CN109464670B - 调控a型和b型流感病毒核蛋白出核的关键氨基酸位点及其作为抗流感病毒药物靶点的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及调控A型和B型流感病毒核蛋白出核的关键氨基酸位点及其作为抗流感病毒药物靶点的用途。本发明还涉及用于对A型或B型流感病毒感染进行治疗的药物组合物，所述药物组合物包含调控A型或B型流感病毒核蛋白出核的化合物。

Description

调控A型和B型流感病毒核蛋白出核的关键氨基酸位点及其作 为抗流感病毒药物靶点的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及调控A型和B型流感病毒核蛋白出核的关键氨基酸位点及其作为抗流感病毒药物靶点的用途。本发明还涉及用于对A型或B型流感病毒感染进行治疗的药物组合物，所述药物组合物包含调控A型或B型流感病毒核蛋白出核的化合物。
背景技术
A型和B型流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)。A型流感病毒(influenza A)能够感染人和多种动物。多种亚型的A型流感病毒具有高致病性和/或高死亡率，严重威胁动物和人类的健康。B型流感病毒(influenza B)主要感染人。虽然对人的致病性相对较低，然而由B型流感病毒感染引发的肺炎常具有很高的死亡率。另一方面，流感病毒表面蛋白易发生抗原变异，从而对以流感病毒表面蛋白为靶点的药物产生抗药性。因此，如何以流感病毒核心的蛋白作为靶点设计药物已经受到越来越多的关注。
A型与B型流感病毒的遗传物质均为单股、负链且分八个节段的RNA。由核蛋白(NP，nucleoprotein)包裹着的病毒RNA(vRNA)与病毒聚合酶(PA、PB1以及PB2)一起形成病毒核糖核蛋白复合物(vRNP，viral ribonucleoprotein)。vRNP是病毒基因组RNA复制和转录的基本功能单位。流感病毒经由内体途径进入细胞后，vRNP释放入细胞质并被转运进入细胞核。在细胞核中进行病毒基因组复制和病毒蛋白的转录翻译，新合成的NP和聚合酶与vRNA组装为子代vRNP。在感染后期，子代vRNP被转运出细胞核到达细胞质膜，募集病毒蛋白并通过出芽的方式释放新病毒粒子。
NP在vRNP的入核与出核中发挥重要作用。细胞质vRNP中的NP与宿主细胞中的核运输蛋白IMPα(importin-α)相互作用，经由IMPα–IMPβ1通路将细胞质vRNP运送入细胞核。而在感染后期，核内的子代vRNP中的NP与流感病毒M1蛋白结合，并利用流感病毒NEP蛋白作为vRNP-M1复合物与宿主细胞核输出蛋白CRM1(chromosome region maintenance 1)出核通路之间的接头，将vRNP-M1转运出核(Nature Reviews Microbiology 13，28–41(2015))。
就以NP作为药物靶点而言，研究表明，在A型流感病毒的vRNP组装中，A型流感病毒核蛋白(ANP)与vRNA的结合依赖于ANP的RNA结合槽区域的多个氨基酸位点(Nature 444:1078–1082，2006)。通过MD建模对结合槽区域与现有的小分子库的相互作用进行筛选显示，萘普生及其衍生物能够通过抑制ANP与vRNA的结合来抑制A型流感病毒的复制。进一步的计算模拟结果表明，萘普生的作用靶点是ANP位于RNA结合槽区域的Y148、R152、R355和R361氨基酸(Lejal N，Tarus B，Bouguyon E，Chenavas S，Bertho N，Delmas B，Ruigrok RW，DiPrimo C，Slama-Schwok A，Structure-based discovery of the novel antiviralproperties of naproxen against the nucleoprotein of influenza A virus，Antimicrob Agents Chemother.2013，57(5)：2231-42；Tarus B，Bertrand H，Zedda G，DiPrimo C，Quideau S，Slama-Schwok A.，Structure-based design of novel naproxenderivatives targeting monomeric nucleoprotein of Influenza A virus，J BiomolStruct Dyn.2015；33(9)：1899-912.；US2014/0163107A1)。萘普生是一类非甾体抗炎药，临床上主要用于治疗关节炎(例如风湿性和类风湿性关节炎、骨关节炎)、强直性脊柱炎、痛风或腱鞘炎等，亦可用于缓解肌肉骨骼扭伤、挫伤、损伤以及痛经等所致的疼痛，尚未报道该药物能够用于抗病毒治疗。
此外，目前的研究还不清楚A型流感病毒NP中参与vRNP入核/出核的关键位点，也未有关于B型流感病毒NP(BNP)的何种位点可作为药物靶点的报道。
发明内容
本发明关注于A型和B型流感病毒核蛋白中对于vRNP的入核/出核关键的氨基酸位点，首次提出A型流感病毒核蛋白(ANP)的第148位酪氨酸和B型流感病毒核蛋白(BNP)的第209位苯丙氨酸分别是A型和B型流感病毒vRNP出核关键位点。能够将上述位点作为药物靶标，设计筛选抑制或阻断流感病毒vRNP出核的药物，从而对流感进行有效治疗。
在第一方面，本发明提供一种对感染有A型流感病毒的受试者进行治疗的方法，其特征在于，给予受试者治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抑制A型流感病毒核蛋白(ANP)的第148位酪氨酸(Y148)与CRM1之间的相互作用的化合物。
在第二方面，本发明提供一种抑制A型流感病毒核蛋白出核的方法，其特征在于，抑制A型流感病毒核蛋白的Y148与CRM1之间的相互作用。
在第三方面，本发明提供一种抑制感染有A型流感病毒的受试者中A型流感病毒核蛋白出核的方法，其特征在于，给予受试者与A型流感病毒核蛋白的Y148相互作用的化合物。
在第四方面，本发明提供一种对感染有B型流感病毒的受试者进行治疗的药物，所述药物包含通过与B型流感病毒核蛋白(BNP)第209位苯丙氨酸(F209)相互作用而抑制所述B型流感病毒核蛋白的活性的化合物。
在第五方面，本发明提供一种对感染有B型流感病毒的受试者进行治疗的方法，其特征在于，给予受试者治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含与BNP的F209相互作用的化合物。
在第六方面，本发明提供一种抑制B型流感病毒核蛋白出核的方法，其特征在于，阻断B型流感病毒核蛋白的F209与CRM1之间的相互作用。
在第七方面，本发明提供一种抑制受试者中B型流感病毒感染的方法，其特征在于，给予受试者与B型流感病毒核蛋白的F209相互作用的化合物。
在第八方面，本发明提供B型流感病毒核蛋白的F209作为抗B型流感病毒药物靶点的用途。
在第九方面，本发明提供一种对具有抑制B型流感病毒感染作用的化合物进行筛选方法，所述方法包含如下步骤：
(a)利用分子三维结构建模软件对B型流感病毒核蛋白的三维结构进行建模；
(b)利用分子对接软件筛选能够与B型流感病毒核蛋白第209位苯丙氨酸相互作用的候选化合物，
(c)在细胞水平上对所述候选化合物是否能够抑制B型流感病毒复制进行验证；
其中，所述B型流感病毒核蛋白序列为PDB数据库中的PDB ID：3TJ0。
在第十方面，本发明提供了由第九方面的方法筛选得到的化合物。
附图说明
