CN109311994B - 抗足糖萼蛋白抗体及其使用方法 - Google Patents

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M.R.休斯
D.C.赫奈斯
K.O.布利克斯特
J.S.巴布库克
C.J.邦德
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J.P.贝里奎斯特
K.G.麦克唐纳
A.冯罗苏姆
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Abstract

本发明涉及抗足糖萼蛋白抗体、包含抗足糖萼蛋白抗体的组合物及使用此类抗体和组合物预防、诊断和治疗癌症的方法。

Description

抗足糖萼蛋白抗体及其使用方法
相关申请案的引用
本申请要求2015年10月1日提交的美国临时专利申请序列号62/236,130和2015年10月21日提交的美国临时专利申请序列号62/244,644以及2016年2月4日提交的美国临时专利申请序列号62/291,262的权益，据此将其通过引用并入用于所有目的，如同本文全面阐述一样。
发明领域
本发明涉及癌症领域，并且涉及用于预防、诊断和治疗癌症的组合物和方法。
发明背景
足糖萼蛋白(podocalyxin)，一种唾液酸糖蛋白，被认为是足细胞糖萼的主要成分。它是跨膜唾液黏蛋白的CD34家族的成员(Nielsen JS，McNagny KM(2008).J of CellScience 121(Pt 22)：3682-3692)。它包被足细胞的第二足突。它带负电荷，并因此可以起到保持相邻足突分离，从而保持尿液过滤屏障打开。小鼠敲除研究进一步支持了这一功能，其揭示了在足细胞形态发生中至关重要的作用(Doyonnas R.等人(2001)J Exp Med 194(1)：13-27；Nielsen JS，McNagny KM(2009).J Am Soc Nephrol 20(10)：1669-76)。足糖萼蛋白在许多癌症中也上调并且在包括乳房(Somasiri等人)、卵巢癌、结直肠癌、膀胱癌和肾细胞癌以及成胶质细胞瘤在内的许多癌症中经常与不良预后相关(Nielsen JS，McNagnyKM(2009).同上；Somasiri A等人(2004).Cancer Res 64(15)：5068-73；Huntsman等人U.S.20100061978A1)；Binder等人，PLOS ONE，8：10 e75945(2013)，Hsu等人，Am J Pathol176(6)：3050-61，Cipollone等人，Clin Exp Metasatasis 29(3)：239-252，Kaprio等人，BMC Cancer 14：493，Binder等人，PLoS One 8(10)：e75945，Boman等人，Br JCancer 108(11)：2321-8。事实上，抗粘附素足糖萼蛋白的过度表达可以是乳腺癌进展的独立预测因子(Somasiri等人Cancer Res.2004年8月1日；64(15)：5068-73)。
由结肠癌细胞表达的足糖萼蛋白的唾液酸化、O-糖基化糖型具有L-选择蛋白和E-选择蛋白结合活性，并且似乎与结肠癌细胞的转移相关(Thomas SN等人(2009年3月).Am JPhysiol Cell Physiol 296(3)：C505-13；Konstantopoulos K等人(2009).Annu RevBiomed Eng 11：177-202；Thomas SN等人(2009).Biorheology 46(3)：207-25)。另外，已有报道称足糖萼蛋白是肿瘤转移的预后指标(McNagny等人美国专利第7,833,733号)，并且可以调节癌细胞生长(Hunstman等人U.S.2010/0061978)。因此，对于癌症治疗需要足糖萼蛋白的拮抗剂。
发明概述
一方面，本发明提供了抗足糖萼蛋白抗体，包括其片段，以及使用抗足糖萼蛋白抗体，例如用于预防、诊断和治疗癌症的方法。
在一个实施方案中，本发明的抗足糖萼蛋白抗体与足糖萼蛋白肿瘤表位结合。如本文所用，“足糖萼蛋白肿瘤表位”是指由下述抗体结合的表位，所述抗体包含含有SEQ IDNO：27的重链可变区和含有SEQ ID NO：29的轻链可变区。
在一个实施方案中，足糖萼蛋白肿瘤表位包含足糖萼蛋白多肽的翻译后修饰。在一个实施方案中，足糖萼蛋白多肽的翻译后修饰包含唾液酸化O-糖基部分。在一个实施方案中，足糖萼蛋白多肽的翻译后修饰包含连接至足糖萼蛋白的O-连接的聚糖部分。在一个实施方案中，足糖萼蛋白多肽的翻译后修饰包含含有β-N-乙酰半乳糖胺的聚糖部分。在一个实施方案中，β-N-乙酰半乳糖胺是末端β-N-乙酰半乳糖胺。
因此，在一个实施方案中，本发明的抗足糖萼蛋白抗体结合是足糖萼蛋白的翻译后修饰的部分。在一个实施方案中，本发明的抗足糖萼蛋白抗体结合与足糖萼蛋白附接的唾液酸化O-糖基部分。在一个实施方案中，本发明的抗足糖萼蛋白抗体结合与足糖萼蛋白连接的O-连接的聚糖部分。在一个实施方案中，本发明的抗足糖萼蛋白抗体结合连接至足糖萼蛋白的聚糖部分，其中聚糖部分在其末端具有β-N-乙酰半乳糖胺。
在一个实施方案中，本发明提供了与包含含有SEQ ID NO：27的重链可变区和含有SEQ ID NO：29的轻链可变区的抗体竞争结合足糖萼蛋白表位的抗足糖萼蛋白抗体。
