CN109540814B - 一种基于多光谱成像技术的蝴蝶兰灰霉病早期检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于多光谱成像技术的蝴蝶兰灰霉病早期检测方法，属于病原性真菌检测技术领域。本发明从灰霉病病原、症状、传播途径和发病条件进行研究分析，利用多光谱成像技术获取蝴蝶兰花瓣信号，通过两层筛选的方式：先用图像分割和预处理处理筛选已发病出现病斑的样本；而对于感染病菌后还未出现病斑的样本，经由数据分析结合化学计量学方法建立分析模型，提取特定波长范围内灰度图像，可视化感染部位，达到在发病早期，根据异常光谱检测出受侵染花瓣，实现将感染植株从未感染植株中快速、有效地筛选出来。此法具有操作简便、快速、无破损、检测成本较低等优点。
Description
技术领域
本发明属于病原性真菌检测技术领域，具体涉及一种基于多光谱成像技术的蝴蝶兰灰霉病早期检测方法。
背景技术
蝴蝶兰（Phalaenopsis）为兰科（Orchidaceae）蝴蝶兰属多年生草本植物，原产于热带、亚热带地区，蝴蝶兰株型优美、花色丰富、花姿优雅，素有“兰中皇后”之美誉，具有极高的观赏价值和经济价值及其可观的盆栽特性，也是重要的出口花卉，在国内外花卉市场上备受人们的青睐。但是在生产过程中，由于病虫害的危害，经常造成蝴蝶兰观赏性降低、商品性打折。尤其一些真菌、细菌性病害，以其病原多、传播快、危害重、潜伏期长等特征，常导致全株枯萎或死亡，失去观赏价值，使蝴蝶兰品质达不到出口要求，严重危害蝴蝶兰的工厂化生产，造成巨大经济损失。
灰霉病是蝴蝶兰上常见的真菌病害，病原菌无性态为灰葡萄孢菌Botrytis cinerea Pers，早春或秋冬为发病高峰期，主要危害蝴蝶兰的花瓣，发病初期在花瓣上出现水浸状的小斑点，随后变成褐色，并逐渐扩大，发病后期病斑相互融合可形成大型病斑，引起花枯，湿度大时可见花上有灰色霉菌（依据从发病初期到病斑形成的症状，可以判定是灰葡萄孢菌）。灰霉病是一类世界性病害，该病的扩展是渐进式的，植株受侵后，病菌能定植下来，随着植株生长而扩展。除了感染蝴蝶兰，还能够感染百合、海棠、玫瑰和芍药等其他花卉，并造成严重经济损失。因此，在蝴蝶兰的生产过程中迫切需要一种便捷、快速、无污染的灰霉病检测方法。
多光谱成像技术是近年来广泛采用的一种快速无损检测技术，与传统高光谱成像技术相比，多光谱成像技术避免了海量的光谱特征数据，更适合于品质实时在线检测。多光谱能够在病原菌发病前检测出感染植株，且通过灰度图将病斑可视化，控制或降低病害的发生，是一套行之有效的防治措施。因此本发明目的在于提供一种快速无损的检测方法，为多光谱成像在花卉品质的无损、实时、自动检测领域提供技术支持，从而提高花卉的观赏价值、经济价值、社会价值。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前并没有一种有效的对蝴蝶兰灰霉病进行检测的方法的问题，提供一种基于多光谱成像技术的蝴蝶兰灰霉病早期检测方法，以实现对蝴蝶兰灰霉病的快速鉴别，提高蝴蝶兰对病原性真菌的防治技术，有利于生产管理。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种基于多光谱成像技术的蝴蝶兰灰霉病早期检测方法，所述方法具体步骤如下：
步骤一：制备综合PDA培养基：称取200±2g马铃薯，去皮，切块，放入蒸馏水中煮沸30min，用八层纱布过滤，向滤液中加入琼脂20±0.0001g，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入磷酸二氢钾3±0.0001g，硫酸镁1.5±0.0001g，葡萄糖20±0.0001g，维生素B110±0.0001mg，搅拌均匀，冷却20 min再补足水分至1000 mL，装入锥形瓶，加塞、用封口膜封住瓶口，121℃灭菌20分钟后取出，冷却后放4℃冰箱贮存，备用；