图1示出转染12、24、36小时后野生型ANP(A-WT)、A-Y148A突变体蛋白和A-Y148F突变体蛋白的细胞定位结果。NP示出TRITC通道荧光，表明ANP蛋白、A-Y148A蛋白或A-Y148F蛋白的定位，叠加图(Merge)为TRITC和DAPI通道(表明细胞核定位)叠加的结果。p.t.表示转染后(post transfection)。
图2示出野生型ANP(A-WT)、A-Y148A突变体蛋白或A-Y148F突变体蛋白与Importin-α1(A)以及CRM1(B)相互作用的Western印迹结果。Input：加样对照。IP:FLAG：经抗FLAG M2珠下拉处理(即，免疫共沉淀)的Western印迹的结果。
图3示出根据噬斑试验获得的其核蛋白分别为野生型ANP(A-WT)和A-Y148F突变体的拯救的A型流感病毒的生长曲线。误差棒表示三次独立实验的标准差。
图4示出A-Y148F突变对病毒在小鼠体内的复制和致病力的影响的结果。(A)小鼠体重随感染天数的变化。(B)小鼠生存率随感染天数的变化。(C)小鼠肺指数随感染天数的变化。(D)病毒滴度随感染天数的变化。(E)感染后5天小鼠的肺脏外观。A-WT为感染野生型病毒的阳性对照。A-Y148F为感染其ANP具有Y148F突变的病毒的实验组。PBS为空白对照。误差棒表示三次独立实验的标准差。
图5示出A型流感病毒核蛋白(Influenza A NP，ANP)与B型流感病毒核蛋白(Influenza B NP，BNP)的结构比较。(A)基于PDB结构做出的ANP(PDB ID NO：2IQH)和BNP(PDB ID NO：3TJ0)的结构示意图，特别标出富含碱性氨基酸的RNA结合槽中的芳香族氨基酸残基Y148和F209。(B)ANP的Y148残基和BNP的F209残基附近的序列。星号示出具有同源性和一致性的氨基酸残基。
图6示出转染12、24、36小时后野生型BNP(B-WT)(A)和B-F209A突变体蛋白(B)的细胞定位结果。NP示出TRITC通道荧光，表明BNP蛋白和B-F209A蛋白的定位，叠加图(Merge)为TRITC和DAPI通道(表明细胞核定位)叠加的结果。
图7示出野生型BNP(B-WT)或B-F209A突变体蛋白与Importin-α1(A)以及CRM1(B)相互作用的Western印迹结果。Input：加样对照。IP:FLAG：经抗FLAG M2珠下拉处理(即，免疫共沉淀)的Western印迹的结果。
图8示出根据噬斑试验获得的萘普生对拯救的A型流感病毒(A)和拯救的B型流感病毒(B)的生长曲线的影响。误差棒表示三次独立实验的标准差。
图9示出萘普生对野生型ANP(A)和BNP(B)的细胞定位的影响的荧光显微结果。+NPX为培养皿中添加萘普生的实验结果。-NPX为无萘普生的对照结果。NP示出TRITC通道荧光，表明核蛋白的定位。DAPI通道荧光表明细胞核定位。TRITC和DAPI通道叠加结果在叠加图(Merge)中显示。
图10示出萘普生影响野生型ANP(A)或野生型BNP(B)与CRM1相互作用的Western印迹结果。Input：加样对照。IP:αFLAG：经抗FLAG M2珠下拉处理(即，免疫共沉淀)的Western印迹的结果。
图11示出萘普生对A型和B型流感病毒在小鼠体内的复制和致病力的影响的结果。(A-B)A型流感病毒感染后(A)或B型流感病毒感染后(B)小鼠体重随感染天数的变化。(C-D)A型流感病毒感染后(C)或B型流感病毒感染后(D)小鼠生存率随感染天数的变化。(E)感染后5天小鼠的肺脏外观。(F-G)A型流感病毒感染后(F)或B型流感病毒感染后(G)小鼠的肺指数随感染天数的变化。(H-I)A型流感病毒感染后(H)或B型流感病毒感染后(I)病毒滴度随感染天数的变化。PBS为空白对照组。fluA/B为A型或B型病毒感染后1天腹腔注射PBS的对照组。fluA/B+Ose为病毒感染后1天胃灌注1mg奥司他韦处理组。fluA/B+NPX50为病毒感染后1天腹腔注射50mM萘普生处理组。fluA/B+NPX5为病毒感染后1天腹腔注射5mM萘普生处理组。误差棒表示三次独立实验的标准差。
具体实施方式
如上所述，本发明关注于A型和B型流感病毒核蛋白中对于vRNP的入核/出核关键的氨基酸位点，发现A型流感病毒核蛋白的Y148或B型流感病毒的F209位点的突变导致流感病毒的出核被抑制。进而，发明人发现萘普生及其衍生物作用于上述位点从而抑制NP出核。能够利用该流感病毒出核机制设计或筛选新的抗病毒药物。
本文使用的术语“A型流感病毒”和“B型流感病毒”具有本领域公知的含义，该分类为基于流感病毒核蛋白的抗原性。就变异能力而言，A型流感病毒较B型流感病毒具有更强的变异性，特别是其表面的血凝素抗原和/或神经氨酸酶抗原的氨基酸突变率非常高，导致出现跨物种传播以及抗病毒药物的失效。
流感病毒的核蛋白(NP)在病毒感染期间高表达并具有多种功能。如上所述，NP覆盖具有八个节段的基因组RNA并与三种聚合酶组装为控制病毒转录和复制的病毒核糖核蛋白复合物(vRNP)。对A型流感病毒NP的研究表明，NP在不同类型的A型流感病毒中高度保守(氨基酸序列具有约90％一致性)，且在细胞中没有对应蛋白。因此，核蛋白是抗病毒的潜在候选靶点(Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2013，第57卷第5号，第2231–2242页)。
B型流感病毒核蛋白(BNP)与A型流感病毒核蛋白(ANP)的整体结构有很多相似之处，然而，就序列而言，BNP与ANP至少存在如下区别：(i)BNP含有显著延长的N-末端区域(第1-70位氨基酸)；(ii)BNP中不存在ANP中的核定位序列NLS-1和NLS-2；(iii)ANP中的一些已知的RNA结合区，特别是第74-88位的柔性碱性环在BNP中不保守；(iv)参与NP同源寡聚化的接头和尾环不保守；以及(v)ANP和BNP序列C端的比对具有空位。此外，序列比对发现，BNP中也有对应于ANP的RNA结合槽的带正电的RNA结合槽，其中的两个带正电残基簇分别为G1(K125、K126、R235、R236)和G2(R211、K213、R217)。此外，第209-211区域是连接各结构域的环(J Virol.2012，86(12)：6758–6767)。在本发明的实施方式中，ANP可具有例如NCBI IDNO:ACF54602.1的氨基酸序列或与该序列具有90％以上一致性的氨基酸序列。BNP可具有例如NCBI ID NO：AAA82969.1的氨基酸序列或与该序列具有90％以上一致性的氨基酸序列。
如上所述，现有研究已报道了NP在vRNP出核中的重要作用。子代vRNP被转运出细胞核到达细胞质膜的第一步是vRNP出核。A型流感病毒利用CRM1(也称为exportin-1)依赖型出核通路实现细胞核至细胞质的转运。具体而言，在vRNP从染色质释放后，vRNP借助“daisy chain”复合体被释放出核，其中病毒核输出蛋白(NEP)作为vRNP-M1和CRM1-RAN-GTP之间的接头。在核孔复合物(NPC)的细胞质侧，借助RAN GTPase激活蛋白(RAN GAP)的RAN-GTP水解将转运蛋白和vRNP释放到细胞质中。另外，体外实验表明，NP蛋白在缺少其它病毒蛋白时仍能实现出核；并且在体外，NP能够直接结合CRM1。这些研究说明NP能够通过与CRM1的直接相互作用介导vRNP的出核。然而，目前还不清楚NP的核输出信号基序对vRNP出核的贡献。在这方面，NP在vRNP出核中的作用仍不十分清楚(Nature ReviewsMicrobiology 13，28–41(2015))。在本发明的实施方式中，取决于受试者，CRM1可为能够感染A型或B型流感病毒的任何宿主物种的CRM1。例如，CRM1蛋白可具有NCBI登记号CAA69905.2的氨基酸序列或与该序列具有90％以上一致性的氨基酸序列。
