CN109400545A - 一种精氨酸甲基转移酶5抑制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明通过对商业化合物库的虚拟筛选及活性研究，发现了一种结构新颖的精氨酸甲基转移酶5抑制剂，结构如式（I），能有效抑制精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)的酶活并且能够有效抑制与PRMT5表达异常相关的肿瘤细胞的恶性增殖。在此基础上，完成了本发明。

Description

一种精氨酸甲基转移酶5抑制剂及其应用
技术领域
本发明涉及一种新型精氨酸甲基转移酶5抑制剂及其应用。
背景技术
蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMTs)家族调控的精氨酸甲基化是一种在细胞核和细胞质中广泛存在的翻译后修饰方式，其以S-腺苷-甲硫氨酸为甲基供体，甲基化修饰蛋白精氨酸侧链的氮原子，生成S-腺苷同型半胱氨酸和甲基精氨酸。目前在哺乳动物身上共发现9种PRMTs（PRMT1-9），其中8种具有生物学活性。根据甲基化产物的不同，可以将PRMTs分为Ⅰ型及Ⅱ型：Ⅰ型PRMT催化形成单甲基精氨酸(MMA)和非对称的二甲基精氨酸，Ⅱ型PRMT催化形成MMA和对称的二甲基精氨酸。PRMT5属于Ⅱ型PRMT。
PRMT5可甲基化不同的底物蛋白参与调节多种生理学过程，例如PRMT5可以通过甲基化组蛋白和转录延长因子从而影响基因转录过程；它可以甲基化抑癌基因p53改变p53的激活状态。
目前已有研究发现在套细胞淋巴癌、急性髓系白血病、肺癌、结肠癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、神经胶质瘤等存在PRMT5的过表达，在套细胞淋巴癌中被证实，通过小分子抑制PRMT5的活性可以抑制肿瘤细胞的增殖。此外，研究发现PRMT5也极有可能是β-地中海贫血病和镰状细胞病的新的治疗靶标。因此PRMT5是一个有前景的治疗靶点，尤其在肿瘤疾病中，已有两个PRMT5的小分子抑制剂处于临床研究阶段。
在新药开发过程中，虚拟筛选被证明是一种非常有效且能够快速发现药物先导物的手段。我们课题组对商业化合物库（SPECS）进行了虚拟筛选，后期通过活性筛选得到了一个化合物，能够抑制PRMT5酶活，并且可有效抑制PRMT5表达异常导致的肿瘤细胞的恶性增殖，能够作为新型PRMT5抑制剂，具有发展成为抗肿瘤药物的良好应用前景。
发明内容
(E)-4-(2-羟基-3-甲氧基苄叉氨基)-2-（5-甲基苯并恶唑-2基）苯酚，结构为式(I)：
。
本发明提供一种精氨酸甲基转移酶5抑制剂，由式I所示的化合物，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物，或其前药制得。
上述的抑制剂应用于制备预防和/或治疗PRMT5表达异常相关的疾病的药物。
上述抑制剂的使用方法包括使细胞与权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体或前药接触的步骤。
上述的抑制剂应用于制备预防和/或治疗急性单核细胞白血病的药物。
其中，所述的急性单核细胞白血病由MV4-11细胞引起。
具体的使用方法包括在MV4-11细胞培养体系中加入权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体或前药。
上述的抑制剂应用于制备预防和/或治疗套细胞淋巴瘤的药物。
其中，所述的细胞淋巴瘤由Jeko-1细胞引起。
具体的使用方法包括在Jeko-1细胞培养体系中加入权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体或前药。
本申请的发明人经过对商业化合物库的虚拟筛选及活性研究，发现了一种结构新颖的精氨酸甲基转移酶5抑制剂，能有有效抑制精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)的酶活并且能够有效抑制与PRMT5表达异常相关的肿瘤细胞的恶性增殖。在此基础上，完成了本发明。
有益效果
本发明的化合物，能够选择性抑制PRMT5，能够用于制备预防和/或治疗PRMT5相关的疾病的药物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为化合物1在Jeko-1细胞上对H4R3的蛋白表达量的影响结果图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1 化合物对PRMT5酶活性的影响
采用放射性同位素的方法测试化合物的酶活抑制活性。实验方法如下：
1. 准备 1x 实验缓冲液（改进的 Tris-HCl 缓冲液）；
2. 在 96 孔板中稀释化合物到所需的浓度；
3. 准备蛋白溶液，也用 1 x 实验缓冲液；
4. 将底物加到 1 x 实验缓冲液中制备底物溶液；
5. 将[3H]-SAM 加入到 1x 实验缓冲液中制备[3H]-SAM溶液；
6. 将SAM 加入到 1x 实验缓冲液中制备冷的 SAM溶液；
7. 移取 10μL 蛋白溶液到含有化合物的 96 孔板中；
8. 室温孵育 15 分钟；
9. 向每个孔中加入 10μL 底物溶液；
