CN109416362B - 溶血-Gb1作为可药化靶标的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及溶血‑Gb1作为药物开发中的可药化靶标的体外用途，并且涉及用于治疗和/或预防疾病的溶血‑Gb1的拮抗剂，其中所述疾病是戈谢病或帕金森病。
Description
本发明涉及溶血-Gb1(lyso-Gb1)的用途，溶血-Gb1的拮抗剂，溶血-Gb1的拮抗剂的用途，产生疾病动物模型的方法，筛选适用于和/或能够治疗和/或预防疾病的药剂的方法，以及评价药剂在治疗和/或预防疾病中的效果的方法。
现代药物开发不再依赖于或多或少的探索式方法，而是通常涉及阐明疾病或病症的分子机制、鉴定候选靶标分子和评价所述靶标分子。一旦这样的经验证的靶标分子(在本文中也称为靶标)是可用的，则可以测试针对其的候选药物。在许多情况下，这样的候选药物是化合物文库的成员，该化合物文库可以由合成或天然化合物组成。组合文库的使用也很常见。这样的化合物文库在本文中也称为候选化合物文库。虽然在过去这种方法已被证明是成功的，但是它仍然耗费时间和金钱。目前，不同的技术应用于靶标识别和靶标验证。
药物开发的另一个先决条件是用于所讨论的疾病或病症的动物模型的可用性。缺乏适当的动物模型增加了任何药物开发的失败的风险，因为在候选药物的筛选、表征和评价中使用的基于细胞的测定与这样的候选药物在人体中的测试之间存在相当大的差距，在基于细胞的测定中获得的结果通常不允许对候选药物在人体中的行为进行全面且基于事实的预测。然而，分别针对所讨论的疾病和病症的动物模型的质量也是重要的。动物模型越好地反映了在人中分别所讨论的疾病和病症的特质，从候选药物的测试中获得的结果就越可靠，这显著降低了候选药物在治疗人类患者中最终失败的风险。
在众多人类疾病中，溶酶体贮积症(lysosomal storage diseases)，在本文中也称为溶酶体贮积病(lysosomal storage disorders)或LSD，是一组由溶酶体功能缺陷导致的罕见的遗传性代谢病症。当机体细胞中的特定细胞器–溶酶体–功能失常时，导致LSD。一些比较突出的溶酶体贮积症是戈谢病(Gaucher’s disease)和法布里病(Fabry disease)。
LSD是由通常由脂质、糖蛋白或所谓的黏多糖的代谢所需要的单个酶的缺陷导致的溶酶体功能障碍所引起的。个别地，LSD以约1:10,000至1:250,000的频率发生，然而，作为一个组来看，发病率为约1:5,000。这些病症中的大部分是常染色体隐性遗传的；然而，少部分是X连锁遗传的，如法布里病和亨特综合征(Hunter syndrome)。
同其他遗传病一样，个体典型地从其父母遗传溶酶体贮积症。尽管每种病症是由翻译成酶活性缺陷的不同的基因突变导致，但是它们均具有共同的生物化学特征–几乎所有的溶酶体病症都是由溶酶体内部异常的物质积聚产生的。
溶酶体贮积症主要影响儿童，并且他们通常在年轻和不可预知的年龄死亡，许多在出生几个月或几年内死亡。许多其他儿童在患有特定病症的各种症状的几年后死于该疾病。
取决于特定病症以及其他变量如发病年龄，溶酶体贮积症的症状有所不同，并且可以从轻微到严重。它们可以包括发育迟缓(developmentaldelay)、运动障碍(movementdisorders)、发作(seizures)、痴呆(dementia)、耳聋(deafness)和/或失明(blindness)。一些患有溶酶体贮积症的人具有肿大的肝脏(肝大(hepatomegaly))和肿大的脾脏(脾大(splenomegaly))、肺和心脏问题以及发育异常的骨骼。
迄今为止，尽管对一些适应证已经使用骨髓移植和酶替代疗法(缩写为ERT)取得了良好的成功，但是对于溶酶体贮积症没有针对病因的治愈，并且治疗主要是针对症状的。另外，在专门的中心对多种这些疾病进行脐带血移植。另外，目前正针对这些疾病中的一些疾病评估底物减少疗法(substrate reduction therapy，缩写为SRT)，这是一种用于减少贮存物质的积聚的方法。此外，正针对这些病症中的某些病症检验伴侣分子疗法，这是一种用来稳定患者产生的缺陷酶类的技术。基因疗法构成了这些疾病的治疗的另一种选择。
来自溶酶体贮积症的组的一种突出疾病是戈谢病。戈谢病由葡糖脑苷脂酶基因(缩写为GBA基因)的遗传缺陷引起，该遗传缺陷导致相应的溶酶体酶葡糖脑苷脂酶(缩写为GCase)的缺乏。葡糖神经酰胺(缩写为GlcCer)在内质网中的形成和在细胞溶酶体中的降解的日益加深的差异导致GlcCer在组织巨噬细胞中的显著积聚。戈谢病的主要临床症状为肝脏和脾脏肿大、红细胞和血小板减少以及导致骨折和骨坏死的风险增加的骨骼异常。葡糖鞘氨醇(glucosylsphingosine，缩写为lyso-Gb1)，即葡糖神经酰胺的脱酰基形式，最近已被鉴定为戈谢病的敏感且特异的生物标志物(参见，例如，国际专利申请WO 2012/167925)。
在1982年首次记录了在婴儿和青少年GD患者中的大脑和小脑中的溶血-Gb的积聚(Nilsson等,1982,J Neurochem 39:709-718)。溶血-Gb1是一种两亲化合物，据报道它起源于溶酶体酸性神经酰胺酶对细胞的主要鞘糖脂贮存产物葡糖神经酰胺的酶促作用(Flanagan等,2013,Mol GenetMetab 108:S40-41；Ferraz等,2016,FEBS Lett 590:716-725)。溶血-Gb1高度富集于患有神经病性GD(neuronopathic GD)的患者的脑组织中，但是不富集于在非神经病性GD(non-neuronopathic GD)患者中(Orvisky等,2002,Mol GenetMetab 76:262-70)。
本发明的一个基础问题是提供适用于治疗溶酶体贮积症并且特别是戈谢病中的治疗方法的靶标。
本发明的一个基础问题是提供适用于治疗帕金森病中的治疗方法的靶标。
本发明的另一个基础问题是提供动物模型，更特别是特别用于溶酶体贮积症和戈谢病的动物模型，以及产生这样的动物模型的方法。
本发明的另一个基础问题是提供动物模型，更特别是用于帕金森病的动物模型，以及产生这样的动物模型的方法。
本发明的另一个基础问题是提供治疗和/或预防疾病、优选溶酶体贮积症并且更优选戈谢病的方法。
本发明的另一个基础问题是提供治疗和/或预防疾病、优选帕金森病的方法。
本发明的又一个基础问题是提供筛选适用于和/或能够治疗和/或预防疾病的药剂的方法，其中所述疾病优选为溶酶体贮积症并且更优选戈谢病。
本发明的又一个基础问题是提供筛选适用于和/或能够治疗和/或预防疾病的药剂的方法，其中所述疾病为帕金森病。
最后，本发明的一个基础问题是提供评价药剂在治疗和/或预防疾病中的效果的方法，其中所述疾病优选为溶酶体贮积症并且更优选戈谢病。
类似地，本发明的一个基础问题是提供评价药剂在治疗和/或预防疾病中的效果的方法，其中所述疾病为帕金森病。
本发明涉及的这些和其他问题由后附权利要求的主题来解决。另外，本发明涉及的这些和其他问题由随后的实施方案的主题来解决。
实施方案1：溶血-Gb1作为疾病治疗中的靶标的用途。
实施方案2：根据实施方案1所述的溶血-Gb1的用途，其中所述疾病是溶酶体贮积症(LSD)。
实施方案3：根据实施方案1至2中任一项所述的用途，其中所述溶酶体贮积症是由葡糖脑苷脂酶的缺陷性活性引起的溶酶体贮积症。
实施方案4：根据实施方案1至3中任一项所述的用途，其中所述疾病是戈谢病。
实施方案5：根据实施方案4所述的用途，其中戈谢病是轻微形式的戈谢病。
实施方案6：根据实施方案4所述的用途，其中戈谢病是非神经病性戈谢病。
实施方案7：根据实施方案4所述的用途，其中戈谢病是神经病性戈谢病。
实施方案8：根据实施方案1至4中任一项所述的用途，其中所述疾病选自包括1型戈谢病、2型戈谢病和3型戈谢病的组。
实施方案9：根据实施方案8所述的用途，其中所述疾病是1型戈谢病。
实施方案10：根据实施方案1至8中任一项所述的用途，其中所述疾病是2型戈谢病或3型戈谢病。
实施方案11：根据实施方案1所述的用途，其中所述疾病是帕金森病。
实施方案12：根据实施方案1至11中任一项所述的用途，其中所述靶标是可药化靶标。
实施方案13：根据实施方案1至12中任一项所述的用途，其中所述靶标是体外靶标。
实施方案14：根据实施方案1至13中任一项所述的用途，其中所述用途是体外用途。
实施方案15：根据实施方案1至12中任一项所述的用途，其中所述靶标是体内靶标。
实施方案16：根据实施方案1至12和15中任一项所述的用途，其中所述用途是体内用途。
实施方案17：溶血-Gb1作为药物开发中的靶标的用途，优选地所述药物能够和/或适用于治疗和/或预防疾病。
实施方案18：根据实施方案17所述的溶血-Gb1的用途，其中所述疾病是溶酶体贮积症(LSD)。
实施方案19：根据实施方案17至18中任一项所述的用途，其中所述溶酶体贮积症是由葡糖脑苷脂酶的缺陷性活性引起的溶酶体贮积症。
实施方案20：根据实施方案17至19中任一项所述的用途，其中所述疾病是戈谢病。
实施方案21：根据实施方案20所述的用途，其中戈谢病是轻微形式的戈谢病。
实施方案22：根据实施方案20至21中任一项所述的用途，其中戈谢病是非神经病性戈谢病。
实施方案23：根据实施方案20所述的用途，其中戈谢病是神经病性戈谢病。
实施方案24：根据实施方案17至21中任一项所述的用途，其中所述疾病选自包括1型戈谢病、2型戈谢病和3型戈谢病的组。
实施方案25：根据实施方案24所述的用途，其中所述疾病是1型戈谢病。
实施方案26：根据实施方案17至24中任一项所述的用途，其中所述疾病是2型戈谢病或3型戈谢病。
实施方案27：根据实施方案17所述的用途，其中所述疾病是帕金森病。
实施方案28：根据实施方案17至27中任一项所述的用途，其中所述靶标是可药化靶标。
实施方案29：根据实施方案17至28中任一项所述的用途，其中所述药物是溶血-Gb1的拮抗剂。
实施方案30：根据实施方案29所述的用途，其中所述拮抗剂能够减轻或改善疾病的至少一种症状。
实施方案31：根据实施方案29所述的用途，其中所述拮抗剂能够治疗疾病，优选地在人中治疗疾病。
实施方案32：根据实施方案29所述的用途，其中所述拮抗剂能够在疾病的动物模型中减轻或改善所述疾病的至少一种症状。
实施方案33：根据实施方案29所述的用途，其中所述拮抗剂能够在疾病的动物模型中治疗所述疾病。
实施方案34：根据实施方案29至33中任一项所述的用途，其中所述疾病是如实施方案18至27中任一项所限定的任何疾病。
实施方案35：根据实施方案32至34中任一项所述的用途，其中所述动物模型是溶血-Gb1诱导动物模型。
实施方案36：根据实施方案32至35中任一项所述的用途，其中所述动物模型是用于所述疾病的动物模型。
实施方案37：根据实施方案36所述的用途，其中用于所述疾病的动物模型或所述疾病的动物模型是用于如实施方案18至27中任一项所限定的疾病的动物模型。
实施方案38：根据实施方案32至37中任一项所述的用途，其中所述动物模型是哺乳动物。
实施方案39：根据实施方案38所述的用途，其中所述哺乳动物是啮齿动物。
实施方案40：根据实施方案39所述的用途，其中所述啮齿动物选自包括小鼠和大鼠的组。
实施方案41：根据实施方案38所述的用途，其中所述哺乳动物选自包括灵长类动物、狗、猪和羊的组。
实施方案42：根据实施方案29至41中任一项所述的用途，其中所述拮抗剂能够减轻所述疾病的至少一种外周症状。
实施方案43：根据实施方案42的用途，其中所述疾病的至少一种外周症状选自包括脾内脏肿大、轻度贫血和炎性组织反应的组，优选1型、2型和/或3型戈谢病的至少一种外周症状，更优选1型戈谢病的至少一种外周症状。
