CN109321474A

CN109321474A - 一种意大利青霉线粒体提取方法

Info

Publication number: CN109321474A
Application number: CN201811285774.8A
Authority: CN
Inventors: 王熠; 彭丽桃
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2019-02-12

Abstract

本发明公开了一种意大利青霉线粒体提取方法，所使用的提取缓冲液为pH为7.4的Hepes‑KOH缓冲液，其中含有0.6M甘露醇、0.2％BSA、2mM EGTA、2mM DTT。本发明利用所建立的意大利青霉线粒体提取缓冲体系，成功的提取了意大利青霉线粒体，其中线粒体的产量较高，且活性较好，使得对意大利青霉线粒体的电子传递链、蛋白组学、遗传机制等的深入研究成为可能，从而为进一步探究以线粒体为靶点的杀菌剂对意大利青霉的抑菌机理奠定了基础。

Description

一种意大利青霉线粒体提取方法

技术领域

本发明涉及意大利青霉(penicillium italicum)线粒体的提取方法。

背景技术

柑橘类水果以其独特的香气和味道，在日常销售的水果中非常受欢迎并在营养供给和促进健康等方面发挥重要作用。意大利青霉在柑橘的采后贮藏、运输期间引起大批量的果实腐烂，给农业生产带来巨大的经济损失。通过意大利青霉线粒体的提取，可对意大利青霉线粒体的功能进行探索，从而进一步探究以线粒体为靶点的杀菌剂对意大利青霉的抑菌机理，可更有效的防治该病害。

通常，线粒体提取方法是先破碎细胞使其均质化，并通过差速离心与密度梯度离心进行分离提纯。提取缓冲液含有多种成分，它可减少线粒体的损伤率并且具有良好的缓冲作用，可以最大程度地保持线粒体提取所需的内环境及各种活性物质的生理活性，在提取线粒体中起了至关重要的作用。线粒体对热不稳定，所以整个提取过程应在低温环境(0-4℃)中进行。线粒体是细胞呼吸发生的主要场所，并在氧化磷酸化过程中产生ATP为细胞供能，占有举足轻重的地位，因此线粒体功能评价的主要方面是呼吸功能。目前普遍采用的线粒体呼吸功能的研究方法是Clark氧电极法，它的基本原理是精确测定线粒体所消耗的氧气量，从而检测线粒体的活性强弱。

发明内容

本发明的目的是提供一种意大利青霉线粒体的提取方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种意大利青霉线粒体提取方法，包括以下步骤：

1)取意大利青霉湿菌丝，用PBS冲洗后加入组织匀浆器中，按照重量比1：3的比例加入提取缓冲液，研磨直至为匀浆状，将匀浆液用纱布过滤，收集滤液；

2)将步骤1)的滤液于4℃、1500g离心10min，去除细胞碎片，取上清于4℃、12000g离心15min，弃上清，将沉淀用悬浮液洗涤一次并悬浮；

3)将步骤2)的悬浮液于4℃、1500g离心10min，取上清于4℃、12000g离心15min，弃上清，收集沉淀；

4)将步骤3)的沉淀用悬浮液悬浮，加入到Percoll分离梯度液中，进行密度梯度离心分离，用注射器吸取黄色的线粒体带，并加入4倍体积的悬浮液，15000g离心15min，将上清去除，再加入5倍体积的悬浮液，12000g离心15min，得到纯化后的线粒体沉淀，

所述提取缓冲液为pH为7.4的Hepes-KOH缓冲液，其中含有0.6M甘露醇、0.2％牛血清白蛋白(BSA)、2mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、2mM二硫苏糖醇(DTT)；

所述悬浮液为pH为7.2的Hepes-KOH缓冲液，其中含有0.6M甘露醇，0.2％BSA，2mMEGTA；

所述Percoll分离梯度液中含有20mM Hepes、0.6M甘露醇，0.2％BSA，2mM EGTA。

优选地，步骤1)中，所述意大利青霉湿菌丝与提取缓冲液的重量比1：3。

本发明对上述方法提取的线粒体进行产量计算，测定其蛋白含量进行验证，结果表明该方法提取得到的线粒体产量符合基本测定标准2mg/ml。

本发明对上述方法获得的线粒体进行呼吸功能检测，对其Ⅲ、Ⅳ态呼吸进行检测，结果表明NADH呼吸链的RCR值为1.36，FADH₂呼吸链的RCR值为2.46，RCR值大于1，表明线粒体结构完整，氧化磷酸化的能力高，偶联程度高。