在本发明中，能够与A型流感病毒核蛋白第148位酪氨酸或B型流感病毒第209位苯丙氨酸相互作用，从而抑制或阻断核蛋白与CRM1之间相互作用的化合物例如为萘普生或其衍生物。本领域已知的是，萘普生是(+)α-甲基-6-甲氧基-2-萘乙酸的通用名。萘普生衍生物具有2-芳基丙酸类的共同结构，本领域已知的萘普生衍生物包括萘普生钠、DL-萘普生、萘普生甲酯、23979-41-1、耐普西诺、萘普生-ETEMESIL、萘普生乙酯、萘普生葡糖苷酸、5-氯代萘普生以及5-碘代萘普生等。本文使用的术语“受试者”是指需要对其体内的A型或B型流感病毒感染进行治疗的患者。受试者可为人或动物，特别是哺乳动物或禽类。例如，所述受试者可为人、猪、海豹、鸡、鹌鹑、鹅或鸭。就这一点而言，本发明的化合物也可作为兽药使用。
本发明所提供药物组合物可包含本文所述的化合物或其前药、药学上可接受的盐或其它药学上可接受的形式，以及任选的药学上可接受的赋形剂。在某些实施方式中，这些组合物任选地进一步包含一种以上其它治疗剂。或者，可向有需要的患者给予本发明的化合物并联合给予一种以上其它治疗剂。例如，在流感病毒的治疗中，用于与本发明的化合物共同给药或与本发明的化合物共同包含于药物组合物中的其它治疗剂可以是获批的抗炎药物。
可将本发明的药物组合物配制为多种剂型，例如但不限于用于口服给药的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、酏剂、胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂；用于吸入式给药的喷雾剂；以及用于注射的注射制剂等。
术语“治疗有效量”指的是当给予需要这种治疗的患者时，足以实现有效治疗的量。治疗有效量可随着待治疗的受试者和疾病状态、患病的程度和给药的方式而变化，并且可由本领域普通技术人员常规确定。
在一些实施方式中，本发明提供一种对具有抑制B型流感病毒感染作用的化合物进行筛选方法，所述方法包含如下步骤：
(a)利用分子三维结构建模软件对B型流感病毒核蛋白的三维结构进行建模；
(b)利用分子对接软件筛选能够与B型流感病毒核蛋白第209位苯丙氨酸相互作用的候选化合物；
(c)在细胞水平上对所述候选化合物是否能够抑制B型流感病毒复制进行验证；
其中，所述B型流感病毒核蛋白序列为PDB数据库中的PDB ID：3TJ0。
优选地，步骤(a)中的所述分子三维结构建模软件可为pyMol软件。优选地，步骤(b)中的所述分子对接软件可为Dock软件。
本领域知晓在细胞水平上对所述候选化合物是否能够抑制B型流感病毒复制进行验证的方法。在一个实施方式中，可利用如下的方式对候选化合物是否能够抑制流感病毒复制进行验证：
(i)以0.01-1的MOI使得哺乳动物细胞(例如A549细胞或MDCK细胞)感染B型流感病毒；
(ii)在感染1h后将所述候选化合物加入至所述细胞的培养液；
(iii)在感染后12h到72h内，每隔12h收取细胞培养基上清；
(iv)利用噬斑技术检测收取的上清中病毒含量；
当72h后病毒含量小于103PFU时，认为候选化合物具有抑制B型流感病毒复制的作用。
本发明还提供了根据上述方法筛选得到的化合物。
本文所述各方面的实施方式可由如下编号的段落说明：
1.一种对感染有A型流感病毒的受试者进行治疗的方法，其特征在于，给予受试者治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抑制A型流感病毒核蛋白的第148位酪氨酸与CRM1之间的相互作用的化合物。
2.一种抑制感染有A型流感病毒的受试者中A型流感病毒核蛋白出核的方法，其特征在于，给予受试者与A型流感病毒核蛋白的第148位酪氨酸相互作用的化合物。
3.如段落1或2所述的方法，其特征在于，所述受试者为哺乳动物或禽类物种，优选为人、猪、鸡、鹌鹑、鹅或鸭。
4.如段落1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述化合物选自于由如下物质所组成的组：萘普生、萘普生钠、DL-萘普生、萘普生甲酯、23979-41-1、耐普西诺、萘普生-ETEMESIL、萘普生乙酯、萘普生葡糖苷酸、5-氯代萘普生、5-碘代萘普生。
5.一种抑制A型流感病毒核蛋白出核的方法，其特征在于，抑制A型流感病毒核蛋白的第148位酪氨酸与CRM1之间的相互作用。
6.抑制A型流感病毒核蛋白的第148位酪氨酸与CRM1之间的相互作用的化合物在制备对感染有A型流感病毒的受试者进行治疗的药物中的用途。
7.抑制A型流感病毒核蛋白的第148位酪氨酸与CRM1之间的相互作用的化合物在制备对感染有A型流感病毒的受试者中A型流感病毒核蛋白出核进行抑制的药物中的用途。
8.如段落6或7所述的用途，其特征在于，所述受试者为哺乳动物或禽类物种，优选为人、猪、鸡、鹌鹑、鹅或鸭。
9.如段落6-8中任一项所述的用途，其特征在于，所述化合物选自于由如下物质所组成的组：萘普生、萘普生钠、DL-萘普生、萘普生甲酯、23979-41-1、耐普西诺、萘普生-ETEMESIL、萘普生乙酯、萘普生葡糖苷酸、5-氯代萘普生、5-碘代萘普生。
10.一种对感染有B型流感病毒的受试者进行治疗的药物，所述药物包含通过与B型流感病毒核蛋白第209位苯丙氨酸相互作用而抑制所述B型流感病毒核蛋白的活性的化合物。
11.如段落10所述的药物，其特征在于，所述化合物抑制B型流感病毒核蛋白的第209位苯丙氨酸与CRM1之间的相互作用。
12.如段落10或11所述的药物，其特征在于，所述受试者为哺乳动物，优选为人或海豹。
13.如段落10-12中任一项所述的药物，其特征在于，所述化合物选自于由如下物质所组成的组：萘普生、萘普生钠、DL-萘普生、萘普生甲酯、23979-41-1、耐普西诺、萘普生-ETEMESIL、萘普生乙酯、萘普生葡糖苷酸、5-氯代萘普生、5-碘代萘普生。
14.一种对感染有B型流感病毒的受试者进行治疗的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含与B型流感病毒核蛋白的第209位苯丙氨酸相互作用的化合物。
15.一种抑制受试者中B型流感病毒感染的方法，其特征在于，给予受试者与B型流感病毒核蛋白的F209相互作用的化合物。
16.如段落14或15所述的方法，其特征在于，所述受试者为哺乳动物，优选为人或海豹。
17.一种抑制B型流感病毒核蛋白出核的方法，其特征在于，阻断B型流感病毒核蛋白的第209位苯丙氨酸与CRM1之间的相互作用。
18.如段落14-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述化合物抑制B型流感病毒核蛋白的第209位苯丙氨酸与CRM1之间的相互作用。
19.如段落18所述的方法，其特征在于，所述化合物选自于由如下物质所组成的组：萘普生、萘普生钠、DL-萘普生、萘普生甲酯、23979-41-1、耐普西诺、萘普生-ETEMESIL、萘普生乙酯、萘普生葡糖苷酸、5-氯代萘普生、5-碘代萘普生。
20.与B型流感病毒核蛋白的第209位苯丙氨酸相互作用的化合物在制备对感染有B型流感病毒的受试者进行治疗的药物中的用途。
21.与B型流感病毒核蛋白的第209位苯丙氨酸相互作用的化合物在制备抑制感染有B型流感病毒的受试者中B型流感病毒核蛋白出核的药物中的用途。
22.如段落20或21所述的用途，其特征在于，所述受试者为哺乳动物，优选为人或海豹。
23.如段落20-22中任一项所述的用途，其特征在于，所述化合物抑制B型流感病毒核蛋白的第209位苯丙氨酸与CRM1之间的相互作用。
24.如段落23所述的用途，其特征在于，所述化合物选自于由如下物质所组成的组：萘普生、萘普生钠、DL-萘普生、萘普生甲酯、23979-41-1、耐普西诺、萘普生-ETEMESIL、萘普生乙酯、萘普生葡糖苷酸、5-氯代萘普生、5-碘代萘普生。