步骤二：将灰葡萄孢菌接种到综合PDA培养基上，在26℃培养箱中培养7天，备用；
步骤三：挑选花期（长势一致）相同、健康的“大辣椒”蝴蝶兰，在相对湿度为80%，温度为25±2℃，有散光的环境下培养；将培养好的灰葡萄孢菌用无菌水冲洗，制成菌悬液来侵染蝴蝶兰花瓣，1天后再次侵染，同时设置未浸染组，侵染组和未浸染组分开培养；
步骤四：侵染两次之后，使用多光谱成像技术获取未侵染和侵染蝴蝶兰的光谱图像,在光谱系统上，通过阈值分割，将感兴趣区域用红色标记，背景用绿色标记，提取感兴趣区域光谱值；
步骤五：对步骤四得到的蝴蝶兰光谱图像进行处理，将花瓣图像信息的灰度值转换成反射率值，对比侵染组和未侵染组花瓣的光谱反射值；对于侵染组，若花瓣RGB图像上病斑已显现，通过选取病斑特征最明显波长下的图像进行图像预处理及分割处理，提取病斑区域灰度图，并通过该区域的光谱反射值确定是否为灰霉病害；若RGB图像上病斑未显现，执行步骤六；
步骤六：获取光谱信息之后，采用支持向量机回归法对上述未出现病斑的侵染组样本建立蝴蝶兰与所对应光谱信息的分析模型，同时提取特定波长范围内的灰度图，与未侵染组灰度图进行对比，寻找感染部位。
本发明相对于现有技术的有益效果是：利用多光谱成像技术具有无损、快速、无污染等优点，该方法可在发病前，根据异常光谱检测出受侵染花瓣，鉴别病原菌侵染和未被侵染的蝴蝶兰，除此之外，在特定波长下的灰度图，可加强病斑可视化，不破坏样品，而且不需要从形态学和分子生物学等传统手段进行鉴定，由所得花瓣信息与对应的光谱图像信息经由数据分析结合化学计量学方法建立分析模型，不需要任何样品预处理，实现对早期病原菌侵染蝴蝶兰的快速无损检测。
附图说明
图1为侵染组和未侵染组蝴蝶兰的平均光谱吸收图；
图2为未侵染组蝴蝶兰在660~970 nm的病斑判别图；
图3为侵染组病斑显现蝴蝶兰在660~970 nm的病斑判别图；
图4为侵染组病斑未显现蝴蝶兰在660~970 nm的病斑判别图；
图5为侵染组和未侵染组蝴蝶兰预测集的实际分类和预测分类图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明的原理为：本发明从灰霉病病原、症状、传播途径和发病条件进行研究分析，利用多光谱成像技术获取蝴蝶兰花瓣信号，通过两层筛选的方式：先用图像分割和预处理处理筛选已发病出现病斑的样本；而对于感染病菌后还未出现病斑的样本，经由数据分析结合化学计量学方法建立分析模型，提取特定波长范围内灰度图像，可视化感染部位，达到在发病早期，根据异常光谱检测出受侵染花瓣，实现将感染植株从未感染植株中快速、有效地筛选出来。此法具有操作简便、快速、无破损、检测成本较低等优点，有利于提高蝴蝶兰对病原性真菌的防治技术以及园艺植物的观赏价值和经济价值，可满足园艺上花卉病原菌侵染大规模快速无损检测的需要。
本发明在选取样本时，均选用花瓣外表完整、无任何可见缺陷（如病斑、黑斑、破损等）的均一样本，健康组不侵染病菌，单独培养，一直培养到侵染组出现病斑，再重新筛选健康组中依旧无任何可见缺陷的样本，作为最终健康组，这样就保证了所用健康组样本是未染病的。
