明质量的情况下提供了更易于实现的方式。将激光器与其余部分分隔开来，使系统的搭建更加灵活，结构更加紧凑。与传统的光场显微镜，本发明还可以通过分束4F系统，调制模块，使探测功能更加丰富。通过调节分束模块，可以实现仅光场探测，仅普通光片显微探测，以及光场与光片同时探测的功能。例如，可以通过在4F系统中插入光学掩模等光学元件，可以进步丰富系统的功能，进行点扩散函数(PSF)调制等成像调制方法，进一步提高获取图像的质量。通过将中继元件替换为分光计，可以在不改变系统的情况下实现多波长荧光图像的探测，从而具有更大的应用范围。
一般的光片显微镜实现三维成像，需要通过扫描的方式，即在不同z轴位置进行成像，然后堆叠形成三维图像；这一方式在对运动样本进行三维成像时，不同z轴位置的所采集的图像并不在同一时间点上，因此不能恢复出正确的三维图像，除非使用非常快的扫描速度；然而依然存在以下问题，例如昂贵，例如常用的相机帧率和扫描装置帧率不能达到，再例如高帧率意味着曝光时间极短、信号十分微弱等。光场显微镜实现三维成像仅需对体积信号进行一次曝光即可回复该体积三维图像，这是光场显微镜发明的初衷和特点，但又带来了空间分辨率低的缺点。本发明旨在结合二者优点，弥补二者缺陷，性价比高。本发明将光片荧光显微镜与光场显微镜结合起来，对比单一的光片荧光成像技术，实现了其所不能达到的对运动样本的三维图像信息的真实采集；对比于光场荧光成像技术，拓展了其应用场景和最终获取图像的质量(尤其表现在分辨率和信噪比的提升上)，减少了其使用成本。
本发明中基于光片照明的高分辨率四维光场显微成像系统，其中的照明模块用于实现对样本的层析式照明；运动控制模块用于三个维度上移动样本，并实现对样本的扫描；探测采集模块用于对荧光样本进行成像，并优选提供了宽场探测和光场探测两个探测模式。照明模块中各系统元件光轴重合且垂直于探测光路光轴，以保证光片与物方焦平面共聚焦，确保图像质量；照明模块中，光纤准直器，光束整形模块，光片生成模块依次放置在光轴上，光纤用于将激光从激光器经过光纤准直器耦合至照明光路。光束整形模块包括可调节狭缝，第一透镜及第二透镜；其中，通过调节可调节狭缝的大小，可以在成像的过程中动态调节光片的厚度，从而获得不同照明厚度的图像；第一透镜及第二透镜同轴等焦放置，用于对激光光束的形状和大小进行调整，生成所需要参数的高斯光片。光片生成模块由单透镜和位移台构成，使用位移台可以调整单透镜在光轴上的位置，从而改变生成高斯光束瑞利范围的位置，实现灵活的成像区域；也就是说，通过控制光片生成模块中的柱透镜及位移器，可实现光片的厚度范围及瑞利范围位置可调，即，通过更换不同焦距的柱透镜，可实现生成光片厚度的范围。位移器用于控制柱透镜沿光轴移动，实现生成光片的瑞利范围位置可调节。另外，激光器与其他元件通过光纤连接，使系统更加模块化，摆放位置更加灵活。照明模块中的整形透镜采用短焦距小型透镜，使系统更加紧凑。光学元件均可安装在安装架(如，自制的小型可调整安装架上)，均可实现平行光轴和垂直光轴方向上的调节。运动控制模块中，三维控制模块(即三维运动模块)带动安装在其上的样品夹持元件从而带动样品在x，y，z三个方向上移动，用于选取不同的成像位置已经对样品进行扫描。三维运动模块可以至少包括三轴位移台和高速直线电机(如压电陶瓷电机等高速直线电机)，用于实现手动调节和高速扫描。样品夹持模块(即，样品夹持元件)可以通过磁铁固定样本，并且可以旋转改变样品与探测光路、以及照明光路的夹角，从而实现更加灵活的成像位置。
