CN109444047A - 一种单分子力学测试的高效实现方法 - Google Patents
一种单分子力学测试的高效实现方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种单分子力学测试的高效实现方法,包括下列步骤:通过促动器使得样品池相对光阱发生移动,捕获微球;实时处理从而监视双光阱,直到双光阱内均为单个微球;停止促动器运行,然后控制位移台带动样品池以一定频率和振幅在水平方向上做简谐运动;单分子力学测试与数据保存:当监测到双光阱内不均为单球时,若出现多球情况,则通过控制挡板关闭后再打开,释放该光阱内的微球,随后通过控制压电陶瓷反射镜PM的转动从而使可动光阱移动到复位位置;若出现无球情况,则可动光阱直接移动到复位位置。
Description
技术领域
本发明涉及一种单分子力学测试的高效实现方法。特别涉及在光镊系统中的单分子力学测试的自动化方法。本发明相对于光镊系统中的单分子力学测试的传统人工操作方式,能够提高单分子力学测试的效率,对于在光镊系统下的测量、测试具有重要意义。
背景技术
光镊系统能够捕获及操控微米及纳米级的微粒(通常为微球),并对所施加的力进行测量,具有非接触、无损伤、高精度的特点,被广泛用于生物单分子、细胞等测量领域中,极大的促进了定量生物学的发展。单分子力谱测试的传统人工操作方式是在实验时,光镊系统形成同一水平线上的两个光阱,一个光阱固定不动,另一个光阱可以在水平方向上接近或远离固定光阱。在位移台上放置样品池后,手动移动样品池,使光阱和样品池之间发生相对移动,光阱因此可以遍历整个样品池。样品池内为充满磷酸缓冲液的液体环境,其内有若干表面被修饰过的微球。当有微球出现在光阱附近时,就会被光阱所捕获。当两个光阱均捕获有单个微球时,控制可动光阱带动其微球接近固定光阱下的微球,接触后有一定几率会在两微球间粘附单分子。随后控制可动光阱远离固定光阱,远离过程中双光阱所在的光路产生的相关数据可以分别通过两个四象限探测器进行采集,对采集到的数据进行分析,可以得到力学测试结果。
当开始进行实验时,首先要做的就是通过光阱捕获微球,但是,在传统的手动操作的光镊系统中,需要依靠手动移动样品池来捕获微粒,且由于高倍物镜下的视场很小,在寻找过程中无法获得样品池内的微球的整体分布情况,因此当有微球出现在视场时,需要依靠操作者的迅速反应才能及时将微球移动至光阱周围。在双光阱光镊系统中,当某个光阱A成功捕获单个微球后,光阱B捕获微球的同时要保证光阱A内捕获的微球不丢失且没有额外的微球进入光阱A,手动捕获的难度无疑更大,对操作者的要求更高,成功捕获的几率则更低。在力学测试实验过程中,单次实验获取有效力学数据的几率很小,所以需要依靠大量的重复性实验以获取足够多的有效实验数据。在双光阱捕获微球后的力学测试过程中,对操纵人员的操作速度、操作经验要求很高,而这往往直接决定了实验的成败。此外,实验过程中会产生大量的原始数据,而大部分数据都为无效数据,这样也为数据的存储、交换造成了一定不便。
据此,本发明提出一种单分子力学测试的高效实现方法。
发明内容
本发明的目的是,改进现有的光镊系统,并给出利用改进的光镊系统实现高效的单分子力学测试的方法自动完成微球捕获。本发明通过促动器使得样品池与光阱发生相对移动、力学测试、数据保存等工作。技术方案如下:
一种单分子力学测试的高效实现方法,对光镊系统的改进如下:
①压电陶瓷反射镜PM的转动可由上位机进行精确控制;上位机通过控制PM反射镜的转动,改变激光反射后的角度,从而精确控制其中一个光阱的移动;