本发明的抗足糖萼蛋白抗体包括例如单克隆抗体、抗体片段(包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段)、双链抗体、单结构域抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体和竞争性抑制包含含有SEQ ID NO：27的重链可变区和含有SEQ ID NO：29的轻链可变区的抗体与足糖萼蛋白肿瘤表位的结合的抗体。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链可变区：GFSLSGYQ(SEQ ID NO：33)；GFSLSGY(SEQ ID NO：34)；和GYQMN(SEQ IDNO：35)。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链可变区：IWSDGGT(SEQ ID NO：36)；WSDGG(SEQ ID NO：37)；和YIWSDGGTDYASWAKG(SEQ ID NO：38)。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链可变区：AREGYWLGAFDP(SEQ ID NO：39)和EGYWLGAFDP(SEQ ID NO：40)。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链可变区：QSVHHKND(SEQ ID NO：42)和QSVHHKNDLA(SEQ ID NO：43)。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链可变区：YTS(SEQ ID NO：45)和YTSLAS(SEQ ID NO：46)。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体包含含有氨基酸序列AGVYEGSSDNRA(SEQID NO：48)的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体包含的重链可变区含有：选自SEQ ID NO：33-35的CDR1；选自SEQ ID NO：36-38的CDR2；和选自SEQ ID NO：39-41的CDR3。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体包含的轻链可变区含有：选自SEQ ID NO：42-44的CDR1；选自SEQ ID NO：45和46的CDR2；和由SEQ ID NO：48列出的CDR3。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体包含的重链可变区含有：选自SEQ ID NO：33-35的CDR1；选自SEQ ID NO：36-38的CDR2；和选自SEQ ID NO：39-41的CDR3；并且进一步包含的轻链可变区含有：选自SEQ ID NO：42-44的CDR1；选自SEQ ID NO：45和46的CDR2；和由SEQ ID NO：48列出的CDR3。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体包含的重链可变区包含由SEQ ID NO：33列出的CDR1，由SEQ ID NO：36列出的CDR2和由SEQ ID NO：39列出的CDR3；并且进一步包含的轻链可变区包含由SEQ ID NO：42列出的CDR1，由SEQ ID NO：45列出的CDR2和由SEQ ID NO：48列出的CDR3。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体包含的重链可变区包含由SEQ ID NO：34列出的CDR1，由SEQ ID NO：37列出的CDR2和由SEQ ID NO：40列出的CDR3；并且进一步包含的轻链可变区包含由SEQ ID NO：43列出的CDR1，由SEQ ID NO：46列出的CDR2和由SEQ ID NO：48列出的CDR3。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体包含的重链可变区包含由SEQ ID NO：35列出的CDR1，由SEQ ID NO：38列出的CDR2和由SEQ ID NO：41列出的CDR3；并且进一步包含的轻链可变区包含由SEQ ID NO：43列出的CDR1，由SEQ ID NO：46列出的CDR2和由SEQ ID NO：48列出的CDR3。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体包含的重链可变区包含：METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSGYQMNWVRQAPGKGLEWIGYIWSDGGTDYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCAREGYWLGAFDPWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO：27)。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体包含的轻链可变区包含：MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAAVLTQTPSPVSAAVGATVSVSCQSSQSVHHKNDLAWFQQKPGQPPKLLIYYTSTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCAGVYEGSSDNRAFGGGTEVVVK(SEQ ID NO：29)。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体包含含有SEQ ID NO：27的重链可变区和含有SEQ ID NO：29的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体是单克隆抗体。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体是抗体片段。