对于本发明所采用的具体组件构成的探测采集模块，该探测采集模块对样本荧光进行收集成像，并具有宽场探测和光场探测两种工作模式，既可以采集普通的光片成像数据，又可以采集高分辨率的四维光场图像数据。优选采用的分束4F模块，分束4F模块中分路模块位于光学4F系统内部，从而可以节约空间，使系统更加紧凑。本发明所优选采用的分束4F模块与常规的分束镜和4F光学系统相比，分束模块位于4F系统内部，使得系统更加紧凑，具有较高的空间利用率。分束光路(如分束镜等)可用翻转镜替换，在不需要光场探测与宽场探测同时进行的情况下，可以获得更高的信号强度(即，若要在光场探测的同时进行宽场探测，则使用分束光路；若不须同时探测，探测时仅使用其中的一路，则可以使用翻转平面镜，可以避免信号强度的损失)；可见，本发明可实现对待观测样本进行光场探测和/或宽场探测。光场探测模块中的微距摄像镜头(即微距镜头)作为中继镜，使系统易于搭建与调试，成本更低。在光场探测模块中，根据光场探测的具体功能要求，可以采用分光计或等同元件代替微距镜头，实现多波长荧光图像的同时探测(即，在不改变光路的情况下实现同时探测多种波长的荧光信号)，也可以根据实际情况和需要自行搭建多通道探测光路，例如在探测双标记样本图像时，使用分束镜、对应双通道的滤色片和双相机进行探测，与使用分光计相比可以拍摄更大的视野。
本发明旨在解决三维荧光成像技术中难以获取运动样本图像的难题。对于传统的光片荧光显微镜，解决这一类问题的常规方法是提高扫描的速度以及相机的帧率，从而获得近乎同相位的三维图像。但这个方法存在如下几个限制和缺点：1.相机的帧率和扫描的速度是有限制的。对于较快的运动过程，并不能通过扫描的方法实现近乎同相位的三维图像的重构，存在着较大的误差；2.帧率和扫描速率的提高，意味着曝光时间的减少，从而导致获取的图像信号强度以及信噪比的降低，从而导致获取的图像降质；3.满足要求的相机和扫描装置价格高昂。本发明采取了另一种创新的思路，通过与分辨率劣势而应用较少的光场探测相结合，在获取较好分辨率的同时避免了扫描的方式，解决了运动样本三维动态成像的问题。
本发明在研发过程中重点考虑具体光路的设计和相应的小型化集成，即如何在保持分辨率的情况下尽可能地减少元件数目以及如何将元件小型化并如何集成在现有的商品化的显微镜之上而对显微镜原有功能进行保留。对于保留元件的选取和相应的参数设计，本发明重点关注不同元件对图像质量的效果和对小型化的影响，最后经过权衡选取了最为重要的元件，实现了较少的数目和较好的成像质量，最终得到的光路设计如后文图1所示。此外，在本发明后文具体实施方式中，由于显微镜载物平台空间有限，为了充分的利用平台空间以及与显微镜相匹配，相应的定制的机械加工夹持元件进行了多次的设计与修改，最终使用了最小的体积实现了稳定的夹持和灵活可调谐的功能。
并且，本发明优选采用压电陶瓷直线电机，是考虑到光片厚度决定可恢复三维图像的z轴深度，对于薄样本如线虫等z轴信息仅有50um左右，不用使用扫描的方式即可达到较好的图像质量；而对于厚样本如斑马鱼心脏，z轴深度在200um左右，由于激光器输出能量一定，若增加光片深度会导致平均激发能量降低，信号强度减弱，影响图像质量。本发明采用快速扫描的方式实现对厚样本的成像，用于保持图像质量，同时为保持扫描过程中各图象信息位于同一时间节点上，可采用高速扫描的方式(例如，扫描频率大于20Hz/200um)。
本发明提供了一种紧凑的、易于实现的高质量实时三维荧光成像系统。本系统可以根据具体工作环境进行定制化搭建，既可以搭建成一个分离式的系统，也可以在现有的光学显微镜上进行改造并搭建，如应用实例所示。
本发明所选取光学元件充分利用有限的空间，在不改变系统性能的情况下，选取短焦距，小尺寸的光学元件，且易于购买。如光束整形模块，在维持整形比率不变的情况下，选择了各自最小焦距的透镜，实现了装置的小型化。分束4F系统，将分束模块结合在4F系统内部，充分利用了现有光路，减少了系统的体积，使系统更加紧凑。与分束模块放置在4F系统外相比，内部的分束模块可以使用更小尺寸的元件，从而节约了成本，具有较高的性价比。
