CN109536471B - 一种抗结核分枝杆菌的靶点及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗结核分枝杆菌的靶点及其应用，属于细胞生物学领域。本发明首次发现位于PknG上的如SEQ ID NO.1所示类泛素结构域，可以通过与E2相互作用抑制NF‑κB天然免疫信号通路活化从而促进结核分枝杆菌的胞内存活过程。本发明成果可为临床结核病药物的开发提供新靶点和新思路，也可以直接应用于科研领域指导开发基于PknG类泛素结构域的化学抑制剂、多肽等商业化产品。

Description

一种抗结核分枝杆菌的靶点及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗结核分枝杆菌的靶点及其应用，属于细胞生物学领域。

背景技术

结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的一种古老疾病，它致今仍是严重威胁全球人类健康的传染病之一。以往研究结果表明：结核分枝杆菌分泌的真核样丝氨酸/苏氨酸激酶(PknG)进入细胞后可以通过调控宿主天然免疫反应促进病原菌的胞内存活。与野生型Mtb相比，敲除了PknG的Mtb在巨噬细胞内的存活能力显著下降，但PknG调控宿主天然免疫的具体分子机制尚不清楚。

发明内容

本发明通过生物信息学分析等手段发现，Mtb PknG中存在一个与真核细胞内泛素蛋白结构类似的全新结构域：类泛素结构域。并进一步通过预测及实验证实该结构域与真核细胞中的泛素结合酶E2相互作用扰乱宿主的天然免疫信号通路，进而促进结核分枝杆菌的胞内存活。经分析发现，该结构域主要存在于结核分枝杆菌中，而在人体有益菌中并不存在。因此，类泛素结构域可作为潜在的抗结核药物新靶点。以该结构域为靶点研究的抑制剂或药物可以有效的抑制结核分枝杆菌与宿主的相互作用，从而抑制结核分枝杆菌的胞内存活；同时该类抑制剂或药物可以特异性对结核分枝杆菌发挥抑制作用而不影响体内益生菌的存活。

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种PknG蛋白结构域，所述结构域含有：

(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)在(1)所示序列基础上突变除第51位氨基酸以外的氨基酸位点、且具有与(1)90％以上相似性并具有E2或泛素结合活性的(1)的衍生多肽或其类似物。

本发明的第二个目的是提供所述PknG蛋白结构域在制备致病菌抑制剂方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述PknG蛋白结构域来源于结核分枝杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述致病菌包括但不限于结核分枝杆菌、链霉菌。

本发明的第三个目的是提供所述PknG蛋白结构域在制备抗结核病药物方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是指，将SEQ ID NO.1所示的PknG蛋白结构域作为药物作用靶点，制备可与之靶向结合的药物。

在本发明的一种实施方式中，所述药物具有与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第51位谷氨酸，或含有第51位谷氨酸的氨基酸序列的结合力。

本发明的第四个目的是提供一种筛选抗结核药物的方法，所述方法应用SEQ IDNO,1所示的结构域，能够与该结构域结合的药物即为筛选的目标药物。

有益效果：本发明提供的类泛素结构域可作为抗结核药物的新靶点，同时以该结构域为靶点设计的抗结核药物可以特异性对结核分枝杆菌存活发挥抑制作用，而不影响体内益生菌的存活。

附图说明

图1为PknG与多种泛素结合酶E2蛋白相互作用效果图；

图2(A)为类泛素结构域与泛素结合酶E2互作能力；类泛素结构域与泛素结合酶E2互作的关键位点；其中，PknG-GFP，带有GFP标签的PknG；PknG(140-234)-GFP，带有GFP标签类泛素结构域的PknG蛋白；PknG△(140-234)-GFP，带有GFP标签类泛素结构域140-234氨基酸缺失的PknG蛋白；

图2(B)为Western Blotting检测免疫共沉淀产物结果；其中，GST，GST标签蛋白；PknG(140-234)，PknG类泛素结构域蛋白；PknG(140-234)E190A，第190位谷氨酸突变为丙氨酸的PknG类泛素结构域蛋白；

图3(A)为PknG中通过促进TRAF2和TAK1降解抑制NF-κB天然免疫信号通路活化的结构域验证；其中，PknG，表达野生型PknG的实验组；K181M，表达第181位赖氨酸突变为甲硫氨酸的PknG突变体的实验组，该蛋白丧失激酶活性；PknG E190A，表达第190位谷氨酸突变为丙氨酸的PknG的实验组，该蛋白丧失与E2互作的能力；