一方面，本发明提供了经CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞，其包含能够结合足糖萼蛋白肿瘤表位的嵌合抗原受体。
一方面，本发明提供了经CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞，其包含嵌合抗原受体，其中嵌合抗原受体包含抗足糖萼蛋白抗体的轻链可变区和抗足糖萼蛋白抗体的重链可变区。
一方面，本发明提供了经CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞，其包含抗足糖萼蛋白抗体。在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体是抗体片段。在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体是scFv。
一方面，本发明提供了一种抑制展示足糖萼蛋白肿瘤表位的细胞生长的方法，其包括使所述细胞与本发明的抗足糖萼蛋白抗体或经CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞接触。在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体以抗体-药物缀合物(ADC)的形式使用。
一方面，本发明提供了一种抑制展示足糖萼蛋白肿瘤表位的细胞增殖的方法，其包括使所述细胞与本发明的抗足糖萼蛋白抗体或经CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞接触。在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体以ADC形式使用。
一方面，本发明提供了一种诱导展示足糖萼蛋白肿瘤表位的细胞死亡的方法，其包括使所述细胞与本发明的抗足糖萼蛋白抗体或经CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞接触。在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体以ADC形式使用。
一方面，本发明提供了一种抑制展示足糖萼蛋白肿瘤表位的细胞分层的方法，其包括使所述细胞与本发明的抗足糖萼蛋白抗体或经CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞接触。在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体以ADC形式使用。
一方面，本发明提供了一种抑制包含展示足糖萼蛋白肿瘤表位的细胞的肿瘤血管化的方法，其包括使所述细胞与本发明的抗足糖萼蛋白抗体或经CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞接触。在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体以ADC形式使用。
在优选的方法中，展示足糖萼蛋白肿瘤表位的细胞是癌细胞。
一方面，本发明提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗足糖萼蛋白抗体或经CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞。在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体以ADC形式使用。
一方面，本发明提供了一种抑制患有癌症的受试者中的肿瘤转移的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗足糖萼蛋白抗体或经CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞。在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体以ADC形式使用。
一方面，本发明提供了一种减小患有癌症的受试者中的肿瘤大小的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗足糖萼蛋白抗体或经CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞。在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体以ADC形式使用。
