CN109312493B - 酶促核酸合成 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于制备多核苷酸的方法，其中核苷酸的添加可经物理、化学和/或酶促控制。该方法包括将选定的核苷酸、阳离子、易错或非模板依赖性DNA聚合酶于反应位点组合，所述反应位点包含与其连接并且具有3'末端核苷酸的起始物序列，其中反应试剂可经调节并且处于允许一个或多个选定的核苷酸共价添加至3'末端核酸的情况，从而使得选定的核苷酸成为3'末端核苷酸，并且重复添加步骤直到多核苷酸形成。

Description

酶促核酸合成

相关申请数据

本申请要求于2016年4月4日提交的美国临时申请号62/317,919号的优先权，其通过引用纳入本文用于所有目的。

政府权益的声明

本发明是基于国立卫生研究院(National Institutes of Health)提供的5R01MH103910和1R01MH103910-01政府资助。政府对本发明享有某些权利。

技术领域

本发明一般涉及使用酶促合成制备寡核苷酸和多核苷酸的方法。

背景技术

DNA被认为是一种非常理想的数字信息存储介质。DNA这类用途的障碍是当前合成方案的高成本以及低效率和速度。在现有技术中，使用亚磷酰胺前体在有机溶剂中合成DNA。这些化学合成方法导致大约1％的错误，并且每个添加步骤花费大约10分钟。此外，在该合成过程中使用的试剂是昂贵的。一些相同试剂也会破坏DNA，这个问题将合成长于约200个碱基的DNA链的可能性排除，进一步妨碍了该化学过程的效率。尽管进行了多次努力，但是之前并未描述使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)合成定制核酸序列的可行方法。TdT目前用于间歇反应，用于向核酸序列的3'末端添加可变长度的单个核苷酸或不受控制的核苷酸混合物序列。控制TdT纳入核苷酸数量和性质以生成用户所定义核酸序列的方法是一个尚未解决的重大挑战。因此，仍然存在开发比现有化学寡核苷酸合成方法更快且更便宜的酶促寡核苷酸合成方法的需求。

发明内容

本公开解决了该需求，并且基于使用非模板依赖性DNA聚合酶合成所需序列的核酸方法的发现。根据本公开的方法将核酸聚合物依次暴露于将聚合物延伸所需长度的核苷酸聚合单元(NPU)。本公开所提供的是，各NPU包括末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)以及一种类型的核苷酸底物(如A、C、G和T/U)。核苷酸底物为核苷酸三磷酸的形式，其对于本发明所考虑的聚合目的为活性形式。本公开提供了新型物理、化学和酶促方法以控制NPU延伸并且将它们限制于数个核苷酸。这些新型方法克服了在通用实验室条件下所遇到的问题，其中NPU将不确定地且不受控地延伸核酸聚合物。这些新型方法提供了DNA聚合物顺序暴露于含有不同核苷酸的NPU并获得所需序列的核酸聚合物，从而为将数字信息酶促编码成DNA提供了基础。这些新型方法提供了对核苷酸数量和性质改善的控制，非模板依赖性DNA聚合物(如TdT)纳入核酸聚合物并使用户定义的核酸序列合成能够用于生物应用。

根据本公开与从头合成核酸最相关的酶是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，其是延伸单链寡核苷酸的一种独特DNA聚合酶。关键地，TdT为非模板依赖性，一种基于提供的核苷酸的可及性使碱基纳入生长的核酸链的性质。该性质使TdT成为一种有吸引力的DNA聚合酶，用于重头DNA合成。

本公开提供的是，在理想情况下，有希望将通过TdT的添加数量限制为1。这样的DNA不仅适用于数字信息存储，也可以用于生物/遗传应用。本公开还提供了，对于将信息储存到DNA中，将添加限制为1并不是必需的。一种示例性的合适编码策略可以用于数字存储目的，其并不将各碱基作为信息的单元，而是将一个或多个相同的碱基的各延伸(即同聚物)作为信息的单元。例如，如果A或T的每个延伸代表0，那么C或G的每个延伸代表1，那么序列“AAATTAACCCCGGACTTAAGGGCC”将等于“ATACGACTAGC”，并且代表“00011010011”。

本公开提供了制备多核苷酸的方法，其包括(a)将反应试剂流动相沿流体通道递送至反应位点，所述反应试剂流动相至少包含易错非模板依赖性DNA聚合酶、选定的核苷酸三磷酸和阳离子，其中所述反应位点包含与其连接并且具有3'末端核苷酸的起始物，其中反应试剂以选定浓度存在于所述反应试剂流动相中，其中所述反应试剂流动相具有选定的体积和选定的流速，以在共价添加一个或多个选定的核苷酸至3'末端核苷酸从而使所述选定的核苷酸成为3'末端核苷酸的条件下在反应位点实现选定的停留时间，(b)将有机洗涤流动相以流体流速递送至所述反应位点，以从所述反应位点去除所述反应试剂，和(c)重复步骤(a)和(b)直到多核苷酸形成，限制条件是步骤(b)不需要在所述多核苷酸形成后进行。

本公开提供了制备多核苷酸的方法，其包括(a)将选定的核苷酸三磷酸、阳离子、易错或非模板依赖性DNA聚合酶以及核苷酸三磷酸失活酶在反应位点组合，所述反应位点包括与其连接并且具有3'末端核苷酸的起始物序列，其中反应试剂以选定浓度存在，并且处于共价添加一个或多个选定的核苷酸至3'末端核苷酸从而使所述选定的核苷酸成为3'末端核苷酸的条件下，并且处于使游离核苷酸三磷酸失活直至游离核苷酸三磷酸基本失活的条件下，其中所需数量的所述选定的核苷酸被添加于所述起始物序列，和(b)重复步骤(a)直到形成所述多核苷酸。

本公开提供了制备多核苷酸的方法，其包括(a)将选定的失活核苷酸、阳离子、易错或非模板依赖性DNA聚合酶在反应位点组合，所述反应位点包括与其连接并且具有3'末端核苷酸的起始物序列，活化所述选定的失活核苷酸，其中反应试剂以选定浓度存在，并且处于共价添加一个或多个选定的活化的核苷酸至3'末端核苷酸从而使所述选定的活化的核苷酸成为3'末端核苷酸的条件下，并且处于其中所需数量的所述选定的活化的核苷酸被添加于所述起始物序列的条件下，和(b)重复步骤(a)直到形成所述多核苷酸。

本公开还提供了制备多核苷酸的方法，其包括(a)将选定的核苷酸三磷酸、阳离子、失活的易错或非模板依赖性DNA聚合酶在反应位点组合，所述反应位点包括与其连接并且具有3'末端核苷酸的起始物序列，活化所述失活的易错或非模板依赖性DNA聚合酶，其中反应试剂以选定浓度存在，并且处于共价添加一个或多个选定的核苷酸至3'末端核苷酸从而使所述选定的核苷酸成为3'末端核苷酸的条件下，并且处于其中所需数量的所述选定的核苷酸被添加于所述起始物序列的条件下，和(b)重复步骤(a)直到形成所述多核苷酸。

本公开还提供了制备多核苷酸的方法，其包括(a)将选定的核苷酸三磷酸、阳离子、易错或非模板依赖性DNA聚合酶在反应位点组合，所述反应位点包括与其连接并且具有3'末端核苷酸的起始物序列，其中反应试剂以选定浓度存在，并且处于共价添加一个或多个选定的核苷酸至3'末端核苷酸从而使所述选定的核苷酸成为3'末端核苷酸的条件下，并且将所述易错或模板非依赖性DNA聚合酶失活以终止添加所述选定的核苷酸，和(b)重复步骤(a)直到形成所述多核苷酸。

本公开进一步提供了制备多核苷酸的方法，其包括(a)将选定的失活核苷酸、阳离子、失活的易错或非模板依赖性DNA聚合酶在反应位点组合，所述反应位点包括与其连接的起始物序列并且具有3'末端核苷酸，活化所述核苷酸并活化所述易错或非模板依赖性DNA聚合酶，其中反应试剂以选定浓度存在，并且处于共价添加一个或多个选定的核苷酸至3'末端核苷酸从而使所述选定的核苷酸成为3'末端核苷酸的条件下，和(b)重复步骤(a)直到形成所述多核苷酸。

本发明的某些实施方式的其他特征和优势将在权利要求中以及以下附图和实施方式的说明下更为显而易见。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一幅有色附图。本专利或专利申请公开与彩色附图的副本将根据要求，在支付所需的费用之后由政府机关提供。结合附图，通过以下示例性实施方式的详述能够更清楚地理解本发明的上述和其他特征和其他优点，其中：

图1A和1B示意性描述了流体装置中暴露于核酸聚合物的NPU的物理控制方法。图1A示意性描述了流过起始物寡核苷酸贴片(patch)的NPU序列的俯视图。图1B示意性描述了执行该物理控制的微流体装置。

图2A和2B示意性描述了流体装置中暴露于核酸聚合物的NPU的化学控制方法。图2A示意性表示了溶液中的NPU，具有TdT和腺苷三磷酸双磷酸酶覆盖的起始物寡核苷酸。图2B示意性描述了当各碱基沉积于NPU上时发生的聚合。

图3描绘了根据本公开方法的实施方式筛选的TdT核苷酸类似物底物，以选择对延伸效率、速率和延伸长度分布更好性能。

图4示意性描述了这样的设备，其执行本公开方法的某些实施方式进行具有给定信息内容的DNA基于TdT的NPU合成。起始物DNA固定于玻璃表面，而所需核苷酸沉积于DNA上。将包括TdT和腺苷三磷酸双磷酸酶的NPU沉积以促进有限延伸。清理后，寡核苷酸准备用于下一个核苷酸和NPU的沉积。

图5示意性描述了用于生成微流体装置的PDMS掩模模板，所述微流体装置执行对核酸聚合物NUP暴露的物理控制。

图6描述了根据本公开方法的实施方式，琼脂糖凝胶上的PCR产物。

图7描述了根据本公开方法的实施方式并由高通量单分子测序所测量的针对各核苷酸类型和浓度添加至寡核苷酸起始物的核苷酸数量的定量以及针对各核苷酸类型和浓度接收核苷酸非零(nonzero)添加的寡核苷酸起始物数量的定量。

图8描述了根据本公开方法的实施方式，各核苷酸浓度具有核苷酸非零添加起始物的组分。

图9描述了3'-修饰的可逆终止子。

图10描述了3'-修饰的可逆终止子。

图11描述了碱基-修饰的核苷酸。

图12示意性描述了二价阳离子，其改变了聚合机制，从而改变了聚合的效率和动力学。

图13描述了根据本公开方法的实施方式，TBE-尿素凝胶上TdT酶活性的pH调节的结果。

图14描述了根据本公开方法的实施方式，TBE-尿素凝胶上TdT酶活性的可逆pH调节的结果。

图15是显示5BR-dCTP和5I-dCTP结果的凝胶图像。

图16是显示5h-dCTP和5hm-dCTP结果的凝胶图像。

图17是显示5m-dCTP和dCTP结果的凝胶图像。

具体实施方式

本公开提供了调节非模板依赖性核酸合成中所用组分和试剂(如核苷酸、非模板依赖性聚合酶和阳离子)活性的方法。可以改变这些组分各自于反应位点的停留时间，以调节核苷酸向起始物序列或生长的核苷酸链的添加。可以对这些组分各自进行活化或失活，以调节核苷酸向起始物序列或生长的核酸链的添加。以此方式，可以将核苷酸添加控制为所需数量的核苷酸，如1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸等。本公开提供的是，在一轮核苷酸添加期间，将添加限于1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸或更多个。反应组分的活化或失活可以是可逆的，以允许多轮核苷酸聚合进行，其各自向引物或生长的多核苷酸链添加不同的核苷酸。