本发明利用所建立的意大利青霉线粒体提取缓冲体系，成功的提取了意大利青霉线粒体，其中线粒体的产量较高，且活性较好。

本研究与现有的技术相比具有以下有益效果：

本研究利用Clark氧电极测定意大利青霉粗线粒体的呼吸功能，同时针对两条呼吸链，添加不同的呼吸底物，通过对比Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ态呼吸活性的方法，对其提取缓冲体系中的成分浓度进行筛选，操作简单，可较快得到结果，同时线粒体产率高并且呼吸活性良好，实现了意大利青霉线粒体的成功提取，也提供了线粒体其它提取步骤的筛选优化方法，同时使得对意大利青霉线粒体的电子传递链、蛋白组学、遗传机制等的深入研究成为可能，从而为进一步探究以线粒体为靶点的杀菌剂对意大利青霉的抑菌机理奠定了基础。

附图说明

图1：渗透压对线粒体NADH呼吸链(A)与FADH₂呼吸链(B)呼吸活性的影响。

图2：pH对线粒体NADH呼吸链(A)与FADH₂呼吸链(B)呼吸活性的影响。

图3：缓冲体系对线粒体NADH呼吸链(A)与FADH₂呼吸链(B)呼吸活性的影响。

图4：BSA浓度对线粒体NADH呼吸链(A)与FADH₂呼吸链(B)呼吸活性的影响。

图5：EGTA浓度对线粒体NADH呼吸链(A)与FADH2呼吸链(B)呼吸活性的影响。

图6：DTT浓度对线粒体NADH呼吸链(A)与FADH₂呼吸链(B)呼吸活性的影响。

图7：BSA标准曲线。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行详细地说明。

1.实验材料

1.1菌株

意大利青霉标准菌

1.2材料与试剂

蔗糖、甘露醇、丙酮酸、苹果酸、琥珀酸、Hepes、Tris、MOPS、EGTA、DTT、No Fattyacid BSA、Percoll、ADP。

2.意大利青霉线粒体的提取缓冲体系的优化

2.1青霉菌孢子悬液制备及菌丝培养

将意大利青霉标准菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化，用接种针取活化好的青霉菌菌种加入无菌水配制成浓度为1.0×10⁶cfu/mL的青霉菌孢子菌悬液。取5ml青霉菌孢子菌悬液接种到250ml马铃薯葡萄糖液体培养基中，26℃，120r/min条件下摇床培养24h。

2.2意大利青霉线粒体提取液成分的优化方法

对意大利青霉线粒体的两条电子传递链进行呼吸测定，具体方法如下。

NADH呼吸链：将培养24h的意大利青霉湿菌丝，将其用PBS冲洗3遍后加入组织匀浆器中，手动研磨直至为匀浆状，1500g离心5min后取上清(粗线粒体悬浮液)，Clark氧电极法测定线粒体耗氧，反应室温度保持25℃，向氧电极反应室中加入上清液，孵育匀浆液置反应室中，待耗氧速率稳定后加入呼吸反应底物苹果酸与丙酮酸(终浓度为5mM)，启动Ⅱ态呼吸，待耗氧速率稳定后加入ADP(终浓度为1mM)启动Ⅲ态呼吸，分别记录Ⅱ态呼吸与Ⅲ态呼吸下的耗氧速率。

FADH₂呼吸链：将培养24h的意大利青霉湿菌丝，将其用PBS冲洗3遍后加入组织匀浆器中，手动研磨直至为匀浆状，1500g离心5min后取上清(粗线粒体悬浮液)，Clark氧电极法测定线粒体耗氧，反应室温度保持25℃，向氧电极反应室中加入上清液，孵育匀浆液置反应室中，待耗氧速率稳定后加入呼吸反应底物琥珀酸钠(终浓度5mM)，启动Ⅱ态呼吸，待耗氧速率稳定后加入ADP(终浓度为1mM)启动Ⅲ态呼吸，分别记录Ⅱ态呼吸与Ⅲ态呼吸下的耗氧速率。

2.3提取缓冲液中渗透剂浓度的筛选

本试验采用非离子型渗透剂甘露醇，将初始缓冲体系定为：Hepes-KOH(pH 7.4)；甘露醇：0、300、600mmol/L；1mmol/L EGTA；20mmol/L Hepes；0.1％BSA(现用现加)；2mmol/LDTT(现用现配)。

结果如图1所示，随着两种呼吸底物的加入，对照组线粒体的呼吸强度大幅减弱，300mM下呼吸强度稍降低，在600mM浓度下线粒体电子传递链可进行电子传递，呼吸强度增大为空白组的2.2倍，并同时结合图中FADH₂呼吸链，加入呼吸底物后600mM浓度下线粒体呼吸耗氧较强，300mM浓度下的线粒体次之，空白组呼吸耗氧最低。可得600mM甘露醇能较好维持线粒体的渗透压和呼吸活性。