25.B型流感病毒核蛋白的第209位苯丙氨酸作为抗B型流感病毒药物靶点的用途。
26.一种对具有抑制B型流感病毒感染作用的化合物进行筛选方法，所述方法包含如下步骤：
(a)利用分子三维结构建模软件对B型流感病毒核蛋白的三维结构进行建模；
(b)利用分子对接软件筛选能够与B型流感病毒核蛋白第209位苯丙氨酸相互作用的候选化合物；
(c)在细胞水平上对所述候选化合物是否能够抑制B型流感病毒复制进行验证；
其中，所述B型流感病毒核蛋白序列为PDB数据库中的PDB ID：3TJ0。
27.如段落26所述的方法，其中，所述步骤(c)按照如下的步骤进行：
(i)以0.01-1的MOI使得哺乳动物细胞感染B型流感病毒；
(ii)在感染1h后将所述候选化合物加入至所述细胞的培养液；
(iii)在感染后12h到72h内，每隔12h收取细胞培养基上清；
(iv)利用噬斑技术检测收取的上清中病毒含量；
当72h后病毒含量小于103PFU时，认为候选化合物具有抑制B型流感病毒复制的作用。
28.如段落26或27所述的方法，其中，步骤(a)中的所述分子三维结构建模软件为pyMol软件。
29.如段落26-28中任一项所述的方法，其中，步骤(b)中的所述分子对接软件为Dock软件。
30.由如段落26-29中任一项所述的方法筛选得到的化合物。
实施例
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。雌性BALB/c小鼠来自北京维通利华实验动物有限责任公司；雌性BALB/c小鼠在下文中简称小鼠。
实施例1A型流感病毒核蛋白Y148残基影响ANP出核
一、载体构建
野生型A型流感病毒核蛋白(ANP)及其Y148残基突变体的构建：
野生型ANP具有NCBI号ACF54602.1示出的氨基酸序列；A-Y148A和A-Y148F突变体片段分别为将野生型ANP序列第148位氨基酸突变为丙氨酸以及苯丙氨酸的序列。
将上述野生型ANP分别克隆到pcDNA4TO(Invitrigen，产品目录号为V103020)、pCMV-MYC(Clontech，产品目录号635689)和表达载体pHH21(来自于美国威斯康星大学麦迪逊分校Yoshihiro Kawaoka教授的馈赠，该载体记载于“Neumann G，等，Generation ofinfluenza A viruses entirely from cloned cDNAs，Proc Natl Acad Sci U S A.1999；96(16):9345-50”)中。pHH21和pcDNA4TO属于流感病毒反向遗传包装系统，pHH21载体带有RNA聚合酶I的启动子和终止子，用以表达流感病毒的8个节段的病毒RNA。pcDNA4TO(Invitrigen，产品目录号为V103020)携带有CMV/TO启动子，用以表达启动病毒拯救过程的病毒核糖核蛋白复合物中的病毒蛋白，包括PA、PB1、PB2和NP。将野生型ANP克隆至pCMV-MYC中时表达带有MYC标签的ANP。
以大肠杆菌DH5α(Invitrogen，产品目录号为18265017)作为克隆宿主，扩增质粒。按照QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，产品目录号为200518)说明书，分别将ANP的第148位酪氨酸定点突变为丙氨酸(Y148A)或苯丙氨酸(Y148F)，得到ANP的两个突变体：Y148A突变体(以下称为A-Y148A)和Y148F突变体(以下称为A-Y148F)。A-Y148A突变体的148位氨基酸残基侧链不带有苯环结构。A-Y148F突变体的148位氨基酸残基侧链为苯丙氨酸，苯丙氨酸与酪氨酸同为芳香族氨基酸，具有与酪氨酸类似的结构。
利用Qiangen试剂盒，分别提取带有野生型ANP、A-Y148F或A-Y148A突变体片段的质粒。
FLAG-CRM1以及FLAG-importin-α1表达载体的构建：利用与如上所述相同的方法，将CRM1(具有NCBI登记号CAA69905.2的氨基酸序列)或importin-α1(具有NCBI登记号AAH67848.1的氨基酸序列)分别克隆到表达载体pcDNA3-FLAG(addgene，产品目录号为20011)中，该载体表达的importin-α1或CRM1带有FLAG标签。
二、A型流感病毒核蛋白Y148残基对ANP细胞定位的影响
将灭菌后的盖玻片放入24孔板，每孔放一片。在24孔板中每孔加入1×105个/mL293T细胞(上海博谷生物科技有限公司，货号为BG0021)悬液0.5mL，培养基为含10wt％胎牛血清(FCS)(ThermoFisher，产品目录号为16000044)的DMEM(ThermoFisher，产品目录号为11965118)培养基。在培养箱(37℃，5％CO2)中将细胞培养至90-95％汇合度。在转染前2h将细胞培养基换为Opti-MEM(ThermoFisher，产品目录号为51985-042)。分别用Opti-MEM培养基将所构建的载体(带有野生型ANP、A-Y148A突变片段或A-Y148F突变片段的pHH21质粒)和LipofectamineTM2000(invitrogen，产品目录号为11668-019)按照1:3的质量比例稀释混匀，并在5min后将质粒与LipofectamineTM2000混合，室温静置15min后将其加入至孔中的细胞培养液中，轻柔晃动24孔板使之与孔中的培养液混匀。所加入的载体浓度为1μg/mL。将24孔板放回培养箱中，转染后4-6h将培养基更换为10wt％FCS的DMEM。
分别于转染后12、24、36小时取出盖玻片，吸去培养液，用PBS洗涤一次。用4％多聚甲醛室温固定30分钟以上或者4℃固定过夜。弃去多聚甲醛固定液，用PBST(加入0.5v/v％Tween的PBS)洗3次，时间保持在15分钟以上。使用PBST配制的4wt％牛血清白蛋白BSA 4℃封闭过夜或者37℃封闭1小时。取出封闭后的盖玻片，加入封闭液配制的一抗ANP多克隆抗体(该ANP多克隆抗体的制备方法和序列请参见Liu X，Sun L，Yu M，Wang Z，Xu C，Xue Q等，Cyclophilin A interacts with influenza A virus M1protein and impairs theearly stage of the viral replication，Cellular microbiology.2009；11(5)：730-41)，37℃结合1小时。其中，所述封闭液为1wt％BSA、5wt％脱脂牛奶，利用PBST配置。所述一抗ANP多克隆抗体为1:2000稀释。PBST洗涤5次，每次10分钟。加入封闭液配制的二抗TRITC标记的山羊抗兔IgG(Abcam，产品货号为ab6718)(1:5000稀释)，37℃结合1小时。PBST洗5次，每次10分钟。使用DAPI(用纯水按1：5000体积比例配制)进行染色，室温染色2-5分钟。PBST洗3次。在载玻片上滴加封片液(50％甘油，用PBS配制)将盖玻片倒扣在载玻片上封片。使用激光共聚焦荧光显微镜(Olympus FV500)观察。DAPI通道的激发和发射波长分别为359nm和461nm，TRITC通道的激发和发射波长分别为550nm和620nm，放大倍数40倍。实验结果如图1所示。ANP WT具备完整的核质穿梭过程，其在转染后12小时主要定位于细胞核中，24小时同时定位于细胞质和细胞核，36小时主要定位于细胞质中。由于A-Y148F模拟了酪氨酸的天然空间构象，其定位结果与WT相似。然而A-Y148A却在36小时出现了核内滞留现象，无法进入细胞质，表明A-Y148对ANP的出核至关重要。