本公开提供了“流动相寡核苷酸合成”的方法，一种酶促合成，其能够控制易错或非模板依赖性聚合酶如TdT添加至DNA的引物链，即DNA合成的引物/起始物的核苷酸的数量和性质。根据本公开的某些方面，方法涉及流体/微流体装置，其中起始物寡核苷酸(核酸作为起始底物用于TdT与所需序列延伸)以贴片(即起始物贴片)固定于该装置的表面。然后将该贴片暴露于试剂的“封包(packet)”，其包括与4种可能的核苷酸三磷酸(dNTP)中的一种预混合的TdT。在一些实施方式中，微流体装置精确地控制贴片对各TdT-dNTP封包的准确暴露时间，因此限制添加至所需计数或所需计数分布。在某些实施方式中，装置还允许对封包的顺序进行控制，从而能够对纳入的序列进行控制。例如，对于序列“GATC”的合成，贴片将暴露于TdT-dGTP的封包，然后是TdT-dATP的封包，然后是TdT-TTP的封包，然后是TdT-dCTP的封包，其中贴片暴露于各封包最佳时间，所述最佳时间保证确保酶单次添加或添加所需长度或长度分布。

本公开提供了对TdT添加的核苷酸数量实现精确控制的多种方式。在一实施方式中，本公开提供了“动力学”控制，其中各封包在贴片上停留对单次添加足够长但是对两次或多次添加太短的一段时间。在另一实施方式中，本公开提供了将动力学控制与多种化学和生物化学方法组合以实现对由TdT添加的核苷酸添加的数量进行控制。在某些示例性的实施方式中，替代天然dNTP，可以使用可逆终止子dNTP。终止子dNTP是经修饰的dNTP，TdT可以添加其至生长的DNA引物但不可进一步延伸。在这样的系统中，在各可逆终止子dNTP-TdT封包后，还将会引入化学、物理或酶促地逆转终止的封包，然后是下一个所需可逆终止子dNTP-TdT封包，依此类推。在另一实施方式中，通过使用工程改造的TdT或封包组合物来实现控制添加的数量，其中TdT酶在其催化循环的一些阶段保持与引物的结合，从而阻断进一步的添加。下一个封包可以允许酶完成催化循环并分离，但是不存在任何dNTP，因此可以避免不需要的添加。

本公开提供的是，流动相合成策略的重要性质是微流体装置中可使用超过一种液相。在某些实施方式中，惰性有机相如矿物油可以用于分离TdT-dNTP封包以保证它们的内容物不混合，并且清理起始物贴片来自之前的TdT-dNTP封包的残留内容物。介于封包之间的有机相还保证了清晰的封包边界，并且因此实现了贴片对各封包暴露时间非常精确的控制。在一些实施方式中，例如，也考虑了有机相中活性化学物质的使用通过终止子核苷酸逆转终止。

本公开提供的是，流动相合成策略的另一重要性质是其允许在4种

TdT-dNTP封包类型的每一种中使用不同的条件。这是十分重要的，因为对于不同的dNTP，酶的动力学可能不同。因此，为了获得最佳结果，对于不同的dNTP，可能需要使用不同的条件，如二价离子的类型和浓度。

本公开提供了流动相寡核苷酸合成的方法，其能够通过非模板依赖性DNA聚合酶末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)快速且高准确性地合成定制DNA序列。根据本公开的方法可以用于合成更便宜、更准确且更长的定制DNA序列，用于生物化学、生物医疗或生物合成应用。此外，考虑到高速DNA合成的潜能，根据本公开的方法可以促进DNA作为信息存储介质的用途。在该情况中，固相合成装置可以用于记录DNA分子中的数字信息。

本公开的实施方式涉及用于制备多核苷酸的方法，其中核苷酸的添加可经物理控制。在一实施方式中，该方法包括(a)将反应试剂流动相沿流体通道递送至反应位点，所述反应试剂流动相至少包含易错非模板依赖性DNA聚合酶，选定的核苷酸三磷酸和阳离子，其中所述反应位点包含与其连接并且具有3'末端核苷酸的起始物，其中反应试剂以选定浓度存在于所述反应试剂流动相中，其中所述反应试剂流动相具有选定的体积和选定的流速，以在共价添加一个或多个选定的核苷酸至3'末端核苷酸从而使所述选定的核苷酸成为3'末端核苷酸的条件下在反应位点实现选定的停留时间，(b)将有机洗涤流动相以流体流速递送至所述反应位点，以从所述反应位点去除所述反应试剂，和(c)重复步骤(a)和(b)直到多核苷酸形成，限制条件是所述多核苷酸形成后不需要进行步骤(b)。

在一实施方式中，根据反应试剂流动相中存在的选定的核苷酸三磷酸的反应性，确定反应试剂流动相选定的体积和选定的流速。在另一实施方式中，根据反应试剂流动相中存在的选定的核苷酸三磷酸，反应试剂流动相的选定的体积和选定的流速不相同。在某些实施方式中，反应试剂流动相的选定的流速恒定，且选定的体积根据反应试剂流动相中存在的选定的核苷酸三磷酸而不相同。在一实施方式中，反应试剂流动相的选定的体积恒定，且选定的流速根据反应试剂流动相中存在的选定的核苷酸三磷酸而不相同。在另一实施方式中，反应试剂流动相的选定的流速恒定，且选定的体积根据反应试剂流动相中存在的选定的核苷酸三磷酸以及待添加至多核苷酸3'末端的选定的核苷酸所需数量而不相同。在另一实施方式中，反应试剂流动相的选定的体积恒定，且选定的流速根据反应试剂流动相中存在的选定的核苷酸三磷酸以及待添加至多核苷酸3'末端的选定的核苷酸所需数量而不相同。

在一实施方式中，反应位点为流体通道表面上的表面区域。在另一实施方式中，反应试剂流动相中反应试剂的选定的浓度通过反应试剂流动相中存在的选定的核苷酸三磷酸确定。在另一实施方式中，反应位点位于流体通道内。在一实施方式中，反应位点为流体通道内的结构。在一实施方式中，反应位点为流体通道内珠的集合。在一实施方式中，反应位点为流体通道表面上的电极。在另一实施方式中，反应位点为流体通道内的电极。在一实施方式中，起始物包括一个或多个核苷酸。在一实施方式中，停留时间足以限制共价添加选定的核苷酸的数量。

在一些实施方式中，有机洗涤流动相与反应试剂流动相互不相溶。在一实施方式中，反应试剂流动相由有机洗涤流动相界定其任一端。在另一实施方式中，有机洗涤流动相在反应位点使反应试剂流动相失活。在某些实施方式中，使用空气塞(air plug)替代有机洗涤流动相或进一步使用空气塞。在一实施方式中，使用水性洗涤流动相替代有机洗涤流动相或进一步使用水性洗涤流动相。在另一实施方式中，使用水性洗涤流动相替代空气塞或进一步使用水性洗涤流动相。在另一实施方式中，数个反应试剂流动相由流向反应位点的有机洗涤流动相界定其任一端。

根据本公开的方法还包括监控共价添加选定的核苷酸的步骤。在一实施方式中，易错非模板依赖性DNA聚合酶为末端脱氧核苷酸转移酶。在另一实施方式中，阳离子为Zn⁺²、Co⁺²、Mg⁺²或Mn⁺²中的一种或多种。

根据本公开的方法所提供的是，选定的核苷酸为天然核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方式中，选定的核苷酸是选自下组的成员：

在一实施方式中，反应试剂流动相包括缓冲液，其包含处于合适pH和温度的单价盐、二价盐、缓冲剂和还原剂。在另一实施方式中，反应试剂流动相包括缓冲液，其包含10-20mM tris-乙酸盐、20-50mM乙酸钾、5-8mM乙酸镁、0.5-1.0mM DTT，并且具有约2-12的pH和约10和80℃的温度。在一实施方式中，反应试剂流动相包括缓冲液，其包含14mM tris-乙酸盐、35mM乙酸钾、7mM乙酸镁、0.7mM DTT，并且具有7.9的pH和约25℃的温度。

本公开的某些实施方式涉及通过可切割部分连接的起始物。

根据本公开的方法还包括在所需核苷酸序列已经添加至多核苷酸3'末端后由反应位点释放多核苷酸。根据本公开的方法还包括使用酶、化学物质、光、热或其它合适的方法或试剂由反应位点释放多核苷酸。根据本公开的方法还包括由反应位点释放多核苷酸，收集多核苷酸，扩增多核苷酸并对多核苷酸进行测序。

本公开的实施方式涉及用于制备多核苷酸的方法，其中核苷酸的添加可以经由使用酶使活性核苷酸三磷酸失活进行化学控制。在一实施方式中，该方法包括(a)将选定的核苷酸三磷酸、阳离子、易错或非模板依赖性DNA聚合酶以及核苷酸三磷酸失活酶在反应位点组合，所述反应位点包括与其连接并且具有3'末端核苷酸的起始物序列，其中反应试剂以选定浓度存在，并且处于共价添加一个或多个选定的核苷酸至3'末端核苷酸从而使所述选定的核苷酸成为3'末端核苷酸的条件下，并且处于使游离核苷酸三磷酸失活直至游离核苷酸三磷酸基本失活的条件下，其中所需数量的所述选定的核苷酸被添加于所述起始物序列，和(b)重复步骤(a)直到形成所述多核苷酸。

在一实施方式中，核苷酸失活酶为核苷酸三磷酸降解酶。在一实施方式中，核苷酸三磷酸失活酶为核苷酸三磷酸降解酶，其以比通过易错或非模板依赖性DNA聚合酶添加核苷酸的速率慢的速率降解核苷酸三磷酸。

在某些实施方式中，核苷酸三磷酸失活酶为核苷酸三磷酸降解酶，其存在的浓度使其降解核苷酸三磷酸的速率比通过由易错或非模板依赖性DNA聚合酶存在的浓度确定的添加核苷酸的速率慢。在一些实施方式中，核苷酸三磷酸失活酶包括ATP二磷酸水解酶、dNTP焦磷酸酶、dNTP酶和磷酸酶。

在一实施方式中，调节核苷酸三磷酸失活酶的浓度以控制一种或多种核苷酸的添加。在一实施方式中，核苷酸三磷酸失活酶使游离的核苷酸三磷酸失活。在一实施方式中，核苷酸三磷酸失活酶通过降解使游离的核苷酸三磷酸失活。在另一实施方式中，核苷酸三磷酸失活酶通过将游离的核苷酸三磷酸彼此之间聚合使游离的核苷酸三磷酸失活。在某些实施方式中，反应条件呈现添加游离的核苷酸三磷酸至起始物序列与降解游离的核苷酸三磷酸之间的竞争反应。

在一实施方式中，将选定的核苷酸添加至反应位点，所述反应位点包括具有末端核苷酸的起始物序列、易错或非模板依赖性DNA聚合酶和核苷酸失活酶。在另一实施方式中，将易错或非模板依赖性DNA聚合酶和核苷酸失活酶添加至反应位点，所述反应位点包括具有末端核苷酸的起始物序列以及选定的核苷酸。在某些实施方式中，在其中聚合酶为失活的条件下，将核苷酸失活酶添加至反应位点，所述反应位点包括具有末端核苷酸的起始物序列、易错或非模板依赖性DNA聚合酶和选定的核苷酸，并且其中聚合酶在添加核苷酸失活酶后活化。在一些实施方式中，重复步骤(b)数次，然后将反应试剂从反应位点去除并向反应位点提供额外的反应试剂。在一实施方式中，各轮添加后，将反应试剂从反应位点去除并向反应位点提供额外的反应试剂。在另一实施方式中，各轮添加后，将反应试剂从反应位点去除并向反应位点提供额外的反应试剂。