本发明在整个检测过程中不需要对花瓣进行任何前处理，用于侵染的蝴蝶兰样品选择隐藏性更高、更具有代表性的深红色蝴蝶兰，所用的蝴蝶兰均处于同一生长期，且花瓣表面没有任何病斑、破损等可视缺陷；多光谱成像技术做到了在样品整体外观一致情况下，对蝴蝶兰花瓣灰霉病的精确鉴别。蝴蝶兰花瓣被病原菌侵染之后1天内，肉眼观察花瓣表面并未出现明显病症，通过多光谱成像技术结合图像处理方法能够有效获取花瓣表面被病菌侵染的区域和侵染程度。根据花瓣受灰霉病侵染后的发病规律，24h即可表现出外部症状，产生直径约0.15 cm小型半透明圆点，随后变成褐色，因此，本发明在侵染之后1天内进行光谱采集。对已出现较为明显病斑的花瓣，通过选取病斑特征最明显波长下的图像进行图像预处理及分割处理，提取病斑区域，并通过该区域的光谱反射值确定是否为灰霉病害。若花瓣上未出现明显病斑，多光谱成像技术通过获取蝴蝶兰花瓣表面光谱信息，并结合化学计量方法，实现对蝴蝶兰灰霉病的快速筛选和鉴别，并能在特定波长范围内将感染部位可视化。
本发明的检测方法可为开发多光谱成像快速无损检测患有灰霉病蝴蝶兰的工业化智能分选设备提供理论基础，及时筛选出种植、运输过程中已被侵染的蝴蝶兰，防止病原性真菌的蔓延，同时减少经济损失，提高园艺植物的观赏价值和经济价值，同时为其他花卉植物的无损检测设备的研发提供技术支持。
具体实施方式一：本实施方式记载的是一种基于多光谱成像技术的蝴蝶兰灰霉病早期检测方法，所述方法具体步骤如下：
步骤一：制备综合PDA培养基：称取200±2g马铃薯，去皮，切块，放入蒸馏水中煮沸30min，用八层纱布过滤，向滤液中加入琼脂20±0.0001g，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入磷酸二氢钾3±0.0001g，硫酸镁1.5±0.0001g，葡萄糖20±0.0001g，维生素B110±0.0001mg，搅拌均匀，冷却20 min再补足水分至1000 mL，装入锥形瓶，加塞、用封口膜封住瓶口，121℃灭菌20分钟后取出，冷却后放4℃冰箱贮存，备用；
步骤二：将灰葡萄孢菌接种到综合PDA培养基上，在26℃培养箱中培养7天，备用；
步骤三：挑选花期（长势一致）相同、健康的“大辣椒”蝴蝶兰，在相对湿度为80%，温度为25±2℃，有散光的环境下培养；将培养好的灰葡萄孢菌用无菌水冲洗，制成菌悬液来侵染蝴蝶兰花瓣，1天后再次侵染，同时设置未浸染组，侵染组和未浸染组分开培养；
步骤四：侵染两次之后，使用多光谱成像技术获取未浸染和侵染蝴蝶兰的光谱图像,在光谱系统上，通过阈值分割，将感兴趣区域（即样本）用红色标记，背景用绿色标记，提取感兴趣区域光谱值；
步骤五：对步骤四得到的蝴蝶兰光谱图像进行处理，将花瓣图像信息的灰度值转换成反射率值，对比侵染组和未侵染组花瓣的光谱反射值；对于侵染组，若花瓣RGB图像上病斑已显现，通过选取病斑特征最明显波长下的图像进行图像预处理及分割处理，提取病斑区域灰度图，并通过该区域的光谱反射值确定是否为灰霉病害；若RGB图像上病斑未显现，执行步骤六；
步骤六：获取光谱信息之后，采用支持向量机回归法对上述未出现病斑的侵染组样本建立蝴蝶兰与所对应光谱信息的分析模型，同时提取特定波长范围内的灰度图，与未浸染组灰度图进行对比，寻找感染部位。
具体实施方式二：具体实施方式一所述的一种基于多光谱成像技术的蝴蝶兰灰霉病早期检测方法，步骤四中，所述的多光谱成像技术的光谱波段包含405~970 nm范围内19个典型特征波长，通过图像分割提取RGB与灰度图，数据处理快速、方便，同时能将病斑可视化。
具体实施方式三：具体实施方式二所述的一种基于多光谱成像技术的蝴蝶兰灰霉病早期检测方法，所述的19个典型特征波长为405nm，435nm，450nm，470nm，505nm，525nm，570nm，590nm，630nm，645nm，660nm，700nm，780nm，850nm，870nm，890nm，910nm，940nm和970nm。