三、A型流感病毒核蛋白Y148残基对ANP与CRM1/IMPα1相互作用的影响
利用包含CRM1或importin-α1(IMPα1)序列的pcDNA3-FLAG载体(分别表达带有FLAG标签的CRM1和IMPα1)和带有野生型或突变型ANP的pCMV-MYC载体(表达的末端带有MYC标签的野生型ANP、A-Y148A突变片段或A-Y148F突变片段)共转染293T细胞。所加入的各载体浓度为3μg/mL pcDNA3-FLAG和1μg/mL pCMV-MYC质粒，转染方法如上所述。
负对照为仅利用带有野生型或突变型ANP的pCMV-MYC载体(表达末端带有MYC标签的野生型ANP、A-Y148A突变片段或A-Y148F突变片段)转染293T细胞，该细胞不转染pcDNA3-FLAG-CRM1或IMPα1。
转染后48小时加入细胞裂解液(1wt％Triton X-100、150mM NaCl、20mM HEPES、10wt％甘油、1mM EDTA(pH 7.4)、5mM Na3VO4)在4℃将细胞裂解，向其中加入5μl抗FLAG M2珠(Sigma，产品货号为A2220)，4℃结合4h或过夜结合。以5000rpm离心2min，弃去上清。再加入1ml细胞裂解液4℃洗涤3次，每次10min。最后加入5×上样缓冲液，煮样5min。以抗c-MYC抗体、抗FLAG抗体(Sigma-Aldrich，产品目录号分别为C3956和F7425)，以及抗β-肌动蛋白抗体(Santa Cruz公司，产品目录号为sc-1616-R)作为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠的单克隆抗体(Jackson，产品目录号为115035003)作为二抗，进行SDS-PAGE电泳和Western印迹分析。
分析结果如图2所示。各图中，第1-3泳道的样品为共转染细胞裂解液样品。第4-6泳道的样品为单转染细胞裂解液样品(阴性对照)，排除了抗FLAG抗体与细胞裂解液中其它组分的非特异性相互作用。Input为加样对照，IP为免疫共沉淀的结果。考虑到MYC-ANP与FLAG-IMPα的分子量大小相近，因此在Western测试中分别与各一抗(兔抗c-MYC抗体或鼠抗FLAG抗体)进行孵育。在图2A中，FLAG-IMPα为仅加入抗FLAG抗体作为一抗的Western结果；MYC-ANP为仅加入抗c-MYC抗体作为一抗的Western结果。可以看出，两种Y148突变对于ANP同FLAG-IMPα的结合均无影响。在图2B中，FLAG-CRM1为仅加入抗FLAG抗体作为一抗的Western结果；MYC-ANP为仅加入抗c-MYC抗体作为一抗的Western结果。结果显示，利用FLAG-CRM1仅能将野生型的ANP和带有Y148F突变的ANP沉淀下来，而检测不到得到CRM1-Y148A复合体，表明Y148A突变导致ANP与CRM1结合能力的丧失。
综上所述，Y148A和Y148F突变均不影响ANP和importin-α1的结合。也就是说，Y148并不是ANP与IMPα1结合的关键位点(图2A)。然而，Y148A突变抑制了ANP与CRM1的结合(图2B)。ANP的Y148F突变对ANP与CRM1结合没有影响，表明148位氨基酸侧链苯环结构对ANP与CRM1功能性相互作用的重要性。这些结果共同表明，突变体A-Y148A通过抑制ANP与CRM1的结合来抑制ANP的出核。
实施例2A型流感病毒核蛋白Y148残基影响A型流感病毒复制和致病力
一、含A-Y148突变的重组A型流感病毒的拯救
利用Neumann G，Watanabe T，Ito H，Watanabe S，Goto H，Gao P，Hughes M，PerezDR，Donis R，Hoffmann E，Hobom G，Kawaoka Y.，Generation of influenza A virusesentirely from cloned cDNAs，Proc Natl Acad Sci U S A.1999，96(16)：9345-50记载的方法，将其中的含NP的相关载体替换为实施例1制备的带有A-ANP野生型片段、A-Y148A突变片段或A-Y148F突变片段的pHH21载体，实施重组A型流感病毒的拯救。利用LipofectamineTM2000转染。转染6h后换液，加入含TPCK处理的胰酶(SIGMA，货号T1426)2μg/ml的无血清的DMEM，培养72h-96h后，收获上清。
二、噬斑试验检测病毒滴度
前2h将细胞培养基换为Opti-MEM(ThermoFisher，产品目录号为51985-042)。分别用Opti-MEM培养基将所构建的载体(带有野生型ANP、A-Y148A突变片段或A-Y148F突变片段的pHH21质粒)和LipofectamineTM2000(invitrogen，产品目录号为11668-019)按照1:3的质量比例稀释混匀，并在5min后将质粒与LipofectamineTM2000混合，室温静置15min后将其加入至细胞培养液中，轻柔晃动培养皿使之与孔中的培养基混匀。所加入的载体浓度为0.4μg/mL。将24孔板放回培养箱中，转染后4-6h将培养基更换为10wt％FCS的DMEM培养基(ThermoFisher，产品目录号为11965118)。
将1×105个/mL MDCK细胞(Cobioer，产品目录号为CBP60561)1mL接种于12孔板，培养基为含10wt％胎牛血清FCS(ThermoFisher，产品目录号为16000044)的DMEM培养基。在培养箱(37℃，5％CO2)中培养过夜，使细胞长成单层(80％以上汇合度)。用PBS洗涤细胞3次，将不同稀释度的病毒(A-WT、A-Y148A和A-Y148F)加入12孔板，每个稀释度3个平行孔，每孔1ml，同时设不加病毒的正常细胞对照。37℃、5％CO2培养箱孵育1h。吸弃病毒液，用PBS洗涤细胞3次，尽量去除残余的液体。将超纯水配制的3wt％低熔点琼脂糖(超纯水配制)加热融化，待其冷却到50℃左右时，与37℃预热的无酚红DMEM培养液以1:1体积比混合(DMEM中含有4μg/ml胰酶，即终浓度为2μg/ml)，混匀后迅速加到12孔板中，每孔1ml。将培养板在4℃放置15min左右，待琼脂糖凝固后再倒置于37℃5％CO2培养箱。培养4d后，计算空斑数，并计算病毒滴度。
实验结果如表1所示。
表1噬斑试验测得的病毒滴度
Figure BDA0001402266090000141
可以看出，A型流感病毒核蛋白的Y148A突变导致病毒无法拯救，而Y148F突变病毒拯救成功，但病毒滴度略低于A-WT。这表明A型流感病毒核蛋白第148位的芳香族氨基酸的苯环对与A型流感病毒的增殖至关重要。
三、Y148F突变对A型流感病毒生长曲线的影响
将1×108个/mL A549细胞(Sigma，产品货号为86012804)接种于10cm培养皿，培养基为含10wt％胎牛血清FCS(ThermoFisher，产品目录号为16000044)的DMEM培养基(ThermoFisher，产品目录号为11965118)。在培养箱(37℃，5％CO2)中培养过夜，使细胞长成单层(80％以上汇合度)。用PBS洗涤细胞3次，分别将上述拯救的A型流感病毒A-WT或A-Y148F(MOI＝0.001)加入培养皿。37℃、5％CO2培养箱孵育1h，吸弃病毒液，更换为10wt％FCS的DMEM，于不同时间点收取细胞上清用于噬斑试验(步骤如上所述)，检测病毒滴度，绘制病毒生长曲线。
实验结果如图3所示。病毒感染后72小时，A-Y148F与A-WT相比，病毒滴度无显著差异，但在感染后48小时可以看到病毒滴度有明显的一过性下降。表明Y148F突变对A型流感病毒的增殖过程影响不大。
