CN109358105B - 一种减少春雷霉素残渣中春雷霉素含量装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种减少春雷霉素残渣中春雷霉素含量装置及方法,采用直流电泳和大分子胶分离技术,采用装置是在一般电泳装置中放置大分子胶,大分子胶中挖一正方形孔,该孔底层有大分子胶为裙底,电解液为PBS、0.8%氯化钠溶液和Tris‑HCl缓冲液,春雷霉素残渣放入正方形大分子胶的孔内或直接电泳。该装置能很好地去除春雷霉素残渣中的春雷霉素,使其更好的资源化利用,另外大分子胶为生物降解材料,残渣中的春雷霉素经电泳跑到大分子胶里,利用分离技术可将跑入到大分子胶的春雷霉素再利用,其中经脱春雷霉素的大分子胶可循环利用。
Description
技术领域
本发明属于小金色链霉菌发酵残渣中的春雷霉素去除的技术领域,具体涉及一种减少春雷霉素残渣春雷霉素含量方法。
背景技术
春雷霉素(Kasugamycin)又叫春日霉素、加收米,是一种防治农作物病害的微生物源农用杀菌剂,其化学名为(5-氨基-2-甲基-6-(2,3,4,5,6-羟基环己基氧代)四氢吡喃-3-基)氨基-α-亚氨醋酸,分子式 C14H25N3O9,分子量 379.4。春雷霉素纯品为白色结晶;盐酸盐为白色针状或片状结晶,纯品熔点:236~239℃分解,盐酸盐熔点:202~204℃(分解),易溶于水,在25℃水中溶解12.5%(W/V),不溶于甲醇、乙醇、丙酮、苯等有机溶剂。其结构式如下式所示:
春雷霉素对人畜无毒、无残留、无污染,符合现代环保要求,被农业部列为无公害农产品生产推荐生物农药。随着人们对农药安全意识的提高,春雷霉素高效、广谱、无公害的生物特性展示了越来越广泛的市场前景。
尽管春雷霉素在水稻稻瘟病等细菌病害防治中药效显著,但利用小金色链霉菌发酵产春雷霉素原药过程中产生大量的抗生素残渣,该残渣的特点如下:
(1)小金色链霉菌发酵178h后的发酵液经酸化后(pH3.0-3.5),经陶瓷膜过滤产生大量的残渣,该残渣春雷霉素含量范围1020-1450µg/L,残渣含水率为90-92%,另外为蛋白、糖类、脂类和微量金属元素;
(2)春雷霉素残渣的水分不容易分离,大多数水分存在小金色链霉菌菌丝体的细胞内,采用超速离心预处理近只能去除部分细胞外的水分;
(3)由于春雷霉素残渣含水量高,如未经处理直接焚烧,其处理装置包括焚烧炉、热交换器、尾气处理装置及吸收塔等,日焚烧费用高,燃烧热值低,可利用价值低,势必增加企业成本等。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题,本发明提供一种减少春雷霉素残渣中春雷霉素含量装置及方法,经减少春雷霉素含量的残渣可进一步资源化利用,降低春雷霉素残渣处理费用,提高春雷霉素残渣再次利用率。
本发明采用如下技术方案如下:一种减少春雷霉素残渣中春雷霉素含量的装置,所述的装置为直接电泳装置,并且另设多孔正方形大分子胶,电解电压为0-300伏,电流为0-150mA, 工作时间为0-120min,采用的直流电泳方式。
进一步地,所述的大分子胶材质为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和果胶中一种。
本发明还保护一种减少春雷霉素残渣中春雷霉素含量方法,采用直流电泳和大分子胶分离相结合的技术,采用装置是在一般电泳装置中放置大分子胶,大分子胶中挖一正方形孔,该孔底层有大分子胶为裙底,电解液为PBS缓冲液、0.8%氯化钠溶液和Tris-HCl缓冲液中的一种或几种,春雷霉素残渣放入正方形大分子胶的孔内进行直接电泳。
进一步的,所述的装置中采用的电泳配置液为pH=7.2的PBS缓冲液或pH=7.0的0.8%NaCl。
进一步地,所述的大分子胶材质为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和果胶中一种。
进一步地,所述的大分子胶材质为琼脂糖凝胶时,其制备方法包括以下步骤:
①称量琼脂糖凝胶,配置一定蒸馏水,蒸馏水中含琼脂糖胶条的质量比3-5%,加热80-100℃溶解,充分搅拌后倒入正方形铁制模具后,在室温下凝固后,在凝固胶中央挖一正方型孔;
②配置电解液,将电解液倒入电泳槽中,将挖好孔的凝固胶放置电泳槽中央固定好后通直流电泳。
进一步地,所述的大分子胶材质为聚丙烯酰胺凝胶时,其制备方法包括以下步骤:①将丙烯酰胺(Acr)和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis) 在催化剂的作用下聚合交连而成具有一定大小孔径的凝胶;
②凝胶浓度按T = [(a+b)/m] x 100(%),C = [b/(a+b)] x 100(%),其中T代表100mL凝胶溶液中含有的单体和交联剂的总克数,C代表凝胶溶液中,交联剂占单体和交联剂总量的百分数;其中a表示丙烯酰胺的质量,b 表示N,N-甲叉双丙烯酰胺的质量,选取a:b=30:1,其余为催化剂与双蒸水;
③将配置好的聚丙烯酰胺凝胶加热80-100℃溶解,充分搅拌后倒入正方形铁制模具后,在室温下凝固后,在凝固胶中央挖一正方型孔;
④配置电解液,将电解液倒入电泳槽中,将挖好孔的凝固胶放置电泳槽中央固定好后通直流电泳。
进一步地,所述的大分子胶材质为果胶时,其制备方法包括以下步骤:
①称量一定量的果胶倒入正方形铁制模具后,在室温下凝固后,在凝固胶中央挖一正方型孔;
②配置电解液,将电解液倒入电泳槽中,将挖好孔的凝固胶放置电泳槽中央固定好后通直流电泳。
进一步地,所述的正方形铁制模具的长×宽×高=12×12×2.5cm,所述的正方型孔的长×宽×高=6×6×2cm。
进一步地,春雷霉素残渣中春雷霉素的含量为1020-1450µg/L。
进一步地,电解过程中,电压为110-170v,电泳时间为90-120min;更优选的,电压为110v,电泳时间为120min。
进一步地,所述的大分子胶材质为琼脂糖凝胶时,在电压110V,工作时间120min,春雷霉素残渣的春雷霉素去除率为92%;电泳槽中的电泳液未检测出春雷霉素;所述的大分子胶材质为聚丙烯酰胺凝胶时,在电压110V,工作时间120min,春雷霉素残渣的春雷霉素去除率为95%,电泳槽中的电泳液未检测出春雷霉素。所述的大分子胶材质为果胶时,在电压110V,工作时间120min,春雷霉素残渣的春雷霉素去除率为92.5%;电泳槽中的电泳液未检测出春雷霉素,电泳液种类对春雷霉素残渣的春雷霉素去除率影响不显著(p>0.05)。
进一步地,琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和果胶对春雷霉素残渣的春雷霉素去除率不存在显著差异(p>0.05),但从环保和经济利益考虑,优先选取琼脂糖凝胶和果胶为多孔支持物。
本发明具有如下有益效果:
1、春雷霉素残渣的春雷霉素经分离后可重新利用,剩余残渣可厌氧发酵产生物质能,厌氧发酵的污泥可做生物有机肥料或环保保温建筑材料等;
2、去除春雷霉素的残渣可做钩鱼饵料,见发明专利“一种春雷霉素残渣发酵的钩鱼饵料及制备方法,专利号:201810884782.8”;
3、去除春雷霉素的残渣可厌氧发酵产生物质能,减少春雷霉素对厌氧发酵菌的抑制作用,提高产氢和产甲烷菌的产沼气效率;
4、减少企业春雷霉素残渣处理费用,同时春雷霉素残渣资源化利用,大大减少生产企业周边环境污染;
5、另外大分子胶为生物降解材料,残渣中的春雷霉素经电泳跑到大分子胶里,利用分离技术可将跑入到大分子胶的春雷霉素再利用,其中经脱春雷霉素的大分子胶可循环利用。
附图说明
下面结合附图做进一步的说明:
图1为负载不同多孔支持物电泳运行的装置示意图;
其中,1、选择开关,2、电压表,3、电流表,4、电源正极接口,5、电源负极接口,6、电泳槽,7、多孔支持胶,8、正方形胶孔,9、电源正极,10、电源负极,11、电源正极线,12、电源负极线;
图2为小金色链霉菌发酵178小时后的SEM图。
具体实施方式
为了对本发明的目的、技术方案及技术效果有更加清楚的理解,现对照附图及具体实施例对本发明进一步详细说明。
本发明所采用的测试手段如下:
(1)春雷霉素质量分数的测定