实施方案44：根据实施方案43所述的用途，其中所述动物模型是小鼠动物模型。
实施方案45：根据实施方案44所述的用途，其中所述小鼠动物模型是溶血-Gb1诱导动物小鼠模型。
实施方案46：根据实施方案45所述的用途，其中所述溶血-Gb1诱导动物小鼠模型是用于戈谢病的溶血-Gb1诱导模型，优选地所述小鼠选自包括C57BL/6JRj小鼠、C57BL/6小鼠和C57/BL/10小鼠的组。
实施方案47：根据实施方案46所述的用途，其中所述戈谢病选自包括轻微形式的戈谢病、1型戈谢病和非神经病性戈谢病的组。
实施方案48：根据实施方案17至47中任一项所述的用途，其中所述药物选自包括以下的组：小分子、溶血-Gb 1结合蛋白、溶血-Gb1结合肽、其抗体或抗原结合片段、anticalin、适体(aptamer)、镜像体(spiegelmer)和溶血-Gb1降解酶。
实施方案49：根据实施方案48所述的用途，其中所述抗体是抗溶血-Gb1抗体，并且抗体片段是所述抗体的溶血-Gb1结合片段。
实施方案50：根据实施方案48所述的用途，其中所述适体、所述镜像体和所述anticalin各自与溶血-Gb1结合或者能够与溶血-Gb1结合。
实施方案51：溶血-Gb1在产生疾病的动物模型中的用途。
实施方案52：根据实施方案51所述的溶血-Gb1的用途，其中所述疾病是溶酶体贮积症(LSD)。
实施方案53：根据实施方案51至52中任一项所述的用途，其中所述溶酶体贮积症是由葡糖脑苷脂酶的缺陷性活性引起的溶酶体贮积症。
实施方案54：根据实施方案51至53中任一项所述的用途，其中所述疾病是戈谢病。
实施方案55：根据实施方案54所述的用途，其中戈谢病是轻微形式的戈谢病。
实施方案56：根据实施方案55所述的用途，其中戈谢病是非神经病性戈谢病。
实施方案57：根据实施方案54所述的用途，其中戈谢病是神经病性戈谢病。
实施方案58：根据实施方案51至55中任一项所述的用途，其中所述疾病选自包括1型戈谢病、2型戈谢病和3型戈谢病的组。
实施方案59：根据实施方案58所述的用途，其中所述疾病是1型戈谢病。
实施方案60：根据实施方案51至58中任一项所述的用途，其中所述疾病是2型戈谢病或3型戈谢病。
实施方案61：根据实施方案51至58中任一项所述的用途，其中所述疾病是3型戈谢病。
实施方案62：根据实施方案51所述的用途，其中所述疾病是帕金森病。
实施方案63：根据实施方案51至62中任一项所述的用途，其中所述动物模型是溶血-Gb1诱导动物模型。
实施方案64：根据实施方案51至63中任一项所述的用途，其中所述动物模型是哺乳动物。
实施方案65：根据实施方案64所述的用途，其中所述哺乳动物是啮齿动物。
实施方案66：根据实施方案65所述的用途，其中所述啮齿动物选自包括小鼠和大鼠的组。
实施方案67：根据实施方案64所述的用途，其中所述哺乳动物选自包括灵长类动物、狗、猪和羊的组。
实施方案68：根据实施方案66所述的用途，其中所述动物模型是小鼠动物模型。
实施方案69：根据实施方案68所述的用途，其中所述小鼠动物模型是溶血-Gb1诱导小鼠动物模型。
实施方案70：根据实施方案69所述的用途，其中所述溶血-Gb1诱导小鼠模型是用于戈谢病的溶血-Gb1诱导小鼠模型，优选地所述小鼠选自包括C57BL/6JRj小鼠、C57BL/6小鼠和C57/BL/10小鼠的组。
实施方案71：根据实施方案70所述的用途，其中所述戈谢病选自包括轻微形式的戈谢病、1型戈谢病和非神经病性戈谢病的组。
实施方案72：一种用于治疗和/或预防疾病的溶血-Gb1的拮抗剂。
实施方案73：根据实施方案72使用的拮抗剂，其中所述拮抗剂选自包括以下的组：小分子、溶血-Gb 1结合蛋白、溶血-Gb1结合肽、其抗体或抗原结合片段、anticalin、适体、镜像体和溶血-Gb1降解酶。
实施方案74：根据实施方案73使用的拮抗剂，其中所述抗体是抗溶血-Gb1抗体，并且抗体片段是所述抗体的溶血-Gb1结合片段。
实施方案75：根据实施方案73使用的拮抗剂，其中所述适体和所述镜像体各自与溶血-Gb1结合或者能够与溶血-Gb1结合。
实施方案76：根据实施方案72至75中任一项使用的拮抗剂，其中所述疾病是溶酶体贮积症(LSD)。
实施方案77：根据实施方案76使用的拮抗剂，其中所述溶酶体贮积症是由葡糖脑苷脂酶的缺陷性活性引起的溶酶体贮积症。
实施方案78：根据实施方案72至77中任一项使用的拮抗剂，其中所述疾病是戈谢病，优选地所述拮抗剂能够减轻所述戈谢病的至少一种外周症状，其中更优选地所述疾病的至少一种外周症状选自包括脾内脏肿大、轻度贫血和炎性组织反应的组，优选1型、2型和/或3型戈谢病的至少一种外周症状，更优选1型戈谢病的至少一种外周症状。
实施方案79：根据实施方案78使用的拮抗剂，其中戈谢病是轻微形式的戈谢病。
实施方案80：根据实施方案78使用的拮抗剂，其中戈谢病是非神经病性戈谢病。
实施方案81：根据实施方案78使用的拮抗剂，其中戈谢病是神经病性戈谢病。
实施方案82：根据实施方案72至78中任一项使用的拮抗剂，其中所述疾病选自包括1型戈谢病、2型戈谢病和3型戈谢病的组。
实施方案83：根据实施方案82使用的拮抗剂，其中所述疾病是1型戈谢病。
实施方案84：根据实施方案72至82中任一项使用的拮抗剂，其中所述疾病是2型戈谢病或3型戈谢病。
实施方案85：根据实施方案72使用的拮抗剂，其中所述疾病是帕金森病。
实施方案86：溶血-Gb1的拮抗剂在制备药物中的用途。
实施方案87：根据实施方案86所述的用途，其中所述拮抗剂选自包括以下的组：小分子、溶血-Gb 1结合蛋白、溶血-Gb1结合肽、其抗体或抗原结合片段、anticalin、适体、镜像体和溶血-Gb1降解酶。
实施方案88：根据实施方案87所述的用途，其中所述抗体是抗溶血-Gb1抗体，并且抗体片段是所述抗体的溶血-Gb1结合片段。
实施方案89：根据实施方案87所述的用途，其中所述适体、所述镜像体和所述anticalin各自与溶血-Gb1结合或者能够与溶血-Gb1结合。
实施方案90：根据实施方案86至89中任一项所述的用途，其中所述疾病是溶酶体贮积症(LSD)。
实施方案91：根据实施方案90所述的用途，其中所述溶酶体贮积症是由葡糖脑苷脂酶的缺陷性活性引起的溶酶体贮积症。
实施方案92：根据实施方案86至91中任一项所述的用途，其中所述疾病是戈谢病，优选地所述药物能够减轻戈谢病的至少一种外周症状，其中更优选地所述疾病的至少一种外周症状选自包括脾内脏肿大、轻度贫血和炎性组织反应的组，更优选1型戈谢病、2型和/或3型戈谢病的至少一种外周症状，最优选1型戈谢病的至少一种外周症状。
实施方案93：根据实施方案91所述的用途，其中戈谢病是轻微形式的戈谢病。
实施方案94：根据实施方案92所述的用途，其中戈谢病是非神经病性戈谢病。
实施方案95：根据实施方案92所述的用途，其中戈谢病是神经病性戈谢病。
实施方案96：根据实施方案86至92中任一项所述的用途，其中所述疾病选自包括1型戈谢病、2型戈谢病和3型戈谢病的组。
实施方案97：根据实施方案96所述的用途，其中所述疾病是1型戈谢病。
实施方案98：根据实施方案86至96中任一项所述的用途，其中所述疾病是2型戈谢病或3型戈谢病。
实施方案99：根据实施方案86所述的用途，其中所述疾病是帕金森病。
实施方案100：一种产生疾病动物模型的方法，其中所述方法包括
a)在一段时间内向动物施用溶血-Gb1，
b)确定所述动物是否显示出所述疾病的至少一种症状。
实施方案101：根据实施方案100所述的方法，其中所述疾病是溶酶体贮积症(LSD)。
实施方案102：根据实施方案101所述的方法，其中所述溶酶体贮积症是由葡糖脑苷脂酶的缺陷性活性引起的溶酶体贮积症。
实施方案103：根据实施方案100至102中任一项所述的方法，其中所述疾病是戈谢病。
实施方案104：根据实施方案102所述的方法，其中戈谢病是轻微形式的戈谢病。
实施方案105：根据实施方案103所述的方法，其中戈谢病是非神经病性戈谢病。
实施方案106：根据实施方案103所述的方法，其中戈谢病是神经病性戈谢病。
实施方案107：根据实施方案100至103中任一项所述的方法，其中所述疾病选自包括1型戈谢病、2型戈谢病和3型戈谢病的组。
实施方案108：根据实施方案107使用的方法，其中所述疾病是1型戈谢病。
实施方案109：根据实施方案100至107中任一项所述的方法，其中所述疾病是2型戈谢病或3型戈谢病。
实施方案110：根据实施方案100所述的方法，其中所述疾病是帕金森病。
实施方案111：根据实施方案100至110中任一项所述的方法，其中所述动物模型是溶血-Gb1诱导动物模型。
实施方案112：根据实施方案100至111中任一项所述的方法，其中所述动物模型是哺乳动物。
实施方案113：根据实施方案112所述的方法，其中所述哺乳动物是啮齿动物。
实施方案114：根据实施方案113所述的方法，其中所述啮齿动物选自包括小鼠和大鼠的组。
实施方案115：根据实施方案113所述的方法，其中所述哺乳动物选自包括灵长类动物、狗、猪和羊的组。
实施方案116：根据实施方案112所述的方法，其中所述动物模型是小鼠动物模型。
实施方案117：根据实施方案116所述的方法，其中所述小鼠动物模型是溶血-Gb1诱导小鼠动物模型。
实施方案118：根据实施方案117所述的方法，其中所述溶血-Gb1诱导小鼠模型是用于戈谢病的溶血-Gb1诱导动物小鼠模型。
实施方案119：根据实施方案118所述的方法，其中所述戈谢病选自包括轻微形式的戈谢病、1型戈谢病和非神经病性戈谢病的组。
实施方案120：根据实施方案100至119中任一项所述的方法，其中施用溶血-Gb1直至所述动物显示出所述疾病的至少一种症状。
实施方案121：根据实施方案100至120中任一项所述的方法，其中皮下施用溶血-Gb1。
实施方案122：根据实施方案100至121中任一项(优选实施方案121)所述的方法，其中在至少两周、至少四周、至少六周、至少八周、至少十周或至少十二周的时间段内施用溶血-Gb1。
实施方案123：根据实施方案100至121中任一项(优选实施方案121至122中任一项)所述的方法，其中在两周、四周、六周、八周、十周或十二周的时间段内施用溶血-Gb1。
实施方案124：根据实施方案100至123中任一项(优选实施方案121至123中任一项)所述的方法，所述动物是小鼠。
实施方案125：根据实施方案124所述的方法，其中所述小鼠选自包括C57BL/6JRj小鼠、C57BL/6小鼠和C57/BL/10小鼠的组。
实施方案126：根据实施方案100至125中任一项(优选实施方案121至125中任一项)所述的方法，其中所述至少一种症状是外周症状。
实施方案127：根据实施方案100至126中任一项(优选实施方案126)所述的方法，其中所述外周症状选自包括脾内脏肿大、轻度贫血、炎性组织反应和肝内脏肿大的组。
实施方案128：根据实施方案100至127中任一项(优选实施方案121至127中任一项)所述的方法，其中施用溶血-Gb1直至所述动物的外周血中的溶血-Gb1浓度为约500ng/ml外周血以上。
实施方案129：根据实施方案100至128中任一项(优选实施方案121至128中任一项)所述的方法，其中所述疾病是戈谢病，其选自包括轻微形式的戈谢病、1型戈谢病和非神经病性戈谢病的组。
实施方案130：根据实施方案100至120中任一项所述的方法，其中鞘内施用溶血-Gb1。
