CN109394755A - 原花青素类化合物在制备抗寨卡病毒的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了式(I)所示的原花青素类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗寨卡病毒的药物中的应用，提供了式(I)所示的原花青素类化合物或其药学上可接受的盐在制药领域中的新用途。该类化合物能有效抑制寨卡病毒的扩增，可作为先导化合物，发展为预防和治疗寨卡病毒感染的药物。活性化合物在抑制剂量下无明显的细胞毒性，且具有共同的母核结构，但母核结构不具备抗病毒活性。其中，活性化合物原花青素被发现在非洲绿猴肾细胞和人脑胶质瘤细胞中均有抗寨卡病毒的活性。该类化合物具重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及药物用途发明领域，具体地，涉及原花青素类化合物在制备抗寨卡病毒的药物中的应用。
背景技术
寨卡病毒(ZikaVirus，ZIKV)为单股、非节段、正链RNA病毒，是一种由蚊虫传播的虫媒病毒，隶属于黄病毒科(Flaviviridae)，黄病毒属(Flavivirus)，与登革病毒(DengueVirus)、黄热病病毒(Yellow Fever Virus)、日本脑炎病毒(Japanese EncephalitisVirus)和西尼罗病毒(West Nile Virus)等黄病毒有亲属关系，具有极强的传染性。2015年，中南美洲(巴西及哥伦比亚)和非洲(佛得角)报告发生寨卡疫情，随后，逾13个美洲国家报告存在寨卡病毒感染，欧洲、亚洲、大洋洲多个国家也陆续发现输入性病例。据巴西卫生部门初步估计，2015年，巴西大约有四十四万到一百三十万例寨卡病毒感染，这说明寨卡病毒疫情在地域上有快速扩大之势。另外，科学家怀疑寨卡病毒可能会造成神经和自身免疫系统并发症。在巴西寨卡疫区，当地卫生局发现婴儿头小畸形(Microcephaly)和吉兰-巴雷综合症(Guillain-BarréSyndrome)患者的数量有所上升。事实上，自2015年寨卡疫情爆发以来，巴西已出现超过4100例新生儿头小畸形。基于寨卡疫情迅速蔓延的趋势，世界卫生组织(WHO)和相关国家政府都提出了紧急应对措施。因此，寻找有效的抗寨卡病毒药物是急需解决的问题，具有非常重要的意义和价值。
原花青素及其类似物具有儿茶素的母核结构。该类化合物广泛存在于葡萄籽、松树皮等植物中。目前由于其抗氧化性，而在市场上被当作人体内的自由基清除剂，应用为保健品。此外，有文献报道该类化合物在抗丙肝病毒(Hepatitis C Virus)、甲型流感病毒(InfluenzaAVirus)等方面均有良好的活性。但除了(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-Epigallocatechin gallate)外，尚未有其他化合物关于抗寨卡病毒活性的报道。
发明内容
本发明提供了原花青素类化合物的新用途。
根据一个方面，本发明提供了下式(I)所示的原花青素类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗寨卡病毒的药物中的应用：
其中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、羟基、甲基、甲氧基、-COR5、 R5为羟基取代的苯基；R1、R2、R3和R4不同时为氢，且式(I)所示的原花青素类化合物不为(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯。
优选地，
R1选自氢、羟基、
R2选自氢、羟基、
R3选自氢、羟基、-COR5或R5为羟基取代的苯基；
R4选自氢、羟基；
R1、R2、R3和R4不同时为氢，且式(I)所示的原花青素类化合物不为(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯。
更优选地，所述原花青类化合物选自如下化合物：
更优选地，所述原花青素类化合物为原花青素或原花青素C1。
根据另一个方面，本发明提供了上述式(I)所示的原花青素类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗寨卡病毒药物中的应用。
本申请人经实验研究发现，上述式(I)所示的原花青素类化合物能有效抑制寨卡病毒的扩增，可作为先导化合物，发展为预防和/或治疗寨卡病毒感染的药物。
根据另一个方面，本发明提供了一种药物组合物在制备抗寨卡病毒的药物中的应用，其中，所述药物组合物包括上述式(I)所示的原花青素类化合物或其药学上可接受的盐，和任选地其药学上可接受的载体。
本发明还提供了含有所述原花青素类化合物或其药学上可接受的衍生物的药物、植物、制剂等中的一种或多种的组合在制备抗寨卡病毒的药物中的应用。
进一步地，所述寨卡病毒为寨卡病毒非洲谱系(African lineage)或亚洲谱系(Asian lineage)。
优选地，所述寨卡病毒为寨卡病毒亚洲谱系。
进一步地，所述抗寨卡病毒感染包括抗寨卡病毒感染易感细胞或直接对病毒本身进行杀伤。