在一个实施方案中，受试者是人类受试者。在一个实施方案中，癌症选自乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、成胶质细胞瘤、AML和ALL。
一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含抗足糖萼蛋白抗体和药学上可接受的载体。一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的经CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体以ADC形式使用。
一方面，本发明提供了制备抗足糖萼蛋白抗体的方法。一方面，本发明提供了制备本文公开的经CAR修饰的免疫细胞的方法。在一个实施方案中，本发明提供了制备包含抗足糖萼蛋白抗体的ADC的方法。
一方面，本发明提供了制备用于治疗癌症的药剂的方法。
一方面，本发明提供了确定受试者中或来自受试者的生物样品中足糖萼蛋白肿瘤表位的存在的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使样品与抗足糖萼蛋白抗体接触并确定抗足糖萼蛋白抗体与样品的结合，其中抗足糖萼蛋白抗体与样品的结合表明样品中足糖萼蛋白肿瘤表位的存在。
一方面，本发明提供了诊断受试者中的癌症的方法，其包括检测受试者中或来自受试者的生物样品中足糖萼蛋白肿瘤表位的存在。
在一个方面中，本发明提供了用于确定诊断患有癌症的受试者的预后的方法，其包括检测受试者中或来自受试者的生物样品中足糖萼蛋白肿瘤表位的存在。在一个实施方案中，所述方法涉及在受试者接受用于治疗癌症的治疗剂后，检测受试者中或来自受试者的生物样品中足糖萼蛋白肿瘤表位的存在。
本文还提供了试剂盒及其使用方法。
附图简述
图1显示人足糖萼蛋白同种型1和2的氨基酸序列-SEQ ID NO：31和32(登录号NP_001018121.1和NP_005388.2)。
图2，图A和B显示了抗足糖萼蛋白抗体抗Podo的重链可变区的核酸序列(SEQ IDNO：12)；重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)；轻链可变区的核酸序列(SEQ ID NO：14)；和轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)(参见实施例)。
图3是一组表格，展示了各种抗Podo抗体对各种表达足糖萼蛋白的细胞系的特异性。
图4，图A是提供了肿瘤和正常细胞系中的抗足糖萼蛋白抗体Podo447和Podo83的FACS特征数据的图。图B是显示响应于与骨髓基质或CoCl2共同培养，THP1细胞中Podo 447的FACS结合的图。
图5是提供Podo83和Podo447抗体的结合数据的表格。
图6，图A-D显示来自正常和恶性组织的代表性IHC染色。
图7是提供关于来自正常和恶性组织的IHC染色的数据的表格。
图8是一组显示使用流式细胞术对83和447抗Podo抗体进行的糖表位作图的图。
图9是一组显示使周蛋白质印迹对83和447抗Podo抗体进行的糖表位作图的图像。
图10是用于确定Podo447抗体识别足糖萼蛋白的新型翻译后修饰的竞争测定的图。
图11是显示响应于与骨髓基质细胞或CoCl2共同培养，OVCAR10细胞上PODO447的FACS结合的图。
图12是一组提供Podo447抗体药物缀合物在胰腺(MiaPaCa)、成胶质细胞瘤(A172)、乳房(MDA-MB231)和正常内皮(HUVEC)细胞上的细胞溶解活性数据的图。
图13是提供来自促进抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的人IgG1嵌合Podo447抗体的数据的图。
图14是展示Podo447缀合物被有效内化并杀伤THP-1 AML细胞系的图。
图15是提供在特定效应物与靶标比率下Podo447对NK细胞溶解活性的增强的量化的图。
图16是展示Podo447未杀伤MDA-MB231或Jurkat细胞的图。
图17是展示Podo447未杀伤正常HUVEC细胞的图。
图18是包含Podo447的重链和轻链结合结构域的两种不同CAR T细胞构建体的示意图。
图19是显示MIA PaCa细胞中PODO 447特异性结合丧失的图，其中PODXL基因表达已用siRNA敲低。
图20是显示MDA-MB231乳腺癌细胞中PODO 447特异性结合丧失的图，其中PODXL基因表达已被shRNA敲低。
图21是显示PANC-1胰腺癌细胞上PODO447和PODO83抗体的FACS结合特性的图。
图22是显示CFPAC-1胰腺癌细胞上PODO447和PODO83抗体的FACS结合特性的图。
图23是总结在有和无内源性足糖萼蛋白转录产物敲低的肿瘤细胞系中PODO447和PODO83的结合的表格。
图24用PODO-CAR对NK-92的慢病毒转导简言之，在补充有12.5％胎牛血清和12.5％马血清的α最小基本培养基中，用100IU/ml的IL-2和8μg/ml聚凝胺培养100,000个NK-92细胞。将空载体对照或含PODO-CAR的慢病毒载体以5∶1的感染复数添加到培养物中。将培养物以1,000x g旋转感染99分钟，并在FACS分选GFP阳性细胞之前培养72小时。在FACS分选后7天使用抗mycTag抗体(1∶100稀释度)通过流式细胞术在NK-92活细胞中检验PODO447靶向臂的表面表达。