实施例1：
实验样本：从花市买来处于花期长势一致的大辣椒蝴蝶兰，挑选出花瓣表面没有病斑、破损等可视缺陷的植株，A组为健康组，B组为侵染组。在25℃±2℃，有散光，相对湿度80%左右的环境下分开培养。
检测步骤如下：
（1）制备综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基（简称综合PDA培养基）
称取200g马铃薯，去皮，切块，放入蒸馏水中煮沸30min，用八层纱布过滤，滤液加入琼脂20g，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，葡萄糖20g，维生素B110mg，搅拌均匀，冷却20 min后再补足水分至1000 mL，装入锥形瓶，加塞、包扎，121℃灭菌20分钟后取出，冷却后放4℃冰箱贮存备用；
（2）病原菌的培养
灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），BNCC 338228购自北纳生物菌种保藏中心，接种到综合PDA培养基上，26℃培养7天，备用。
（3）病原菌侵染蝴蝶兰花瓣
在超净工作台中，将培养好的灰葡萄孢菌用无菌水从PDA培养基上冲洗下来，制成菌悬液，取直径为6mm的圆形滤纸片蘸取菌悬液（完全浸透且无液滴滴落），将该滤纸片摆放在蝴蝶兰最大的花瓣上，每片花瓣上摆放2个纸片，放在左右对称的位置。1天后重复侵染。
（4）蝴蝶兰花瓣光谱图像获取与处理
a、光谱图像获取
侵染完成后，随机从A组中摘取100枚、B组选取200枚花瓣，用多光谱测量仪（Videometer A/S，Hørsholm，丹麦，其光谱范围为405-970 nm）获取上述花瓣样本和背景信息。
b、光谱图像预处理
获取的光谱图像首先用VideometerLab 软件进行去噪处理，然后采用典型判别分析（CDA）和阈值设定完成背景剔除和图像分割（将感兴趣区域用红色标记，背景用绿色标记，提取感兴趣区域光谱值），经过反射率动态定标板将花瓣图像信息的灰度值转换成反射率值。对比两组花瓣在405-970 nm范围内的光谱反射值，如图1，
对于B组，若花瓣RGB图像上病斑已显现，通过选取病斑特征最明显波长下的图像进行图像预处理及分割处理，提取病斑区域灰度图，如图3，并通过该区域的光谱反射值确定是否为灰霉病害；若RGB图像上病斑还未显现，实施步骤（5）。
（5）蝴蝶兰灰霉病检测模型建立
获取光谱信息之后，采用支持向量机回归法（SVM）对上述未出现病斑的侵染组样本建立蝴蝶兰与所对应光谱信息的分析模型。本方法采用一个简单的高斯函数，径向基函数（RBF）作为SVM的核函数，所得最优参数分别为边界参数c取值2和内核参数g取值2，并建立预测模型。A、B两组分别随机分配30和60个样本作为建模集，其余样本作为预测集。同时提取特定（本实施例中为660~850nm）波长范围内的灰度图，如图4，与健康组灰度图进行对比，如图2，寻找感染部位，从而提高检测准确度。
（6）模型验证
利用建立的模型，对预测集样品进行预测，在建模集中鉴别的正确率为98.10%，在预测集中的鉴别正确率为97.78%，如图5。表明所建立的模型具有较好的预测能力，本方法在蝴蝶兰灰霉病早期快速无损鉴别应用上可行。
表1未侵染和侵染蝴蝶兰建模和预测样本的检测结果。