所述试剂如下:
乙腈:色谱纯;水:新蒸二次蒸馏水;春雷霉素盐酸盐水合物标样:已知质量分数≥80.0%。
所述仪器如下:
高效液相色谱仪:具有可变波长紫外检测器;色谱数据处理机;色谱柱:150mm×3.9mm(id)不锈钢色谱柱,Waters symetryshield RP18,粒径5μm;微量进样器:50μL。
高效液相色谱操作条件如下:
流动相:0.5%十二烷基硫酸钠水溶液∶乙腈= 80∶20(v/v),用磷酸调pH值为2.5。
流速:1.0mL/min;检测波长:210nm;温度:25℃;进样体积:10μL;保留时间:春雷霉素约10.7min。
计算:
将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中春雷霉素的面积分别进行平均,试样中春雷霉素的质量分数ω1(%)按式(1)计算:
式中:A 1 ――标样溶液中,春雷霉素峰面积的平均值;
A 2 ――试样溶液中,春雷霉素峰面积的平均值;
m 1 ――春雷霉素标样的质量,单位为克(g);
m 2 ――试样的质量,单位为克(g);
ω――标样中春雷霉素的质量分数(%)。
(2)春雷霉素残渣金属离子的测定方法参照肥料测定金属离子的国标方法GB/T23349-2009。
实施例1
为了确定时间电压对春雷霉素残渣的春雷霉素含量的影响,选取178小时发酵液(菌丝体扫描电镜见图2)经酸化的酸化液经陶瓷膜过滤的残渣,选择电压为30、50、70、90、110、130、170伏的直流电压,电泳槽的电泳液为PBS缓冲液(pH=7.2),电泳时间为90min,多孔支持物为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和果胶,具体结果见表1.1。
表1.1 不同电压对春雷霉素残渣的春雷霉素去除效果的影响
从表1.1可以看出,随着电压不断升高,各支持物残渣的春雷霉素去除率是不断升高的,30-100伏之间,升高幅度越大,110伏后,升高趋势不明显;在30-50伏直流电压间,其中聚丙烯酰胺凝胶支持物下的春雷霉素下降更快,三种支持物下的残渣春雷霉素去除效果比较可知,聚丙烯酰胺凝胶和果胶两者春雷霉素去除率差异极显著(p<0.01),聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶两者春雷霉素去除率差异显著(0.01<p<0.05),果胶与琼脂糖凝胶两者春雷霉素去除率差异不显著(p>0.05),70-170伏电压间,支持物春雷霉素去除率两者比较差异不显著(p>0.05)。
实施例2
为了确定时间对春雷霉素残渣的春雷霉素含量的影响,选择电泳时间为30、45、60、75、90、105和120min,直流电压110伏,电泳槽的电泳液为PBS缓冲液(pH=7.2),多孔支持物为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和果胶,具体结果见表2.1。
表2.1 不同电泳时间对春雷霉素残渣的春雷霉素去除效果的影响
从表2.1可知,在电泳时间30-90之间,随着电泳时间延长,残渣的春雷霉素去除效率随时间的延长是增加的,三者支持物之间,两两比较,其去除率差异不显著(p>0.05),90-120之间,各持物物下的春雷霉素去除率是下降的,是因为春雷霉素残渣带电荷的正负离子迁移速率不同,迁移速率与带电荷、迁移离子半径和形状相关所致。
实施例3
为了确定春雷霉素残渣的春雷霉素含量是否影响残渣春雷霉素的去除率,选择陶瓷膜过滤段的春雷霉素残渣,以残渣质量做2倍稀释后搅拌均匀,电泳电压为110伏,电泳时间为90min,电泳槽的电泳液为PBS缓冲液(pH=7.2),具体结果如表2.1。
表3.1 春雷霉素残渣的春雷霉素含量对残渣中的春雷霉素去除率的影响
从表3.1可以看出,春雷霉素残渣做倍比稀释时,在0-24稀释间,各支持物下的春雷霉素去除率是随稀释倍数增大而增大的,这是因为春雷霉素盐酸盐在各支持物空间容积一定情况下,春雷霉素盐酸盐与各支持物之间的阻力减少,迁移速率增加所致;在24-27稀释倍数之间,春雷霉素去除率是下降,这是因为在低溶度下春雷霉素盐酸盐,残渣二价或多价金属离子迁移速率致使一价春雷霉素离子迁移缓慢所致。