实施方案131：根据实施方案100至120和130中任一项(优选实施方案130)所述的方法，其中在至少两周、至少四周、至少六周、至少八周、至少十周或至少十二周的时间段内施用溶血-Gb1。
实施方案132：根据实施方案100至120和130至131中任一项(优选实施方案130至131中任一项)所述的方法，其中在两周、四周、六周、八周、十周或十二周的时间段内施用溶血-Gb1。
实施方案133：根据实施方案100至120和130至132中任一项(优选实施方案130至1323中任一项)所述的方法，所述动物是小鼠。
实施方案134：根据实施方案133所述的方法，其中所述小鼠是C57BL/6JRj小鼠、C57BL/6小鼠和C57/BL/10小鼠。
实施方案135：根据实施方案100至120和130至134中任一项(优选实施方案130至134中任一项)所述的方法，其中所述至少一种症状是中枢神经症状。
实施方案136：根据实施方案100至120和130至135中任一项(优选实施方案135)所述的方法，其中所述中枢症状选自包括共济失调、痴呆、眼运用不能和帕金森综合征的组。
实施方案137：根据实施方案100至120和130至136中任一项(优选实施方案130至136中任一项)所述的方法，其中施用溶血-Gb1直至所述动物的外周血中的溶血-Gb1浓度为约10至30ng/ml脑脊液。
实施方案138：根据实施方案100至120和130至137中任一项(优选实施方案130至137中任一项)所述的方法，其中所述疾病是戈谢病，其选自包括2型戈谢病、3型戈谢病和神经病性戈谢病的组。
实施方案139：一种可通过根据实施方案100至138中任一项所述的方法获得的动物模型，其中所述动物模型是疾病动物模型，优选地所述疾病是溶酶体贮积症。
实施方案140：一种动物模型，其中所述动物模型是用于疾病的溶血-Gb1诱导动物模型，优选地所述疾病是溶酶体贮积症。
实施方案141：根据实施方案139至140中任一项所述的动物模型，其中所述溶酶体贮积症是由葡糖脑苷脂酶的缺陷性活性引起的溶酶体贮积症。
实施方案142：根据实施方案139至141中任一项所述的动物模型，其中所述疾病是戈谢病，优选地所述疾病是戈谢病的至少一种外周症状，其中优选地戈谢病的所述至少一种外周症状选自包括脾内脏肿大、轻度贫血和炎性组织反应的组，更优选1型、2型和/或3型戈谢病的至少一种外周症状，最优选1型戈谢病的至少一种外周症状。
实施方案143：根据实施方案142所述的动物模型，其中戈谢病是轻微形式的戈谢病。
实施方案144：根据实施方案142所述的动物模型，其中戈谢病是非神经病性戈谢病。
实施方案145：根据实施方案142所述的动物模型，其中戈谢病是神经病性戈谢病。
实施方案146：根据实施方案139至142中任一项所述的动物模型，其中所述疾病选自包括1型戈谢病、2型戈谢病和3型戈谢病的组。
实施方案147：根据实施方案146所述的动物模型，其中所述疾病是1型戈谢病。
实施方案148：根据实施方案139至146中任一项所述的动物模型，其中所述疾病是2型戈谢病或3型戈谢病。
实施方案149：根据实施方案139至140中任一项所述的动物模型，其中所述疾病是帕金森病。
实施方案150：根据实施方案139至149中任一项所述的动物模型，其中所述动物模型是溶血-Gb1诱导动物模型。
实施方案151：根据实施方案139至150中任一项所述的动物模型，其中所述动物模型是哺乳动物。
实施方案152：根据实施方案151所述的动物模型，其中所述哺乳动物是啮齿动物。
实施方案153：根据实施方案151所述的动物模型，其中所述啮齿动物选自包括小鼠和大鼠的组。
实施方案154：根据实施方案151所述的动物模型，其中所述哺乳动物选自包括灵长类动物、狗、猪和羊的组。
实施方案155：根据实施方案151所述的动物模型，其中所述动物模型是小鼠动物模型。
实施方案156：根据实施方案155所述的动物模型，其中所述小鼠动物模型是溶血-Gb1诱导小鼠动物模型。
实施方案157：根据实施方案156所述的动物模型，其中所述溶血-Gb1诱导小鼠模型是用于戈谢病的溶血-Gb1诱导小鼠动物模型。
实施方案158：根据实施方案157所述的动物模型，其中所述戈谢病选自包括轻微形式的戈谢病、1型戈谢病和非神经病性戈谢病的组。
实施方案159：一种筛选适用于和/或能够治疗和/或预防疾病的药剂的方法，其中所述方法包括：
-测试候选化合物是否是溶血-Gb1的拮抗剂，
其中如果所述候选化合物是溶血-Gb1的拮抗剂，则所述候选化合物是适用于和/或能够治疗和/或预防疾病的药剂。
实施方案160：根据实施方案159所述的方法，其中所述溶血-Gb1的拮抗剂是如实施方案72至85中任一项所限定的拮抗剂。
实施方案161：根据实施方案159至160中任一项所述的方法，其中所述候选化合物选自小分子、溶血-Gb 1结合蛋白、溶血-Gb1结合肽、其抗体或抗原结合片段、anticalin、适体、镜像体和溶血-Gb1降解酶。
实施方案162：根据权利要求159至161中任一项所述的方法，其中测试候选化合物是否是溶血-Gb1的拮抗剂在根据实施方案139至158中任一项所述的动物模型中进行或者使用根据实施方案139至158中任一项所述的动物模型进行。
实施方案163：根据实施方案162所述的方法，其中所述方法包括将候选物施用至所述动物模型并且确定所述候选化合物是否改善所述疾病的至少一种症状，优选地所述至少一种症状是戈谢病的至少一种外周症状，其中甚至更优选地戈谢病的所述至少一种外周症状选自包括脾内脏肿大、轻度贫血和炎性组织反应的组，最优选1型、2型和/或3型戈谢病的至少一种外周症状，最大限度地优选1型戈谢病的至少一种外周症状。
实施方案164：根据实施方案159至163中任一项所述的方法，其中所述候选化合物包含在化合物文库中或者取自化合物文库。
实施方案165：一种评价药剂在治疗和/或预防疾病中的效果的方法，其中所述方法包括
-在根据实施方案139至158中任一项所述的动物模型中或使用根据实施方案139至158中任一项所述的动物模型测试所述药剂的效果。
实施方案166：根据实施方案165所述的方法，其中所述药剂是如实施方案72至85中任一项所限定的拮抗剂。
实施方案167：根据实施方案165至166中任一项所述的方法，其中所述药剂选自小分子、溶血-Gb 1结合蛋白、溶血-Gb1结合肽、其抗体或抗原结合片段、anticalin、适体、镜像体和溶血-Gb1降解酶。
实施方案168：根据实施方案165至167中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述药剂施用至所述动物模型并且确定所述药剂是否改善所述疾病的至少一种症状，优选地所述至少一种症状是戈谢病的至少一种外周症状，其中甚至更优选地戈谢病的所述至少一种外周症状选自包括脾内脏肿大、轻度贫血和炎性组织反应的组，最优选1型、2型和/或3型戈谢病的至少一种外周症状，最大限度地优选1型戈谢病的至少一种外周症状。
实施方案169：根据实施方案159至168中任一项所述的方法，其中所述疾病是溶酶体贮积症(LSD)。
实施方案170：根据实施方案159至169中任一项所述的方法，其中所述溶酶体贮积症是由葡糖脑苷脂酶的缺陷性活性引起的溶酶体贮积症。
实施方案171：根据实施方案159至170中任一项所述的方法，其中所述疾病是戈谢病。
实施方案172：根据实施方案171所述的方法，其中戈谢病是轻微形式的戈谢病。
实施方案173：根据实施方案171所述的方法，其中戈谢病是非神经病性戈谢病。
实施方案174：根据实施方案171所述的方法，其中戈谢病是神经病性戈谢病。
实施方案175：根据实施方案159至171中任一项所述的方法，其中所述疾病选自包括1型戈谢病、2型戈谢病和3型戈谢病的组。
实施方案176：根据实施方案175所述的方法，其中所述疾病是1型戈谢病。
实施方案177：根据实施方案159至171中任一项所述的方法，其中所述疾病是2型戈谢病或3型戈谢病。
实施方案178：根据实施方案139至168中任一项所述的方法，其中所述疾病是帕金森病。
本发明基于以下令人惊讶的发现：溶血-Gb1是溶酶体贮积症(优选戈谢病和帕金森病)的靶标(并且更具体地是可药化靶标)。本发明的另一个令人惊讶的发现是，可以通过使用溶血-Gb1来产生动物模型，更具体地通过在一段时间内向动物施用溶血-Gb1来产生动物模型，因此所述动物将显现对于疾病是特征性的至少一种症状，所述疾病优选为溶酶体贮积症，优选戈谢病或帕金森病。
本发明还基于以下令人惊讶的发现：溶血-Gb1引起戈谢病的至少一种外周症状，其中戈谢病的至少一种外周症状选自包括脾内脏肿大、轻度贫血和炎性组织反应的组，更优选1型、2型和/或3型戈谢病的至少一种外周症状，最大限度地优选1型戈谢病的至少一种外周症状。该发现是令人惊讶的，因为许多其他病理生理学作用归因于鞘脂(Rotstein等,2010,JLipid Res 51:1247-1262)、溶血-鞘脂(Ballabio等,2009,Biochem BiophysAct1793:684-96)并且特别是溶血-Gb1(Schueler等,2003Neurobiol Dis 14:595-601)。
溶血-Gb1在本文中还称为葡糖鞘氨醇或溶血-葡糖脑苷脂，并且具有式(I)：
如与本发明的每个和任何方面的每个和任何实施方案相关地在本文中优选使用的，术语靶标和靶标分子在本文中以可互换的方式使用。
如与本发明的每个和任何方面的每个和任何实施方案相关地在本文中优选使用的，靶标分子是被另一种化合物靶向的分子，优选被靶标的拮抗剂靶向的分子，其中优选地化合物直接与靶标分子相互作用。与此相关，直接相互作用优选是化合物和靶标分子之间的物理相互作用，优选包括靶标分子的原子、离子和/或化学基团或部分与化合物的原子、离子和/或化学基团或部分之间的相互作用。
如与本发明的每个和任何方面的每个和任何实施方案相关地在本文中优选使用的，可药化靶标是当与患有疾病或处于发展该疾病的危险中的受试者中的化合物直接相互作用时导致疾病的治疗和/或疾病的预防的靶标分子；优选地，这样的化合物是靶标分子的拮抗剂和/或这样的直接相互作用优选是化合物和靶标分子之间的物理相互作用，优选包括靶标分子的原子、离子和/或化学基团或部分与化合物的原子、离子和/或化学基团或部分之间的相互作用。
如与本发明的每个和任何方面的每个和任何实施方案相关地在本文中优选使用的，候选化合物文库是候选化合物的文库。优选地，文库包含至少两种或更多种组成部分，即至少两种或更多种化合物。优选地，候选化合物是与靶标分子直接相互作用的化合物。与此相关，直接相互作用优选是候选化合物和靶标分子之间的物理相互作用，优选包括靶标分子的原子、离子和/或化学基团或部分与候选化合物的原子、离子和/或化学基团或部分之间的相互作用。
如与本发明的每个和任何方面的每个和任何实施方案相关地在本文中优选使用的，溶酶体贮积症(LSD)是由溶酶体功能缺陷导致的罕见的遗传性代谢病症。当机体细胞中的特定细胞器–溶酶体–功能失常时，导致LSD。