②样品池的水平对称轴处放置促动器X,促动器X与样品池的左侧接触,带动样品池沿水平方向移动;样品池的竖直对称轴处放置促动器Y,促动器Y与样品池的上侧接触,带动样品池沿竖直方向移动;
③设置在光路的不同位置处的挡板均设置有开关,上位机通过通信控制系统控制三个挡板的打开和闭合。
所述的高效实现方法包括下列步骤:
步骤1:通过促动器使得样品池相对光阱发生移动,从而寻找微球,当有微球出现在光阱周围时,就会被光阱捕获;
步骤2:上位机通过对相机的显微图像指定区域进行实时处理从而监视双光阱,直到双光阱内均为单个微球;
步骤3:停止促动器运行,然后控制位移台带动样品池以一定频率和振幅在水平方向上做简谐运动,采集此过程中四象限探测器产生的电压信号,对该信号进行傅里叶变换等方式分析处理后得到光阱刚度与四象限探测器灵敏度参数;
步骤4:单分子力学测试与数据保存:
①,通过控制压电陶瓷反射镜PM转动,改变该路激光的反射反向,从而控制可动光阱带动其捕获的微球移动到碰撞位置。
②,通过控制可动光阱带动其内捕获的微球水平移动使得令双光阱微球接触碰撞若干次,然后可动光阱带动其内捕获的微球移动到拉伸起始处。
③,可动光阱从拉伸起始处开始继续移动指定拉伸长度的距离,随后再返回拉伸起始处,从四象限探测器中获取该过程的电压信号的变化情况,并对该过程中的信号进行分析与处理,完成一次对生物单分子的力学测试。
④,根据③中的数据处理结果,若两微球之间成功粘连单分子,则③过程中电压信号的方差会大于某个设定阈值,此时保存该次力学测试数据并返回③;否则,返回①。
步骤5:重复步骤1~步骤4,在步骤3与步骤4的任意时刻,当监测到双光阱内不均为单球时,若出现多球情况,则通过控制挡板关闭后再打开,释放该光阱内的微球,随后通过控制压电陶瓷反射镜PM的转动从而使可动光阱移动到复位位置;若出现无球情况,则可动光阱直接移动到复位位置。随后返回步骤①。
附图说明
图1是双光阱光镊系统的光路结构。
图2是所提样品池、位移台、促动器的位置。
图3是样品池前后光路的示意图。
图4是所提方法的流程图。
图5是力学测试过程的各位置解释。
图6是寻找捕获微球时,样品池在平面中的移动路径示意图。
图7是相机判断双光阱内微球的存在情况(无微球、单微球、多微球)。
图8是力学测试过程中碰撞阶段(左图)与拉伸阶段(右图)的流程图。
具体实施方式
下面结合实例和附图对本发明的一种单分子力学测试的高效实现方法做出详细说明。
本发明的目的为在位移台上放置好样品池后,控制程序可以依据下列步骤,自动完成数据采集与处理、样品池的移动路径规划(寻找微球)、微球存在情况判断、功率谱计算、力学测试与分析、数据保存等工作。
光路部分解释如下:
如附图1所示,激光器出射的激光首先通过隔离器ISO,然后经由透镜组T1扩束。半波片HW1、HW2与偏振分光棱镜PBS1、光阱BD构成功率调整模块,使入射激光经过此模块结构后的出射激光功率大幅度降低。偏振分光棱镜PBS2使入射激光分为反射光和透射光两部分,其中,反射光经过声光调制器AOM后,被反射镜Mirror1改变传播方向。透射光被压电陶瓷反射镜PM改变传播方向。当挡板Shutter1与挡板Shutter2均打开时,两路光最终在偏振分光棱镜PBS2处汇合,然后一起经由透镜组T2再次进行扩束。扩束后的激光被二向色镜DM1反射后穿过汇聚物镜FO,随后通过PI位移台与样品池SP。从样品池SP出射的激光经过聚光物镜BO后被二向色镜DM2反射,然后穿过透镜RL。最后在被反射镜Mirror改变传播方向后,经由偏振分光棱镜PBS4后两路激光分别被两个四象限探测器QPD接收。