图3(B)为不同蛋白对宿主内TRAF2和TAK1蛋白降解能力；其中，WT Mtb，野生型结核分枝杆菌；△PknG，敲除PknG的Mtb；△PknG：PknG，敲除PknG基因后又回补野生型PknG基因的Mtb(相当于能够表达野生型PknG的Mtb)；△PknG：PknG E190A，敲除PknG基因后又回补了第190位谷氨酸突变为丙氨酸的PknG基因的Mtb(即表达PknG E190A突变蛋白的Mtb)；

图3(C)为体外泛素化实验证明PknG促进TRAF2和TAK1蛋白在体外K48泛素化；其中，GST，GST标签蛋白；GST-PknG，带有GST标签的PknG；GST-PknG E190A，带有GST标签的第190位谷氨酸突变为丙氨酸的PknG突变蛋白。

图4为不同结核分枝杆菌的胞内存活能力；其中WT Mtb为野生型结核分枝杆菌；△PknG，敲除PknG的Mtb；△PknG：PknG，敲除PknG基因后又回补了野生型PknG基因的Mtb，即能够表达野生型PknG的Mtb；△PknG：PknG E190A，敲除PknG基因后又回补了第190位谷氨酸突变为丙氨酸的PknG突变的Mtb(即表达PknG E190A突变蛋白的Mtb)。

具体实施方式

实施例1结核分枝杆菌分泌蛋白PknG

一段类泛素结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。该结构域存在于结核分枝杆菌效应蛋白PknG(Gene ID:886397编码)(氨基酸序列140位-234位)，可以与泛素结合酶(E2)相互作用促进结核分枝杆菌的胞内存活过程。

实施例2 PknG通过类泛素结构域与泛素连接酶(E2)互作

将E2s基因,包括UbcH5a(Gene ID:7321)，UbcH5b(Gene ID:7322),UbcH5c(GeneID:7323)和UbcH7(Gene ID:7332)，分别克隆到pcDNA6A中，将PknG及其截短体基因(包括编码类泛素结构域的基因，及PknG△(140-234)蛋白的基因)分别构建到p3xflag CMV14和pEGFP-N1质粒中。将上述包含有E2基因的PcDNA6A质粒分别与p3xflag CMV14-PknG共转染到HEK293T细胞中，将细胞置于37摄氏度5％二氧化碳培养箱中培养24小时；转染24小时后，吸取细胞培养基，并用PBS至少洗涤细胞两次；加入1ml细胞裂解液冰上充分裂解细胞；将细胞裂解产物转移到1.5ml离心管中，4摄氏度条件下14，000rpm离心5分钟；将上清转移到新的离心管中，加入ANTI-

M2 Affinity Gel(Sigma)或Anti-Myc magnetic beads(Santa Cruz)进行免疫共沉淀实验；将免疫共沉淀产物通过Western Blotting检测。

结果显示，带有Flag标签的PknG蛋白与泛素偶联酶UbcH5a，UbcH5b,UbcH5c和UbcH7四个蛋白均存在不同程度的相互作用，其中PknG与UbcH7的作用略强一些(图1)。采用PknG-GFP、PknG(140-234)-GFP、PknG△(140-234)-GFP重复免疫共沉淀实验，结果显示，PknG的类泛素结构域可与E2互作，而缺失了类泛素结构域的PknG与E2的互作能力丧失。该结果说明PknG与E2的互作依赖其类泛素结构域(PknG第140位-234位氨基酸)(图2A)；进一步地，对PknG类泛素结构域第190位(SEQ ID NO.1第51位氨基酸)进行点突变，将谷氨酸替换为丙氨酸，记为通过Pull-dowm实验确认PknG的第190位谷氨酸(即SEQ ID NO.1所示类泛素结构域的第51位氨基酸)是PknG蛋白与E2的互作的关键位点(图2B)。

实施例3 PknG通过促进TRAF2和TAK1降解抑制NF-κB天然免疫信号通路活化依赖其类泛素结构域

使用双荧光素酶报告基因系统检测NF-κB天然免疫信号通路活化情况，具体方法如下：在HEK293T细胞中转染1μg pNF-κB-Luc和50ng pRL-TK，同时共转染1μg PknG(p3xflag CMV14-PknG)或激酶活性丧失的点突变体PknG K181M或与E2互作能力丧失的点突变体PknG E190A，转染p3xflag CMV14空载体的细胞作为对照；转染20小时后，在细胞培养基中加入20ng/ml TNFα(Invitrogen)继续培养6小时；裂解细胞，使用双荧光素酶报告系统检测试剂盒(Promega)检测NF-κB天然免疫信号通路活化情况。结果显示，PknG可以使NF-κB天然免疫信号通路活化能力被抑制50％，同时PknG激酶活性丧失的突变体K181M同样可以使NF-κB天然免疫信号通路活化能力被抑制50％，抑制能力与野生型PknG相似，而与E2互作能力丧失的PknG突变体E190A对NF-κB信号通路活化没有影响(图3A)。该结果说明PknG抑制NF-κB活化的功能依赖其类泛素结构域及其与E2的互作，而不依赖于PknG的激酶活性。