本公开的实施方式涉及用于制备多核苷酸的方法，其中核苷酸的添加可以经由活化失活核苷酸进行化学控制。在一实施方式中，该方法包括(a)将选定的失活核苷酸、阳离子、易错或非模板依赖性DNA聚合酶在反应位点组合，所述反应位点包括与其连接并且具有3'末端核苷酸的起始物序列，活化所述选定的失活核苷酸，其中反应试剂以选定浓度存在，并且处于共价添加一个或多个选定的活化的核苷酸至3'末端核苷酸从而使所述选定的活化的核苷酸成为3'末端核苷酸的条件下，并且处于其中所需数量的所述选定的活化的核苷酸被添加于所述起始物序列的条件下，和(b)重复步骤(a)直到形成所述多核苷酸。

在一实施方式中，失活核苷酸通过化学反应、酶、热、光或pH活化。在另一实施方式中，失活核苷酸包括保护基团，并且去除保护基团。在一些实施方式中，失活核苷酸包括通过光、热、酶、化学反应或pH活化的NPE或DMNPE笼状核苷酸或相似的笼状核苷酸。在某些实施方式中，NPE笼状核苷酸包括脱氧核苷酸5'-三磷酸，P3-(1-(2-硝基苯基)乙基)酯。在某些实施方式中，DMNPE笼状核苷酸包括脱氧核苷酸5'-三磷酸，P3-(1-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)乙基)酯。

在一实施方式中，选定的失活核苷酸是核苷、核苷酸单磷酸或核苷酸二磷酸形式，通过活化酶如核苷酸二磷酸激酶使其成为活性核苷酸三磷酸形式。在另一实施方式中，将失活核苷酸以允许一个或多个活化的核苷酸添加的速率活化。在一实施方式中，将失活核苷酸以允许一个或多个活化的核苷酸添加的速率活化，此后使活化的核苷酸或聚合酶之一失活。在另一实施方式中，将失活核苷酸活化，从而允许添加一个或多个活化的核苷酸，在这之后使聚合酶失活。在另一实施方式中，通过化学反应、二价阳离子、酶、热、光或pH使聚合酶失活。

在一实施方式中，将选定的失活核苷酸添加至反应位点，所述反应位点包括具有末端核苷酸的起始物序列和易错或非模板依赖性DNA聚合，并且将失活核苷酸活化。在一些实施方式中，重复步骤(b)数次，然后将反应试剂从反应位点去除并向反应位点提供额外的反应试剂。

本公开的实施方式涉及用于制备多核苷酸的方法，其中核苷酸的添加可以经由活化失活聚合酶进行化学和酶促控制。在一实施方式中，该方法包括(a)将选定的核苷酸三磷酸、阳离子、失活的易错或非模板依赖性DNA聚合酶在反应位点组合，所述反应位点包括与其连接并且具有3'末端核苷酸的起始物序列，活化所述失活的易错或非模板依赖性DNA聚合酶，其中反应试剂以选定浓度存在，并且处于共价添加一个或多个选定的核苷酸至3'末端核苷酸从而使所述选定的核苷酸成为3'末端核苷酸的条件下，并且处于其中所需数量的所述选定的核苷酸被添加于所述起始物序列的条件下，和(b)重复步骤(a)直到形成所述多核苷酸。

在一实施方式中，失活的易错或非模板依赖性DNA聚合酶通过化学反应、二价阳离子、酶、热、光或pH活化。在一些实施方式中，失活的易错或非模板依赖性DNA聚合酶通过化学反应、酶、热、光或pH活化，并且在将所需数量选定的核苷酸添加于起始物上后，通过化学反应、酶、热、光或pH再次失活。在一实施方式中，失活的易错或非模板依赖性DNA聚合酶包括保护基团，并且去除保护基团。在某些实施方式中，保护基团包括化学基团，所述化学基团被纳入聚合酶中，并且通过光、热、pH或酶去除以控制聚合酶活性。

在一实施方式中，将失活的易错或非模板依赖性DNA聚合酶以允许一个或多个核苷酸添加的速率活化。在另一实施方式中，将失活的易错或非模板依赖性DNA聚合酶以允许一个或多个核苷酸添加的速率活化，此后使核苷酸或聚合酶之一失活。在另一实施方式中，将失活的易错或非模板依赖性DNA聚合酶活化，从而允许添加一个或多个核苷酸，在这之后使聚合酶失活。在一实施方式中，通过化学反应、酶、热、光或pH使聚合酶失活。在某些实施方式中，将失活的易错或非模板依赖性DNA聚合酶添加至反应位点，所述反应位点包括具有末端核苷酸的起始物序列和选定的核苷酸三磷酸，并且其中将失活的易错或非模板依赖性DNA聚合酶活化。在一些实施方式中，重复步骤(b)数次，然后将反应试剂从反应位点去除并向反应位点提供额外的反应试剂。

本公开的实施方式涉及用于制备多核苷酸的方法，其中核苷酸的添加可以经由使活性聚合酶失活进行化学和酶促控制。在一实施方式中，该包括(a)将选定的核苷酸三磷酸、阳离子、易错或非模板依赖性DNA聚合酶在反应位点组合，所述反应位点包括与其连接并且具有3'末端核苷酸的起始物序列，其中反应试剂以选定浓度存在，并且处于共价添加一个或多个选定的核苷酸至3'末端核苷酸从而使所述选定的核苷酸成为3'末端核苷酸的条件下，并且将所述易错或模板非依赖性DNA聚合酶失活以终止添加所述选定的核苷酸，和(b)重复步骤(a)直到形成所述多核苷酸。

在一实施方式中，失活的易错或非模板依赖性DNA聚合酶通过化学反应、酶、热、光或pH活化。在另一实施方式中，活性易错或非模板依赖性DNA聚合酶在添加所需数量选定的核苷酸后通过化学反应、酶、热、光或pH失活，并且通过化学反应、酶、热、光或pH再次活化，用于将下一个选定的核苷酸添加至多核苷酸的3'末端。在一实施方式中，失活的易错或非模板依赖性DNA聚合酶包括保护基团，并且去除保护基团。在某些实施方式中，保护基团包括化学基团，所述化学基团被纳入聚合酶中，并且通过光、热、pH或酶去除以控制聚合酶活性。

在一实施方式中，将易错或非模板依赖性DNA聚合酶以允许一个或多个核苷酸添加的速率失活。在另一实施方式中，将易错或非模板依赖性DNA聚合酶以允许一个或多个核苷酸添加的速率失活。在另一实施方式中，将易错或非模板依赖性DNA聚合酶添加至反应位点，所述反应位点包括具有末端核苷酸的起始物序列和选定的核苷酸三磷酸，并且其中使易错或非模板依赖性DNA聚合酶失活。在一些实施方式中，重复步骤(b)数次，然后将反应试剂从反应位点去除并向反应位点提供额外的反应试剂。

本公开的实施方式涉及用于制备多核苷酸的方法，其中核苷酸的添加可以经由活化核苷酸和聚合酶进行化学和酶促控制。在一实施方式中，该方法包括(a)将选定的失活核苷酸、阳离子、失活的易错或非模板依赖性DNA聚合酶在反应位点组合，所述反应位点包括与其连接的起始物序列并且具有3'末端核苷酸，活化所述核苷酸并活化所述易错或非模板依赖性DNA聚合酶，其中反应试剂以选定浓度存在，并且处于共价添加一个或多个选定的核苷酸至3'末端核苷酸从而使所述选定的核苷酸成为3'末端核苷酸的条件下，和(b)重复步骤(a)直到形成所述多核苷酸。

在一实施方式中，使活性核苷酸和活性易错或非模板依赖性DNA聚合酶失活以终止添加选定的核苷酸。在另一实施方式中，活性易错或非模板依赖性DNA聚合酶在添加所需数量选定的核苷酸后通过化学反应、酶、热、光或pH失活，并且通过化学反应、酶、热、光或pH再次活化，用于将下一个选定的核苷酸添加至多核苷酸的3'末端。在一实施方式中，失活的易错或非模板依赖性DNA聚合酶通过化学反应、酶、热、光或pH活化。在另一实施方式中，失活的易错或非模板依赖性DNA聚合酶包括保护基团，并且去除保护基团。在一些实施方式中，保护基团包括化学基团，所述化学基团被纳入聚合酶中，并且通过光、热、pH或酶去除以控制聚合酶活性。在一实施方式中，失活核苷酸通过化学反应、酶、热、光或pH活化。在另一实施方式中，失活核苷酸包括保护基团，并且去除保护基团。在一些实施方式中，失活核苷酸包括通过光、热、酶、化学反应或pH去除的NPE笼状核苷酸或相似的笼状核苷酸。在某些实施方式中，NPE笼状核苷酸包括脱氧核苷酸5'-三磷酸，P3-(1-(2-硝基苯基)乙基)酯。在一些实施方式中，选定的失活核苷酸是核苷、核苷酸单磷酸或核苷酸二磷酸形式，通过活化酶如核苷酸二磷酸激酶使其成为活性核苷酸三磷酸形式。在某些实施方式中，将失活核苷酸或失活的易错或非模板依赖性DNA聚合酶之一以允许一个或多个核苷酸添加的速率活化。在一些实施方式中，重复步骤(b)数次，然后将反应试剂从反应位点去除并向反应位点提供额外的反应试剂。

经修饰或以其他形式的聚合酶(包括但不限于易错或模板依赖性聚合酶)可以用于生成具有随机或已知或所需核苷酸序列的核苷酸聚合物。非模板依赖性聚合酶，无论其修饰与否，可以被用于从头开始生成核酸。使用常见的核苷酸，如A、T/U、C或G。可以使用缺少链终止部分的核苷酸。可逆终止子可用于制备核苷酸聚合物的方法。模板依赖性聚合酶可以用于制备核酸序列。这样的非模板依赖性聚合酶可以是易错的，这可能会引起添加超过一种产生均聚物的核苷酸。

使用易错聚合酶(如非模板依赖性易错聚合酶)和常见或天然核酸(其可能是未被修饰的)合成寡核苷酸序列或多核苷酸序列。起始物序列或引物以已知的(如可寻址阵列中)或随机的各种位置与底物(如二氧化硅底物)连接。将包括至少选定核苷酸、非模板依赖性聚合酶和聚合酶酶活性所需的其它试剂的试剂以一定条件施加在底物的一个或多个位置，所述位置是起始物序列所在，所述一定条件是聚合酶向起始物序列添加一个或超过一个或多个核苷酸以延伸起始物序列。核苷酸(“dNTP”)可以施加于或流入周期性应用中。具有封闭基团或可逆终止子的核苷酸在足以限制或减少dNTP的酶促加成(enzymaticaddition)至一个dNTP的可能性的反应条件下可以与dNTP使用，即，考虑到反应动力学使用选择的反应条件将一个dNTP添加。具有封闭基团或可逆终止子的核苷酸是本领域技术人员已知的。根据另一个实施方式，当反应条件允许时，在常见或天然核苷酸与非模板依赖性易错聚合酶使用时，可以添加超过一种dNTP以形成均聚物运行。

可以使用蛋白酶、光化学或电化学调节作为反应条件修饰聚合酶活性，从而使得在单个dNTP之外的dNTP添加最小化。然后对一个或多个位置进行洗涤以去除试剂。重复施用试剂和洗涤的步骤直到生成所需的核酸。根据这一个方面，可以将试剂连续地或平行地添加到底物上的一个或超过一个或多个位置，或者可以使试剂与支持物的整个表面接触，如通过将试剂流过支持物的表面。根据一个方面，例如，基于聚合酶的活性或反应动力学确定反应条件，从而限制聚合酶将超过一个核苷酸连接至生长的寡核苷酸或起始物序列末端的能力。