四、A-Y148F突变对病毒在小鼠体内的复制和致病力的影响
1、小鼠分组
6周龄BALB/c雌性小鼠通过乙醚麻醉后，利用鼻吸法使其吸入50μl(104PFU/ml)的WSN野生型或A-Y148F突变病毒，阴性对照设置为吸入灭菌后的PBS。将小鼠分为体重组和解剖组：体重组用于观察每日体重和小鼠的死亡率，每组8只小鼠。解剖组用于解剖，观察肺脏以及测量肺组织病毒载量，每组9只小鼠。
2、体重检测
体重组每日称取并记录小鼠体重，观察病理特征并记录其死亡个数，共计14天。
3、肺指数测定
解剖组在感染后3d、5d、7d各组分别解剖3只小鼠，称取小鼠体重及肺脏重量，计算肺指数(肺指数＝肺质量/小鼠体重)。
4、肺组织病毒载量测定
对于解剖组小鼠的肺脏，利用QIAGEN TissueLyser II在1ml冰浴PBS中将肺脏组织匀浆，30循环/s进行4min，以5000g将匀浆液离心10min，利用如上所述的噬斑实验测定其中的病毒滴度。
实验结果如图4所示。与PBS组相比，病毒感染后WSN WT组小鼠(A-WT)体重迅速下降，而A-Y148F组小鼠体重下降幅度相对较小(图4A)。WSN WT组小鼠在感染后13d全部死亡，此时A-Y148F组小鼠生存率为37.5％(图4B)。流感病毒主要感染肺脏，我们发现病毒感染后5天，WSN WT和A-Y148F组小鼠肺脏的均出现明显的眼观病变(图4E)，肺指数(图4C)和肺脏中的病毒滴度(图4D)明显升高，且A-Y148F的复制能力和致病力相对较弱，但与WSN WT并无统计学显著性差异。这些体内实验结果也表明ANP上148位的苯环是影响A型流感病毒增殖能力的关键位点，与体外结果一致。
实施例3B型流感病毒核蛋白F209残基影响B型流感病毒核蛋白出核
一、B型流感病毒核蛋白(BNP)出核关键位点研究
BNP与ANP的结构非常相似。特别是，二者均包含一个富含碱性氨基酸的RNA结合槽(Ye Q，Krug RM，Tao YJ.，The mechanism by which influenza A virus nucleoproteinforms oligomers and binds RNA，Nature.2006；444(7122)：1078-82。Ng AK，Lam MK，Zhang H，Liu J，Au SW，Chan PK等，Structural basis for RNA binding and homo-oligomer formation by influenza B virus nucleoprotein，Journal ofvirology.2012；86(12)：6758-67)。序列比对结果显示，ANP与BNP的RNA结合槽中均有一个芳香族氨基酸，ANP的Y148和BNP的F209(图5A)，而且这两个位点附近的序列同源性非常高(图5B)。因此，我们猜测B-F209在BNP的出核过程中也可能发挥着与A-Y148相似的功能。
二、野生型B型流感病毒核蛋白(BNP)及其F209残基突变体的构建
野生型BNP为具有NCBI号AAA82969.1示出的氨基酸序列；B-F209A突变体片段为将野生型BNP序列第209位氨基酸突变为丙氨酸的序列。
根据实施例1所述的方法，将上述野生型BNP克隆至pCMV-MYC载体(Clontech，产品目录号为631601)。以大肠杆菌DH5α作为克隆宿主，扩增质粒。按照QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，产品目录号为200518)说明书，将BNP的第209位苯丙氨酸定点突变为丙氨酸(F209A)，得到B-F209A突变体。该突变体侧链不带有苯环结构。分别提取带有野生型BNP的pCMV-MYC质粒和带有B-F209A突变体的pCMV-MYC质粒。
根据实施例1的方法，构建包含FLAG-CRM1以及FLAG-importin-α1的表达载体。
三、B型流感病毒核蛋白F209氨基酸残基对BNP细胞定位的影响
利用与实施例1相同的方法，分别用带有野生型BNP或B-F209A突变片段的pCMV-MYC质粒对293T细胞进行转染。
分别于转染后12、24、36小时取样，利用与实施例1类似的方法对盖玻片进行固定和封闭。取出封闭后的盖玻片，加入封闭液(1wt％BSA、5％脱脂牛奶，PBST配置)配制的一抗BNP抗体(Santa Cruz，产品货号为sc-80483，1:2000稀释)，37℃结合1小时。PBST洗涤5次，每次10分钟。加入封闭液配制的荧光二抗，TRITC标记的山羊抗兔IgG(Abcam，产品货号为ab6718，1:5000稀释)，二抗同样使用封闭液配制，37℃，结合1小时。PBST洗5次，每次10分钟。使用DAPI(用纯水按1:5000体积比例配制)进行染色，室温染色2-5分钟。PBST洗3次。在载玻片上滴加封片液(50％甘油，用PBS配制)将盖玻片倒扣在载玻片上，封闭四周。使用激光共聚焦荧光显微镜(Olympus FV500)观察。DAPI通道的激发和发射波长分别为359nm和461nm，TRITC通道的激发和发射波长分别为550nm和620nm，放大倍数40倍。
实验结果如图6所示。BNP WT具备完整的核质穿梭过程，其在转染后12小时主要定位于细胞核中，24小时和36小时同时定位于细胞质和细胞核(图6A)。然而B-F209A突变体在这3个时间点均以细胞核的定位为主(图6B)，表明F209A突变严重影响了BNP的出核过程。
四、B型流感病毒核蛋白F209残基对BNP与CRM1/IMPα1相互作用的影响
利用与实施例1相同的方法，用包含CRM1或importin-α1(IMPα1)序列的pcDNA3-FLAG载体(分别表达带有FLAG标签的CRM1和IMPα1)和带有野生型或突变型ANP的pCMV-MYC载体(表达的末端带有MYC标签的野生型ANP、A-Y148A突变片段或A-Y148F突变片段)共转染293T细胞。阴性对照为仅利用包含CRM1或importin-α1的pcDNA3-FLAG载体对293T细胞进行转染。
利用与实施例1相同的方法，以抗c-MYC抗体、抗FLAG抗体(Sigma-Aldrich，产品目录号分别为C3956和F7425)，以及抗β-肌动蛋白抗体(Santa Cruz公司，产品目录号为sc-1616-R)作为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠的单克隆抗体(Jackson，产品目录号为115035003)作为二抗，进行SDS-PAGE电泳和Western印迹分析。
分析结果如图7所示。各图中，第1-2泳道的样品为共转染细胞裂解液样品。第3-4泳道的样品为单转染细胞裂解液样品(阴性对照)，排除了抗MYC抗体与细胞裂解液中其它组分的非特异性相互作用。Input为加样对照，IP为免疫共沉淀的结果。在图7A中，FLAG-IMPα为仅加入抗FLAG抗体作为一抗的Western结果；MYC-BNP为仅加入抗c-MYC抗体作为一抗的Western结果。IP结果显示，MYC-BNP与FLAG-IMPα的明显结合(1-2泳道)；而仅单转染MYC-BNP的第3-4泳道并没有检测到MYC-BNP。说明B-F209A突变不影响BNP同IMPα的结合。在图7B中，FLAG-CRM1为仅加入抗FLAG抗体作为一抗的Western结果；MYC-ANP为仅加入抗c-MYC抗体作为一抗的Western结果。IP结果显示，第1泳道的野生型BNP能够同CRM1有效结合，而第2泳道仅检测到微弱的MYC-BNP条带，说明F209A突变使BNP同CRM1的结合力降低。
综上所述，F209A突变不影响BNP和importin-α1的结合。也就是说，F209A并不是BNP与IMPα1结合的关键位点(图7A)。然而，F209A突变抑制了BNP与CRM1的结合(图7B)，表明第209位氨基酸对BNP与CRM1功能性相互作用的重要性。这些结果共同表明，突变体B-F209A通过抑制BNP与CRM1的结合来抑制BNP的出核。