如与本发明的每个和任何方面的每个和任何实施方案相关地在本文中优选使用的，葡糖脑苷脂酶是这样的葡糖脑苷脂酶：由于所述酶的遗传缺陷，其活性相比于健康受试者是降低的。所述缺陷由编码葡糖脑苷脂酶的基因中的一个或多个隐性突变导致，并且影响男性和女性，所述葡糖脑苷脂酶是一种位于染色体1(1q21)上的特异性的溶酶体水解酶(也称为β-葡糖苷酶，EC 3.2.1.45,PDB 1OGS)。β-葡糖苷酶中的不同突变决定该酶的剩余活性，并且在很大的程度上，决定表型。葡糖脑苷脂酶在本文中还称为β-葡糖脑苷脂酶、β-葡糖苷酶、酸性β-葡糖苷酶、葡糖神经酰胺酶或D-葡糖-N-酰基鞘氨醇葡糖水解酶。该酶为55.6KD、497个氨基酸长的蛋白，其具有葡糖神经酰胺酶活性，即，该酶通过切割(即，水解)葡糖脑苷脂(其为糖脂代谢的中间体)的β-糖苷键而催化被称为葡糖脑苷脂的脂肪物质的分解。葡糖脑苷脂，在本文中也称为葡糖神经酰胺或Gb1，是红细胞和白细胞的细胞膜组成成分。当该酶有缺陷时，底物积聚，特别是在单核细胞谱系的细胞中。这是由于清除这些细胞的巨噬细胞不能清除废物，所述废物积聚在原纤维中，并且变成所谓的戈谢细胞(Gaucher cells)，其在光学显微镜下表现得与揉皱的纸相像。脂肪物质可以积聚在脾、肝、肾、肺、脑和骨髓中。
如与本发明的每个和任何方面的每个和任何实施方案相关地在本文中优选使用的，基于发病年龄和神经系统受累体征，戈谢病涵盖三种亚型。1型，即非神经病性形式，是最常见的(>90％的患者)，并且主要症状包括脾脏和肝脏肿大(肝脾大(hepatosplenomegaly))、血小板减少症、贫血和骨骼疾病(Mistry和Zimran,Dis.Model.Mech.2011,Nov；4(6):746-752)。此外，已经报道了其他器官(诸如肺)中的明显的内脏炎症，这与大的特征性巨噬细胞向组织的浸润(“戈谢细胞”)和炎性细胞因子如TNF-a、IL-1b、IL-6和ChT1的伴生有关。在神经病性形式中，即在也称为神经元GD(nGD)(其中GD代表戈谢病)并且比1型罕见得多的2型和3型中，除了内脏症状以外还观察到神经异常。
据此，如与本发明的每个和任何方面的每个和任何实施方案相关地在本文中优选使用的，戈谢病涵盖非神经病性I型，在本文中也称为1型，其是最常见的疾病形式，大约每50,000例活产中发生1例。其最通常在Ashkenazi Jewish血统的人中发生。症状可以在生命早期开始或在成年期开始，并且包括肿大的肝和非常肿大的脾(统称肝脾大)；脾可能破裂并且引起另外的并发症。骨骼软弱(skeletal weakness)和骨病可能是广泛的。脾肿大和骨髓替代引起贫血、血小板减少症和白细胞减少症。脑没有被病理性影响，但是可能有肺损伤以及罕见的肾损伤。该组中的患病受试者通常容易出现青肿(由于低的血小板水平)并且由于低的红细胞数量而经历疲劳。取决于疾病发作和严重性，I型患者可能很好地活到成年期。多数患病受试者具有轻微的疾病形式或者可能不表现出任何症状。
2型慢性神经病性，在本文还称为2型，可能在儿童期或者甚至在成年期的任何时间开始，并且大约每100,000例活产中发生1例。与急性的或3型形式相比，其特征在于缓慢进展的但是较轻微的神经病症状。主要的症状包括肿大的脾和/或肝，发作(seizures)，协调性差，骨骼不齐(skeletalirregularities)，眼运动障碍(eye movement disorders)，血液病症(包括贫血)和呼吸问题。患者通常活到其青少年期的早期和成年期。
3型急性神经病性，在本文还称为3型，典型地在出生6个月内开始，并且发病率约为每100,000例活产中有1例。症状包括肿大的肝和脾，广泛和进展性的脑损伤，眼运动障碍，痉挛状态(spasticity)，发作，肢体僵硬(limb rigidity)以及吮吸和吞咽能力差。受影响的儿童通常活到2岁就死亡。
优选地，戈谢病的症状可以包括肿大的脾和肝，肝脏功能失常，骨骼障碍和骨损伤(其可能是疼痛的、严重性的神经病并发症)，淋巴结肿胀以及(偶尔地)邻近关节肿胀，下腹膨胀(distended abdomen)，皮肤呈褐色色调，贫血，低血小板和眼白(巩膜)上的黄色脂肪沉积。最严重影响的人还可能更容易受感染影响。
如与本发明的每个和任何方面的每个和任何实施方案相关地在本文中优选使用的，受试者是人。
如与本发明的每个和任何方面的每个和任何实施方案相关地在本文中优选使用的，小鼠动物模型和小鼠模型在本文中以可互换方式使用。
与本发明的每个和任何方面相关并且如果没有另外明确指出，若提及疾病或病症，则这样的疾病和病症分别是溶酶体贮积病或帕金森病。在本发明之内的是，溶酶体贮积症是典型地由葡糖脑苷脂酶的缺陷性活性引起的溶酶体贮积症。优选地，葡糖脑苷脂酶的缺陷活性意指与健康个体的葡糖脑苷脂酶的酶活性相比，该葡糖脑苷脂酶的酶活性降低，其中优选地这样的个体是人。更优选地，葡糖脑苷脂酶的这种缺陷活性由一个或几个突变(优选氨基酸突变)引起。迄今为止，葡糖脑苷脂酶的缺陷活性意指和/或涵盖这样的实施方案，其中与健康个体的酶相比，该酶是缺陷性的，其中优选地这样的个体是人。
在本发明的每个和任何方面的一个实施方案中，溶酶体贮积症是戈谢病。本领域技术人员将认识到，戈谢病以各种形式存在，由此本领域中理解各种形式实际上构成连续体。然而，即使到目前为止，戈谢病仍被区分为或分类为1型戈谢病、2型戈谢病和3型戈谢病。优选地，1型戈谢病也称为轻微形式的戈谢病或非神经病性戈谢病。与此相比，2型戈谢病和3型戈谢病也称为神经病性戈谢病。也在本发明之内的是，戈谢病是严重形式的戈谢病。
与本发明的每个和任何方面相关并且如果没有另外明确指出，若提及动物模型，则这样的动物模型优选为疾病动物模型，优选用于如本文中公开的任何疾病并且更优选如本文中定义的溶酶体贮积病(包括其各种实施方案)或帕金森病。
在本发明的每个和任何方面的一个实施方案中，动物模型是哺乳动物。在优选实施方案中，哺乳动物是啮齿动物，其中更优选地，啮齿动物选自包括小鼠、大鼠、兔和豚鼠的组。在另一个实施方案中，动物是狗、羊、猪和灵长类动物；优选地，灵长类动物不同于人。本领域技术人员将认识到，根据本发明，可以基于任何动物和任何哺乳动物生成动物模型，特别是溶血-Gb1对其是有毒的和/或其对溶酶体贮积病是易感的和/或其显示葡糖脑苷脂酶活性的任何动物和任何哺乳动物。
关于本发明，经历根据本发明的任何治疗方法和/或任何预防方法的受试者优选是人。此外，当提及生物体并且没有进一步指定生物体时，这样的生物体优选是人；备选地，这样的生物体不同于人。
应当理解，在本发明的任何方面的优选实施方案中，戈谢病的治疗和/或预防是戈谢病的至少一种外周症状的治疗和/或预防，其中优选地戈谢病的至少一种外周症状选自包括脾内脏肿大、轻度贫血和炎性组织反应的组，更优选1型、2型和/或3型戈谢病的至少一种外周症状，最优选1型戈谢病的至少一种外周症状。
应当理解，在本发明任何方面的优选实施方案中，根据本发明待治疗或可治疗的受试者是已被诊断患有戈谢病的受试者。用于诊断的方法是本领域技术人员已知的，并且例如在国际专利申请WO 2012/167925和RolfsA等(Rolfs A等,PLOS ONE,2013年11月,卷8,第11期,e79732)中描述，其公开内容通过引用结合于此。更具体地，受试者被诊断为患有戈谢病是游离溶血-Gb1浓度超过临界值，其中在样品是来自受试者的血清或血浆样品的情况下，临界值为5ng/ml或12ng/ml，其中这样的血清或血浆样品可以是干血滤纸卡之一，并且其中在样品是血液并且更优选来自受试者的全血的情况下，临界值是20ng/ml，其中这样的血液或全血样品可以是干血滤纸卡之一。如本文中优选使用的，游离的溶血-Gb1是指按原样存在于来自受试者的样品(如血液)中并且优选地不是对所述受试者的样品的操作所产生的溶血-Gb1。所述对样品的操作可以是Groener等(Groener等，Plasmaglucosylceramide and ceramide in type 1Gaucher disease patients:Correlationswith disease severity and response to therapeutic intervention(1型戈谢病患者中的血浆葡糖神经酰胺和神经酰胺：与疾病严重性和针对治疗干预的响应的相关性).Biochimica et Biophysica Acta 1781(2908)72～78,2007)描述的。按照此，按原样存在于采集样品的受试者的血液的游离的溶血-Gb1更特别地不是分别由对包含在血液中的样品和优选在患者身体外的样品的化学、生物化学或物理处理产生的溶血-Gb1。本领域技术人员应该理解，游离的溶血-Gb1当用于本文时，优选是除了Gb1之外存在的，并且是由受试者的代谢活动产生的化合物。因此，Gb1是与戈谢病相关地积聚的分子，存在于来自受试者的样品中，其与存在于受试者的血液中的游离的溶血形式(即，游离的溶血-Gb1)相比，具有至少一个脂肪酸部分连接到溶血-Gb1的鞘氨醇部分的伯氨基。
与本发明的每个和任何方面相关并且如果没有另外明确指出，若提及溶血Gb1的拮抗剂，则在一个实施方案中，这样的拮抗剂能够减轻或改善疾病的至少一种症状。在另一个实施方案中，能够或适用于治疗疾病。在一个实施方案中，拮抗剂能够在疾病的动物模型中减轻或改善疾病的至少一种症状，优选地，动物模型是本发明的动物模型。在一个实施方案中，拮抗剂能够或适用于在疾病动物模型中治疗疾病，优选地，动物模型是其各种实施方案中的本发明的动物模型。在溶血-Gb1的拮抗剂的一个实施方案中，疾病是如本文中公开的任何疾病，并且更优选如本文中定义的溶酶体贮积病(包括其各种实施方案)或帕金森病。
在一个实施方案中，拮抗剂是选自包括以下的组的化合物：小分子、溶血-Gb 1结合蛋白、溶血-Gb1结合肽、其抗体或抗原结合片段、适体、镜像体和溶血-Gb1降解酶。
在一个实施方案中，小分子是符合本领域技术人员已知的Lepinski的五项规则的化合物。更具体地，根据所述的Lepinski规则，有资格作为小分子的化合物不违反以下标准中的至多一个：(a)不超过5个氢键供体(氮-氢键和氧-氢键的总数)；(b)不超过10个氢键受体(所有氮或氧原子)，(c)分子量小于500道尔顿；和(d)辛醇-水分配系数log P不大于5。
在一个实施方案中，溶血-Gb1结合蛋白是这样的蛋白质，其在一定程度上与溶血-Gb1结合，使得各自在本文公开的各种实施方案中，在减轻或改善疾病的至少一种症状方面并且个别地在治疗疾病方面，上述标准中的至少一个得到满足。在一个实施方案中，蛋白质是包含通过肽键共价连接的氨基酸链的聚合物，其中所述聚合物包含约100个氨基酸残基或更多个氨基酸残基。溶血-Gb1结合蛋白的一个实施方案是溶血-Gb1结合抗体或其溶血-Gb1结合片段。另外的溶血-Gb1结合蛋白是溶血-Gb1结合anticalin。
用于产生与特定靶标结合的抗体的方法是本领域中已知的，并且例如在Harlow,E.和Lane,D.,“Antibodies:A Laboratory Manual,”Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,(1988)中描述。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。优选地，可以根据Cesar和Milstein的方案以及基于其的进一步发展来制造单克隆抗体。如本文中使用的抗体包括但不限于完整抗体、抗体片段或衍生物(如Fab片段、Fc片段)和单链抗体，只要它们是合适的并且能够结合溶血-Gb1即可。产生多克隆抗体是本领域中已知的，例如在Harlow,E.和Lane,D.,“Antibodies:A Laboratory Manual,”Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY,(1988)中描述。优选地，用于治疗目的的抗体是如上定义的人源化抗体或人抗体。