上位机可以精确控制压电陶瓷反射镜PM在水平面内偏转,精度在纳弧度级别。当偏振分光棱镜PBS2的透射光打在压电陶瓷反射镜PM上时,控制PM转动,可控制反射后光束的出射方向,即可控制样品池内对应光阱的移动。因此,PM路激光产生的光阱称之为可动光阱,移动范围约为10μm。
激光在偏振分光棱镜PBS2处分为透射光和反射光,又在偏振分光棱镜PBS3处合为一束光。若在偏振分光棱镜PBS3处两束光的频率接近,则会发生干涉。因此对偏振分光棱镜PBS2的反射光,使用声光调制器AOM改变其频率,接着被反射镜Mirror1反射后,在偏振分光棱镜PBS3处于PM路的激光汇合。由于反射镜Mirror1的位置固定,致使AOM路的激光在样品内的光阱是固定不动的,因此,AOM路激光产生的光阱称之为固定光阱。
挡板Shutter1与挡板Shutter2分别决定着可动光阱与固定光阱的存在情况,上位机通过通信系统控制挡板的开启与关闭。若挡板Shutter1关闭,则阻断PM路激光的传播,样品池内对应的光阱随之消失。若挡板Shutter2关闭,则阻断AOM路激光的传播,样品池内对应的光阱也会随之消失。实验时,若发现某光阱内捕获有多个微球,在关闭该路光阱对应的挡板,当微球被液体流动冲走后,打开挡板,即起到释放光阱内微球的作用。第三个挡板shutter3在打开时,调整样品池SP到合适的位置处可以观测到明显的亮斑,说明此时光阱出现在了样品池内。调整完毕后关闭shutter3会滤除掉该光斑以避免影响实验的观测。
如附图2所示,样品池在磁铁的作用下,竖直的贴在位移台上。促动器X固定在位移台的水平轴上,促动器Y固定在位移台的竖直轴上。当位移台移动时,会带动促动器与样品池同步移动。促动器实际上是可延轴伸缩的步进电机,以促动器X为例。当促动器X向右移动时,会推着样品池向右;当促动器X向左移动时,会拉着样品池向左。因此,当位移台静止时,促动器可以使样品池在平面内移动,从而使光阱与样品池之间发生相对位移。促动器的精度在微米级别,且量程较大,因此可以使光阱遍历整个样品池。位移台的量程较小,但是精度在纳米级别。
样品池前后的光路大致如附图3所示,其中,四象限探测器由四个光电二极管以2*2的形式紧密的排列在四个象限内,当激光打在光电二极管上时,由于发生光电效应,会在该二极管上会产生电流,电流的大小与激光的光强成正比,产生的电流经过内部的运算放大器,转换成电压信号输出,输出值与激光打在四象限探测器上的位置有关。当激光打在四象限探测器的正中心时,输出的电压值约为0。当位移台带动样品池移动时,激光打在四象限探测器上的位置及光强发生变化,得到的输出电压值也随之变化。采集这个过程的电压变化信号,对其做傅里叶分析等处理,可以计算出光阱刚度等参数。
微球偏离光阱中心或PM反射镜移动,均会导致四象限探测器QPD上的信号发生改变。然而,只有微球偏离光阱中心而产生的数据是实验所需要的,PM反射镜移动导致的信号变化应尽可能小。因此,在光路结构上,压电陶瓷反射镜PM与汇聚物镜FO的入瞳关于透镜组T2共轭,两个四象限探测器与聚光物镜BO的后焦平面关于透镜RL共轭,可以在理论上使PM反射镜的的移动不引起QPD的接收信号随之变化。