图25PODO-CAR导致细胞毒活性。GFP载体和PODO-CAR CD4+T细胞与用细胞增殖染料eFluor 670(CPD)标记的PODO 447+A-172细胞以所示比率共同培养24小时。A)显示碘化丙啶(PI)染色(在CPD+GFP-细胞上门控)的代表图并且B)显示特异性细胞死亡。
图26PODO-CAR在CD4和CD8T细胞表面表达。GFP载体和PODO-CAR CD3+ T细胞在黑暗中用抗-CD4(OKT4)-VB241、抗-CD8(SK1)-APCCy7、抗Myc-Tag-Alexa-647和PI染色15分钟。在BD-LSR Fortessa上通过流式细胞术分析测定表面表达。图显示在(PI阴性)活细胞上门控的转导2.5周后的表面表达。
图27用酶处理的A172细胞(活细胞)或用酶处理的裂解物(变性的)。
图28 A172细胞。1.用podo447抗体拉下足糖萼蛋白。2.在变性条件下用酶处理足糖萼蛋白。3.用(a)3d3足糖萼蛋白抗体(不与podo447抗体竞争的抗体)，(b)podo447抗体进行凝胶电泳和印迹。
图29糖表位作图。Podo447(A)和对照抗体IgG1κ(B)的聚糖微阵列(v3.1)分析。Podo447与末端GalNAc单糖和寡糖#006、#025、#106、#107、#263和#389积极结合。Sp2：2个氨基-乙基；spe：氨基-丙基；sp10：PEG2接头；DD：未知缀合物。
图30通过流式细胞术测定的A172结合。人源化和兔/人嵌合Podo447抗体结合内源性表达足糖萼蛋白的A172细胞。
发明详述
I.一般技术
除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在文献中有全面解释，例如“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第二版(Sambrook等人，1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编辑，1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney编辑，1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press，Inc.)；“CurrentProtocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等人编辑，1987，及定期更新)；“PCR：ThePolymerase Chain Reaction”，(Mullis等人编辑，1994)；“A Practical Guide toMolecular Cloning”(Perbal Bernard V.，1988)；“Phage Display：A LaboratoryManual”(Barbas等人，2001)。
本领域技术人员将认识到可用于本发明实践中的与本文所述相似或等同的许多方法和材料。实际上，本发明不以任何方式限于所描述的方法和材料。为了本发明的目的，以下术语定义如下。
II.定义
为了解释本说明书，以下定义将适用并且在适当时，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。如果示出的任何定义与通过引用并入本文的任何文件发生冲突，则以下面示出的定义为准。
除非另有说明，否则术语“足糖萼蛋白”，如本文中所用，是指来自任何脊椎动物来源的任何天然足糖萼蛋白，脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人、灵长类动物和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。足糖萼蛋白分子也称为足糖萼蛋白样蛋白1、PC、PCLP1、gp135、MEP21和血栓粘蛋白(thrombomucin)。人足糖萼蛋白由对应登录号NM_001018111.2和NM_005397.3的核苷酸序列编码。足糖萼蛋白的同种型包括558个氨基酸的多肽(登录号：NP_001018121.1)和526个氨基酸的多肽(登录号NP_005388.2)。
术语“足糖萼蛋白”涵盖“全长”、未加工的足糖萼蛋白以及由细胞中加工产生的任何形式的足糖萼蛋白。该术语还涵盖天然存在的足糖萼蛋白变体，例如剪接变体、等位基因变体和同种型。本文描述的足糖萼蛋白多肽可从多种来源，诸如从人组织类型或从另一来源分离，或通过重组或合成方法制备。人足糖萼蛋白的氨基酸序列包括对应SEQ ID NO：31或32的序列(图1)。“天然序列足糖萼蛋白多肽”包含具有与源自自然界的相应足糖萼蛋白多肽相同的氨基酸序列的多肽。此类天然序列足糖萼蛋白多肽可以从自然界分离或可以通过重组或合成方式产生。术语“天然序列足糖萼蛋白多肽”具体涵盖特定足糖萼蛋白多肽天然存在的截短或分泌形式(例如细胞外结构域序列)，该多肽天然存在的变体形式(例如，可选剪接形式)和天然存在的等位基因变体。在本发明的某些实施方案中，本文公开的天然序列足糖萼蛋白多肽是包含附图所示全长氨基酸序列的成熟或全长天然序列多肽。尽管附图中公开的足糖萼蛋白多肽显示以本文在图中指定为氨基酸位置1的甲硫氨酸残基开始，但可以想象并且可能的是图中位于氨基酸位置1上游或下游的其它甲硫氨酸残基可以用作足糖萼蛋白多肽的原始氨基酸残基。