本申请人经定量聚合酶链式反应(Quantitative Polymerase Chain Reaction,Q-PCR)实验研究了所述原花青素类化合物的抗寨卡病毒活性，结果如图1所示。发现NSF104原花青素(Procyanidin)、NSF237没食子儿茶素没食子酸酯((-)-Gallocatechingallate)、NSF240葡萄籽提取物(Grape Seed Extract)、NSF245原花青素C1(ProcyanidinC1)等原花青素类化合物具有较好的抗寨卡病毒活性，并具有共同的母核结构，其结构式见图2。NSF244最近已被报道，但其结构相差较大，且本发明活性最好的化合物比NSF244强两倍以上。图1中NSF233、NSF234、NSF236、NSF238、NSF243都是母核结构，但不具备抗病毒活性。活性化合物的抑制曲线见图3，计算得活性化合物半数有效抑制浓度(IC50)值为NSF104(4.258μM),NSF237(8.035μM),NSF240(7.586μM),NSF245(1.493μM)。活性化合物细胞毒性测试见图4。预处理时间和不同易感细胞中的活性测试见图5。其他方法的活性验证见图6。
所述原花青素类化合物可添加药物可接受的载体，制成常规的剂型如片剂、散剂、针剂、颗粒剂、胶囊剂等。
本发明的有益效果主要体现在：
(1)本发明发掘了原花青素类化合物的新用途，即在制备抗寨卡病毒的药物中的应用。
(2)本发明首次发现NSF104、NSF237、NSF240、NSF245具有抗寨卡病毒的活性。
(3)本发明发现的活性化合物的抗病毒活性强，其中NSF245(原花青素C1)的半数有效抑制浓度(IC50)仅为已报道的活性化合物NSF244的三分之一左右。
(4)本发明发现的活性化合物具有共同母核儿茶素结构。
(5)本发明发现的活性化合物在抑制剂量下并无明显的细胞毒性作用，且部分化合物已作为保健品出现在市场上，安全性高。预示着该类化合物在抗寨卡病毒感染领域有很好的药用前景。
(6)活性化合物NSF104对不同的易感细胞表现出抗寨卡病毒活性，且抑制效果已得到不同实验方法的验证。
附图说明
图1为显示用Q-PCR方法测定的原花青素类化合物在非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)中的抗寨卡病毒活性实验结果的图。纵坐标为寨卡病毒RNA的相对数量，是指每种化合物处理组相对溶剂空白对照组寨卡病毒RNA的数量(％)；
图2为几种原花青素类化合物及其共同母核的结构式的图；
图3为用Q-PCR方法测定的4个活性化合物在非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)中对寨卡病毒的抑制曲线(计算出IC50)；
图4为显示4个活性化合物对非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)的毒性检测结果的图；
图5为显示用Q-PCR方法测定的活性化合物NSF104(原花青素，Procyanidin)在处理时间为1-3天时分别在非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)和人脑胶质瘤细胞(U251MG细胞)中的抗寨卡病毒活性实验结果的图；
图6为显示用免疫荧光检测方法(Immunofluorescence)及蛋白质印迹法(WesternBlot)测定的活性化合物NSF104(原花青素，Procyanidin)在非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)中的抗寨卡病毒活性实验结果的图。图6A中的mock指无寨卡病毒感染的细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例一：基于Q-PCR的抗寨卡病毒活性测试
1、实验材料
(1)细胞株：金侠课题组赠送的非洲绿猴肾细胞(vero细胞株)
(2)病毒株：寨卡病毒株(中国科学院武汉病毒研究所微生物菌毒种保藏中心)
(3)主要试剂：TRNzol裂解液(Tiangen)、氯仿、异丙醇、75％乙醇、反转录试剂盒(ReverTraAce qPCR RT,Yoyobo)、实时荧光定量PCR试剂盒(SYBR Green Realtime PCRMasterMix,Toyobo,Japan)
(4)主要仪器：Eppendorfcentrifuge 5424R低温离心机、Applied BiosysytemsPCR仪、Applied Biosysytems quantistudio 6Flex、海尔冰箱
2、实验方法
(1)化合物与寨卡病毒共同处理非洲绿猴肾细胞
4μL 1×106寨卡病毒(MOI＝0.1)分别与不同剂量(0.1,1,10μM)的16种化合物(见图1所列)混合好后同时处理4×104个非洲绿猴肾细胞，48小时后弃掉上清，收取细胞。
(2)细胞内RNA抽提以及反转录
1)收取的细胞用500μLTRNzol(Tiangen)裂解收集，随后加入100μL氯仿。剧烈震荡混匀后，16000rcf，4℃，离心10分钟，用无RNA酶的EP管和枪头吸取上层水相约200μL，并加入等体积异丙醇置于-20℃沉淀2小时。沉淀后的RNA在16000rcf，4℃，离心10分钟，用75％乙醇洗涤两遍，晾干后用30μL无RNA酶的水溶解。