实施例4
为了确定电泳槽的电泳液对春雷霉素残渣的春雷霉素去除率影响,选择陶瓷膜过滤段的春雷霉素残渣,电泳电压为110伏,电泳时间为90min,多孔支持物为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和果胶,具体结果见表4.1。
表4.1 电泳槽的电泳液对春雷霉素残渣的春雷霉素去除率影响
从表4.1可知,电泳槽的电泳液类型不同,在同一支持物下春雷霉素的去除率变化不显著(p>0.05),三种电泳液经实验比较得出优选0.8%NaCl或者PBS。
实施例5
为了确定是否由丙烯酰胺(Acr)与N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)质量比对春雷霉素残渣的春雷霉素去除率的影响,选取丙烯酰胺(Acr)与N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)质量比分别为30:1,20:1和10:1;电泳电压为110伏,电泳时间为30、45、60、75、90、105min,电泳槽的电泳液为PBS缓冲液(pH=7.2),具体结果如表4.1。
表5.1 丙烯酰胺(Acr)与N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)质量比对春雷霉素残渣的春雷霉素去除率的影响
从表5.1可知,丙烯酰胺(Acr)与N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)质量比也影响残渣春雷霉素的去除率,在底质量比10:1和20:1下,随着质量比增大,残渣春雷霉素的去除率也是升高的,但变化幅度不是很明显,差异不显著(p>0.05);但质量比在40:1与质量比30:1时,残渣春雷霉素的去除率反而降低,差异不显著(p>0.05);经比较可知应选质量比30:1。
实施例6
为了确定春雷霉素残渣在不同电泳时间对春雷霉素残渣的金属Zn2+离子去除率影响,选择时间为0、15、30、45、60、75、90、105min,电泳槽的电泳液为PBS缓冲液(pH=7.2),电泳电压为110伏,多孔支持物为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和果胶,具体结果见表6.1。
表6.1春雷霉素残渣在不同电压下对春雷霉素残渣的金属Zn2+含量影响情况
从表6.1可知,Zn2+在各支持物下,随着时间下降依次减少的,在相同时间段,三者支持物下降依次为琼脂糖凝胶、果胶和聚丙烯酰胺凝。
实施例7
为了确定春雷霉素残渣在不同电泳时间对春雷霉素残渣的金属Hg2+离子去除率影响,选择时间为0、15、30、45、60、75、90、105min,电泳槽的电泳液为PBS缓冲液(pH=7.2),电泳电压为110伏,多孔支持物为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和果胶,具体结果见表7.1。
表7.1春雷霉素残渣在不同电压下对春雷霉素残渣的金属Hg2+含量影响情况
从表7.1可知,在各支持物下,Hg2+随着时间下降依次减少的,在相同时间段,三者支持物下降依次为琼脂糖凝胶、果胶和聚丙烯酰胺凝。
实施例8
为了确定春雷霉素残渣在不同电泳时间对春雷霉素残渣的金属Cd2+离子去除率影响,选择时间为0、15、30、45、60、75、90、105min,电泳槽的电泳液为PBS缓冲液(pH=7.2),电泳电压为110伏,多孔支持物为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和果胶,具体结果见表8.1。
表8.1春雷霉素残渣在不同电压下对春雷霉素残渣的金属Cd2+含量影响情况
从表8.1可知,在各支持物下,Cd2+随着时间下降依次减少的,在相同时间段,三者支持物下降依次为琼脂糖凝胶、果胶和聚丙烯酰胺凝。