2.4提取缓冲液中pH的筛选

将pH设为7.0、7.2、7.4、7.6，渗透剂浓度为筛选所得浓度，其余成分与2.3缓冲体系相同。

结果如图2所示，在两种呼吸链中，随着pH的升高，线粒体的呼吸活性呈现先升高后降低的趋势，且在pH为7.4较其余pH呼吸活性最强。而线粒体在pH为7.0的环境下，活性最低，在FADH₂呼吸链中Ⅲ态呼吸耗氧最低，比pH为7.6的环境下低7.36nmol/ml/min，进一步验证线粒体更适宜在偏碱的环境下保持活性。综上，意大利青霉线粒体最适合的pH为7.4。

2.5提取缓冲液中缓冲体系的筛选

将缓冲体系设为Hepes-KOH、Hepes-Tris、Tris-HCl、MOPS-KOH，渗透剂、pH为筛选所得结果。

结果如图3所示，线粒体在Hepes-KOH缓冲体系中初始呼吸、II态呼吸明显强于其余缓冲体系，而线粒体在Hepes-KOH缓冲体系中Ⅲ态呼吸略强于在Tris-HCl缓冲体系中，且试验发现在NADH呼吸链中Tris-HCl缓冲体系可明显加强线粒体的Ⅲ态呼吸，Ⅲ态呼吸较II态呼吸耗氧上升4.4nmol/ml/min，为其余缓冲体系的2.1-4.7倍。由图3(B)可得，线粒体在Hepes-KOH缓冲体系与MOPS-KOH缓冲体系中，FADH₂电子传递活跃，且在MOPS-KOH缓冲体系略强。但综合两种电子传递链，Hepes-KOH缓冲体系的缓冲能力较强，且确保了匀浆后意大利青霉线粒体的pH环境为中性偏碱。

2.6提取缓冲液中BSA浓度的筛选

将BSA浓度设为0、0.1％、0.2％、0.4％、0.8％，渗透剂浓度、缓冲体系与pH为筛选所得。

结果如图4所示，BSA对于NADH呼吸链前期的电子传递影响较小，后期由于BSA的保护作用显现，线粒体在0.2％BSA的浓度下Ⅲ态呼吸速率较高。且由图4(B)可得，BSA的存在对线粒体FADH₂呼吸链的影响较大，0.2％的BSA浓度相较其余浓度更利于FADH₂呼吸链的电子传递，且在各呼吸阶段耗氧较大，呼吸活性较高。综上可得，提取体系中添加BSA的最适浓度为0.2％。

2.7提取缓冲液中EGTA浓度的筛选

将EGTA浓度设为0、1mM、2mM、4mM、8mM，渗透剂浓度、缓冲体系、BSA浓度与pH为筛选所得。

结果如图5所示，低浓度EGTA螯合金属离子可提高线粒体活性，但高浓度(8mM)下却始终抑制线粒体各阶段的呼吸活动，导致此现象的原因可能为高浓度EGTA抑制线粒体中呼吸相关酶的活性。由图5(A)可得，NADH呼吸链中线粒体在4mM浓度下较2mM浓度下添加呼吸底物后的活性略高，各阶段相差在0.1-0.5nmol/ml/min之间，但在FADH₂呼吸链中，与NADH呼吸链相反，2mM浓度下的线粒体活性略高于在4mM的浓度下。综上结合线粒体在两种呼吸链中的耗氧，2mM与4mM的两浓度之间差异较小，本试验采用2mM浓度的EGTA。

2.8提取缓冲液中DTT浓度的筛选

将DTT浓度设为0、0.5mM、1mM、2mM、4mM、8mM，渗透剂浓度、缓冲体系、BSA浓度、金属离子螯合剂浓度与pH为筛选所得。

结果如图6所示，在NADH呼吸链(图6，A)中，0.5mM的浓度在线粒体呼吸前期作用不明显，但后期加入底物ADP后可较好维持线粒体呼吸，且较其余组无较大差异，其余浓度的各组在各阶段耗氧速率相差较小。在FADH₂呼吸链(图6，B)中，DTT的浓度达到0.5mM可稳定维持线粒体的II态呼吸，但随着DTT浓度的升高，2mM下线粒体的初始呼吸与Ⅲ态呼吸活性最高，耗氧速率最大。综上同时结合NADH呼吸链，将DTT的最适浓度设为2mM。