10. 向每个孔中加入 10μL [3H]-SAM溶液引发反应；
11. 室温孵育 240 分钟；
12. 向每个孔中加入 10μL 冷的 SAM溶液终止反应；
13. 转移 40μL 反应混合溶液到 GF/B 板上，用三蒸水真空洗涤 3 次；
14. 在 MicroBeta 液体闪烁/发光计数仪上读取数据；
15. 根据公式计算抑制率，
%Inh = (最大信号 – 化合物信号) / (最大信号 –最小信号) × 100
最大信号是从酶和底物反应得到，最小信号是从底物得到。
数据处理后用 GraphPad Prism5.0 作图。使用已知的SAH做阳性对照。
实验结果如表1所示。根据抑制曲线求得化合物的IC50值(抑制酶活力50%时的抑制剂浓度)，实验结果如表1所示。
表1. 化合物对PRMT5酶活性抑制活性
实施例2 化合物对肿瘤细胞增殖的影响
1.细胞培养
MV4-11（急性髓系白血病细胞）、Jeko-1（急性淋巴瘤细胞）细胞培养所用的培养液是RPMI 1640＋10％的胎牛血清，同时为了防止细菌污染，培养液加入了100 U／mL 青霉素和100 μg／mL链霉素。于37℃、5％ CO2饱和湿度条件下培养，实验用的细胞均处于对数生长期。
2.细胞增殖活性检测
调整细胞浓度为1 x 105 /mL 并接种于24 孔培养板，每孔体积1mL，设立对照组和实验组，对照组加DMSO，实验组加入PRMT5活性小分子抑制剂I并使最终浓度达到0-100μM。用CellTiter-Glo试剂检测活细胞量，检测时间为加药处理后4天。实验结果如图1所示。
表2. 化合物对肿瘤细胞增殖的影响
实验结果表明，化合物I对MV4-11和Jeko-1均有较强的增殖抑制作用。
实施例3 化合物对细胞内H4R3甲基化的影响
Western Blot检测H4R3甲基化表达
调整Jeko-1细胞浓度为5 × 105 /ml 并接种于6孔培养板，每孔体积2 ml，设立对照组和实验组，对照组仅加DMSO，实验组加入化合物I以使终浓度为5-40 μM。细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱培养96h后收集，获取细胞总蛋白。在蛋白样品中按比例加入2× SDS，混匀后99℃变性10min，并于4-12% SDS−PAGE分离。将蛋白电转入硝酸纤维膜，并用5%脱脂牛奶室温封闭0.5h。H4R3及H4抗体4℃封闭过夜。用1×TBST洗3次，每次5分钟；稀释后的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1h。1×TBST洗3次，每次5分钟。使用ECL Western Blot发光检测试剂和分析系统进行显色。
通过Western blot 蛋白印迹杂交实验检测H4R3的蛋白表达量，以此来探究化合物对胞内对称二甲基化精氨酸的影响。研究表明，H4R3蛋白是PRMT5的底物，能够被PRMT5甲基化修饰，因此H4R3可以被用于追踪给药后PRMT5在胞内的变化。实验结果（图1）显示，胞内H4R3被明显抑制，所以可以推测该系列化合物的抗细胞增殖作用是由PRMT5被抑制的直接结果，这也说明，本发明化合物在胞内没有脱靶。
实验结果表明，细胞内H4R3被明显抑制，化合物在细胞内能够靶向PRMT5。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (9)

1.一种精氨酸甲基转移酶5抑制剂，其特征在于，由式I所示的化合物，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物，或其前药制得，。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，应用于制备预防和/或治疗PRMT5表达异常相关的疾病的药物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述方法包括使细胞与权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体或前药接触的步骤。
4.一种精氨酸甲基转移酶5抑制剂的应用，其特征在于，应用于制备预防和/或治疗急性单核细胞白血病的药物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的急性单核细胞白血病由MV4-11细胞引起。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的方法包括在MV4-11细胞培养体系中加入权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体或前药。
7.一种精氨酸甲基转移酶5抑制剂的应用，其特征在于，应用于制备预防和/或治疗套细胞淋巴瘤的药物。
8.跟权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的细胞淋巴瘤由Jeko-1细胞引起。
9.根据权利要求8所述的应用，所述的方法包括在Jeko-1细胞培养体系中加入权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体或前药。
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