实施例9
为了确定春雷霉素残渣在不同电泳时间对春雷霉素残渣的金属Pb2+离子去除率影响,选择时间为0、15、30、45、60、75、90、105min,电泳槽的电泳液为PBS缓冲液(pH=7.2),电泳电压为110伏,多孔支持物为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和果胶,具体结果见表9.1。
表9.1春雷霉素残渣在不同电压对春雷霉素残渣的金属Pb2+含量影响情况
从表9.1可知,在各支持物下,Pb2+随着时间下降依次减少的,在相同时间段,三者支持物下降依次为琼脂糖凝胶、果胶和聚丙烯酰胺凝。
实施例10
为了确定春雷霉素残渣在不同电泳时间对春雷霉素残渣的金属Cr3+离子去除率影响,选择时间为0、15、30、45、60、75、90、105min,电泳槽的电泳液为PBS缓冲液(pH=7.2),电泳电压为110伏,多孔支持物为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和果胶,具体结果见表10.1。
表10.1春雷霉素残渣在不同电压下对春雷霉素残渣的金属Cr3+含量影响情况
从表10.1可知,在各支持物下,Cr3+随着时间下降依次减少的,在相同时间段,三者支持物下降依次为琼脂糖凝胶、果胶和聚丙烯酰胺凝。
虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种减少春雷霉素残渣中春雷霉素含量方法,其特征在于,采用直流电泳和大分子胶分离相结合的技术,采用装置是在一般电泳装置中放置大分子胶,大分子胶中挖一正方形孔,该孔底层有大分子胶为裙底,春雷霉素残渣放入正方形大分子胶的孔内进行直接电泳;所述的装置中采用的电泳配置液为pH=7.2的PBS缓冲液或pH=7.0的0.8%NaCl;所述的大分子胶材质为琼脂糖凝胶、果胶中一种;正方形铁制模具的长×宽×高=12×12×2.5cm,所述的正方形孔的长×宽×高=6×6×2cm;春雷霉素残渣中春雷霉素的含量为1020-1450µg/L;电解过程中,电压为110-170v,电泳时间为90-120min。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的大分子胶材质为琼脂糖凝胶时,其方法包括以下步骤:
①称量琼脂糖凝胶,配置一定蒸馏水,蒸馏水中含琼脂糖胶条的质量比3-5%,加热80-100℃溶解,充分搅拌后倒入正方形铁制模具后,在室温下凝固后,在凝固胶中央挖一正方形孔;
②配置电解液,将电解液倒入电泳槽中,将挖好孔的凝固胶放置电泳槽中央固定好后通直流电泳。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的大分子胶材质为果胶时,其方法包括以下步骤:
①称量一定量的果胶倒入正方形铁制模具后,在室温下凝固后,在凝固胶中央挖一正方形孔;
②配置电解液,将电解液倒入电泳槽中,将挖好孔的凝固胶放置电泳槽中央固定好后通直流电泳。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,电解过程中,电压为120v,电泳时间为120min。
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Exposure effect of fungicide kasugamycin on bacterial community in natural river sediment;CHI-YU HUANG等;《Journal of Environmental Science and Health Part B》;20100527;第45卷;全文 * |
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CN109358105A (zh) | 2019-02-19 |
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