综上，现有光场成像技术使用宽场照明的方式，图像的分辨率和信噪比受到影响。本发明引入光片照明的方式，提高了所恢复图像的信噪比和分辨率。并且，一般的光场显微镜不具备样本高速扫描的功能，本发明还优选使用快速的压电陶瓷电机实现样本高速扫描，以备大样本成像的需求。本发明具有较高的性价比，采用了较少的元件，和优化系统设计，操作简单，易于搭建实现方式灵活，具有很大的实用价值。并且，整个系统可进行小型化设计和可集成设计，使更易于推广、使用。
附图说明
图1是本发明提供的基于光片照明的高分辨率四维光场显微成像系统的原理图(图中的点划线为光轴示意)。
图2是本发明实施实例提供的基于光片照明的高分辨率四维光场显微镜的照明模块及运动控制模块结构示意图。
图3是本发明实施实例获得的线虫三维成像结果。
图4是本发明实施实例获得的斑马鱼心跳过程成像结果。
图5是本发明成像的恢复结果与一般的使用宽场照明的光场显微镜使用去卷积方法的恢复结果对比，其中左图为本发明系统的结果图，右图为同一样本使用一般光场显微镜在同一深度位置的回复结果。
图6是本发明实施实例中的样品夹持元件部分的放大示意图。
图中各附图标记的含义如下：11为多波长激光器、12为光纤、13为光纤为准直器，14为可调节狭缝，15为光束整形模块(其中，151为可更换透镜1，152为可更换透镜2)，16为柱透镜，31为显微物镜，32为滤色片，33为无限远校正套筒透镜，34为分束4F模块(其中，341为透镜1，342为分路模块或可翻转反射镜，343为透镜2，344为透镜3；例如，341可以为双胶合透镜，342为可翻转反射镜，343为双胶合透镜，344为双胶合透镜；另外透镜1、透镜2、透镜3三者完全相同)，35为微透镜阵列，36为微距镜头，37为探测器，41为样品夹持元件，42为压电陶瓷位移台，43为三维位移台，44为环境维持器；4101为连接元件，4102为玻片，4103为磁铁，4104为可旋转元件，4105为延长支杆。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明所提供的一种基于光片照明的高分辨率四维光场显微成像系统可以用于活体生物样本的观测与研究，尤其是既对空间分辨率有要求，又希望获得实时运动过程的生物研究，如线虫行为的观测，斑马鱼心脏的跳动研究，果蝇幼虫运动研究等。
本发明提供了一种基于现有显微镜的实现方法，充分利用现有显微镜的功能，在不改变显微镜结构的情况下，使显微系统的功能更加多样性；以现有技术中常用的正置荧光显微镜为例，基于本发明，仅需对现有正置荧光显微镜的照明端和探测端进行拓展和改进，即可在不改变正置显微镜功能的情况下实现高时空分辨率的光场探测。本发明的系统充分考虑了兼容性问题，所设计元件参数与尺寸在保持成像质量的情况下均采用所占空间达到最小。以本设计实例为例，所使用奥林巴斯BX-51正置显微镜的载物台仅有180mm×130mm左右大小，为实现在改载物台上集成相应的照明模块和运动控制模块，所使用的柱透镜尺寸均为20mm×20mm左右，采用定制的小型化机械加工元件实现对各光学元件的夹持，旨在减小所占用的体积，充分利用显微镜的载物台空间。而相应的对样本运动控制模块也采用了小型化的电机以及定制的小型化机械加工元件，同样置于显微镜载物台之上。用于扫描的压电陶瓷位移台大小仅为70mm×70mm×25mm，可以置于载物台之上用于实现上下扫描而不会与显微镜镜筒和其他元件发生冲突。用于粗调节以及定位的三维位移台，大小不超过50mm×50mm×50mm，通过定制的机械加工元件与其他部件和载物台相连接，且部分位于载物台之外。如图2所示。探测端光路的改造可根据不同显微镜的结构进行拓展，在显微镜相机口除根据系统设计的参数和各元件位置关系(图1探测端部分光路)进行搭建。同时，这也是一种易于实现，成本较低的实现方法。其照明与运动控制模块如图2所示。该图2所示意的一种组件设置方式充分利用了荧光显微镜的探测光路和显微镜载物台，实现本发明中的无限远成像模块和光片生成模块中的位移台。