实验开始后,在PI位移台上放置制备好的样品池,样品池内部为充满磷酸缓冲液的液体环境,其中有表面被修饰过的聚苯乙烯微球,以及大量生物单分子(如DNA),生物单分子的两端可以与微球表面进行特异性结合。激光在样品池内出现两处光阱,光阱对对其附近的微球具有吸附捕获作用。通过CCD相机可以看到视场内对应的显微图像。控制促动器去移动样品池,使光阱遍历样品池去搜寻微球,直到双光阱内均为单个微球。然后通过控制压电陶瓷反射镜PM水平转动控制可动光阱移动,从而使可动光阱的微球接近固定光阱的微球。当两个微球碰撞后,有一定几率可以在其之间粘连生物单分子。碰撞后,使可动光阱的微球远离固定光阱的微球一段距离。根据背焦平面干涉法,当微球在光阱的中心时,在聚光物镜BO的后焦平面由于干涉会产生均匀的圆环;当微球偏离光阱中心时,聚光物镜的后焦平面干涉圆环的能量分布会随之改变。该能量变化会导致四象限探测器上的信号也发生变化。当两球之间成功粘连生物单分子时,记录此过程中QPD上的数据变化,分析处理后可以得到此过程的生物单分子的力谱测试数据。若两球间未成功粘连生物单分子,则舍弃此阶段QPD的数据,并进行下一轮的碰撞。
整体步骤如附图4所示,且步骤中提到的力学测试过程中的各位置如附图5所示。
详细步骤说明如下:
1,控制可动光阱移动到复位位置,然后通过促动器控制样品池,让样品池和光阱发生相对移动,光阱因此可以遍历整个样品池。当有微球出现在光阱周围时,就会被光阱捕获。样品池的移动路径可以根据实际需要进行调整,本发明示例的移动路径如附图6所示,具体内容叙述如下:假设样品池要遍历的区间为水平长度为a,竖直长度为b的矩形,其中,将b进行n等分,每份长度为c,则样品池从起始位置(矩形的右下角)开始,先以一定速度向左移动长度a,再以一定速度向上移动长度c,移动完毕后判断此时样品池在竖直方向上的总移动长度:若大于等于b,则样品池以一定速度移动至起始位置,否则,向右水平移动长度a距离。移动完毕后再次判断此时样品池在竖直方向上的总移动长度:若大于等于b,则样品池以一定速度移动至起始位置,否则,向左水平移动长度a的距离。后续移动情况以此类推。当样品池移动到起始位置后,即开始下一轮移动。
2,在步骤1的样品池移动的同时,对相机传来的图像,选择如附图7所示的相邻的两块矩形区域(左边的区域代表固定光阱,右边的区域代表可动光阱),用卷积神经网络(结构为VGGNet)识别这两个矩形区域内的图像,然后分别得到双光阱处微球存在情况的判断结果:无球、单球以及多球的概率。判断结果如附图7右侧中所示,Left_Single表示固定光阱内单球的概率,Left_Multi表示固定光阱内多球的概率,Left_None表示固定光阱内无球的概率。只有当Left_Single的数值大于某设定值(如90%)时,才认为此时固定光阱内微球的存在情况为单球。Right_Single、Right_Multi、Right_None分别表示可动光阱内微球为单球、多球以及无球的情况。同样的,只有当Right_Single的数值大于某设定值(如90%)时,才认为此时可动光阱内微球的存在情况为单球。只有当两个光阱内均判断为单球时,才转入步骤3。
3,停止促动器运行,然后通过位移台带动样品池以一定频率和振幅在水平方向上做简谐运动,该运动会导致四象限探测器上产生数据波动,采集这些数据后通过傅里叶变换等方式分析处理得到光阱刚度等参数后,将可动光阱移动到复位位置。
4,单分子力谱测试及数据保存,其中碰撞和拉伸阶段的流程图如附图8所示,具体步骤如下:
①:控制可动光阱以较快的速度从复位位置移动到起始位置,随后再以相对较慢的速度从初始位置移动到碰撞位置。
②:可动光阱控制的微球对固定光阱控制的微球进行预设次数的碰撞。初始碰撞深度为Collision_min(nm)。
③:碰撞深度+1预设增量(Collision Plus(nm)),若此时碰撞深度大于最大碰撞深度(Collision_max(nm)),则释放微球,同时可动光阱移动到复位位置,然后跳转至步骤①;若此时碰撞深度不大于最大碰撞深度,则控制可动光阱将微球从碰撞位置移动到拉伸起始处。