从图1可看出，侵染组、健康组在405-660 nm之间没有明显的光谱区分，但在660-970nm范围，侵染组的吸收显著低于健康组。依据图1，图2、图3和图4分别提取了健康组、侵染组病斑已显现和侵染组病斑未显现的蝴蝶兰花瓣在特征光谱660-970 nm范围内的灰度图，图2蝴蝶兰未受灰葡萄孢菌感染，在全波长范围内没有病斑出现，为对照组，图3在660-970nm均出现病斑，且在660-850nm范围更加明显，850-970nm病斑弱化，与光谱反射差异范围一致。由于大辣椒蝴蝶兰颜色较深，受病菌感染后，初期发病斑点在肉眼下很难发现，但在特定波长范围下的灰度图中加强后，可以明显看到病斑。图4提取了侵染后病斑还未显现蝴蝶兰在660-850nm的灰度图，从图中可以清晰的看出RGB图完好无损，但灰度图中病斑被加强从而可视化。这种早期的检测需要提取健康组和侵染组的光谱值，并用原始数据进行SVM建模分析，计算机模型建立结果如表1所示，建模集和预测集的准确率分别达到98.10%和97.78%，而图5可明确看出预测集的错判情况。结果表明本方法能够实现对蝴蝶兰灰霉病早期的快速无损检测。
Claims (3)
1.一种基于多光谱成像技术的蝴蝶兰灰霉病早期检测方法，其特征在于：所述方法具体步骤如下：
步骤一：制备综合PDA培养基：称取200±2g马铃薯，去皮，切块，放入蒸馏水中煮沸30min，用八层纱布过滤，向滤液中加入琼脂20±0.0001g，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入磷酸二氢钾3±0.0001g，硫酸镁1.5±0.0001g，葡萄糖20±0.0001g，维生素B110±0.0001mg，搅拌均匀，冷却20 min再补足水分至1000 mL，装入锥形瓶，加塞、用封口膜封住瓶口，121℃灭菌20分钟后取出，冷却后放4℃冰箱贮存，备用；
步骤二：将灰葡萄孢菌接种到综合PDA培养基上，在26℃培养箱中培养7天，备用；
步骤三：挑选花期相同、健康的蝴蝶兰，在相对湿度为80%，温度为25±2℃，有散光的环境下培养；将培养好的灰葡萄孢菌用无菌水冲洗，制成菌悬液来侵染蝴蝶兰花瓣，1天后再次侵染，同时设置未浸染组，侵染组和未浸染组分开培养；
步骤四：侵染两次之后，使用多光谱成像技术获取未浸染和侵染蝴蝶兰的光谱图像,在光谱系统上，通过阈值分割，将感兴趣区域用红色标记，背景用绿色标记，提取感兴趣区域光谱值；
步骤五：对步骤四得到的蝴蝶兰光谱图像进行处理，将花瓣图像信息的灰度值转换成反射率值，对比侵染组和未侵染组花瓣的光谱反射值；对于侵染组，若花瓣RGB图像上病斑已显现，通过选取病斑特征最明显波长下的图像进行图像预处理及分割处理，提取病斑区域灰度图，并通过该区域的光谱反射值确定是否为灰霉病害；若RGB图像上病斑未显现，执行步骤六；
步骤六：获取光谱信息之后，采用支持向量机回归法对上述未出现病斑的侵染组样本建立蝴蝶兰与所对应光谱信息的分析模型，同时提取特定波长范围内的灰度图，与未浸染组灰度图进行对比，寻找感染部位。
2.根据权利要求1所述的一种基于多光谱成像技术的蝴蝶兰灰霉病早期检测方法，其特征在于：步骤四中，所述的多光谱成像技术的光谱波段包含405~970 nm范围内19个典型特征波长，通过图像分割提取RGB与灰度图。
3.根据权利要求2所述的一种基于多光谱成像技术的蝴蝶兰灰霉病早期检测方法，其特征在于：所述的19个典型特征波长为405nm，435nm，450nm，470nm，505nm，525nm，570nm，590nm，630nm，645nm，660nm，700nm，780nm，850nm，870nm，890nm，910nm，940nm和970 nm。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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