其中，照明模块包括：激光器11，光纤12，光线准直头13，可调节狭缝14，柱透镜15，柱透镜16。激光器发射的激光耦合入光纤，再通过光纤准直头生成圆形光束，经过柱透镜15、16整形后形成压缩的椭圆光束入射柱透镜16，生成用于照明的高斯光片。通过调节可调节狭缝14，可以在成像过程中动态调整光片厚度。通过横向移动显微镜载物台，可以调节生成光片瑞利范围的位置，实现样本照明区域的选取。
运动控制模块包括：样品夹持元件41，三维位移台43，压电陶瓷位移台42，以及环境维持器44。通过调节三维位移台43可以调节样品的空间位置，对样品不同位置进行照明和探测。利用高速、高频率的压电陶瓷位移台42可以实现对样品超高速的扫描，获取实时三维图像。通过旋转样品夹持元件，可以调整样品的角度，实现对样品最佳形态的成像。
本实施实例基于现用正置荧光显微镜。通过小型化设计，充分利用了现有正置荧光显微镜的载物台51，宽场照明光路和部分探测光路，降低了系统搭建成本，拓展了系统的功能，也拓展了现有荧光显微镜的功能。其中图2所示52为正置荧光显微镜的显微物镜。
探测采集模块可以包括：反射镜，双胶合透镜341，可翻转反射镜342，双胶合透镜343、双胶合透镜344，微透镜阵列35，微距镜头36，科研级CMOS相机37.反射镜用于将镜筒光束反射到水平平面上，易于系统的搭建和调试。通过调整可翻转反射镜342，可以选择光场探测模式或是普通光片探测模式。可以将翻转透镜342替换为分束光路(如分束镜等)，从而同时实现光场探测和光片探测。在光场探测情况下，显微镜所成荧光图像经4F系统中继后成像至微透镜阵列35处，在微透镜阵列焦距处获取光场探测图像，经由微距镜头36中继后成像在科研级CMOS相机37上。普通探测是指一般显微镜的探测方式，即将探测传感器平面置于显微成像系统的像平面上进行图像信息的探测，也即宽场探测。
在本发明实例中，尽可能选取小尺寸、短焦距光学元件，并使用自制光学元件夹持具来减小系统体积，降低成本。如光束整形模块中，选取柱透镜151焦距为12.7mm，宽高为20mm，12mm；选取柱透镜152焦距为10mm，宽高为20mm，12mm。充分利用有限空间，实现所需要的照明光片。
另外，光场探测模块包括微透镜阵列35、中继镜头/分光计36、探测器37，宽场探测模块包括探测器37，二者所在光学系统中的位置可以互换(图1所示为其中一种设置方式)。
实施例1：
本实施例主要是使用该系统进行线虫运动成像以及三维重构。线虫是生物学中常用的一种模式生物，研究线虫运动以及相应的运动过程中的神经信号变化具有重要意义。使用常用的宽场显微镜，可以很好的捕捉到线虫的运动过程，但是分辨率、信噪比较低，无法满足对分辨率的要求。使用光片荧光显微镜进行观察，虽然可以获得较好的分辨率和信噪比，但是无法获取运动过程的三维荧光图像。使用本系统可以同时满足对线虫运动成像的空间分辨率和时间分辨率的需求，是相关生物问题研究的有工具。
图3是对使用红色荧光蛋白(RFP)标记了pan neuron神经元的线虫进行成像的结果。选取某一时间点进行拍摄并进行三维重构，进行分层展示。使用本系统，通过一次拍摄，样本的三维荧光信息均的到了有效的重构。图3展示了不同深度位置的恢复结果。具有较好的三维解析能力和较高的分辨率，完全可以满足对运动线虫神经元信号变化的分析。