如本文所用，术语“足糖萼蛋白肿瘤表位”，在本文中还可互换地称为“足糖萼蛋白表位”，是指包含含有包含SEQ ID NO：27的重链可变区和含有SEQ ID NO：29的轻链可变区的抗体所结合的表位。一种此类抗体，在本文中称为Podo447抗体，具有本文例如实施例3说明的结合特征。例如A172细胞、人成胶质细胞瘤细胞系以及黑素瘤细胞的表面上，展示出足糖萼蛋白肿瘤表位。发现足糖萼蛋白瘤肿瘤表位与正常细胞相比在某些细胞类型的癌性形式中富集或对其有特异性。发现足糖萼蛋白肿瘤表位与疾病阶段(例如黑素瘤)相关。可以通过与包含含有SEQ ID NO：27的重链可变区和含有SEQ ID NO：29的轻链可变区的抗体竞争结合足糖萼蛋白表位(例如，如A172细胞上展示的那样)的能力来鉴定本发明的抗足糖萼蛋白抗体。
在一个实施方案中，足糖萼蛋白肿瘤表位包含足糖萼蛋白多肽的翻译后修饰。在一个实施方案中，足糖萼蛋白多肽的翻译后修饰包含唾液酸化O-糖基部分。在一个实施方案中，足糖萼蛋白多肽的翻译后修饰包含连接至足糖萼蛋白的O-连接的聚糖部分。在一个实施方案中，足糖萼蛋白多肽的翻译后修饰包含含有β-N-乙酰半乳糖胺的聚糖部分。在一个实施方案中，β-N-乙酰半乳糖胺是末端β-N-乙酰半乳糖胺。
因此，在一个实施方案中，本发明的抗足糖萼蛋白抗体结合是足糖萼蛋白的翻译后修饰的部分。在一个实施方案中，本发明的抗足糖萼蛋白抗体结合与足糖萼蛋白附接的唾液酸化O-糖基部分。在一个实施方案中，本发明的抗足糖萼蛋白抗体结合与足糖萼蛋白连接的O-连接的聚糖部分。在一个实施方案中，本发明的抗足糖萼蛋白抗体结合连接至足糖萼蛋白的聚糖部分，其中聚糖部分在其末端具有β-N-乙酰半乳糖胺。
如本文所用，氨基酸残基/位置的“修饰”是指与原始氨基酸序列相比一级氨基酸序列的变化，其中所述变化由涉及所述氨基酸残基/位置的序列改变产生。例如，典型的修饰包括用另一个氨基酸取代残基(或在所述位置)(例如保守性或非保守性取代)，邻近所述残基/位置插入一个或多个(通常少于5或3个)氨基酸，及所述残基/位置的缺失。“氨基酸取代”或其变型是指用不同氨基酸残基置换预定(原始)氨基酸序列中的现有氨基酸残基。通常并且优选地，与包含原始(或“野生型”)氨基酸序列的多肽相比，修饰导致变体多肽至少一种物理生物化学活性的改变。例如，就抗体而言，改变的物理生物化学活性可以是结合亲和力、结合能力和/或对靶分子的结合效应。
术语“抗体”从最广义上使用并且具体包括例如，单个抗足糖萼蛋白单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整单克隆抗体)，具有多表位特异性的抗足糖萼蛋白抗体组合物，多克隆抗体，多价抗体，由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要它们表现出所需生物学活性)，单链抗足糖萼蛋白抗体和抗足糖萼蛋白抗体片段(参见下文)，包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段，双链抗体，单结构域抗体(sdAb)，只要它们表现出所需生物学或免疫学活性。抗足糖萼蛋白抗体并且尤其是片段中还包括可以用作靶向臂，针对CAR-T细胞或CAR-NK细胞的嵌合抗原受体中的足糖萼蛋白肿瘤表位的抗足糖萼蛋白抗体的部分(以及抗足糖萼蛋白抗体的部分的组合，例如scFv)。此类片段不一定是蛋白水解片段，而是可赋予靶标亲和力的多肽序列的部分。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文可与抗体互换使用。抗体可以是例如人类的、人源化和/或亲和力成熟的。
术语“抗足糖萼蛋白抗体”、“足糖萼蛋白抗体”和“结合足糖萼蛋白的抗体”可互换使用。抗足糖萼蛋白抗体优选能够以足够的亲和力结合，使得该抗体可用作诊断剂和/或治疗剂。
在一个实施方案中，足糖萼蛋白抗体在本文中用于具体指抗足糖萼蛋白单克隆抗体，其(i)包含SEQ ID NO：27的重链可变结构域(图2)和/或SEQ ID NO：29的轻链可变结构域(图2)；或(ii)包含表3所示的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。
“分离的抗体”是已经从其天然环境的组分中鉴定并分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是会干扰抗体治疗用途的物质，并且可能包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。
4链抗体基本单元是主要由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚糖蛋白。就IgG而言，4链单元通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两条H链根据H链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。每条H链和L链还具有规律间隔的链内二硫桥。每条H链在N-端具有可变结构域(VH)，接着是α链和γ链各自的三个恒定结构域(CH)，以及μ和ε同种型的四个CH结构域。每条L链在N-端具有可变结构域(VL)，接着是在其另一端的恒定结构域(CL)。VL与VH对齐并且CL与重链的第一恒定域(CH1)对齐。据信特定氨基酸残基会在轻链与重链可变结构域之间形成界面。VH和VL配对在一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别的抗体的结构和性质，参见例如Basic andClinical Immunology，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编)，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994年，第71页和第6章。