本发明的抗体和可以根据本发明使用的抗体可以具有一种或几种标记或标签。这样的标记或标签可以用于在其诊断应用或其治疗应用中检测抗体。优选地，标记和标签选自包括抗生物素蛋白(avidine)、链霉抗生物素蛋白(streptavidine)、生物素、金和荧光素的组，并且例如在ELISA方法中使用。这些和其他标记以及方法例如在Harlow,E.和Lane,D.,‘’Antibodies:A Laboratory Manual,”Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY,(1988)中描述。
也在本发明之内的是，除检测以外，标签或标记还展现出另外的功能，如与其他分子的相互作用。这样的相互作用可以是例如与一种或几种其他化合物的特异性相互作用。这些其他化合物可以是使用抗体的系统(如通过使用相应抗体分析的人体或动物体或样品)固有的那些化合物。适当的标记可以是例如生物素或荧光素，其具有存在于各自化合物或结构上的特异性相互作用配偶体如抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白等，以与由此标记或标签的抗体相互作用。
在一个实施方案中，溶血-Gb1结合肽是这样的蛋白质，其在一定程度上与溶血-Gb1结合，使得各自在本文公开的各种实施方案中，在减轻或改善疾病的至少一种症状方面并且个别地在治疗疾病方面，上述标准中的至少一个得到满足。在一个实施方案中，肽是包含通过肽键共价连接的氨基酸链的聚合物，其中所述聚合物包含少于100个氨基酸残基。如本文使用的，术语肽还包括典型地包含约10个至约100个氨基酸残基的多肽，并且狭义上的肽典型地包含2个至约10个氨基酸残基。在一个实施方案中，溶血-Gb1结合肽是溶血-Gb1结合anticalin。
anticalin，一种靶标结合多肽，尤其在德国专利申请DE 197 42 706中描述。
适体是这样的D-核酸，其是单链或双链的，并且与靶标分子特异性相互作用。适体的制备或选择在例如欧洲专利EP 0 533 838中描述。基本上，实现以下步骤。首先，提供核酸(即潜在的适体)的混合物，其中每个核酸通常包含几个(优选至少八个)随后的随机化核苷酸的区段。随后使该混合物与靶标分子接触，由此核酸与靶标分子结合，如相比于候选混合物，基于增加的对靶标的亲和力或以更大的力与之结合。随后将结合的核酸与混合物的其余部分分离。任选地，使用例如聚合酶链式反应来扩增由此获得的核酸。这些步骤可以重复几次，最后得到特异性结合靶标的核酸的比率增加的混合物，然后任选地从中选择最终的结合的核酸。这些特异性结合的核酸被称为适体。明显的是，在用于产生或鉴别适体的方法的任何阶段，可以采用个别核酸的混合物的样品以使用标准技术确定其序列。在本发明之内的是，可以如例如通过引入产生适体的领域中的技术人员已知的确定的化学基团来稳定适体。这样的修饰可以例如在于在核苷酸的糖部分的2’位置处引入氨基。适体目前用作治疗剂。然而，也在本发明之内的是，由此选择或产生的适体可以用于靶标确认和/或作为用于开发药物(优选基于小分子的药物)的先导物质。这实际上是通过竞争测定来完成的，其中靶标分子和适体之间的特异性相互作用被候选药物抑制，从而在从靶标和适体的复合物替换适体时，可以假设相应的候选药物允许特异性抑制靶标和适体之间的相互作用，并且如果相互作用是特异性的，则所述候选药物至少在原则上将适用于阻断靶标并且因此降低其在包含该靶标的相应系统中的生物利用度或活性。然后，可以对由此获得的小分子进行进一步的衍生化和修饰，以优化其物理、化学、生物和/或医学特性，如毒性、特异性、生物降解性和生物利用度。在优选实施方案中，适体是能够与溶血-Gb1结合的适体。
可以根据本发明使用或产生的镜像体的产生或制备基于类似的原理。镜像体的制备在国际专利申请WO 98/08856中描述。镜像体是L-核酸，这意指它们由L-核苷酸构成，而不是由如适体中的D-核苷酸构成的适体。镜像体的特征在于这样的事实：它们在生物系统中具有非常高的稳定性，以及可与适体相比地，与它们所针对的靶标分子特异性相互作用。为了产生镜像体，产生异质的D-核酸群，并且使该群与靶标分子(其为溶血-Gb1)的光学对映体接触。随后，分离那些不与靶标分子的光学对映体相互作用的D-核酸。然而，将与靶标分子的光学对映体相互作用的那些D-核酸分离、任选地测定和/或测序，并且随后基于从D-核酸获得的核酸序列信息来合成相应的L-核酸。这些L-核酸在序列上与前述的与靶标分子的光学对映体相互作用的D-核酸相同，其将与天然存在的靶标分子而不是与其光学对映体特异性相互作用。类似于用于产生适体的方法，也可以多次重复各种步骤，从而富集与靶标分子的光学对映体特异性相互作用的那些核酸。
与本发明的各个方面相关，表明疾病是溶酶体贮积病，优选戈谢病。本申请提供了溶血-Gb1作为靶标(优选可药化靶标)并且能够分别诱导和产生用于这种疾病的动物模型的实验证据。基于所述实验证据和在患有帕金森病的患者中观察到的溶血-Gb1的滴度，本领域技术人员认识并理解，溶血-Gb1所标注和执行的与溶酶体贮积症和特别是戈谢病有关的相同功能将由溶血-Gb1在帕金森病中同样地显示和执行。在一个实施方案中，帕金森病是具有突变型葡糖脑苷脂酶(优选在患有戈谢病的受试者中观察到的突变型葡糖脑苷脂酶)的受试者的帕金森病，其中更优选地，患有帕金森病的受试者未显示出戈谢病的任何临床症状。
在一个实施方案中，溶血-Gb1降解酶是溶血-Gb1代谢酶。这类酶适合用作溶血-Gb1的拮抗剂，条件是在酶作用于溶血-Gb1后获得的溶血-Gb1衍生物不再是与本发明相关地定义的溶血-Gb1的拮抗剂。
在第一方面，通过溶血-Gb1作为疾病治疗中的靶标的用途来解决本发明的基础问题。这样的用途在本文中也称为根据本发明的用途、根据本发明的溶血-Gb1的治疗用途或根据本发明的第一用途。这样的第一方面是基于以下令人惊讶的发现：溶血-Gb1最近已被鉴定为戈谢病的诊断标志物(Dekker N等,Blood.118(16):e118-27；Rolfs A等,PLoSOne.8(11):e79732)，其是疾病中的靶标，所述疾病优选本文中公开的各种实施方案中的溶酶体贮积病，以及帕金森病。更重要地，溶血-Gb1也是可药化靶标。如本文中优选使用的，可药化靶标是已知的或预期以高亲和力与药物结合。
此外，根据定义，药物与可药化靶标的结合必须改变靶标的功能，对患者具有治疗益处。
根据本发明的第一方面的用途涵盖体外和体内用途两者。在所述用途是体外用途的实施方案中，溶血-Gb1用于化学、生物化学、物理或基于细胞的测定。例如，这样的测定确定候选药物是否有效地结合至溶血-Gb1和/或干扰其导致疾病的一种或几种症状的作用。在一个实施方案中，靶标存在于细胞、组织、器官或生物体外；在备选的实施方案中，靶标存在于细胞、组织、器官或生物体内；这样的细胞、组织、器官或生物体可以活的或死亡的。在另外的实施方案中，所述用途是体内用途，即以治疗和/或预防疾病为目的靶向作为靶标的溶血-Gb1；优选地，在这样的实施方案中，溶血-Gb1存在于生物体、器官、组织或细胞中，它们更优选是活的。在备选的实施方案中，溶血-Gb1作为靶标的体内用途不是为了治疗和/或预防疾病的目的；优选地，这样的体内用途是用于获得与溶血-Gb1在细胞、组织、器官或生物体中的参与有关的医学和/或科学见解。
在第二方面，通过溶血-Gb1作为药物开发中的靶标的用途来解决本发明的基础问题，其中，优选地，该药物能够和/或适用于治疗和/或预防疾病，优选本文公开的各种实施方案中的溶酶体贮积病，以及帕金森病。类似于第一方面，该第二方面基于以下令人惊讶的发现：溶血-Gb1不仅是诊断标志物而且是疾病中的靶标，所述疾病优选本文公开的各种实施方案中的溶酶体贮积病，以及帕金森病。这样的第二方面在本文中也称为根据本发明的用途，更具体地，根据本发明的第二用途。
应当理解，本发明的第一方面的任何实施方案也是本发明的第二方面的实施方案，反之亦然。
如本文中优选使用的，术语“药物开发”优选意指提供能够和/或适用于优选地治疗本文公开的各种实施方案中的溶酶体贮积病以及帕金森病的药物的任何方法。这样的方法涵盖对药物的任何筛选，测试任何候选药物用于不同目的的有用性或适合度，包括质量控制，优选质量控制。这样的药物开发不同于药物的制备，其中优选地，药物的制备意指配制和/或包装药物以使其准备好供患者或医疗保健工作者使用。关于这样的本发明的第二方面，在一个实施方案中，药物是根据本发明的拮抗剂。
在第三方面，通过溶血-Gb1在产生疾病的动物模型中的用途来解决本发明的基础问题，所述疾病优选本文公开的各种实施方案中的溶酶体贮积病，以及帕金森病。该第三方面基于以下令人惊讶的发现：可以通过使用溶血-Gb1来产生用于此类疾病的动物模型。这样的第三方面在本文中也称为根据本发明的用途，更具体地，根据本发明的第三用途。
在该产生中使用的动物是本文公开的任何动物。根据本发明的第三方面的通过使用溶血-Gb1获得的动物模型也称为溶血-Gb1诱导动物模型。其中动物模型作为模型的疾病是本文公开的溶酶体贮积病，或者帕金森病。
在第四方面，通过用于治疗和/或预防疾病的溶血-Gb1的拮抗剂来解决本发明的基础问题，所述疾病优选本文公开的各种实施方案中的溶酶体贮积病，以及帕金森病。该第四方面基于以下令人惊讶的发现：溶血-Gb1不仅是诊断标志物而且是疾病中的可药化靶标，所述疾病优选本文公开的各种实施方案中的溶酶体贮积病，以及帕金森病。这样的第四方面在本文中也称为根据本发明的拮抗剂。
如本文中公开的，鉴于本发明的上述令人惊讶的发现，本发明的拮抗剂可以使用常规措施制备而不具有任何过度负担。在一个实施方案中，溶血-Gb1的拮抗剂是预防或改善由本发明的动物模型显示的至少一种疾病相关症状的拮抗剂。
在第五方面，通过溶血-Gb1的拮抗剂在制备药物中的用途来解决本发明的基础问题，其中所述药物用于治疗和/或预防疾病，优选本文公开的各种实施方案中的溶酶体贮积病，以及帕金森病。类似于本发明的第四方面，该第五方面基于以下令人惊讶的发现：溶血-Gb1不仅是诊断标志物而且是疾病中的可药化靶标，所述疾病优选本文公开的各种实施方案中的溶酶体贮积病，以及帕金森病。这样的第五方面在本文中也称为根据本发明的用途，更具体地，根据本发明的第五用途。
在第六方面，通过一种产生疾病动物模型的方法来解决本发明的基础问题，其中所述方法包括
a)在一段时间内向动物施用溶血-Gb1，
b)确定所述动物是否显示出所述疾病的至少一种症状，
所述疾病优选本文公开的各种实施方案中的溶酶体贮积病，以及帕金森病。该第六方面基于以下令人惊讶的发现：可以通过使用溶血-Gb1来产生用于此类疾病的动物模型，其中动物模型是疾病动物模型，所述疾病优选本文公开的各种实施方案中的溶酶体贮积病，以及帕金森病。这样的第六方面在本文中也称为根据本发明的用于产生动物模型的方法。由于通过使用溶血-Gb1产生动物模型，所以从本发明的这种方法获得或可获得的动物模型也称为溶血-Gb1诱导动物模型。
在一个实施方案中，在一段时间内连续施用溶血-Gb1。
在根据本发明的用于产生动物模型的方法的一个实施方案中，步骤a)中提供的动物典型地是健康动物，其经处理以展现疾病的表型、所述疾病的至少一种症状。
优选的动物是小鼠。本领域技术人员将认识到，典型地，使用年龄小(如10周)的小鼠。然而，也在本发明之内的是，使用甚至更年轻或更老的小鼠。
在根据本发明的一个实施方案中，将溶血-Gb1施用至动物直至动物显示出疾病的至少一种症状。优选地，稳定地显示疾病的至少一种症状。如本文中优选使用的，稳定地显示意指动物显示疾病的至少一种症状达足够的时间，以便进行使用动物模型的测试和程序。
本领域技术人员将认识到，施用至动物的溶血-Gb1的浓度取决于分别施用和待施用溶血-Gb1的时间段，以及分别所需和预期的疾病严重程度。根据本公开，可以通过常规实验确定浓度。优选地，施用溶血-Gb1至实现中毒、优选慢性中毒的程度。在非神经病性戈谢病的情况下，待实现系统性慢性中毒，而在神经病性戈谢病的情况下，待实现慢性CNS中毒。