综合ANP和BNP的结果，我们认为ANP和BNP的RNA结合槽中的芳香族氨基酸A-Y148和B-F209是调控NP出核的关键位点。
实施例4A-Y148和B-F209是萘普生与ANP/BNP结合的关键位点
利用等温滴定微热量仪(NANO-ITC 2G，TA Instruments)测量萘普生与ANP/BNP的相互作用。等温滴定量热法(Isothermal titration calorimetry，ITC)可测量两个分子相互作用时发生的热量变化。用加入1％DMSO的50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)配置1mM的萘普生溶液和0.1mM的ANP/BNP溶液，室温搅拌15min。参比池中只加入缓冲液，样品池中加入1.48mL ANP或BNP溶液，搅拌注射器装有8μL萘普生溶液。萘普生溶液每次注射时间持续16s，间隔240s。每次注射都会形成一个热脉冲，该脉冲与时间积分，并进行浓度归一化，以生成kcal/mol对摩尔比(配体/样品)的滴定曲线。得出的等温线配合结合模型，从而生成亲和力(Kd)、化学计量(n)和相互作用的焓(ΔH)。
为了进一步验证A-Y148和B-F209位点是否为萘普生与ANP和BNP相互作用的关键位点，按照上述方法用萘普生溶液分别滴定含突变位点的A-Y148F蛋白/B-F209A蛋白的溶液，将生成的热力学参数与ANP/BNP溶液进行比较。实验结果如表2所示。
表2ITC测量获得的热力学参数
Figure BDA0001402266090000181
萘普生-ANP/BNP的Kd值显示萘普生与ANP/BNP之间存在相互作用。值得注意的是，萘普生与BNP的相互作用要明显高于其与ANP的相互作用。而且，ANP的Y148和BNP的F209位点突变都导致萘普生与ANP和BNP结合力下降，表明A-Y148和B-F209是萘普生与ANP/BNP结合的关键位点。
实施例5萘普生对细胞中A型和B型流感病毒复制的影响
一、萘普生对A型和B型流感病毒生长曲线的影响
将1×108个/mL A549细胞(Sigma，产品货号为86012804)接种于10cm培养皿，培养基为含10wt％胎牛血清FCS(ThermoFisher，产品目录号为16000044)的DMEM培养基(ThermoFisher，产品目录号为11965118)。在培养箱(37℃，5％CO2)中培养过夜，使细胞长成单层(80％以上汇合度)。用PBS洗涤细胞3次，分别将上述拯救的A型流感病毒WSN A/WSN/1933(H1N1)(Maorong Yu，Xiaoling Liu，Shuai Cao等。Identification andCharacterization of Three Novel Nuclear Export Signals in the Influenza AVirus Nucleoprotein.Journal of Virology，2012(86)：4970-4980)(MOI＝0.1)或B型流感病毒Lee40(Cao S，Jiang J，Li J，Li Y，Yang L，Wang S，Yan J，Gao GF，Liu W。Characterization of the nucleocytoplasmic shuttle of the matrix protein ofinfluenza B virus。J Virol.2014；88(13)：7464-73.doi:10.1128/JVI.00794-14)(MOI＝1)加入培养皿。37℃5％CO2培养箱孵育1h，吸弃病毒液，用PBS洗涤细胞3次，尽量去除残余的液体，每皿加入含12ng萘普生(Sigma，产品货号为82170)的正常细胞培养液(10wt％FCS的DMEM)。于不同时间点收取细胞上清用于后续的噬斑试验(步骤如实施例2所述)检测病毒滴度，绘制病毒生长曲线。
实验结果如图8所示。与未处理组相比，经萘普生处理(+NPX)的细胞中，病毒的滴度均明显下降，表明萘普生对A型流感病毒(图8A)和B型流感病毒(图8B)均有抗病毒作用。
二、萘普生对ANP和BNP出核的影响
将灭菌后的盖玻片放入24孔板，每孔放一片。每孔加入1×105个/mL A549细胞悬液，培养基为含10wt％FCS的DMEM。在培养箱(37℃，5％CO2)中将细胞培养至90-95％汇合度。用PBS洗涤细胞3次，分别将拯救的A型流感病毒WSN A/WSN/1933(H1N1)(MOI＝0.1)和B型流感病毒Lee40(MOI＝1)加入24孔板。37℃5％CO2培养箱孵育1h，吸弃病毒液，用PBS洗涤细胞3次，尽量去除残余的液体，实验组每孔加入含400pg萘普生的正常细胞培养液(10wt％FCS的DMEM)。对照组孔中不加萘普生。
病毒感染后12小时，吸去培养液，根据实施例1所述的步骤，对盖玻片进行封闭、固定和免疫荧光检测。所使用的一抗为ANP多克隆抗体(请参见Liu X，Sun L，Yu M，Wang Z，XuC，Xue Q等，Cyclophilin A interacts with influenza A virus M1protein andimpairs the early stage of the viral replication，Cellular microbiology.2009；11(5)：730-41)或BNP抗体(Santa Cruz，产品货号为sc-80483)，所使用的荧光二抗为TRITC标记的山羊抗兔IgG。使用激光共聚焦荧光显微镜(Olympus FV500)观察DAPI和TRITC通道中的荧光定位。DAPI的激发和发射波长分别为359nm和461nm，TRITC的激发和发射波长分别为550nm和620nm，放大倍数40倍)。
实验结果如图9。病毒感染后24小时，经萘普生处理的细胞中，ANP(图9A)和BNP(图9B)主要定位于细胞核，而未处理组主要定位于细胞质，表明萘普生能够显著抑制ANP和BNP的出核。
三、萘普生对ANP和BNP与CRM1结合的影响
将3×107个/mL 293T细胞接种于60mm培养皿，在培养箱(37℃，5％CO2)中将细胞培养过夜，使细胞长成单层(90-95％以上汇合度)。利用实施例1构建的包含野生型ANP的pCMV-MYC载体(表达带有MYC标签的ANP)或实施例3构建的包含野生型BNP的pCMV-MYC载体(表达带有MYC标签的BNP)与实施例1构建的FLAG-CRM1表达载体对293T细胞进行共转染，37℃、5％CO2培养箱孵育1h，吸弃病毒液，用PBS洗涤细胞3次，尽量去除残余的液体，每个培养皿加入4ng萘普生。利用实施例1构建的包含野生型ANP的pCMV-MYC载体(表达带有MYC标签的ANP)或实施例3构建的包含野生型BNP的pCMV-MYC载体(表达带有MYC标签的BNP)对293T细胞进行转染作为对照。
转染后48小时加入细胞裂解液(1wt％Triton X-100、150mM NaCl、20mM HEPES、10wt％甘油、1mM EDTA(pH 7.4)、5mM Na3VO4)在4℃将细胞裂解，向其中加入5μl抗FLAG M2珠(Sigma，产品货号为A2220)，4℃结合4h或过夜结合。以5000rpm离心2min，弃去上清。再加入1ml细胞裂解液4℃洗涤3次，每次10min。最后加入5×上样缓冲液，煮样5min。以抗c-MYC抗体、抗FLAG抗体(Sigma-Aldrich，产品目录号分别为C3956和F7425)，以及抗β-肌动蛋白抗体(Santa Cruz公司，产品目录号为sc-1616-R)作为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠的单克隆抗体(Jackson，产品目录号为115035003)作为二抗，进行SDS-PAGE电泳和Western印迹分析。