图5展示了本发明成像的恢复结果与一般的使用宽场照明的光场显微镜使用去卷积方法的恢复结果对比，其中左图为本发明系统的结果图，右图为同一样本使用一般光场显微镜在同一深度位置的回复结果。这里选取了同样的三个点状结构进行分辨率的对比。从灰度轮廓图中可以看出，本系统完整的回复了三个分离点的信息，而一般的光场显微镜则并没有很好的分辨这三个点。
实施例2：
本实施例主要是使用该系统进行活体斑马鱼心脏跳动的成像以及三维重构。斑马鱼心脏在心脏科学和医学的研究中具有重要意义，通过对心肌细胞运动和心脏血液流动的研究，对相应的医学和病理学领域具有重要的启示意义。使用常用的宽场显微镜进行观察，由于斑马鱼心脏位于体内，存在组织散射和吸收，因此在分辨率上损失较大，不能达到细胞级别的观察。使用光片荧光显微镜进行观测，则仅能观察记录某一深度的荧光信号，不能对整个心脏三维的跳动过程进行记录和重构。本系统可以很好的解决这一问题，在不损失分辨率的情况下，可以对斑马鱼心脏的跳动过程进行记录和重构，利于相应的分析和研究。
图4是对使用绿色荧光蛋白(GFP)标记斑马鱼心肌细胞的心脏进行成像的结果。对某一帧光场图像进行三维重构和恢复，分别展示了三维渲染图和相应的xy，xz，yz面的投影视图。在具备较高信噪比的同时，解析出了细胞级别的心脏结构，具有较高的时间分辨率和空间分辨率。
此外，上述实施例所采用的夹持元件，如图6所示。图6表示了图2中运动控制模块的部分元件，图中，42为高速的压电陶瓷位移台示意，磁铁4103、可旋转元件4104、延长支杆4105共同组成了样品加持元件。可以通过若干枚可施放的小型磁铁4103将玻片4102固定在可旋转元件4104上(该可旋转元件4104内部嵌有磁铁；当需要固定玻片时，可将若干枚磁铁4103放在玻片上与可旋转元件4104相对的位置；当需要更换玻片时，可将若干枚磁铁4103从这些位置移除)，通过旋转可旋转元件4104即可控制不同的样品拍摄角度。延长支杆4105其设计长度可根据具体需求来灵活调整(例如，可根据具体应用场景选择某一个特定长度值)，可用于将样品放置在特定环境(如水缸)中。样品夹持元件与压电陶瓷位移台42通过连接元件4101相连。其中连接元件4101与延长支杆4105之间、可旋转元件4104与延长支杆4105之间均可以通过螺丝固定连接。连接元件4101、可旋转元件4104、延长支杆4105均为铝制机械加工元件，宽度均优选在5mm以内，具有体积小、质量轻的特点，可以充分利用显微镜载物台的有效空间。
本发明中所采用的各个功能组件均可采用市售商品。本发明中未详细说明的功能模块(如，运动控制模块中的三维运动子模块等)，均可参考现有技术构建，只要能够实现相同的功能即可；当然，也可以直接采用市售成熟产品。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于光片照明的高分辨率四维光场显微成像系统，其特征在于，包括光片照明模块、运动控制模块和探测采集模块，其中，
所述光片照明模块用于产生强度可调节、波长可调节、且厚度可调节的高斯光片，从而用于对待观测样本的层析照明；
所述运动控制模块用于实现所述待观测样本在三维空间中的运动，从而实现对所述待观测样本不同位置的光片照明和探测采集；
所述探测采集模块用于采集来自所述待观测样本的信号，对所述待观测样本进行光场探测，并利用图像传感器对采集得到的信号进行记录存储，该光场探测具体用于采集四维光场图像数据。
2.如权利要求1所述基于光片照明的高分辨率四维光场显微成像系统，其特征在于，所述探测采集模块还用于对所述待观测样本进行宽场探测，并同样利用图像传感器对采集得到的信号进行记录存储；所述宽场探测具体是用于采集普通的光片成像荧光数据。