此外，根据某些实施方式，可以将聚合酶调节成对于基于光的方法光敏性的。根据该方面，调节光以调整聚合酶，使其仅添加单个核苷酸。将该光照射于底物的个别位置或像素，所述位置或像素存在聚合酶、核苷酸和适当的试剂和反应条件。以这种方式，因为聚合酶被光所活化，核苷酸被添加到起始物序列或存在的核苷酸。在某些实施方式中，聚合酶活性可以通过pH来控制。本领域技术人员熟知各聚合酶具有活性pH范围，在该范围之外其为失活的。在一实施方式中，可以在活性范围内和外调整反应试剂pH以控制聚合酶。在一示例性实施方式中，已经确定TdT在小于pH 10时具有活性，但是在pH 11时失活。因此，如果反应的初始步骤为pH 11，将pH临时改变至10以下的任何位置可以临时活化TdT酶。此外，本领域技术人员还熟知，二价阳离子如Mg++、Co++、Mn++、Zn++、Ni++为所有已知DNA聚合酶的活性所必需。由反应螯合二价阳离子可以将聚合酶停止，或者将二价阳离子释放到反应中可以活化聚合酶。可以生成工程改造的聚合酶，使其通过特定波长的光活化，而通过另一波长的光失活。这类聚合酶可以含有光-活性基团，如偶氮苯、螺吡喃或视黄醛。可以制备这样的工程改造的聚合酶，其在某温度失活，但在另一温度再次活化。也已知天然聚合酶将具有这样的特性，但是相较于工程改造的聚合酶，其为有限且用处不大的水平。此外，存在聚合酶的竞争性、非竞争性或无竞争性化学抑制剂，如阿昔洛韦(苏维乐(Zovirax))，可以通过光、pH或热使其成为笼状，从而使其可以被可逆地释放/吸收或活化/失活，以控制聚合酶的活性。

使用流动池或其它通道(如微流体通道或具有输入和输出的微流体通道)来递送包括试剂(如聚合酶、核苷酸和其它适当的试剂)和洗剂的流动相或反应流体至流动池内底物的特定位置，如微流体通道内。本领域技术人员将意识到，反应条件将基于底物反应区域的尺寸、试剂、浓度、反应温度和用于生成和递送试剂和洗剂的结构。根据某些方面，可以针对TdT的使用优化pH和其它反应物和反应条件，以非模板依赖性方式将dNTP添加到存在的核苷酸或寡核苷酸。例如，通过引用全文纳入本文的Ashley等.,Virology 77,367-375(1977)确定针对dNTP添加的某些试剂和反应条件，如起始物尺寸、二价阳离子和pH。据报道，TdT在较宽pH范围具有活性，最优pH 6.85。制备核酸中，提供或递送dNTP、rNTP或rNDP的方法是有用的。J Clin Microbiol.1988年5月；26(5):804–807中描述了由dNTP填充的脂质体中pH敏感性病毒颗粒释放脂肪酶或其它膜溶解酶(membrane-lytic enzyme)。可从中释放NTP的光敏笼状(Photo-caged)rNTP或dNTP，特别是对350nm光敏感的硝基苄基衍生物，商购自生命技术公司(Life technologies)。视紫红质(rhoposin)或细菌视蛋白触发的信号转导导致囊泡或核苷酸的其他分泌是本领域已知的。藉由这些递送dNTP的方法，核苷酸将在遇到的第一引物聚合酶和任何下游之间被去除或隔离。

本文所用的核酸化学、生物化学、遗传学和分子生物学的术语和符号遵循本领域的标准论述和文本中的术语和符合，例如，Kornberg和Baker，DNA Replication(《DNA复制》)，第二版(W.H.弗里曼出版社(W.H.Freeman)，纽约，1992)；Lehninger，Biochemistry(《生物化学》)，第二版(沃斯出版社(Worth Publishers)，纽约，1975)；Strachan和Read，Human Molecular Genetics(《人类分子遗传学》)，第二版(WL出版社(Wiley-Liss)，纽约，1999)；Eckstein编，Oligonucleotides andanalogs:A Practical Approach(《寡核苷酸和类似物：实践方法》)(牛津大学出版社(Oxford University Press)，纽约，1991)；Gait编，Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(《寡核苷酸合成：实践方法》)(IRL出版社，牛津，1984)；等。

核酸和核苷酸

本文所用术语“核酸分子”、“核酸序列”、“核酸片段”和“寡聚物”可互换使用，并且意在包括但不限于，可能具有各种长度的核苷酸的聚合物形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。

通常，术语“核酸分子”、“核酸序列”、“核酸片段”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且意在包括但不限于，可能具有各种长度的核苷酸的聚合物形式，包括脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)，或其类似物。寡核苷酸通常由4个核苷酸碱基的特定序列组成，所述4个核苷酸碱基为：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)(当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶(U)替代胸腺嘧啶(T))。根据某些方面，可以使用脱氧核苷酸(dNTP，如dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。根据某些方面，可以使用核糖核苷酸三磷酸(rNTP)。根据某些方面，可以使用核糖核苷酸二磷酸(rNDP)。

术语“寡核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示；或者，该术语可以应用于多核苷酸分子本身。可以将该字母表示输入具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，如功能基因组学和同源性搜索。寡核苷酸任选地可以包括一个或多个非标准的核苷酸、核苷酸类似物和/或修饰的核苷酸。本公开考虑了任何脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其化学变体，如碱基的甲基化、羟甲基化或糖基化形式等。根据某个方面，在制备核酸的方法中使用天然核苷酸。天然核苷酸缺少链终止部分。

修饰的核苷酸的示例包括但不限于，二氨基嘌呤、S2T、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2、2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、五步苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤等。还可以在碱基部分(例如，在通常能够与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子和/或在通常不能与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子)、糖部分或磷酸骨架修饰核酸分子。核酸分子可以还包含胺改性的基团，如氨基烯丙基-dUTP(aa-dUTP)和氨基己基丙烯酰胺-dCTP(aha-dCTP)，以允许如N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)的胺反应性部分共价连接。

本公开的寡核苷酸中标准DNA碱基对或RNA碱基对的替代物可以提供每立方毫米更高的密度，更高的安全性(天然毒素的意外或目的性合成的抵抗)，光编程的(photo-programmed)聚合酶中更容易的区分，或更低的二级结构。与天然或变异的聚合酶相容、用于从头和/或扩增合成的这样的替代碱基对在Betz K,Malyshev DA,Lavergne T,Welte W,Diederichs K,Dwyer TJ,Ordoukhanian P,Romesberg FE,Marx A(2012)KlenTaq聚合酶通过诱导沃森-克里克几何学复制非天然碱基对(KlenTaq polymerase replicatesunnatural base pairs by inducing a Watson-Crick geometry),Nature Chem.Biol.8:612-614中描述；参见YJ,Malyshev DA,Lavergne T,Ordoukhanian P,Romesberg FE.J AmChem Soc.2011年12月14日；133(49):19878-88,使用高效复制和转录的非天然碱基对类型位点特异性标记DNA和RNA(Site-specific labeling of DNA and RNA using anefficiently replicated and transcribed class of unnatural base pairs)；SwitzerCY,Moroney SE,Benner SA.(1993)Biochemistry.32(39):10489-96.异胞苷和异鸟苷之间碱基对的酶促识别(Enzymatic recognition of the base pair between isocytidineand isoguanosine)；Yamashige R,Kimoto M,Takezawa Y,Sato A,Mitsui T,Yokoyama S,Hirao I.Nucleic Acids Res.2012Mar；40(6):2793-806.高特异性非天然碱基对系统作为PCR扩增的第三个碱基对(Highly specific unnatural base pair systems as a thirdbase pair for PCR amplification)；以及Yang Z,Chen F,Alvarado JB,Benner SA.J AmChem Soc.2011年9月28日；133(38):15105-12,六字母合成遗传系统的扩增、突变和测序(Amplification,mutation,and sequencing of a six-letter synthetic geneticsystem)。可以使用其它非标准的核苷酸，如Malyshev,D.A.,等.,Nature,509卷,385-388页(2014年5月15日)中的dexfribed，通过引用全文纳入本文。

聚合酶

根据本发明的一个替代性实施方式，使用聚合酶构建例如表示信息的核酸分子，所述信息在本文中被记录在核酸序列中，或核酸在本文中指储存介质。聚合酶是，例如，使用DNA或RNA作为模板产生核酸序列的酶。产生RNA聚合物的聚合酶被称为RNA聚合酶，而产生DNA聚合物的聚合酶被称为DNA聚合酶。包含错误的聚合酶是本领域已知的，并且在本文中称为“易错聚合酶”。非模板依赖性聚合酶可以是易错聚合酶。使用易错聚合酶允许将特定碱基纳入DNA分子的特定位置。易错聚合酶在其试图复制模板时要么接受非标准碱基，如可逆链终止碱基，要么纳入不同核苷酸，如选择性给予的天然的或未修饰的核苷酸。非模板依赖性聚合酶，如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，也被称为DNA核苷酸基内转移酶(DNAnucleotidylexotransferase，DNTT)或末端转移酶，其通过催化核苷酸添加到不具有模板的DNA分子的3'末端制备核酸链。TdT优选的底物是3'-突出，但是其也可以将核苷酸添加到钝的或凹陷的3'末端。钴是一种辅助因子，然而，该酶在体外给予Mg和Mn时催化反应。核酸起始物可以是4或5个核苷酸或更长的核苷酸，并且可以是单链或双链的。双链起始物可以具有3’突出，或者其可以是钝端的，或者其可以具有3’凹陷端。

TdT，类似所有DNA聚合酶，同样需要金属离子进行催化。然而，TdT的独特之处在于其使用多种二价阳离子(如Co2+、Mn2+、Zn2+和Mg2+)的能力。通常，引物p(dA)n(其中n是从4到50的链长度)的延伸率与dATP在存在二价金属离子的情况下以如下顺序排列：Mg2+>Zn2+>Co2+>Mn2+。此外，各金属离子对于核苷酸纳入的动力学有不同的效果。例如，Mg2+促进dGTP和dATP的优先应用，而Co2+增加嘧啶、dCTP和dTTP的催化聚合效率。Zn2+作为TdT的独特正效应物，因为用Mg2+的反应速率受到微摩尔量的Zn2+的添加的刺激。该增强可反映Zn2+诱导TdT中构象改变的能力，而其产生较高的催化效率。相较于Mg2+，聚合速率在Mn2+存在的情况下较低，这表明Mn2+并不如Mg2+异样高效地支持反应。TdT的进一步描述在BiochimBiophys Acta.,2010年5月；1804(5):1151–1166中提供，其全部内容通过引用纳入本文。此外，人们可以用其它设计为调节核苷酸结合的阳离子替换核苷酸脉冲中的Mg2+、Zn2+、Co2+或Mn2+。例如，如果核苷酸脉冲用如Na+、K+、Rb+、Be++、Ca++或Sr++的其它阳离子替换Mg++，那么核苷酸可以结合，而不是纳入，因此调节核苷酸是否纳入。然后，可以提供不具有核苷酸或Mg++的预洗涤脉冲(任选)，或者然后，可以提供不具有核苷酸的Mg++缓冲液。

通过控制引物/起始物，可以调节核苷酸底物，或聚合酶，特定核酸纳入聚合物。因此，这样的聚合酶能够纳入独立于模板序列的核苷酸，并且因此有益于从头产生核酸序列。易错聚合酶和引物序列的组合作为书写机制，用于将信息给予核酸序列。

通过控制引物/起始物，可以调节核苷酸底物，或非模板依赖性聚合酶，添加核苷酸至起始物序列或存在的核苷酸或寡核苷酸，以通过延伸产生寡核苷酸。因此，这样的聚合酶能够纳入不具有模板序列的核苷酸，并且因此有益于从头产生核酸序列。