本领域技术人员将认识到，对于非神经病性戈谢病，皮下施用是优选的，而对于神经病性戈谢病，鞘内施用是优选的。在皮下施用的情况下，可能的日剂量是10mg溶血-Gb1/kg体重，其中通过泵以2.64μl/天的流速连续地皮下施用溶血-Gb1。
关于在用于产生动物模型的本发明方法中使用的特定动物品系和小鼠品系，本领域技术人员将认识到，原则上可以使用任何野生型实验室品系。这样的野生型实验室品系是选自包括C57BL/6JRj品系、C57BL/6品系和C57/BL/10品系的组中的一个。
在一个实施方案中，优选地在疾病是戈谢病并且更优选非神经病性戈谢病的情况下，疾病的至少一种症状是外周症状。优选地，这样的外周症状是选自包括脾的内脏增大、轻度贫血、炎性组织反应和肝的内脏增大的组中的一种。关于肝和脾的肿大，本领域技术人员将认识到，这样的增大是相对于非溶血-Gb1处理的动物，其因此有效地起到阴性对照的作用。如本文中优选使用的，贫血被定义为“低于基线值2x SD的Hb值”(Raabe BM等,J AmAssoc Lab Anim Sci.50(5):680-5)。轻微形式的贫血是其中观察到的Hb值不远低于(即接近)基线值的这种贫血。如本文中优选使用的，如本领域已知的，基于CD68和F4/80确定炎性组织反应(参见，例如，BovenLA等,Am J.Clin Pathol 2004 122(3):359-69)。
在一个实施方案中，优选地在疾病是戈谢病并且更优选神经病性戈谢病的情况下，疾病的至少一种症状是中枢神经症状。优选地，这样的中枢神经症状是选自包括共济失调、痴呆、眼运用不能和帕金森综合征的组中的一种。
在第七方面，通过可由根据第六方面的方法获得的动物模型来解决本发明的基础问题，其中所述动物模型是疾病动物模型，所述疾病优选本文公开的各种实施方案中的溶酶体贮积病，以及帕金森病。类似于本发明的第六方面，该第七方面基于以下令人惊讶的发现：可以通过使用溶血-Gb1来产生用于此类疾病的动物模型。这样的第七方面在本文中也称为根据本发明的动物模型。
在第八方面，通过动物模型来解决本发明的基础问题，其中所述动物模型是用于疾病的溶血-Gb1诱导动物模型，所述疾病优选本文公开的各种实施方案中的溶酶体贮积病，以及帕金森病。类似于本发明的第七方面，该第八方面基于以下令人惊讶的发现：可以通过使用溶血-Gb1来产生用于此类疾病的动物模型。这样的第八方面在本文中也称为根据本发明的动物模型。
在第九方面，通过一种筛选适用于和/或能够治疗和/或预防疾病的药剂的方法来解决本发明的基础问题，其中所述方法包括
-测试候选化合物是否是溶血-Gb1的拮抗剂，
其中如果所述候选化合物是溶血-Gb1的拮抗剂，则所述候选化合物是适用于和/或能够治疗和/或预防疾病的药剂。优选地，所述疾病是本文公开的各种实施方案中的溶酶体贮积病，以及帕金森病。该第九方面基于以下令人惊讶的发现：溶血-Gb1不仅是诊断标志物而且是疾病中的可药化靶标，所述疾病优选本文公开的各种实施方案中的溶酶体贮积病，以及帕金森病。这样的第九方面在本文中也称为根据本发明的筛选适用于和/或能够治疗和/或预防疾病的药剂的方法。
在根据本发明的筛选适用于和/或能够治疗和/或预防疾病的药剂的方法的一个实施方案中，所述测试包括使用本发明的动物模型。优选地，所述测试包括向动物模型施用候选化合物并且评价候选化合物是否减轻或改善动物模型所显示的疾病的至少一种症状。
在根据本发明的筛选适用于和/或能够治疗和/或预防疾病的药剂的方法的一个实施方案中，溶血-Gb1的拮抗剂是根据本发明的拮抗剂。在另一个实施方案中，候选化合物是化合物小分子、溶血-Gb 1结合蛋白、溶血-Gb1结合肽、其抗体或抗原结合片段、anticalin、适体、镜像体和溶血-Gb1降解酶。
在第十方面，通过一种评价药剂在治疗和/或预防疾病中的效果的方法来解决本发明的基础问题，其中所述方法包括
-在根据本发明的动物模型中或使用根据本发明的动物模型测试所述药剂的效果。
优选地，所述疾病是本文公开的各种实施方案中的溶酶体贮积病，以及帕金森病。该第十方面基于以下令人惊讶的发现：溶血-Gb1不仅是诊断标志物而且是疾病中的可药化靶标，所述疾病优选本文公开的各种实施方案中的溶酶体贮积病，以及帕金森病。这样的第十方面在本文中也称为根据本发明的评价药剂在治疗和/或预防疾病中的效果的方法。
在一个实施方案中，根据本发明的评价药剂在治疗和/或预防疾病中的效果的方法用于评价药剂的以下效果中的一种：副作用、协同作用、毒性作用、对各种生理参数的影响、对生化因子和参数的影响。这样的效果是本领域技术人员已知的，并且用于确定这样的效果的测定对于本领域技术人员同样是已知的。本领域技术人员还将理解，在这样的方法中，至少阴性对照和任选的阳性对照将进行所述方法。基于这样的阴性对照，可以鉴定和任选地量化与测试药剂相关的任何有利效果。在一个实施方案中，本发明的这种方法分别用于剖析药剂和候选药物。这样的剖析是在申请用于治疗和/或预防疾病的药剂的销售许可时准备提交给卫生当局的档案的一部分。
现在将通过下述附图和实施例进一步举例说明本发明，从中可以理解其它的特征、实施方案和优点。
更具体地：
图1A和1B是示出了用溶血-Gb1或单独的赋形剂处理的小鼠血液中溶血-Gb1的水平作为时间的函数的图，图1A以条形图显示结果并且图1B以框线图显示结果；使用渗透微型泵，小鼠接受皮下溶血-Gb1达12周；在4周后的第一次取样时以及其后的整个治疗阶段中，溶血-Gb1值增加；赋形剂处理的(或给药前)动物具有较低但可检测的溶血-Gb1值，其为1.2–1.5ng/mL血液；对于每个数据点，测试的动物数量在图中表示，框(box)表示中值以及第25百分位数和第75百分位数，图表的短线(whisker)示出了最小值和最大值。
图2A是示出了各种组织即心脏、肾、肝、脾和脑中的溶血-Gb1浓度(ng/ml干组织)的图；溶血-Gb1处理的动物显示为黑色框，赋形剂处理的动物显示为白色框，表示三只独立动物的最小值和最大值，而每种器官样品一式两份地进行测量；白线和黑线表示平均值；与对照动物相比，处理小鼠的所有外周器官均显示出大幅升高的溶血-Gb1水平；
图2B是示出了尿液中的溶血-Gb1浓度(ng/ml尿液)的图，在处理开始后6周时，从一组4只(未处理)动物/笼和两组3只(处理的)动物/笼中在24小时收集所述尿液。在相应柱的上方示出了获得的溶血-Gb1水平。处理的动物中的溶血-Gb1含量是指计算的排泄率为0.6ng*min-1；溶血-Gb1处理的动物显示为黑色框，赋形剂处理的动物显示为白色框，表示三只动物的最小值和最大值，而每种器官样品一式两份地进行测量。白线和黑线表示平均值。
图3是一组的两幅图，其示出了溶血-Gb1处理的C57/BL/6JRj小鼠中的Hb(血红蛋白；左图)和Hct(血细胞比容；右图)的血液变化；在每个指定的时间点(4周、8周和12周)，值来源于4只对照和6只溶血-Gb1处理的小鼠；黑色框和白色框表示中值、第25和第75百分位数，图表的短线示出了最大值和最小值；使用双尾Mann-Whitney检验分析每个时间点的治疗组之间的差异。左图：在每个时间点Hb值低于基线值2x SD，表明轻度贫血。右图：治疗开始后4周和8周时Hct值显著不同。
图4A是一组的两幅图，其示出了8周和12周后脾和肝的器官重量分析的结果(g/100g体重)；在每个指定的时间点，值来源于4只对照和6只溶血-Gb1处理的小鼠；黑色框和白色框表示中值、第25和第75百分位数，图表的短线示出了最大值和最小值；使用双尾Mann-Whitney检验分析每个时间点的治疗组之间的差异；在处理开始后8周和12周，处理的小鼠的脾相对于对照是肿大的。与对照相比，肝脏重量在统计学上没有显著差异。
图4B是一组的两幅图，其示出了脾和肝中炎性组织标志物F4/80和CD68的蛋白质印迹(Western blot)分析的结果，而在8周后在溶血-Gb1处理的小鼠中观察到F4/80和CD68的脾水平显著增加，并且在相同动物的肝脏中注意到类似的增加。
图4C是示出了来自对照和溶血-Gb1处理的动物的一半脾脏的照片，而器官样品示出了大小的变化和区别性的颜色。
图5A-B是显微照片，其示出了来自赋形剂和溶血-Gb1处理的小鼠的H&E染色的脾脏切片，显示出与白髓和红髓类似的脾结构(图5A、5B)。
图5C-J是显微照片，其示出了来自赋形剂和溶血-Gb1处理的小鼠的脾脏的石蜡切片用抗-CD68(图5C、D和高倍放大的E、F)和抗-F4/80(图5G、H和高倍放大的I、J)进行免疫组织化学分析，而来自溶血-Gb1处理的小鼠的切片显示出与赋形剂对照相比，CD68和F4/80阳性细胞的数量显著增加。
图6示出了表1A和1B，其包括研究中测试的所有参数。
图7表示示出了在处理开始后4、8和12周后脾脏和肝脏裂解物中的GCase水平的条形图。
图8是示出了在4周和8周后用溶血-Gb1或单独的赋形剂处理的小鼠血液中不同类型的葡糖神经酰胺的水平的图。
如上所述，基于遗传缺陷的性质，GD的动物模型显示出广谱的神经病学、血液学和内脏表型。遗传性和非遗传性(化学诱导的)GD小鼠模型两者都提供了对疾病病理学的有益洞察，通常非常类似于人类表型(综述于Farfel-Becker等,2011,Dis Mod Mech 4:746-52)。然而，迄今为止开发的疾病模型中没有一个允许隔离地分析可归因于单独的鞘脂贮存的作用。
如实施例中所示，本发明的发明人已经开发了一种动物模型，其允许独立于GCase活性、GCase失活、葡糖神经酰胺和/或葡糖神经酰胺积聚的潜在作用，隔离地分析溶血-Gb1的作用。
实施例
实施例1：材料与方法
动物饲养(housing)和动物处理
在德国萨尔布吕肯的Pharmacelsus GmbH进行动物实验程序。将成年雄性C57BL/6JRj小鼠(10周龄，购自法国Janvier Labs)饲养在温控室(20-24℃)中并且保持12小时光照/12小时黑暗循环。随意地提供食物(
R/M-H，10mm)和水。
所有实验程序均根据当地动物福利部门的规定批准和进行。在DMSO和丙二醇中于37℃在超声浴处理10分钟下，制备溶血-Gb1储备溶液。通过使用ALZET泵来实现溶血-Gb1(Matreya LLC,USA)的皮下施用，所述泵植入其颈部的后面并且设定为2.64μl/天的流速，以获得10mg溶血-Gb1/kg体重的日剂量。根据制造商的说明，在植入之前将泵装载储备溶液并且使其起动。
使用从侧尾静脉获得的Li-肝素血液进行血液取样。在每个取样时间点，将20μl的2个等分试样转移至干血斑滤纸卡(Centogene AG，Rostock，德国)。在最后的取样时间点之后，通过吸入过量的异氟烷来处死小鼠，取出器官，冷冻并收集，用于将来的检查。在适用的情况下，将器官分割。将一半器官立即冷冻在液氮中。另一半用福尔马林固定和石蜡包埋，用于组织学分析(Histalim，Montpellier，法国)。
样品制备和由干血斑(缩写为DBS)测定溶血-Gb1
使用DBS穿孔机(Perkin Elmer LAS，德国)切下直径为3.2mm的3个孔，并且置于2.2ml圆底试管(Eppendorf，德国)中。将50μl提取溶液(DMSO:水，1:1)和具有溶解于乙醇中的标准物的100μl内标溶液添加到纸孔的顶部。将样品混合30秒，并且在700rpm的搅拌下在37℃置于温育框(Heidolph，Schwabach，德国)中30分钟。温育后，将试管在最大功率下超声处理1分钟，然后将液体转移至置于96孔V形底板(VWR，德国)上的具有PTFE膜(PALL，德国)的AcroPrep滤板上。通过在Hermle Z300平板离心机(Hermle Labortechnik，德国)中以3,500rpm离心5分钟来过滤样品，以从溶液中移除任何固体颗粒。