3.如权利要求1或2所述基于光片照明的高分辨率四维光场显微成像系统，其特征在于，所述光片照明模块包括光轴均相互重合的多波长激光器(11)、光纤(12)、光纤准直器(13)、光束整形模块(15)和光片生成模块，其中，所述光纤(12)和所述光纤准直器(13)用于将所述多波长激光器(11)的出射光耦合至所述光束整形模块(15)；所述光束整形模块(15)包括依次位于光轴上的可调节狭缝(14)、可更换的第一透镜(151)、以及可更换的第二透镜(152)；其中，所述可调节狭缝(14)用于对耦合进该光束整形模块(15)的光束进行压缩，实现在成像过程中光片厚度的动态调整；所述可更换的第一透镜(151)与所述可更换的第二透镜(152)两者共焦平行放置，所述可更换的第一透镜(151)与所述可更换的第二透镜(152)独立的选自圆透镜或柱透镜，通过选择不同焦距的圆透镜或柱透镜实现对光束不同程度、不同维度的压缩与扩束；
优选的，经过所述光束整形模块(15)整形后得到的光束再经过所述光片生成模块形成用于照明的一束压成片状的高斯光束，得到高斯光片。
4.如权利要求1或2所述基于光片照明的高分辨率四维光场显微成像系统，其特征在于，所述光片生成模块包括位于光轴上的可更换的柱透镜(16)及位移器；其中，所述柱透镜(16)用于控制生成的所述高斯光片的厚度；所述位移器则用于控制所述柱透镜(16)沿光轴的移动，从而控制生成的所述高斯光片的瑞利范围位置。
5.如权利要求2所述基于光片照明的高分辨率四维光场显微成像系统，其特征在于，所述探测采集模块包括无限远成像模块、分束4F模块(34)、光场探测模块、以及宽场探测模块；其中，
所述无限远成像模块依次包括显微物镜(31)、滤色片(32)以及无限远校正套筒透镜(33)，这些显微物镜(31)、滤色片(32)以及无限远校正套筒透镜(33)依次放置在与高斯光片平面相垂直的第二光轴上；
所述分束4F模块(34)包括三个全同透镜以及分路模块(342)，记这三个全同透镜分别第一透镜(341)、第二透镜(343)、第三透镜(344)，则所述第一透镜(341)与所述第二透镜(343)两者同轴等焦放置，它们的光轴与所述第二光轴重合；所述第一透镜(341)与所述第二透镜(343)的光轴还经过所述分路模块(342)，且所述分路模块(342)放置在所述第一透镜(341)与所述第二透镜(343)之间，所述分路模块(342)具体为分束光路或翻转平面镜，用于将光束分为两路或者使光束发生90°偏折；所述第三透镜(344)的光轴与所述第二光轴相垂直，经过所述分束光路得到的两路光束相互垂直；
对于所述光场探测模块及所述宽场探测模块，其中任意一个位于所述分束4F模块(34)中所述第三透镜(344)后方的光路上，另一个位于所述分束4F模块(34)中所述第二透镜(343)后方的光路上；其中，所述光场探测模块包括依次位于所述第三透镜(344)或所述第二透镜(343)后方光路且均位于所述第三透镜(344)光轴或均位于所述第二透镜(343)光轴上的微透镜阵列(35)、微距镜头(36)及探测器(37)，所述微距镜头(36)还能够被分光计或滤光片代替；所述宽场探测模块则包括位于所述第二透镜(343)或所述第三透镜(344)后方光路上的探测器(37)。
6.如权利要求5所述基于光片照明的高分辨率四维光场显微成像系统，其特征在于，在所述分束4F模块(34)的傅里叶平面上还设置有光学掩模。
7.如权利要求1所述基于光片照明的高分辨率四维光场显微成像系统，其特征在于，所述运动控制模块具体包括样品夹持元件及三维运动模块；其中，所述样品夹持元件用于固定所述待观测样本，所述三维运动模块则用于控制所述待观测样本实现空间三维方向上的运动；
优选的，所述三维运动模块包括三维位移台、以及能够驱动该三维位移台沿空间三个两两相互垂直的方向独立运动的直线电机；这些直线电机均优选为压电陶瓷电机。
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