η-聚合酶(Matsuda等.(2000)Nature 404(6781):1011-1013)是这样的一种聚合酶的示例，其在所有4种dNTP存在的情况下具有高突变速率(～10％)以及对3’错配较高的耐受，并且如果限制于1中或2种dNTP，这些值可能甚至更高。因此，η-聚合酶是与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)相似的核酸信息的从头记录器(de novo recorder)，但是其具有这样的优势，即通过该聚合酶产生的产物是连续双链的。双链DNA比起单链DNA具有较低粘性的二级结构，并且具有更易预测的二级结构。此外，双链DNA作为聚合酶和/或DNA结合蛋白系连(DNA-binding-protein tether)的良好支持物。

根据某些方面，可以使用模板依赖性或模板半依赖性易错聚合酶。根据某些实施方式，可以使用模板依赖性易错聚合酶，这可能会容易产生错误。根据某些实施方式，可以使用非模板依赖性RNA聚合酶。在使用模板依赖性或模板半依赖性聚合酶的情况下，模板与通用碱基的任何组合都可以使用，这将支持接受许多核苷酸类型。此外，可以使用错误耐受阳离子，如Mn⁺。此外，本公开考虑了使用错误耐受的聚合酶突变体。参见Berger等.,用于杂交、复制和链终止的通用碱基(Universal Bases for Hybridization,Replication andChain Termination),核酸研究(Nucleic Acids Research)2000,8月1日,28(15)pp.2911-2914，其通过引用纳入本文。为本领域技术人员所知的使非模板依赖性聚合酶活化或失活的方法能够用于本公开。

支持物和连接

在某些示例性实施方式中，本文所述的一种或多种寡核苷序列被固定于支持物(例如，固体和/或半固体支持物)。在某些方面，寡核苷酸序列可以使用本文所述的一个或多个亚磷酰胺接头与支持物连接。合适的支持物包括但是不限于，载玻片、珠粒、芯片、颗粒、股线、凝胶、片材、管、球体、容器、毛细管、垫、片、膜、板等。在各种实施方式中，固体支持物可以是生物的、非生物的、有机的、无机的、或其任意组合。本发明的支持物可以是所需的任何形状、尺寸或结构结构。例如，支持物可以是正方形、矩形、圆形、扁平、平面、环形、管状、球形等。当使用基本上是平面的支持物时，可以将支持物物理分隔成区域，例如，用沟槽、凹槽、孔或化学屏障(例如，疏水涂层等)。支持物可以由玻璃(二氧化硅)、金属、陶瓷、聚合物或本领域技术人员已知的其他材料制成。支持物可以是固体、半固体、高弹体或凝胶。在某些示例性实施方式中，支持物是微阵列。本文所用术语“微阵列”在一个实施方式中指一种类型的阵列，其包含固相支持物，所述固相支持物具有基本平的表面，其上有空间确定的非重叠区域或位点的阵列，其各自包含固定的杂交探针。“基本平的”指，位于表面上的感兴趣的特征或物体，例如探针位点，可占据表面上或表面下延伸的一定体积，并且其维度小于所述表面的维度。例如，位于光纤束的面上的珠产生基本平的探针位点表面，或者，位于多孔平面基质或在其上合成的寡核苷酸产生基本平的表面。此外，空间确定的位点可以是“可寻址的”，其中，其位置和该位置处固定的探针的鉴定是已知的或可确定的。

固体支持物还可以包括半固体支持物，如具有固体和液体成分的可压缩的基质，其中，液体占据孔、空间或固体基质元件之间的其它间隙。优选地，半固体支持物包括聚丙烯酰胺、纤维素、聚二甲基硅氧烷、聚酰胺(尼龙)和交联的琼脂糖、右旋糖酐和聚乙二醇。可以共同使用固体支持物和半固体支持物，也可各自独立地使用。

支持物可以还包括固化的介质。根据本发明使用这样固化的介质在核酸分子沉积和扩增所需的条件下是物理稳定且化学惰性。有用的支持基质能够承受PCR所需温度的快速变化和极端温度。支持物材料允许酶促核酸核酸。如果并不知给定的基材是否将会这样，那么在根据发明生产一组阵列的任何尝试之前，对其进行凭经验的测试。根据本发明的一个实施方式，支持物结构包括半固体(即，凝胶状)晶格或基质，其中，晶格或基质元件之间的空隙或孔用水性或其它液体介质填充；典型的孔(或“筛”)尺寸是100μm-5nm的范围内。基质元件之间较大的间隔是在容限范围内，但是在其固定之前，扩增产物扩散的可能性增加。半固体支持物是可压缩的。出于印刷的目的，以平面，或基本上是平面的方式制备支持物。例如，实际上是平面的支持物可能是圆柱形的，这样的话，为了接触其它平面或圆柱形的支持物，通过将一个在另一个上翻转，阵列的核酸分布于其外表面。最后，根据本发明使用的支持物材料允许通过本技术领域已知的方法将阵列的核酸特征与其固定(共价连接)。满足这些条件的物质包括有机和无机物质，并且包括但不限于，聚丙烯酰胺、纤维素、和聚酰胺(尼龙)，以及交联的琼脂糖、右旋糖酐和聚乙二醇。

一实施方式是关于玻璃支持物(如板、载玻片或芯片)上的薄聚丙烯酰胺凝胶。如下所述，合成该类型的聚丙烯酰胺片材。丙烯酰胺和双丙烯酰胺以被设计成在单个聚合物链之间产生这样程度的交联的比例(例如，38：2的比例是典型的测序凝胶)混合，当调整用于凝胶中的混合物的整体百分比时，所述程度的交联导致所需孔尺寸，以提供聚丙烯酰胺片材所需的拉伸性能。聚丙烯酰胺凝胶铸造方法是本领域已知的(参见Sambrook等.,1989,《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning,A Laboratory Manual),第2版,冷泉港实验室出版社,纽约州冷泉港，其通过引用全文纳入本文)，并且本领域的技术人员没有困难做出这样的调整。

凝胶片材被浇铸在两个刚性表面之间，其中至少一个表面是在将其与另一个表面去除之后保持连接的玻璃。用不会抑制凝胶聚合的润滑剂涂覆聚合完成后待去除的浇铸表面；出于这样的目的，通常时候用硅烷。将一层硅烷在通风橱下在表面上散布并使其静置直至几乎干燥。然后，用乙醇去除(擦拭，在小物体的情况下，彻底清洗)过量的硅烷。浇铸之前，用常常被称作“”交联硅烷的γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(目录号M6514，西格玛公司(Sigma)；密苏里州圣路易斯)处理将会与凝胶片材关联的玻璃表面。用该试剂涂覆三次将接触凝胶的玻璃表面。面积等于1200cm²的各处理需要125μl交联硅烷在25ml乙醇中。在该溶液散布到玻璃表面之前，其与750μl水和75μl冰醋酸的混合物结合，并且剧烈摇晃。允许乙醇溶剂在涂层之间蒸发(在通风窗下约5分钟)，并且在最后的涂覆干燥后，经由大量乙醇洗涤，尽可能完全地去除过量的交联硅烷，从而防止凝胶上其它支持物平板的“夹心”。然后，将平板组装，并且如所需浇铸凝胶。

决定根据本发明使用的凝胶的尺寸的唯一操作性约束是本领域技术人员浇铸这种凝胶的物理能力。浇铸长达1米的凝胶虽然麻烦，但是对于核酸测序技术熟练的工作人员来说是熟知的方法。如果生产更大的凝胶，根据本发明也是有用的。聚合完成后，由较大完整的凝胶切下极小的凝胶。

注意的是，本领域至少已知一种用于浇铸具有包埋在其基质内的生物活性物质(如酶)的聚丙烯酰胺凝胶的方法(O’Driscoll,1976,Methods Enzymol.,44:169-183，其全部内容通过引用纳入本文)。也已记载使用光交联聚乙二醇树脂并允许在凝胶基质中包埋活细胞的相似的方案(Nojima和Yamada,1987,Methods Enzymol.,136:380-394，其全部内容通过引用纳入本文)。这样的方法根据本发明是有用的。如下所述，出于将完整的染色体DNA递送至适合脉冲场凝胶电泳的基质或作为宿主细胞“菌苔(lawn)”的目的，通常将全细胞浇铸到琼脂糖中，在根据Benton和Davis的方法(参见Maniatis等.,1982,《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press),纽约州冷泉港，其全部内容通过引用纳入本文)转移空斑之前，所述菌台将支持噬菌体生长。简言之，电泳级凝胶(例如，超纯；生命技术公司(Life Technologies)/吉布可公司(Gibco)-BRL)溶解于生理(等渗的)缓冲液中，并且允许在管、瓶或烧瓶中平衡至50℃至52℃。然后将细胞加入琼脂糖，并且在将混合物倒出或移液到凝胶电泳槽之前，将其彻底、迅速(如果在瓶或管中，通过旋转盖帽和倒置，如果在烧瓶中，通过涡旋)混合。如果使用低熔点琼脂糖，在添加细胞之前，其可能带来更低的温度(降至接近室温，取决于琼脂糖的浓度)。对于一些细胞类型，这是理想的；然而，如果电泳是在细胞裂解之后、所得核酸池的分子共价连接支持物之前，那么其在冷藏下进行，如在4℃至10℃“冷”室。

固定在微阵列上的寡核苷酸包括在试验反应中或从试验反应产生的核酸。通常，微阵列上的寡核苷酸或多核苷酸是单链的，并且共价连接至固相支持物，常常通过5'端或3'端连接。在某些示例性实施方式中，探针经由一个或多个可切割接头固定。微阵列中包含核酸的非重叠区域的密度通常大于100/cm²，并且较为普遍地，大于1000/cm²。有关于核酸探针的微阵列技术的综述见于如下示例性参考文献：Schena,Editor,《微阵列：实践方法》(Microarrays:A Practical Approach)(IRL出版社，牛津，2000)；Southern,CurrentOpin.Chem.Biol.,2:404-410(1998)；Nature Genetics增刊，21:1-60(1999)；和Fodor等,美国专利号5,424,186；5,445,934；和5,744,305。

将寡核苷酸固定于支持物的方法是本领域已知的(珠：Dressman等.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:8817、Brenner等.(2000)Nat.Biotech.18:630、Albretsen等.(1990)Anal.Biochem.189:40、和Lang等.Nucleic Acids Res.(1988)16:10861；硝化纤维：Ranki等.(1983)Gene 21:77；纤维素：Goldkorn(1986)Nucleic Acids Res.14:9171；聚苯乙烯：Ruth等.(1987)合成核酸治疗和诊断应用会议(Conference of Therapeutic andDiagnostic Applications of Synthetic Nucleic Acids),英国剑桥.；聚四氟乙烯-丙烯酰胺：Duncan等.(1988)Anal.Biochem.169:104；聚丙烯：Polsky-Cynkin等.(1985)Clin.Chem.31:1438；尼龙：Van Ness等.(1991)Nucleic Acids Res.19:3345；琼脂糖：Polsky-Cynkin等.,Clin.Chem.(1985)31:1438；以及丙烯葡聚糖凝胶：Langdale等.(1985)Gene 36:201；乳胶：Wolf等.(1987)Nucleic Acids Res.15:2911)。可用连接化学或聚合物(如，氨基硅烷、NHS酯类、点击化学、多溶素等)涂覆支持物以将核酸结合至支持物。

本文中所用的术语“连接(attach)”指共价相互作用和非共价相互作用。共价相互作用是两个原子或自由基之间由共用一对电子(即，单键)、两对电子(即，双键)或三对电子(即，三键)所形成的化学连接。共价相互作用在本领域中已知为电子对相互作用或电子对键连。非共价相互作用包括但不限于，范德华相互作用、氢键、弱化学键(即，通过短范围非共价力)、疏水相互作用、离子键等。非共价相互作用的综述可见于Alberts等，刊于《细胞分子生物学》(Molecular Biology of the Cell)，第三版，加兰出版社(GarlandPublishing)，1994。