④:控制可动光阱带动微球以一定速度从拉伸起始处开始移动指定拉伸长度的距离(移动方向为使两个光阱的间距增大的方向),随后再返回拉伸起始处,完成一次对单分子的力学测试。初始拉伸长度为Tensile_Min(nm)。
⑤:根据背焦平面探测法对④中产生的力学数据进行分析,判断两个微球之间是否成功粘连单分子。如果未粘连,则控制可动光阱以一定速度返回碰撞位置,然后跳转至步骤②;否则,保存该次力学测试数据。
⑥:判断拉伸记录次数是否到达拉伸预设次数:
若未到达拉伸预测次数,则拉伸记录次数+1并返回④。
若到达拉伸预设次数,则判断此时拉伸长度是否大于拉伸最大处:
大于拉伸最大处,则释放双光阱内的微球,然后可动光阱移动至复位位置并跳转至步骤①;
不大于拉伸最大处,则拉伸长度+1预设增量(Tensile Plus(nm))并跳转至步骤④。
5,双光阱内均为单球是步骤3和步骤4的前提。在步骤3与步骤4中的任意时刻,均实时的计算处理相机传来的图像,并得到双光阱内微球存在情况的判断结果。当判断到双光阱内并非均为单球时,停止步骤3或步骤4,同时释放光阱内微球,返回步骤1。
Claims (1)
1.一种单分子力学测试的高效实现方法,对光镊系统的改进如下:
①压电陶瓷反射镜PM的转动可由上位机进行精确控制;上位机通过控制PM反射镜的转动,改变激光反射后的角度,从而精确控制其中一个光阱的移动;
②样品池的水平对称轴处放置促动器X,促动器X与样品池的左侧接触,带动样品池沿水平方向移动;样品池的竖直对称轴处放置促动器Y,促动器Y与样品池的上侧接触,带动样品池沿竖直方向移动;
③设置在光路的不同位置处的挡板均设置有开关,上位机通过通信控制系统控制三个挡板的打开和闭合。
所述的高效实现方法包括下列步骤:
步骤1:通过促动器使得样品池相对光阱发生移动,从而寻找微球,当有微球出现在光阱周围时,就会被光阱捕获;
步骤2:上位机通过对相机的显微图像指定区域进行实时处理从而监视双光阱,直到双光阱内均为单个微球;
步骤3:停止促动器运行,然后控制位移台带动样品池以一定频率和振幅在水平方向上做简谐运动,采集此过程中四象限探测器产生的电压信号,对该信号进行傅里叶变换等方式分析处理后得到光阱刚度与四象限探测器灵敏度参数;
步骤4:单分子力学测试与数据保存:
①,通过控制压电陶瓷反射镜PM转动,改变该路激光的反射反向,从而控制可动光阱带动其捕获的微球移动到碰撞位置;
②,通过控制可动光阱带动其内捕获的微球水平移动使得令双光阱微球接触碰撞若干次,然后可动光阱带动其内捕获的微球移动到拉伸起始处;
③,可动光阱从拉伸起始处开始继续移动指定拉伸长度的距离,随后再返回拉伸起始处,从四象限探测器中获取该过程的电压信号的变化情况,并对该过程中的信号进行分析与处理,完成一次对生物单分子的力学测试;
④,根据③中的数据处理结果,若两微球之间成功粘连单分子,则③过程中电压信号的方差会大于某个设定阈值,此时保存该次力学测试数据并返回③;否则,返回①;
步骤5:重复步骤1~步骤4,在步骤3与步骤4的任意时刻,当监测到双光阱内不均为单球时,若出现多球情况,则通过控制挡板关闭后再打开,释放该光阱内的微球,随后通过控制压电陶瓷反射镜PM的转动从而使可动光阱移动到复位位置;若出现无球情况,则可动光阱直接移动到复位位置;随后返回步骤①。
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