2)反转录使用ReverTraAce qPCR RT试剂盒(Toyobo)：RNA于65℃变性5分钟后置于冰上。
反转录反应体系如下：10μL
| Buffer | 2μL |
| H<sub>2</sub>O | 3μL |
| Primer(引物) | 0.5μL |
| Enzyme(酶) | 0.5μL |
| RNA | 4μL |
反转录反应步骤：
| 37℃ | 15分钟 |
| 95℃ | 5分钟 |
| 4℃ | 5分钟 |
(3)实时荧光定量PCR
反应体系：12μL
| SYBR | 6μL |
| Primer qF | 0.24μL |
| Primer qR | 0.24μL |
| H<sub>2</sub>O | 3.52μL |
| cDNA | 2μL |
定量PCR反应程序：
所用的primer序列：
| ZIKV-qF | CAACCACTGCAAGCGGAAGGGT |
| ZIKV-qR | AAGTGATCCATGTGATCAGTTGA |
| Actin-qF | AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG |
| Actin-qR | ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC |
3、实验结果
如图1所示，我们观察到不同浓度(0.1,1,10μM)的化合物NSF237、NSF240、NSF245、NSF104抑制了胞内的寨卡病毒RNA水平，在10μM浓度下几乎可以完全抑制胞内病毒核酸水平。
其中，化合物NSF237、NSF240、NSF245、NSF104的名称与分子式如图2所示，NSF237为没食子儿茶素没食子酸酯((-)-Gallocatechin gallate)，NSF240为葡萄籽提取物(Grape Seed Exact)，NSF245为原花青素C1(Procyanidin C1),NSF104为原花青素(Procyanidin)，5种具有抗寨卡病毒活性的化合物的共同母核为儿茶素或表儿茶素(catechin)。
实施例二：5种具有抗病毒活性的化合物的IC50计算
1、实验材料
(1)主要试剂：同实施例一。
(2)主要仪器：同实施例一。
2、实验方法
(1)实施例一中筛出来的5种化合物与寨卡病毒同时处理非洲绿猴肾细胞
1)4μL 1×106寨卡病毒(MOI＝0.1)分别与不同剂量(0,0.5,1,2,4,8,16,32,64μM)的5种化合物(见图3所列)混合好后同时处理4×104个非洲绿猴肾细胞，48小时后弃掉上清，收取细胞。
(2)细胞内RNA抽提以及反转录、实时定量Q-PCR。
具体方法同实施例一。
3、实验结果
结果用Graphpad软件计算得出，NSF237、NSF240、NSF245、NSF104等5种化合物的IC50(50％抑制浓度)分别为：8.035μM、7.586μM、1.493μM和4.258μM。结果见图3。
实施例三：细胞毒性实验
1、实验材料
(1)主要试剂：CellTiter-Glo试剂(Promega)
(2)主要仪器：多功能酶标仪(Thermo)
2、实验方法
(1)铺在96孔板的2×104个非洲绿猴肾细胞用不同浓度(0,0.5,1,2,4,8,16,32,64μM)的5种化合物处理2天后，使用CellTiter-Glo试剂(Promega)检测细胞活力：在每个细胞培养孔加入100μL的CellTiter-Glo检测试剂，室温置于摇床20分钟后，使用白色微孔发光定量仪检测荧光数值。
3、实验结果
如图4所示：除了化合物NSF245在较高剂量下具有较为明显的细胞毒性外，其余3种化合物皆无明显的细胞毒性。
实施例四：不同处理时间下及不同细胞中的抗病毒活性
1、实验材料
(1)细胞株：金侠课题组赠送的非洲绿猴肾细胞(vero细胞株)、程乐平课题组赠送的人星形胶质瘤细胞(U251MG)
(2)主要试剂：同实施例一。
(3)主要仪器：同实施例一。
2、实验方法
(1)4μL 1×106寨卡病毒(MOI＝0.1)分别与不同剂量(0,0.5,1,2,4,8,16,32,64μM)NSF104化合物同时处理4×104个非洲绿猴肾细胞(图5A)和4×104个人星形胶质细胞瘤细胞U251MG(图5B)，分别在24小时、48小时和72小时后弃掉上清，收取细胞。
(2)细胞内RNA抽提以及反转录、实时定量Q-PCR。
具体方法同实施例一。
3、实验结果
如图5所示，24小时后，NSF104在2种不同的细胞系都发挥了抑制寨卡病毒的作用，72小时依然存在抗病毒作用。
实施例五：基于免疫荧光检测法和基于蛋白印迹法的抗寨卡病毒活性验证
1、实验材料
(1)主要试剂：PIRA裂解液、蛋白酶抑制剂PMSF、一抗flavivirus envelopeprotein(clone D1-4G2-4-15；mouse；1:1000；Millipore,Billerica,MA)、二抗AlexaFluor 488-conjugated secondary antibody、核染料Hoechst33258dye、4％多聚甲醛、一抗anti-ZIKV capsid polyclonal antibody(capsid peptide sequence designed asMKNPKKKSGGFRIVC)and一抗β-actin(Sigma,Darmstadt,Germany)、chemiluminescent HRPsubstrate(Millipore)。