根据某些方面，使用共价接头将核酸分子附着或固定于基材，所述共价接头选自3-甲基尿苷、丙烯酰基和六乙二醇。除了将接头序列与库的分子连接，所述库用于支持物定向连接，如果需要，限制性位点或调控元件(如启动子元件、帽位点或翻译终止信号)与该库的成员连接。可以去除在支持物表面已经合成的核酸，如通过本领域技术人员已知的一种或多种可切割接头。还可以设计接头具有化学活性区段，所述区段任选地可以用试剂(如酶)、光、热、pH缓冲液和氧化还原试剂切割。这样的接头可以用于针对各离散的特征预制不同溶液相引物的原位固相非活性储库(reservoir)。一旦切割接头后，引物将会在用于PCR的溶液中释放，也许通过使用来自热循环过程的热作为引发。

还考虑了经由库的成员与共价结合支持物的核酸分子杂交进行核酸分子与支持物的附着。

根据本发明将核酸分子固定于支持物基质通过数个方法中的任一个实现。可以进行经由使用带有适于与支持物共价连接的化学基团的3'-末端标签直接固定，核酸分子库的单链分子与已经结合支持物的寡核苷酸引物的杂交，或将核酸分子散布在支持物上以及导入可以共价连接支持物的引物(在铺板前或后添加)。在使用预固定的引物的情况中，其被设计成捕获广谱的序列基序(例如，给定链长度的几乎所有多聚体，例如，六聚体)、与特异性序列同源的核酸或在特定序列基序上包含变体的核酸。或者，该引物包含与核酸分子库的所有成员共有的合成分子特征，如接头序列。

将会对两种交联核酸分子与聚丙烯酰胺凝胶片材的方法进行详细的描述。第一种方法(由Khrapko等.,1996提供，美国专利号5,552,270)涉及用3-甲基尿苷对核酸分子进行3'加帽。使用该方法制备本发明库的核酸分子，从而在其3'末端包括该修饰的碱基。在引用的方案中，浇铸30μm厚的8％聚丙烯酰胺凝胶(30:1，丙烯酰胺：双丙烯酰胺)片材，然后在室温暴露于50％肼1小时。这样的凝胶根据本发明也是有用的。然后将基质风干至其将吸收包含如下所述核酸分子的溶液的程度。用1mM过碘酸钠(NaIO₄)在室温下氧化其3'末端包含3-甲基尿苷的核酸分子10分钟-1小时，用8-10体积的丙酮中的2％LiClO₄沉淀并且在水中溶解至10pmol/μl的浓度。调整该浓度，以便在将核酸分子以均匀地覆盖支持物表面并高效地(即完全地)被其吸收的体积散布于支持物时，阵列核酸分子的密度处于上述范围内。将核酸分子散布于凝胶表面，并将平板置于潮湿培养箱4小时。然后将其在室温进行0.5小时的干燥，并在适合其后续使用的缓冲液中洗涤。或者，将凝胶在水中清洗，重新干燥并储存在–20℃待用。认为结合凝胶的核酸的核酸总体产率是80％，并且对于这些分子，98％通过其氧化的3'基团特异性地连接。

第二种用于将核酸分子共价连接聚丙烯酰胺片材的交联部分是5'丙烯酰基团，其连接到引物。本发明可以使用在其5'末端包括这样修饰碱基的寡核苷酸引物。具体而言，将这样的寡核苷酸直接浇铸到凝胶中，从而使得丙烯酰基团成为聚合基质的完整、共价结合的部分。引物的3'末端保持未结合，从而使其与库的核酸分子自由地相互作用并杂交，以及开始其酶促第二链合成。

或者，使用六乙二醇将核酸分子与尼龙或其它支持物基质共价连接(Adams和Kron,1994，美国专利号5,641,658)。此外，核酸分子经由用紫外光的辐射与尼龙交联。尽管由于波长和透射强度的变化，需要对各种使用仪器校准辐射支持物的时间长度以紫外光源的最佳距离，但是至少一种针对核酸分子与杂角膜交联专门设计的装置可市售获得(Stratalinker，斯查塔基公司(Stratagene))。应注意，在经由放射进行交联的过程中，将会出现受限的核酸链切口。然而，在诸如杂交过程中所用的条件下，切口的量通常是可忽略的。然而，在一些情况中，核酸分子紫外光交联的方法将由于切口并不适用。核酸分子与支持物在既非5'-末端或3'-末端的附着也同样发生，但应注意的是，如此交联的阵列的潜在应用很大程度上并不受到影响，因为这样的交联并不抑制寡核苷酸引物与结合支持物的固定的分子的杂交。

本文所述支持物可以具有与其相关的一个或多个光学可寻址虚拟电极，从而在本文所述支持物上的反应位点产生阴离子环形涡旋。

试剂递送系统

根据某些方面，递送试剂和洗剂，反应物在所需位置存在所需的一段时间，例如，以将dNTP共价连接至在所需位置连接的存在的核苷酸或起始物序列。将选定的核苷酸试剂液体脉冲过或流过或沉积于反应发生的反应位点，然后可以任选地递送不包括该核苷酸的洗剂或缓冲液。合适的递送系统包括流体系统、微流体系统、注射器系统、喷墨系统、移液管系统和本领域技术人员已知的其它液体递送系统。设想了多种流动池实施方式或流动通道实施方式或微流体通道实施方式，这些实施方式可以使用泵或电极或其它移动流体通过通道或微流体通道领域技术人员已知的方法，通过一个或多个通道递送单独的试剂或试剂的混合物或洗剂至基材表面所处位置的反应区域或容器，从而使得试剂可以接触待添加核苷酸的所需位置。

根据另一个实施方式，提供了具有一个或多个储库的微流体装置，所述储库包括将经由微通道转移至反应区的一种或多种试剂，所述反应区是试剂混合和反应发生的位置。本领域技术人员已知这些微流体装置以及移动流体试剂流过这些微流体装置的方法。

如果需要，固定的核酸分子可以使用这样的装置(例如，任何市售可得的可以基本无修饰形式使用的喷墨打印机)，这样的装置将喷射集中爆发的包含试剂的溶液(参见Castellino(1997)Genome Res.7:943-976，其全部内容通过引用纳入本)。.当前，这样的方法在Incyte制药公司和Rosetta生物系统有限公司进行，后者采用“轻微修饰的爱普生墨盒”(加利福尼亚州托伦斯的爱普生美国有限公司(Epson America,Inc.))。喷墨沉淀的方法依赖于压电效应，以此包含感兴趣液体的窄管(在这种情况下是寡核苷酸合成试剂)被适配器包围。穿过适配器的电荷导致适配器以不同于管的速率膨胀，并且迫使小滴液体试剂从管中移到涂覆的载玻片或其他支撑物。

试剂可以在支持物的离散区域沉积，因此各区域形成阵列的特征。该特征能够如本文所述生成阴离子环形涡旋。所需核酸序列可以在各位置逐滴合成，对于本领域已知的其他方法也是如此。如果试剂的色散角很窄，其可以创建包含许多特征的阵列。或者，如果喷雾装置更广泛地聚焦，那么其将以更宽的角度分散核酸合成试剂(几乎是每次覆盖整个支持物)并且产生各成员具有相同序列的阵列(即，该阵列只有单一功能)。

以下实施例是本发明的代表。这些实施例并不构成对本发明范围的限制，因为这些和其他等价实施方式将对于本发明、附图和所附权利要求而言是显而易见的。

实施例

本公开示例性的实施方式涉及用TdT酶促合成用户定义的核酸序列的方法。根据本公开的方法考虑四个主要方面：物理和化学控制核酸聚合物对NPU的暴露，TdT的核苷酸类似物底物，TdT聚合的条件，以及本发明的示例实施方式，针对基于TdT的NPU合成限定信息内容的核酸。根据本公开的新型方法可以用于合成核酸聚合物，用于DNA中的信息储存。根据本公开的这些新型方法还提供了对非模板依赖性DNA聚合物(如TdT)纳入核酸聚合物的核苷酸数量和性质改善的控制，并使用户定义的核酸序列合成能够用于生物应用。

核酸聚合物的受控NPU暴露

本公开所提供的是，限制通过TdT的核苷酸添加数量可以通过控制聚合反应下述的三个要素中的一个或组合实现：引物/起始物、核苷酸底物或聚合酶。使用TdT进行定制DNA合成的先前和正在进行的尝试集中于与核苷酸结合的引物/起始物上。具体地，其他人已经尝试使用可逆终止子核苷酸类似物来合成所需序列的DNA。然而，已经发现TdT并不能有效作用于任何可用的可逆终止子核苷酸类似物。此外，使用这类类似物增加了DNA合成的复杂性和成本，同时增加了合成时间。本公开提供了酶促合成的新型方法，其侧重于使用各种物理和化学控制方法对核苷酸和聚合酶(即NPU)进行控制。

在根据本公开方法的一种方法中，控制起始物/引物与NPU物理接触的时间。在一实施方式中，本公开的方法提供了通过流体建立这种NPU暴露控制的物理方法的有效方式。这类方法的示例性实施方式示于图1A和1B，其中起始物寡核苷酸固定于流体装置的表面(称之为起始物贴片或贴片)。然后将该贴片暴露于NPU，其包括仅与4种可能的核苷酸三磷酸(dNTP)中的一种预混合的TdT。如图1B所示，微流体装置以给定的速率在贴片上流动每个NPU，从而限制贴片对每个NPU的暴露时间，以产生所需碱基延伸至所需计数或所需计数分布。在某些实施方式中，装置还允许对NPU的顺序进行控制，从而对纳入的序列和信息内容进行控制(图1A)。例如，对于合成序列“GATC”，贴片将连续地暴露于4种NPU。NPU将各自包括分别具有dGTP、dATP、dTTP和dCTP的TdT。流体控制将贴片暴露于各NPU最佳时间，这确保特定核苷酸添加至起始物寡核苷酸的整个贴片中。

在根据本公开方法的另一种方法中，控制核苷酸底物对用于延长引物/起始物的酶可及的时间量。在一实施方式中，将降解dNTP的酶“ATP二磷酸水解酶”(腺苷三磷酸双磷酸酶)与TdT一起添加到反应(图2A)。该添加导致两个竞争反应：一个为通过TdT将游离核苷酸聚合成核酸聚合物，而另一个为通过腺苷三磷酸双磷酸酶降解对TdT可及的游离核苷酸。优化腺苷三磷酸双磷酸酶的浓度，从而允许核苷酸的可重复添加，延伸设定长度。一旦核苷酸通过聚合酶添加至起始物并通过腺苷三磷酸双磷酸酶降解其超出量，将下一个核苷酸添加至混合物(图2B)。例如，对于合成序列“GATC”，将起始物、TdT和腺苷三磷酸双磷酸酶混合。然后，将少量的dGTP添加至该混合物。数秒后，一旦TdT已经延伸了起始物，而腺苷三磷酸双磷酸酶已经降解了过量的dGTP，将少量的dATP添加至混合物。如此，数秒后添加dTTP，而将在这做好后数秒添加dCTP。这种新的控制策略避免了在第一种物理控制方法中存在的对高时间暴露控制的挑战性要求。

本公开的方法考虑了除了这两个具体实施例以外的其它方法，其提供了引物/起始物对NPU暴露相似的控制。在一些实施方式中，这些其它方法包括：通过热、光波长或pH来活化失活核苷酸或失活TdT酶，以及使用蛋白酶来去除TdT酶，相对于在设定的时间量后通过腺苷三磷酸双磷酸酶从反应去除dNTP等等。