制备尿液样品用于LC/MRM-MS分析
将25μL尿液等分试样加入100μL内标和250μL乙醇中。将样品冷却至4℃达1小时以沉淀尿蛋白，然后将它们在台式离心机中以14,500rpm旋转3分钟。将每个样品的体积定量地转移至96孔板中，并且如上所述进行进一步处理。
用于溶血-Gb1测定的器官样品制备
从动物中提取后，立即将器官在液氮中深冻。将样品冻干(Alpha 2-4LSC，Christ，Osterode am Harz，GER)并且用研钵和研杵将其磨成粉末。在圆底试管中建立2至5mg粉末的部分。在粉末之上，加入50μl/mg粉末的提取溶液，并且将样品在搅拌下在37℃温育5分钟。随后，将样品在液氮中冷冻30秒并且以增强功能超声处理5分钟。温育、冷冻和超声处理步骤重复6次。最后，将混合物涡旋，并且将25μl悬浮液的等分试样用于溶血-Gb1测定。每个样品补充有100μl内标(溶血-Gb2，200ng/ml)和250μl乙醇。将样品在4℃冷却1小时以沉淀膜蛋白，并且在台式离心机中以14.5krpm旋转3分钟。将每个样品的体积定量地转移至96孔滤板中，并且如上所述进行进一步处理。
LC/MRM-MS测量
使用与ABSciex 5500TripleQuad质谱仪(ABSciex，Darmstadt，德国)偶联的Waters Acquity UPLC(Waters，UK)，对DBS和器官提取物两者的溶血-Gb1进行LC-MRM-MS分析。使用0.9ml/min的流速，在60℃预热的孔径为3mM的C8柱(ACE柱，德国)上进行色谱运行。将10μl提取物注射到柱上，并且使用从40％A(在水中的50mM甲酸)至100％B(在丙酮:乙腈体积1:1中的50mM甲酸)的线性梯度洗脱化合物。在UPLC的上游，添加3:1的分流器。监视以下MRM跃迁：对于内标为624.3→282.2(DP为30V，CE为38V，并且CXP为10V)，并且对于溶血-Gb1为462.3→282.2(DP为28V，CE为30V，并且CXP为10V)。使用以下参数以正离子模式进行MRM-MS分析：CUR气体40psi，IS电压5.5kV，CAD 8psi，锥温500℃，GS 1 45psi，GS2 60psi，EP 10V。对于分析的所有批次，使用溶血-Gb1在乙醇中的7个稀释物(以ng/ml计的浓度：0；5；10；50；100；200；1000)来测量标准曲线。
血细胞计数
在异氟醚麻醉下通过眼球后静脉丛将小鼠放血，然后通过过量吸入处死。从每只动物抽取200μL的全血EDTA样品以分析天冬氨酸氨基转移酶(AST/GOT)、白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白(Hb)、血细胞比容(PCV＝血细胞压积，Hct)、平均细胞体积(MCV)、平均细胞Hb(MCH)、平均细胞Hb浓度.(MCHC)和血小板计数(PLT)(IDEXX Bioresearch，Ludwigsburg，德国)。
细胞因子分析
按照供应者的说明进行
Multiplex免疫测定(ebioscience，SanDiego，CA)。使用包括质量控制标准的自动化
分析装置软件(Luminex，Austin，TX)获得动物组之间的差异。
蛋白质印迹
在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Roche，Mannheim，GER)的RIPA缓冲液中将肝脏和脾脏匀化。将裂解物在15,000g、4℃下离心15分钟以移除不溶性沉淀，并且收集上清液。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)测量蛋白质浓度。典型地，加载100μg蛋白质用于在4％-15％预制Tris-甘氨酸梯度凝胶(BioRad，Mannheim，GER)上进行电泳。随后，通过半干转移装置(BioRad，Munich，GER)将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，用于免疫检测分析。通过大鼠抗F4/80(1:500，Biolegend，San Diego，CA)、大鼠抗-CD68[FA-11](1:200abcam，Cambridge，UK)小鼠抗GAPDH(1:10,000，abcam，Cambridge，UK)，各自在补充有5％脱脂奶粉的TBST中，检测靶蛋白。将荧光缀合物二抗应用于使用Li-Cor Odyssey成像系统(Bad Homburg，GER)的检测。
组织病理学评价
在切除后，将器官在福尔马林中固定24小时，并且转移至70％乙醇中。为了确保无偏差的比较，通过HISTALIM(Montpellier，法国)分析器官的相同部位。按照针对小鼠器官验证的4小时程序，在Peloris自动装置(Leica，Wetzlar，德国)上处理样品。按照HISTALIM程序，将样品包埋在石蜡中。对于肝脏、脾脏和股骨样品，制备切片(3-5μm厚度)并且优先放置在Superfrost+载玻片上(以确保组织粘附)，从而按照经验证的苏木精/伊红(H&E)方案进行染色。在x20物镜和不具有Z堆叠的情况下，将所有载玻片在明场条件下用Nanozoomer扫描仪(Hamamatsu Photonics，Hamamatsu，日本)进行数字化。由高级组织病理学家检查载玻片，以评价溶血-Gb1对测试小鼠的毒理学作用。
免疫组织化学
对于免疫组织化学，使8周的处理的小鼠的脾脏的5μm石蜡切片经受大鼠抗-CD68克隆FA-11(1:100，Bio-Rad Laboratories，Raleigh，NC，USA)和大鼠抗-小鼠F4/80Cl:A3-1(1:100，BioLegend，San Diego，CA，USA)。然后将切片脱石蜡，再水化，并且在微波下在0.1M柠檬酸盐缓冲液中预处理(5min 850W和5min 340W)，随后与PBS中的3％H2O2连续温育以将内源性过氧化物酶阻断30分钟，然后在PBS中的1.5％正常山羊血清(NGS)中与3％牛血清白蛋白连续温育1小时以阻断非特异性表位。随后，将切片在4℃暴露于3％NGS/PBS中的一抗过夜。取决于一抗并且在PBS中洗涤后，将切片顺序地与第二抗-大鼠或抗-小鼠IgG(1:200；Vector，Burlingame，CA，USA)温育1小时，与链霉抗生物素蛋白-生物素复合物(ABC)试剂温育1小时(Vectastain-Elite；Vector，Burlingame，CA，USA)，然后最终用3,-3,-二氨基联苯胺(DAB，Sigma，Munich，德国)可视化，其使用H2O2活化。切片用苏木精复染，脱水，用DePeX固定并且盖玻片。
数据分析
使用GraphPad Prism 5进行可视化和统计数据评价。结果以中值和范围表示。非参数双尾Mann-Whitney检验用于鉴定治疗组之间的差异：在每个指定时间点，对照相对于溶血-Gb1处理的小鼠的血红蛋白、Hct和肝/脾重量。对于P值<0.05*、<0.01**、<0.005***，结果被认为是统计学上显著的。
葡糖脑苷脂酶酶活性测量
在补充有0.15％Triton X-100和0.125％牛磺胆酸钠的pH 4.5调节的冰冷的磷酸钾缓冲液(100μL/mg组织)中，将新鲜冷冻的肝脏和脾脏样品匀化。将组织悬浮液强制通过配有2mL注射器的22号针头10次，以解除细胞结合。此后，将悬浮液进行5次冷冻/解冻循环，随后在4℃以15,000x g离心15分钟，以获得澄清的裂解物。测量含有GCase的提取物的蛋白质浓度，并且使用2mM终浓度的4-甲基伞形基(umbelliferyl)-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUG)作为底物，将9μg全蛋白用于酶促反应。通过加入0.2mL的1.0M甘氨酸缓冲液(pH 10.5)来终止反应。在酶标仪(Tecan，
瑞士)中测定游离荧光团4-MU。
实施例2：向小鼠连续皮下施用溶血-Gb1后的溶血-Gb1水平
雄性C57BL/6JRj小鼠在其颈部的后面配有皮下渗透微型泵，以实现溶血-Gb1的长期施用(12周)。进行反复的DBS取样以研究小鼠器官系统中的溶血-Gb1水平发展。
在处理的小鼠中监测血液溶血-Gb1水平的结果显示于图1A和B中。
从图1A和B中可以看出，处理开始后24小时，溶血-Gb1水平已经大幅升高(数据未显示)。24小时后观察到的溶血-Gb1值显现于整个处理阶段中。在4周、8周和12周后，溶血-Gb1水平的范围为700-900ng/ml，与赋形剂处理的小鼠相比，反映出增加超过500倍。赋形剂处理的(或给药前)动物具有较低但可检测的溶血-Gb1值，大约1.2-1.5ng/ml血液(图1A和B)。
在处理开始4周后，对小鼠的器官进行溶血-Gb1分析。结果显示于图2A中。
从图2A中可以看出，在处理(10mg*kg-1*天-1)开始4周后，分析心脏、肾脏、肝脏、脾脏和脑的溶血-Gb1积聚。与对照动物相比，处理的小鼠的所有外周器官均显示出大幅升高的溶血-Gb1水平。在肾中检测到最高水平的溶血-Gb1，这表明水溶性溶血-Gb1的主要尿液排出。这通过尿液中的溶血-Gb1水平得到证实(图2B)。在所有其他外周器官中也观察到溶血-Gb1的显著增加，而肝脏中的倍数变化更显著并且脾脏中的倍数变化较不显著。脑溶血-Gb1的小幅2倍增加归因于组织毛细血管中的血液遗留，在分析之前未通过灌注将其清除。
实施例3：溶血-Gb1处理的小鼠的系统性损伤的分析
3.1测试高溶血-Gb1水平是否对动物造成系统性损伤。通过血细胞计数分析评价这样的系统性损伤。结果显示于图3中。
从图3左图中可以明显看出，Hb值略微降低并且在每个时间点低于基线值2x SD，表明如Raabe等(Raabe等，2011，同上)定义的轻度贫血。对所有时间点的对照组进行比较，并且发现它们之间不存在统计学差异。
更具体地，动物显示有(displaced)降低的Hct，并且在处理开始后4周和8周时Hct值不同(图3，右图)。12周时对照值的下降是显著的，并且可能是赋形剂(50％DMSO/50％丙二醇)处理的结果，因为丙二醇(丙二醇的附录，补充丙二醇的1997年毒理学档案；https://www.atsdr.cdc.gov/toxprofiles/propylene_glycol_addendum.pdf)已被证明是一种血液学上有效的化合物。低输注体积和报道的化合物在显著更高剂量下的耐受性(Thackaberry等,2010,Toxicol Sci,117:485-492)使得这不太可能。然而，更重要的是这样的事实：在溶血-Gb1处理的动物中不存在Hct减少的进一步进展。
应当注意，并未观察到血小板减少症或白细胞(WBC)异常。表S1A和S1B(图6)总结了该研究中汇编的所有相关参数。
3.2由于贫血是脾脏肿大(戈谢病的另一个标志)的常见结果，所以进行器官重量分析、蛋白质印迹分析以及脾脏的大小和颜色分析。其结果显示于图4A、图4B和图4C中。
图4A总结了从溶血-Gb1处理的C57/BL/6JRj小鼠的器官重量分析获得的结果。从图4A中可以明显看出，与对照器官相比，治疗开始8周和12周后，处理的小鼠的脾脏肿大。肝脏重量与对照动物无统计学差异，因此动物没有肝大。
为了研究脾脏和肝脏两者在组织炎症方面的分子变化，分析了巨噬细胞标志蛋白F4/80和CD68。图4B示出了所述炎性组织标志物F4/80和CD68的蛋白质印迹分析的结果。与器官重量一致，两种蛋白质的水平在脾脏中升高，而在肝脏中仅观察到轻微的变化。