(2)主要仪器：多功能酶标仪(Thermo)、荧光显微镜、Transference decoloringshaker、Amersham imager 600。
2、实验方法
(1)将2×104非洲绿猴肾vero细胞铺到96孔板里，过夜，将2μL1×106寨卡病毒寨卡病毒分别与不同剂量(0,0.5,1,2,4,8,16,32,64μM)NSF104处理非洲绿猴肾vero细胞，48小时后弃上清收取细胞。
(2)将(1)收取的细胞加入4％多聚甲醛固定液，室温30分钟固定后，PBS洗三遍，再加入封闭液(含10％FCS,1％Triton,3％BSA的PBS溶液)室温封闭1小时降低非特异性结合。弃去封闭液后再加入结合缓冲液(含1％Triton,3％BSA的PBS溶液)稀释的flavivirusenvelope protein(病毒包膜蛋白)单克隆抗体。弃去一抗反应液，PBS洗三遍，再加入结合缓冲液稀释的AlexaFluor488标记的二抗和Hoechst 33258染色液，室温摇床上避光1小时。弃去二抗反应液，PBS洗三遍后于荧光显微镜下荧光并拍照。
(3)将2×105非洲绿猴肾vero细胞铺到12孔板里，过夜，将20μL1×106寨卡病毒寨卡病毒分别与不同剂量(0,0.5,1,2,4,8,16,32,64μM)NSF104处理非洲绿猴肾vero细胞，48小时后弃上清收取细胞。
(4)蛋白免疫印迹方法
将上述(3)收取的细胞样品在冰上用RIPA裂解液(含有PMSF(苯甲基磺酰氟))裂解，之后BCA蛋白浓度测定试剂盒对不同组别的蛋白样品定量。最终每个样品吸取等量蛋白裂解液，加入5倍体积的SDS-PAGE上样缓冲液，98℃煮10分钟。聚丙烯凝胶电泳：每个样品上样20μL，60V(伏特)浓缩胶，130V(伏特)分离胶，时间视样品位置而定。转膜：200mA 2小时，后用5％脱脂牛奶4℃过夜封闭，再用对应的一抗(anti-ZIKV capsid，β-actin)和二抗(Alexa Fluor488标记的二抗)分别室温孵育2小时和1小时。最后用HRP(辣根过氧化物酶)底物显影检测目标蛋白表达量。
3、实验结果
如图6所示，图6A为NSF104和寨卡病毒同时处理细胞的免疫荧光结果，从胞内检测到的寨卡病毒E蛋白的水平(绿色荧光强弱)来看，NSF104抑制了寨卡病毒E蛋白的表达，进一步证实了NSF104具有抗寨卡病毒活性。图6B为NSF104和寨卡病毒同时处理细胞的蛋白免疫印迹结果，从寨卡病毒capsid蛋白表达水平来看，NSF104抑制了寨卡病毒capsid蛋白的表达，进一步证实了NSF104具有抗寨卡病毒活性。
Claims (6)
1.式(I)所示的原花青素类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗寨卡病毒的药物中的应用：
其中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、羟基、甲基、甲氧基、-COR5、 其中R5为羟基取代的苯基；R1、R2、R3和R4不同时为氢，且式(I)所示的原花青素类化合物不为(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯。
2.根据权利要求1所述的式(I)所示的原花青素类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗寨卡病毒的药物中的应用，其特征在于：
R1选自氢、羟基、
R2选自氢、羟基、
R3选自氢、羟基、-COR5或其中R5为羟基取代的苯基；
R4选自氢、羟基。
3.根据权利要求1所述的式(I)所示的原花青素类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗寨卡病毒的药物中的应用，其特征在于：所述原花青类化合物选自如下化合物：
4.根据权利要求1所述的式(I)所示的原花青素类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗寨卡病毒的药物中的应用，其特征在于：所述原花青素类化合物为原花青素或原花青素C1。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的式(I)所示的原花青素类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗寨卡病毒的药物中的应用，其特征在于：所述寨卡病毒为寨卡病毒非洲谱系或亚洲谱系。
6.根据权利要求5所述的式(I)所示的原花青素类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗寨卡病毒的药物中的应用，其特征在于：所述寨卡病毒为寨卡病毒亚洲谱系。
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