TdT的核苷酸类似物底物

在本公开方法的一般方案中，通过TdT分布延伸长度对于保证高效且准确将信息编码到DNA中十分重要。已经发现4种天然核苷酸(A、C、G和T)各自的延伸效率、速率和延伸长度分布不相同。事实上，已经观察到，对于基于TdT的DNA合成，dCTP显示出最优的性能，而dATP和dTTP显示出最差的性能。考虑到这些观察结果，对数个核苷酸类似物进行筛选以寻找相较于其天然相对物在基于TdT的DNA合成中具有优越性能的核苷酸类似物。研究了下述具有NPU制剂的核苷酸类似物，所述NPU制剂包括腺苷三磷酸双磷酸酶。

表1.筛选核苷酸类似物

已经发现下述核苷酸类似物展现出相对于其天然相对物与TdT同样好或优越的效率、速率和/或长度分布(参见图3核苷酸结构)。

表2.改善的dATP替代物

7-去氮-7-溴-dATP
	1-硼烷-dATP(2'-脱氧腺苷-5'-O-(1-硼烷三磷酸))
2-氨基-dATP(二氨基嘌呤)
	7-去氮-dATP
7-去氮-7-碘-dATP

表3.改善的dTTP替代物

5-丙炔基-dUTP
	5-溴-dUTP
5-碘-dUTP
	5-氨基烯丙基-dUTP
5-炔丙基氨基-dUTP

通常，已经观察到，比其天然相对物带更多正电荷的所有核苷酸类似物为更高效的TdT底物。这些类似物包括但不限于5-氨基烯丙基-dUTP和5-炔丙基氨基-dUTP。

本公开范围内的其它核苷酸类似物包括：

1-5-羟基-dCTP(hdCTP)

2-5-羟基甲基-dCTP(hmdCTP)

3-5-溴-dCTP(BrdCTP)

4-5-碘-dCTP(IdCTP)

和

5-5-甲基-dCTP(5m-dCTP)

受控TdT合成的生物化学制剂

已经发现下述缓冲液配方对于TdT聚合为最佳，其允许TdT高效添加所有核苷酸：

10至20mM Tris-乙酸盐

20至50mM乙酸钾

5至8mM乙酸镁

0.5-1.0mM DTT

pH 7.9，25℃

腺苷三磷酸双磷酸酶在上述条件中同样为活化的。

具体地，已经发现下述缓冲液对于TdT聚合为最佳：

14mM Tris-乙酸盐

35mM乙酸钾

7mM乙酸镁

0.7mM DTT

pH 7.9，25℃

设备实施

本公开提供了示例性设备、方案和实施NPU酶促合成的方法以生成给定信息内容的核酸聚合物。图4说明了这一实施的实施方式。4种NPU各为TdT、腺苷三磷酸双磷酸酶和下述核苷酸之一的制剂：7-去氮-7-溴-dATP、dCTP、dGTP和7-丙炔基-dUTP。

使用机器人分配系统(来自Formulatrix公司的Mantis机器人)，其可以经编程以在xyz空间内可再现地运动并以100纳升增量分配液体。使用该机器人，将100纳升的起始物寡核苷酸以介于0.04微摩尔和5微摩尔的最佳浓度沉积于ArrayIt SuperAldehyde2涂覆的载玻片(目录号SMA2F)，并重悬于1X微点样溶液(ArrayIt)。设计起始物寡核苷酸具有5'氨基修饰用于固定于玻璃表面，并且具有脱氧尿苷(deoxyUridine)以实现通过如下所示USER(尿嘧啶特异性切割试剂)酶的寡核苷酸释放。

5Am12-fS3-ctgac:

/5AmMC12/TTTTTTTTTT/ideoxyU//ideoxyU/

CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT CTGAC

将具有起始物寡核苷酸的载玻片用1.4X微点样溶液(ArrayIt)和500毫摩尔NaCl(3.5毫升2x寡核苷酸点样溶液，1毫升水，0.5毫升5摩尔NaCl溶液)在封闭环境内孵育24小时以防止蒸发。然后将该载玻片首先在室温干燥，然后60℃孵育1小时。然后用水洗涤该载玻片一次，用pH 8.0的0.1％SDS+1毫摩尔Tris HCl洗涤一次，并用水洗涤三次(最后一次剧烈摇动)。

为了还原席夫碱(Schiff base)和未反应的醛，制备0.15g NaBH₄的35毫升PBS溶液。NaBH₄溶解后，向溶液添加15毫升100％乙醇。将载玻片在该溶液中孵育15分钟，将管盖打开，以允许氢气溢出。之后使用水将载片洗涤两次。

为了使DNA变性，将载玻片在孵育在80℃水中3分钟，然后浸入冰冷的100％乙醇30秒(最后一个序列来使寡核苷酸变性并保持这种方式)。一旦在锥形管中以500g离心3分钟干燥，载玻片就可以用于酶促合成。

使用如下循环过程来合成给定信息内容的DNA：

1.将重悬于25％乙醇(或可以使蒸发加快并保持核苷酸的溶解度的其它溶剂)的0.2微升所需核苷酸沉积于寡核苷酸点样点(spot)并于室温干燥(这将花费数分钟)。

2.将0.5-1微升NPU(配方如下)与干燥核苷酸一起沉积于各寡核苷酸点样点：

3.室温孵育后，将点样点用室温0.1％SDS洗涤一次，用水洗涤两次，并且干燥一次，准备好用于循环步骤的步骤1。

一旦序列已经合成，将DNA衔接体连接于延伸光核苷酸的3'端。连接在载玻片上过夜室温进行，通过在密封容器内用以下混合物将载玻片表面浸没以防止水分和氧气：

5P-cagtc-rS9-dd/5phos/CAGTC

AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA/3ddC/

通过0.1％SDS洗涤和两次水洗涤将该连接混合物由载玻片洗去，随后通过连接干燥。

样品可以通过将1微升下述USER混合物沉积来洗脱：

37℃孵育30分钟后，将样品转移到单独的管，并用50微升的10微摩尔Tris+0.001％吐温20溶液稀释。以诸如下述合适的引物在定量PCR中对5微升各反应物进行定量:

f-tS3 CTACACTCTTTCCCTACACGAC

f-ttS9 GTGACTGGAGTTCAGACGTG

其可以经适当扩增用于本领域技术人员已知的高通量测序平台，包括但不限于亿明达公司(Illumina)、太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)或牛津纳米孔公司(Oxford Nanopore)。

物理控制材料和方法的实验方案总结

根据本公开的示例性方案，起始物寡核苷酸首先固定在称之为起始物贴片的表面上，在该示例性实施方式中，是通过UV将DNA交联至玻璃表面。在将起始物拴系于固体支持物后，对表面进行处理以中和化学活性基团，如在该情形中的醛，并且增加疏水性。随后对预制的定制PDMS装置进行等离子体处理，以便将其与起始物贴片共价连接到载玻片。

使用氮泵推动含有酶混合物的水性团块(slug)(即离散体积)穿过一个通道，而含有洗剂溶液的油性团块(即离散体积)穿过另一个通道。调节泵速以获得约100微米长的水相团块，其被约1毫米长的有机相团块分离。各水性团块在起始物贴片上的停留时间通过改变泵速进行调节，同时保持水性通道和油性泵相同的相对速率。总反应时间为泵活动时穿过起始物贴片的各水性团块的所有停留时间的总和。

各所需反应时间后，可以评估起始物贴片上合成的DNA添加的核苷酸数量。通过成像，添加的核苷酸长度可以通过使用荧光核苷酸或荧光探针的杂交进行评估。在该示例性实施方式中，还可以将起始物贴片上合成的DNA通过使用USER(尿嘧啶特异性切割试剂)酶酶促释放，所述USER切割初始起始物寡核苷酸5'远端附近的尿嘧啶。然后通过流入试管来收集切割的DNA链。然后将这些链进行PCR扩增，并通过两种方法评估合成核苷酸的数量：在琼脂糖或PAGE凝胶上进行电泳以进行粗略的批量分析，并用下一代测序平台如亿明达公司、太平洋生物科学公司或牛津纳米孔公司进行测序，用于定量单分子分析。

具体方案

1.将玻璃载玻片用1M HCl振荡洗涤10分钟，用超纯水清洗两次，用丙酮洗涤5分钟，同时摇动，并风干。

2.在载玻片的背面，使用标记物标记放置起始物寡核苷酸的点样点。将寡核苷酸ctgac在PBS中稀释至5uM。将3uL该寡核苷酸溶液置于玻璃载玻片，并于60℃孵育直到干燥。

ctgac

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT/ideoxyU//ideoxyU/CGACGCTCTTCCGATCTCTGAC

3.使用UV Stratalinker 2400，寡核苷酸通过暴露于100uJ 6.5秒共价连接于玻璃。然后用0.1XSSC与0.2％SDS振荡洗涤载玻片5分钟，用水清洗1次，并于60℃干燥10分钟。

4.将预先铸造成含有100微米通道以及标准T形接头的PDMS掩模(图5中的图示)用氧等离子体以200毫瓦处理30秒并密封到载玻片上，使得寡核苷酸贴片将会在用于起始物的通道部分之下。

5.有机相为十六烷和AR-20硅油7：3的混合物(均购自西格玛公司(Sigma))。使用空气泵以10兆帕斯卡的背压连续泵送该有机/洗涤溶液通过有机/洗涤输入口。

6.以下述组成来制备水性试剂：

15mM Tris-乙酸盐、35mM乙酸钾、7mM乙酸镁、1U/uL TdT酶、0.01％曲通X-100、1mMCy5-dATP，pH＝8.0。

另一个空气泵用于连续泵送该水性试剂溶液通过装置上的水/试剂输入口。

7.因此，不断生成约100微米长的水相团块，其被约1毫米长的有机相团块分离。通过分别增加或减少系统中泵生成的总压强，可以增加或减少这些水性团块在起始物贴片上的总停留时间。与起始物贴片发生接触的团块数量可以通过泵工作的总时间进行控制。

8.在实验结束时，用2XSSC洗涤通道。

9.起始物贴片上聚合的量通过使用倒置荧光显微镜对Cy5通道内装置的起始物贴片进行成像来评估。

该实验的结果显示，通过各团块添加至起始物的核苷酸的平均数量可以通过改变起始物贴片与各团块的暴露时间来控制，如通过总荧光强度所测量。

化学控制材料和方法的实验方案总结

根据本公开的示例性方案，起始物寡核苷酸首先固定在表面上，例如，通过使用5'修饰的寡核苷酸固定在醛官能化的玻璃载玻片上。在将起始物拴系于固体支持物后，对表面进行处理以中和化学活性基团，如在该情形中的醛，并且增加疏水性。

制备下述浓度或类型的溶剂(如水或乙醇)中的核苷酸稀释物：

7-去氮-7-溴-dATP、7-丙炔基-dUTP、dCTP和dGTP的0、15.625、31.25、62.5、125、250、500和1000uM稀释物。

用液体处理机器人将这些核苷酸各自印刷于寡核苷酸点样点，然后印刷含有TdT(末端脱氧核苷酸转移酶)和腺苷三磷酸双磷酸酶的酶促混合物。在寡核苷酸、印刷的核苷酸和印刷酶促混合物之间特定的反应时间后，洗涤载玻片并将末端寡核苷酸连接到合成的DNA上以允许随后的扩增。

在该示例性实施方式中，通过使用切割初始起始物寡核苷酸5'远端附近的尿嘧啶的USER(尿嘧啶特异性切割试剂)酶，合成的DNA链各自从固体支持物表面释放。然后将这些链进行PCR扩增，并通过两种方法评估合成核苷酸的数量：在琼脂糖或PAGE凝胶上进行电泳以进行粗略的批量分析，并用下一代测序平台如亿明达公司、太平洋生物科学公司或牛津纳米孔公司进行测序，用于定量单分子分析。