来自任何脊椎动物物种的L链可基于其恒定结构域的氨基酸序列分配为两种明显不同类型(称为κ和λ)中的一种。根据其重链(CH)恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分配为不同的类别或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于CH序列和功能上相对小的差异，将γ和α类进一步分成亚类，例如，人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以称为“VH”或“VH”。轻链的可变结构域可以称为“VL”或“VL”。这些结构域通常是抗体中变化最大的部分并且含有抗原结合位点。
术语“可变”是指下述事实，即在抗体间可变结构域的某些区段在序列上广泛不同。V结构域介导抗原结合并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变结构域的110个氨基酸跨度上不均匀分布。相反，V区由称为框架区(FR)的15-30个氨基酸的相对不变的区段组成，被称为“高变区”的各9-12个氨基酸长的极端可变性较短区域间隔。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，主要采用β-折叠构型，通过三个高变区连接，这三个高变区形成连接并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。每条链中的高变区通过FR紧密靠近在一起，并与来自另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，PublicHealth Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))。
“完整”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双链抗体；线性抗体(参见美国专利第5,641,870号，实施例2；Zapata等人，Protein Eng.8(10)：1057-1062[1995])；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点并因此保留了结合抗原的能力。抗足糖萼蛋白抗体片段中还包括可以用作靶向臂，针对CAR-T细胞或CAR-NK细胞的嵌合抗原受体中的足糖萼蛋白肿瘤表位的抗足糖萼蛋白抗体的部分(以及抗足糖萼蛋白抗体的部分的组合，例如scFv)。此类片段不一定是蛋白水解片段，而是可赋予靶标亲和力的多肽序列的部分。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的称为“Fab”片段的抗原结合片段和残留的“Fc”片段(反映能够容易结晶的名称)。Fab片段由整条L链连同H链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一个恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段就抗原结合而论是单价的，即具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生单个大的F(ab′)2片段，其大致对应于两个具有二价抗原结合活性的二硫化物连接的Fab片段且仍然能够交联抗原。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基端具有额外的少量残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文对其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab′的名称。F(ab′)2抗体片段最初是作为在Fab′片段之间具有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段产生的。还已知抗体片段的其它化学偶联。
Fc片段包含通过二硫化物结合在一起的两条H链的羧基端部分。抗体的效应功能由Fc区中的序列确定，该区也是某些细胞类型上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。