分析结果如图10所示。各图中，第1和3泳道的样品为共转染的细胞的裂解液，第2和4泳道的样品为包含单转染阴性对照的细胞裂解液的结果，排除了抗FLAG抗体与细胞裂解液中其它组分的非特异性相互作用。第3-4泳道的样品为在细胞培养液中加入萘普生。Input为加样对照，IP为利用抗FLAG M2珠(αFLAG)免疫共沉淀的结果。FLAG-CRM1为仅加入抗FLAG抗体作为一抗的Western结果；MYC-ANP(图10A)或MYC-BNP(图10B)为仅加入抗c-MYC抗体作为一抗的Western结果。在图10A和图10B中，第1泳道显示，无萘普生情况下，ANP和BNP均能够与CRM1结合。第3泳道当利用萘普生处理后，ANP或BNP不与CRM1结合。第2和4泳道排除抗FLAG抗体同其它组分的非特异性作用
可见，萘普生抑制了ANP(图10A)和BNP(图10B)与CRM1的结合。表明萘普生通过抑制ANP/BNP与CRM1的结合来抑制NP的出核。
实施例6萘普生对小鼠体内A型和B型流感病毒复制及致病力的影响
一、小鼠分组
6周龄BALB/c小鼠经过乙醚麻醉后，利用鼻吸法吸入50μl的A型流感病毒WSN A/WSN/1933(H1N1)(104PFU/ml)或B型流感病毒Lee40(105PFU/ml)，阴性对照设置为吸入灭菌后的PBS。病毒感染后1d，胃灌注奥司他韦(Sigma，产品货号为PHR1871)(1mg)、腹腔注射低剂量(5mM)或高剂量(50mM)的萘普生1mL或腹腔注射PBS作为对照(1mL)。将小鼠分为体重组和解剖组：体重组用于观察每日体重和小鼠的死亡率，每组8只小鼠。解剖组用于解剖，观察肺脏以及测量肺组织病毒载量，每组12只小鼠。
2、体重检测
体重组每日称取并记录小鼠体重，观察病理特征并记录其死亡个数，共计14天。
3、肺指数测定
解剖组在感染后2d、4d、6d、8d各组分别解剖3只小鼠，称取小鼠体重及肺脏重量，计算肺指数(肺指数＝肺质量/小鼠体重)。
4、肺组织病毒载量测定
对于解剖组小鼠的肺脏，利用QIAGEN TissueLyser II在1ml冰浴PBS中将肺脏组织匀浆，30循环/s进行4min，以5000g将匀浆液离心10min，利用实施例2所述的噬斑实验测定其中的病毒滴度。
解剖组在感染后2d、4d、6d、8d时每组解剖3只小鼠，称取小鼠体重及肺脏重量，计算肺指数(肺指数＝肺质量/小鼠体重)。
实验结果如图11所示。感染A型流感病毒并注射PBS的小鼠(fluA)感染后体重急速下降，并于第6天全部死亡；感染A型流感病毒并用奥司他韦(fluA+Ose)或萘普生处理的小鼠(fluA+NPX50以及fluA+NPX5)在病毒感染后1-4天体重迅速下降，之后缓慢回升(图11A、C)。感染B型流感病毒并注射PBS的小鼠(fluB)、感染B型流感病毒并用奥司他韦(fluB+Ose)或萘普生处理的小鼠(fluB+NPX50以及fluB+NPX5)在病毒感染后1-4天体重迅速下降，之后缓慢回升，1周之后与PBS组无显著差异(图11B)。fluA+奥司他韦组(fluB+Ose)、fluA+萘普生高剂量组(fluB+NPX50)、fluA+萘普生低剂量组(fluB+NPX5)的生存率分别为100％、25％和87.5％，其中的高剂量和低剂量组的差异显著，低剂量组呈现出较高的生存率(图11C)。fluB组、fluB+奥司他韦组、fluB+萘普生高剂量组、fluB+萘普生低剂量组的生存率分别为25％、37.5％和75％，100％(图11D)。可见，与奥司他韦相比，萘普生对于B型流感病毒具有更好的治疗效果，其中低剂量组小鼠全部存活(图11D)。肺脏的眼观病变(图11E)和肺指数(图11F和图11G)数据显示，fluA+奥司他韦组、fluA+萘普生低剂量组、fluB+萘普生低剂量组、fluB+萘普生高剂量组肺脏损伤较轻，肺指数较低。肺脏的病毒载量结果显示，对于fluA，奥司他韦和低剂量萘普生的治疗效果较好(图11H)，而对于fluB，低剂量和高剂量萘普生的治疗效果较好(图11I)。
以上实验结果表明，萘普生在小鼠体内能够抑制A型和B型流感病毒复制及致病力。

Claims (11)

1.与B型流感病毒核蛋白第209位苯丙氨酸相互作用的化合物在制备对感染有B型流感病毒的受试者进行治疗的药物中的用途，其中，所述化合物选自于由如下物质所组成的组：萘普生、萘普生钠、DL-萘普生、萘普生甲酯、23979-41-1、耐普西诺、萘普生-ETEMESIL、萘普生乙酯、萘普生葡糖苷酸、5-氯代萘普生、5-碘代萘普生。
2.与B型流感病毒核蛋白第209位苯丙氨酸相互作用的化合物在制备抑制感染有B型流感病毒的受试者中B型流感病毒核蛋白出核的药物中的用途，其中，所述化合物选自于由如下物质所组成的组：萘普生、萘普生钠、DL-萘普生、萘普生甲酯、23979-41-1、耐普西诺、萘普生-ETEMESIL、萘普生乙酯、萘普生葡糖苷酸、5-氯代萘普生、5-碘代萘普生。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述受试者为哺乳动物。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述哺乳动物为人或海豹。
5.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述化合物抑制B型流感病毒核蛋白的第209位苯丙氨酸与CRM1之间的相互作用。
6.阻断B型流感病毒核蛋白的第209位苯丙氨酸与CRM1之间的相互作用的化合物在制备抑制B型流感病毒核蛋白出核的药物中的用途，其中，所述化合物选自于由如下物质所组成的组：萘普生、萘普生钠、DL-萘普生、萘普生甲酯、23979-41-1、耐普西诺、萘普生-ETEMESIL、萘普生乙酯、萘普生葡糖苷酸、5-氯代萘普生、5-碘代萘普生。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述化合物抑制B型流感病毒核蛋白的第209位苯丙氨酸与CRM1之间的相互作用。
8.一种对具有抑制B型流感病毒感染作用的化合物进行筛选方法，所述方法包含如下步骤：
(a)利用分子三维结构建模软件对所述B型流感病毒核蛋白的三维结构进行建模；
(b)利用分子对接软件筛选能够与所述B型流感病毒核蛋白的第209位苯丙氨酸相互作用的候选化合物；
(c)在细胞水平上对所述候选化合物是否能够抑制B型流感病毒复制进行验证；
其中，所述B型流感病毒核蛋白序列为PDB数据库中的PDB ID：3TJ0。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述步骤(c)按照如下的步骤进行：
(i)以0.01-1的MOI使得哺乳动物细胞感染B型流感病毒；
(ii)在感染1h后将所述候选化合物加入至所述细胞的培养液；
(iii)在感染后12h到72h内，每隔12h收取细胞培养基上清；
(iv)利用噬斑技术检测收取的上清中病毒含量；
当72h后病毒含量小于103PFU时，认为候选化合物具有抑制B型流感病毒复制的作用。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中，步骤(a)中的所述分子三维结构建模软件为pyMol软件。
11.如权利要求8或9所述的方法，其中，步骤(b)中的所述分子对接软件为Dock软件。
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