3.意大利青霉线粒体的提取

将培养24h的意大利青霉湿菌丝，将其用PBS冲洗3遍后加入组织匀浆器中，按照重量比1：3的比例加入预冷的提取缓冲液，手动迅速研磨直至为匀浆状，将匀浆液用一层纱布过滤，将滤液收集于离心管中，于4℃、1500g离心10min，去除细胞碎片，取上清置于离心管中，于4℃、12000g离心15min，弃上清，用悬浮液将沉淀洗涤一次，并轻轻悬浮，再次进行差速离心，于4℃、1500g离心10min，取上清置于离心管中，于4℃、12000g离心15min，弃上清，收集所得沉淀即为粗提的线粒体样品。依次将2.5ml 40％，4ml 23％的Percoll分离梯度液铺在离心管中，然后将线粒体粗提物用悬浮液悬浮并小心铺在上层，17000g离心30min，离心后黄色的线粒体带在23％和40％Percoll分离梯度液之间，用注射器吸取线粒体带到另一离心管中，并加入4倍体积的悬浮液，15000g离心15min，将离心后的上清去除重新悬浮线粒体，再加入5倍体积的悬浮液，12000g离心15min，得到纯化后的线粒体沉淀。以上操作均在0-4℃下进行。

所述提取缓冲液为pH为7.4的Hepes-KOH缓冲液(Hepes浓度为20mM)，其中还含有0.6M甘露醇、0.2％(wt)BSA、2mM EGTA、2mM DTT；

所述悬浮液为pH为7.2的Hepes-KOH缓冲液(Hepes浓度为20mM)，其中还含有0.6M甘露醇，0.2％BSA，2mM EGTA；

所述Percoll分离梯度液中含有20mM Hepes、600mM甘露醇，0.2％(wt)BSA，2mMEGTA，其中下层分离液中Percoll浓度为40％(wt)；上层分离液中Percoll浓度为23％(wt)。

4.意大利青霉线粒体提取后的检测

4.1线粒体蛋白含量测定

牛血清白蛋白(BSA)标准溶液配制：准确称取BSA 0.1006g，用纯化水溶解、稀释、定容100ml。然后从中准确移取10ml，用纯化水稀释定容至100ml，得到0.1006mg标准溶液。

考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90％乙醇中，加入85％的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。

BSA标准曲线制作：分别精密移取0.1006mg/ml BSA标准溶液0.25，0.50，1.00，1.50，2.00，3.00ml，于6支20ml具塞试管，分别精密加入4.75，4.50，4.00，3.50，3.00，2.00ml纯化水，摇匀。分别准确加入5.00ml考马斯亮蓝G-250试液，显色5分钟，于595nm处测定吸光度。吸光度对BSA浓度线性回归，制作标准曲线。

线粒体蛋白质浓度测定：准确移取待测线粒体1.00ml溶液(提取液稀释20倍)于20.00ml具塞试管中，加入纯化水4.00ml，再各加入5.00ml考马斯亮蓝G-250试液，显色5分钟，于595nm处测定吸收度。

BSA标准曲线如图7所示：根据回归方程，在595nm处测定吸光度为0.0538，计算可得线粒体蛋白质浓度为0.113mg/ml，根据稀释20倍，折算提取线粒体蛋白质浓度为0.113*20＝2.26mg/ml，符合常规线粒体的测定浓度2mg/ml。

4.2线粒体呼吸功能测定

Clark氧电极法测定线粒体耗氧。反应室温度保持25℃，孵育线粒体0.2mg置反应室中，加入25℃预热测定介质至反应体积1ml。分别以琥珀酸(终浓度5mmol/L)、苹果酸和丙酮酸(终浓度均为5mmol/L)为底物，测定无ADP耗氧速度(Ⅲ态呼吸)及ADP(终浓度1mmol/L)加入后的耗氧速度(IV态呼吸)。呼吸控制率(RCR)即Ⅲ态呼吸与IV态呼吸耗氧速度之比。

如表1所示，线粒体的NADH呼吸链RCR值为1.36，大于1，略低于正常值2—4。但意大利青霉线粒体在FADH₂电子传递链中Ⅲ态呼吸和Ⅳ态呼吸的耗氧量的RCR值为2.46，大于正常值2。此现象与筛选时线粒体的呼吸状态相符，线粒体的FADH₂呼吸链的呼吸强度较NADH呼吸链强，总体RCR值大于1，表明线粒体保留了其氧化磷酸化的能力，可进行后续的实验研究。

表1

nmol O₂·mg·ml^-1·min^-1

Claims

1.一种意大利青霉线粒体提取方法，其特征在于包括以下步骤：

所述提取缓冲液为pH为7.4的Hepes-KOH缓冲液，其中含有0.6M甘露醇、0.2％牛血清白蛋白、2mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、2mM二硫苏糖醇；

所述悬浮液为pH为7.2的Hepes-KOH缓冲液，其中含有0.6M甘露醇，0.2％牛血清白蛋白，2mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸；

所述Percoll分离梯度液中含有20mM Hepes、0.6M甘露醇，0.2％牛血清白蛋白，2mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸。

2.如权利要求1所述的意大利青霉线粒体提取方法，其特征在于：步骤1)中，所述意大利青霉湿菌丝与提取缓冲液的重量比1：3。