分别用野生型结核分枝杆菌(WT Mtb)、敲除PknG的Mtb(△PknG：PknG)、PknG类泛素结构域第190位谷氨酸突变为丙氨酸的Mtb(△PknG：PknG E190A；该突变不再与E2相互作用)感染巨噬细胞U937，分别在感染0、12、24小时收取细胞；裂解细胞并进行Western blot蛋白检测。

结果显示，结核分枝杆菌中的PknG蛋白可以促进宿主细胞内TAK1和TRAF2蛋白的降解，该功能依赖其与E2的相互作用(图3B)。进一步地，建立体外泛素化体系，将泛素蛋白、泛素活化酶(E1)、泛素转移酶UbcH7(E2)、带有Flag标签的TAK1(或TRAF2)(底物)分别与GST、GST-PknG或与E2互作能力丧失的点突变体PknG E190A在30摄氏度条件下共孵育1小时，然后Western Blot检测蛋白的泛素化水平。结果显示PknG可以作为E3连接酶通过与E2互作促进底物TAK1和TRAF2的泛素化降解，从而抑制宿主NF-κB天然免疫信号通路活化促进自身存活(图3B、3C)。

实施例4 PknG类泛素结构域敲除的结核分枝杆菌的胞内存活能力显著下降

分别用野生型结核分枝杆菌(Mtb)(WT Mtb),PknG敲除Mtb(△PknG)，PknG敲除Mtb(△PknG：PknG),PknG类泛素结构域突变Mtb(△PknG：PknG E190A)感染巨噬细胞U937，分别在感染2、4、8、24小时收取细胞；加入0.5％SDS裂解10分钟；吸取裂解液梯度稀释涂平板，计算Mtb克隆数。

结果显示，感染24小时后，野生型Mtb在巨噬细胞内存活的菌数(CFU)为9×10⁴～1×10⁵个；而PknG敲除的Mtb在同样条件下在巨噬细胞内存活的菌数只有4×10⁴个；Mtb(△PknG：PknG)菌株在巨噬细胞内存活的菌数与野生型无明显差异为9×10⁴个；而Mtb(△PknG：PknG E190A)菌株在巨噬细胞内存活的菌数为6×10⁴个，数量比野生Mtb的存活数低40％。该结果说明PknG在促进结核分枝杆菌胞内存活过程中发挥重要作用，该功能依赖其类泛素结构域及其与E2的互作(图4)。

实施例5 PknG类泛素结构域的应用

SEQ ID NO.1所示的结构域可作为抗结核分枝杆菌新靶点在抗结核药物研发中应用，具体包括在商业化蛋白、多肽、抑制剂、试剂盒、抗体等方面的开发和应用，例如针对该靶点设计的抑制剂或抗体等可以拮抗该结构域的功能，从而抵抗结核分枝杆菌胞内存活,以及利用PknG与E2相互作用促进TAK1和TRAF2等底物的泛素化的功能，开发体外泛素化试剂盒或使用包含类泛素结构域的PknG类似的蛋白进行试剂盒及商业化产品的开发等。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种抗结核分枝杆菌的靶点及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Leu Asn Pro Gly Asp Ile Val Ala Gly Gln Tyr Glu Val Lys Gly

1 5 10 15

Cys Ile Ala His Gly Gly Leu Gly Trp Ile Tyr Leu Ala Leu Asp Arg

20 25 30

Asn Val Asn Gly Arg Pro Val Val Leu Lys Gly Leu Val His Ser Gly

35 40 45

Asp Ala Glu Ala Gln Ala Met Ala Met Ala Glu Arg Gln Phe Leu Ala

50 55 60

Glu Val Val His Pro Ser Ile Val Gln Ile Phe Asn Phe Val Glu His

65 70 75 80

Thr Asp Arg His Gly Asp Pro Val Gly Tyr Ile Val Met Glu Tyr

85 90 95

Claims (1)

1.SEQ ID NO.1所示的PknG蛋白的结构域在筛选致病菌抑制剂方面的应用，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的PknG蛋白结构域的第51位谷氨酸作为致病菌抑制剂结合的靶点；所述致病菌为结核分枝杆菌。

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