最后，对来自对照和溶血-Gb1处理的动物的一半脾脏进行目视检查。器官样品显示了大小的变化和不同的颜色外观(参见图4C)。
使用H&E对所有动物的脾脏(还有肝脏和股骨)进行一般组织染色未显示出赋形剂和溶血-Gb1处理的器官之间的显著异常(数据未显示)，但是使用特异性抗体的免疫组织化学分析证实了蛋白质印迹结果。详细地，在赋形剂和溶血-Gb1处理的小鼠中，脾脏的H&E染色切片在白髓和红髓中显示出类似的形态(图5A、B)。免疫组织化学数据显示，当与赋形剂对照相比时，溶血-Gb1处理的小鼠中的CD68-免疫反应性大幅增加(图5C、D)。特别地，在荚膜附近看到CD68阳性细胞的积聚(图5E、F)。此外，与赋形剂对照相比，溶血-Gb1处理的小鼠中F4/80免疫反应性增加(图5G、H)。更高的放大倍数显示，与溶血-Gb1处理的小鼠的脾脏中的CD68阳性细胞相比，F4/80阳性细胞的定性染色强度为弱至中等(图5E、F至I、K)。
溶血-Gb1是GCase的潜在底物，其提出的问题是，如前所评估，该处理是否可以影响动物中的适当酶功能(Vacaro等,1985,Eur J Biochem 14:351-21)。脾脏和肝脏裂解物中的酶测量显示出正常的离体活性(图7)，这提供了溶血-Gb1并未显著影响小鼠中的野生型GCase的证据。葡糖神经酰胺水平仅受到适度影响的事实进一步支持了该发现(图8)。
实施例4：实施例2和3的结果的解读
用高剂量(10mg*kg-1*天-1)的溶血-Gb1皮下处理10周龄C57BL/6JRj小鼠长达84天(12周)的时间段。
小鼠在血液和脾脏中显现出与轻微形式的戈谢病相当的表型，其中表型类似于戈谢病1型的遗传性小鼠模型中观察到的表型。
尽管存在正常的GCase，但是所述处理导致所有主要组织中的溶血-Gb1积聚和在处理开始后4周时>500ng/ml血液的稳健血液浓度。对此的一种解释可以是与葡糖神经酰胺相比，GCase水解溶血-Gb1的能力较低(Vacaro等，同上)。典型地，在酶替代疗法(缩写为ERT)之前，戈谢患者血浆溶血-Gb1水平的范围为50–250ng/ml(Rolfs等,PLoS One.8(11):e79732)，表明小鼠循环中的所得浓度是可比较的，因为，至少在人类中，溶血-Gb1血液水平超过血浆值>2倍(未公开的数据)。由于发现溶血-Gb1水平与疾病严重程度相关(Dekker等，2011，同上；Rolfs等，2013，同上)，因此可以预期如果观察到的溶血-Gb1浓度最初是GD症状发作的原因，则其足够高以在小鼠中产生与在患者中类似的表型，最典型的是肝脾大、贫血和骨病。
据信，葡糖神经酰胺和葡糖鞘氨醇是造成巨噬细胞器官浸润的原因，并且因此是发展脏器肿大的原因。因此，进行处理的动物的器官重量分析。脾脏重量增加与该器官中溶血-Gb1的显著增加一致，并且通过蛋白质印迹和免疫组织化学证实观察到的CD68和F4/80抗原的升高。这可以表明尽管对CD68和F4/80呈阳性染色的细胞群变化，但是免疫细胞(可能是巨噬细胞)的数量增加导致该组织中的早期或慢性炎症(Boven等,2004,Am JClinPathol 122:359-369；Kinoshita等,2010,J Hepatol,53:903-910)。相比之下，心脏、肺和肾脏的大小看起来正常。处理8周时肝脏重量略微升高(虽然不是统计学上显著的)，并且肝脏切片的组织学检查表明不存在病理生理状况。然而，相应的肝脏CD68和F4/80水平看起来轻微升高，并且在较早开始溶血-Gb1处理(P20)的后续实验中观察到肝脏显著肿大(数据未显示)。该实验还证实了最初在遗传性非神经病性GD小鼠中报道的脾脏增大以及降低的Hb和Hct(Enquist等,2006,Proc Natl Acad Sci USA,103:13819-13824)。
在器官重量和血液参数方面，在治疗8周后并未观察到表型严重程度的进一步发展；这表明小鼠的生理性适应，或者可能是在关键目标位置缺少关键的溶血-Gb1浓度。
此外，小鼠并未显示出明显的健康问题或功能限制，并且在整个实验阶段没有减轻体重。该发现与不具有明显CNS受累的遗传性小鼠模型的情况相反，所述情况表明，与50天龄的健康小鼠相比，体重减轻15％，但是没有进一步的进展性下降(Mizukami等,2002,JClin Invest.109(9):1215-21.)。由Mizukami等介绍的小鼠显示出最小的葡糖神经酰胺贮存和缺少典型的戈谢组织浸润。然而，他们的小鼠确实显示出反映了肝脏TNF-α和IL-1β表达升高的多系统炎症，强调了炎症是可能不必然以存在戈谢细胞为典型特点的GD的关键特征。我们的溶血-Gb1处理的小鼠显示出血液中TNF-α和IL-1β的略微升高，如通过
Multiplex免疫测定所观察到的，可能表明B细胞增殖。然而，我们并未发现大多数研究细胞因子的显著上调(图6)。
小鼠(10周龄动物)护理的较晚开始可能解释观察到的外周组织中的生理变化为何不显示疾病的整个症状谱。较早的报道证实了胚胎期中小鼠体内溶血-Gb1的升高(Orvisky等,2000,Pediatr Res.48(2):233-7)。然而，该发现涉及神经病性戈谢小鼠模型。迄今为止，在非神经病性小鼠模型中不存在对溶血-Gb1的产前研究，但是可以合理假设溶血-Gb1在早期发育阶段中也是升高的，因为发现其在年龄很小的个体的组织中是升高的(Orvisky等,2002,Mol Genet Metab.76(4):262-70)。
相比于GD患者以及Orvisky及其同事(Orvisky等，2000，同上)检查的GD的遗传性小鼠模型(其中在脾脏中观察到最高的溶血-Gb1水平)，我们观察到不同的分布，其中在肾脏和肝脏中测量到最高溶血-Gb1水平。Orvisky及其同事报告的发现表明，GD中的溶血-Gb1来源于脾内巨噬细胞来源，而在我们的模型中，不出所料地，肾脏和肝脏看起来吸收了更多的皮下施用的溶血-Gb1。动物脑中溶血-Gb1水平的可忽略的增加表明溶血-Gb1不能穿过血脑屏障。并未进行CNS测量，因为动物并未表现出行为异常，并且脑中的基础溶血-Gb1水平高于外周器官。这表明对CNS中的溶血-Gb1具有更好的耐受性。
大多数已知的GD模型具有快速下降的缺点，这阻碍了疾病进展的密切检查。大多数GD患者携带N370S等位基因，其与晚期疾病发作、轻微症状和疾病进展缓慢有关。这表明某些(主要是纯合的)患者终生无症状(Balwani等,2010,Arch Intern Med,170:1463-1469)。研究GD的病理生理学与溶血-Gb1处理的动物中的表型之间的关系可以用于更好地理解常见和较轻的GD等位基因。然而，N370S突变也可以发现于具有早期疾病发作的患者中(Balwani等，同上)。最近的发现强烈表明遗传背景(Klein等,2016,Cell Rep,16:2546-53)在GD动物模型和患者的表型严重程度中的关键作用。还可以推测，动物代谢途径的差异有助于疾病的发展。因此，单个近交小鼠品系的溶血-Gb1处理不能充分反映人类GD中表现出的复杂的表型谱。
本发明的小鼠模型可以用于研究溶血-Gb1中和剂(例如抗体和适体)作为GD的潜在药物疗法的功效。针对目标血液疾病(如特定癌症)的单克隆抗体的工程改造正在成为标准疗法。已经采用了通过抗体和适体灭活生物活性脂质的策略(Sabbadini RA.；BritishJournal of Pharmacology.2011；162(6):1225-1238；WO 2011/15341；Purschke等,Biochem J.2014Aug15；462(1):153-62；国际专利申请WO 2011/131371)。分析对GD内脏体征的抗炎药物效果可以帮助揭示观察到的炎性组织反应是否足以保护小鼠免于出现疾病体征，解释它们未改变的整体健康状态。
实施例5：帕金森病中的溶血-Gb1
与患有不具有GBA(葡糖脑苷脂酶)突变的帕金森病的患者相比，患有具有GBA突变的帕金森病的患者显示出溶血-Gb1水平的增加。溶血-Gb1水平始终低于12ng/ml(其为患有戈谢病的患者的临界阈值)，但仍然是增加的(7.9ng/ml相对于2.8ng/ml)。与作为戈谢病携带者但不是帕金森病携带者的患者相比，患有帕金森病的这些患者的溶血-Gb1水平也是增加的。
这些数据支持了溶血-Gb1参与由GBA突变引起的帕金森病的病理生理学。
本说明书、权利要求书、序列表和/或附图公开的本发明的特征可以单独地和以其任意组合作为用于以其多种形式实现本发明的材料。
Claims (12)
1.溶血-Gb1作为药物开发中的可药化靶标的体外用途，所述药物用于治疗和/或预防疾病，其中所述疾病是由葡糖脑苷脂酶(GBA)突变引起的戈谢病或由葡糖脑苷脂酶(GBA)突变引起的帕金森病，其中所述药物是与溶血-Gb1直接相互作用的溶血-Gb1的拮抗剂，其中所述溶血-Gb1的拮抗剂选自由以下组成的组：溶血-Gb1结合抗体或其结合溶血-Gb1的片段、溶血-Gb1结合anticalin、溶血-Gb1结合适体和溶血-Gb1结合镜像体。
2.溶血-Gb1在产生疾病小鼠动物模型中的用途，其中所述疾病是由葡糖脑苷脂酶(GBA)突变引起的戈谢病或由葡糖脑苷脂酶(GBA)突变引起的帕金森病。
3.一种产生疾病动物模型的方法，其中所述方法包括
a)在一段时间内向动物施用溶血-Gb1，
b)确定所述动物是否显示出所述疾病的至少一种症状，
其中所述疾病是由葡糖脑苷脂酶(GBA)突变引起的戈谢病或由葡糖脑苷脂酶(GBA)突变引起的帕金森病。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述动物模型是哺乳动物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述动物模型是啮齿动物。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述动物模型是小鼠。
7.根据权利要求3所述的方法，其中施用溶血-Gb1直至所述动物显示出所述疾病的至少一种症状。
8.根据权利要求3所述的方法，其中皮下施用溶血-Gb1。
9.根据权利要求3所述的方法，其中在两周、四周、六周、八周、十周或十二周的时间段内施用溶血-Gb1。
10.根据权利要求3所述的方法，其中所述至少一种症状是选自包括以下的组的外周症状：脾内脏肿大、轻度贫血、炎性组织反应和肝内脏肿大。
11.一种筛选适用于和/或能够治疗和/或预防疾病的药剂的方法，其中所述方法包括：
-测试候选化合物是否是溶血-Gb1的拮抗剂，
其中如果所述候选化合物是溶血-Gb1的拮抗剂，则所述候选化合物是适用于和/或能够治疗和/或预防疾病的药剂，其中所述疾病是由葡糖脑苷脂酶(GBA)突变引起的戈谢病或由葡糖脑苷脂酶(GBA)突变引起的帕金森病，其中所述候选化合物选自由以下组成的组：溶血-Gb1结合抗体或其抗原结合片段、溶血-Gb1结合anticalin、溶血-Gb1结合适体和溶血-Gb1结合镜像体。
12.药剂在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的应用，其中所述制备包括如下评价所述药剂在治疗和/或预防疾病中的效果：
-在动物模型中测试所述药剂对于所述疾病的效果，其中所述动物模型能够通过根据权利要求3至10中任一项所述的方法获得，并且
其中所述疾病是由葡糖脑苷脂酶(GBA)突变引起的戈谢病或由葡糖脑苷脂酶(GBA)突变引起的帕金森病。
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