具体方案

1.将下述寡核苷酸重悬于1X微点样溶液(ArrayIt)：

5Am12-ctgac

/5AmMC12/TTTTTTTTTT/ideoxyU//ideoxyU/

CTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT CTGAC。

2.将上述寡核苷酸聚合物点样于一个醛涂覆的载玻片。然后在60℃孵育该载玻片1小时。

3.然后用水洗涤该载玻片一次，用0.1％SDS+1mM TrisHCl洗涤一次，并在水中再洗涤3次。

4.为了还原席夫碱和未反应的醛，制备0.15g NaBH₄的35mL PBS溶液。NaBH₄溶解后，向溶液添加15mL 100％。将该载玻片在该溶液中孵育15分钟。

5.为了使DNA变性，将载玻片在孵育在约80℃水中3分钟，然后浸入冰冷的100％乙醇30秒(最后一个序列来使寡核苷酸变性并保持这种方式)。

6.通过500g离心3分钟干燥载玻片。

7.制备25％乙醇中的7-去氮-7-溴-dATP、7-丙炔基-dUTP、dCTP和dGTP的0、15.625、31.25、62.5、125、250、500和1000uM稀释物。

8.用液体处理机器人将2μl各核苷酸浓度的液滴打印于寡核苷酸采样点，并在室温(RT)干燥数分钟。

9.将5μl这样的酶促混合物液滴沉积于具有干燥核苷酸的各点样点：

15mM Tris-乙酸盐、35mM乙酸钾、7mM乙酸镁、1U/μL TdT酶、0.001U/μL腺苷三磷酸双磷酸酶，pH＝8.0。

10.室温孵育4分钟后，用室温0.1％SDS洗涤载玻片一次并用水洗涤两次，然后用离心再次干燥。

11.用下述混合物以室温在载玻片上过夜进行连接：

50mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、1mM DTT、1mM ATP、25％PEG 8K、1μM 5P-cagtc寡核苷酸、0.8U/μl T4RNA连接酶1，pH＝7.5，

其中所述寡核苷酸5P-cagtc具有如下序列：

5phos/CAGTC AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA

12.通过0.1％SDS洗涤连接混合物，并用水洗涤两次。通过离心干燥该载玻片。

13.使用1.0ul USER混合物在37C洗脱样品30分钟：

10mM Tris-HCl pH＝8,0.2U/μL UDG酶，0.5U/μL内切核酸酶VIII酶。

14.用S1和S2作为引物在反应中扩增2μL各模板：

S1 CTACACTCTTTCCCTACACGAC

S2 GTGACTGGAGTTCAGACGTG。

15. 5μl的各PCR产物在4％琼脂糖凝胶上运行(如图6所示)。

这些结果说明腺苷三磷酸双磷酸酶在各反应中有效限制了通过TdT延伸的平均量。此外，用于反应的核苷酸的量可以用于调整这些延伸的量。

16.将0.5μl的PCR产物与NEBNext双标引引物组合(Dual Indexing Primer Set)用于第二PCR，并以100bp单个读数在亿明达MiSeq上测序。

根据亿明达MiSeq读数的分析，针对各核苷酸类型和浓度对添加于寡核苷酸起始物的核苷酸数量以及针对各核苷酸类型和浓度接收核苷酸非零(nonzero)添加的寡核苷酸起始物数量进行定量(参见图7和图8)，其中0-7各碱基(即A0至A7)对应给定核苷酸浓度增加。

通过pH调节TdT酶促活性

这些实验的目的是确定TdT在其中具有活性的pH范围。

1.制备50mM Tris(碱)和50mM硼酸的缓冲液，并使用乙酸和氢氧化钠将其pH(初始约为8.5)调整为6.05、6.9、7.93、8.96、10.02和11.07。这些缓冲液在实验中作为2X缓冲液。

2.延伸反应如下组成：

3.孵育各反应物15分钟，然后与未延伸的起始物上样至TBE-尿素凝胶用于比较。

如图13所示，TBE-尿素凝胶中的结果明确，pH可以用于以适合基于pH的数据存储TdT控制的方式调节TdT酶的活性。还需要明确的是pH对TdT的作用是可逆的；也就是说，酶的活性在不适宜的pH下可以大幅度降低，但是在适宜的pH下可以返回正常活性。进行后续实验以研究该问题。

在下述实验中，将TdT在没有核苷酸或起始物的情况下在一pH下孵育15分钟，然后将其与核苷酸和起始物以这样的方式组合，所述方式的混合物在聚合期间的最终pH将与初始15分钟孵育的pH不同。

1.制备50mM Tris(碱)和50mM硼酸的缓冲液，并使用乙酸和氢氧化钠将其pH(初始约为8.5)调整为6.05、6.9、7.93、8.96、10.02和11.07。这些缓冲液在实验中作为2X缓冲液。

2.延伸反应以两部分组成：

部分1：

部分2：

8个不同的延伸反应以针对部分1和部分2中缓冲液的下述pH进行：

3.各反应的两个部分都孵育15分钟，然后将其混合以形成总计20μl，然后上样至TBE-尿素凝胶。

如图14所示，TdT在高于6且低于11的pH范围具有高度活性，并且其在低于6且高于11的pH范围内基本上失活。由该实验清楚地看出，TdT的酶促活性可以通过升高和降低pH进行可逆地抑制。TdT酶促活性的抑制在pH约为11时比在pH约为6时更有效。

例如，如图14中泳道A和I所示，起始pH分别为6和11时，酶显示很少甚至没有聚合活性。泳道B和C显示当将酶保持在pH＝6时，其可以通过增加pH至更碱性的值活化。泳道G和H显示当将酶保持在pH＝11时，其可以通过降低pH至更酸性的值活化。由于酶在pH＝6或pH＝11时显然不会不可逆地变性，因此清楚地看出pH对酶促活性的影响是可逆的，并且可以通过改变pH被使酶多次活化或失活。因此，证明了可以通过将反应溶液的pH变为11或更高使TdT可逆地失活。具体地，酶在6-10的pH时具有高度活性并且在大于11的pH时基本上不具有活性，但是一旦pH降低回6-10范围内，可以被再次活化。

下述经修饰的核苷酸类似物与起始物寡核苷酸测试：5-羟基-dCTP(hdCTP)、5-羟甲基-dCTP(hmdCTP)、5-溴-dCTP(BrdCTP)、5-碘-dCTP(IdCTP)和5-甲基-dCTP(5m-dCTP)。待使用的核苷酸和其相应的最终浓度为hdCTP：0、2、4、8、16、32uM；hmdCTP：0、2、4、8、16、32uM；BrdCTP：0、2、4、8、16、32uM；IdCTP：0、2、4、8、16、32uM；和5mdCTP：0、2、4、8、16、32uM。反应终止溶液STOP&LOAD制备为含有20mM EDTA的20ul Novex 2X TBE-尿素上样缓冲液。对于各反应，将16ul反应溶液以如下所述制备为主混合物：3μl水；10μl 2X反应缓冲液；2μl 1uM引物；1μl TdT酶促混合物；16ul总体积。然后将各混合物与下述组分以特定顺序混合：dNTP(各种4X浓度)为4.0μl。所有的反应在22℃进行。对于各反应，16ul的反应混合物与4.0ul的dNTP混合。孵育5分钟后，20ul的STOP&LOAD与反应物混合。将所有样品在75℃孵育5分钟，然后在冰上冷却。将9ul每种上样混合物上样至15％TBE-尿素凝胶。凝胶在1X TBE中以180V运行90分钟。运行后，凝胶在1X TBE中的1X SybrGold中进行15分钟染色，用1X TBE清洗一次，并以SybrGold通道中5秒暴露在GelDoc上成像。图15是显示5BR-dCTP和5I-dCTP结果的凝胶图像。图16是显示5h-dCTP和5hm-dCTP结果的凝胶图像。图17是显示5m-dCTP和dCTP结果的凝胶图像。

其他实施方式

其他实施方式对于本领域技术人员而言将是显而易见的。应当理解的是，前述仅为了清楚描述而提供，并且仅仅是示范性的。本发明的精神和范围并不限于上述示例，而是被所述权利要求所包括。本文中应用的所有公开、专利和专利申请通过引用全文纳入本文用于所有目的，就如同各公开、专利被具体地且单独地说明通过引用纳入本文一样。

Claims (16)

1.一种制备多核苷酸的方法，其包括：

（a）将选定的核苷酸三磷酸、阳离子、非模板依赖性DNA聚合酶以及核苷酸三磷酸失活酶在支持物表面的反应位点组合，所述反应位点包括与其连接并且具有3'末端核苷酸的起始物序列，其中反应试剂以选定浓度存在，并且处于共价添加一个或多个选定的核苷酸三磷酸至所述3'末端核苷酸从而使所述选定的核苷酸三磷酸成为3'末端核苷酸的条件下，并且处于使游离核苷酸三磷酸失活直至游离的核苷酸三磷酸基本失活的条件下，其中所需数量的所述选定的核苷酸被添加于所述起始物序列，

（b）重复步骤（a）直到形成所述多核苷酸。

2.如权利要求1所述的方法，其中，核苷酸三磷酸失活酶为核苷酸三磷酸降解酶。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸三磷酸失活酶为核苷酸三磷酸降解酶，其以比通过所述非模板依赖性DNA聚合酶添加核苷酸的速率慢的速率降解核苷酸三磷酸。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸三磷酸失活酶为核苷酸三磷酸降解酶，其存在的浓度使其降解核苷酸三磷酸的速率比通过由所述非模板依赖性DNA聚合酶存在的浓度确定的添加核苷酸的速率慢。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸三磷酸失活酶包括ATP二磷酸水解酶、dNTP焦磷酸酶、dNTP酶。

6.如权利要求1所述的方法，其中，调节所述核苷酸三磷酸失活酶的浓度以控制一种或多种核苷酸的添加。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸三磷酸失活酶使游离的核苷酸三磷酸失活。

8.如权利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸三磷酸失活酶通过降解使游离的核苷酸三磷酸失活。

9.如权利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸三磷酸失活酶通过将游离的核苷酸三磷酸彼此之间聚合使所述游离的核苷酸三磷酸失活。

10.如权利要求1所述的方法，其中，所述反应条件呈现添加游离的核苷酸三磷酸至所述起始物序列与降解游离的核苷酸三磷酸之间的竞争反应。

11.如权利要求1所述的方法，其中，将所述选定的核苷酸三磷酸添加至所述反应位点，所述反应位点包含具有末端核苷酸的所述起始物序列、所述非模板依赖性DNA聚合酶和所述核苷酸三磷酸失活酶。

12.如权利要求1所述的方法，其中，将所述非模板依赖性DNA聚合酶和所述核苷酸三磷酸失活酶添加至所述反应位点，所述反应位点包含具有末端核苷酸的所述起始物序列，以及所述选定的核苷酸三磷酸。

13.如实施方式1所述的方法，其中，在其中所述聚合酶为失活的条件下，将所述核苷酸三磷酸失活酶添加至所述反应位点，所述反应位点包含具有末端核苷酸的所述起始物序列、所述非模板依赖性DNA聚合酶和所述选定的核苷酸三磷酸，并且其中所述聚合酶在添加所述核苷酸三磷酸失活酶后活化。

14.如权利要求1所述的方法，其中，重复步骤（b）数次，然后将所述反应试剂从所述反应位点去除并向所述反应位点提供额外的反应试剂。

15.如权利要求12所述的方法，其中，各轮添加后，将所述反应试剂从所述反应位点去除并向所述反应位点提供额外的反应试剂。

16.如权利要求13所述的方法，其中，各轮添加后，将所述反应试剂从所述反应位点去除并向所述反应位点提供额外的反应试剂。

Images