“Fv”是含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价缔合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可以呈类似于双链Fv种类的“二聚体”结构缔合。由这两个结构域的折叠产生六个高变环(各自来自H和L链的3个环)，其贡献氨基酸残基用于抗原结合并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原有特异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得sFv能够形成抗原结合所需的结构。sFv的综述，参见Pluckthun，于The Pharmacology of MonoclonalAntibodies中，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)；Borrebaeck 1995，下文。在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体来源的scFv用作本文公开的CAR-T细胞或CAR-NK细胞的靶向臂。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同源的抗体群获得的抗体，即除了可能少量存在的可能天然存在的突变之外，构成该群的单个抗体是相同的。单克隆抗体针对单个抗原位点具高度特异性。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除其特异性之外，单克隆抗体的优点在于可以合成而不被其它抗体污染。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等人，Nature，256：495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可以使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见例如美国专利第4,816,567号)。也可以使用例如Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体中分离“单克隆抗体”。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”，在本文中使用时，是指在序列上是高变的和/或形成结构限定的环的抗体可变结构域的区域。通常，抗体包含六个高变区；VH中有三个(H1、H2、H3)，并且VL中有三个(L1、L2、L3)。许多高变区描绘正在使用中并包含在本文中。Kabat互补决定区(CDR)基于序列可变性并且是最常用的(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))。而Chothia是指结构环的位置(Chothia and LeskJ.Mol.Biol.196：901-917(1987))。Chothia CDR-H1环的末端在使用Kabat编号规则规定编号时，根据环的长度在H32和H34之间变化(这是因为Kabat编号方案将插入置于H35A和H35B处；如果35A和35B都不存在，则环结束于32处；如果只有35A，则环结束于33处；如果35A和35B都存在，则环结束于34处)。AbM高变区代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并且通过Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触”高变区是基于对可用复杂晶体结构的分析。来自这些高变区中的每一个的残基如下所述。
Figure BDA0001680380570000191
高变区可以包含如下的“延伸高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97(L3)和VH中的26-35B(H1)、50-65、47-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变结构域残基根据Kabat等人，同上进行编号。
“框架”或“FR”残基是除了本文定义的高变区残基之外的那些可变区残基。
术语“按照Kabat的可变结构域残基编号”或“按照Kabat的氨基酸位置编号”及其变型是指Kabat等人用于抗体汇编的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有更少或附加的氨基酸，其对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可以包括在H2的残基52之后的单个氨基酸插入物(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后插入的残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。对于给定抗体而言可以通过在抗体序列同源区与“标准”Kabat编号序列的比对来确定残基的Kabat编号。
当提及可变结构域中的残基(大致为轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如Kabat等人，Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1991))。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，Kabat等，上文中报道的EU索引)。“Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。除非本文另有说明，否则提及抗体可变结构域中残基编号意指由Kabat编号系统进行残基编号。
“封闭”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物学活性的抗体。优选的封闭抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物学活性。在一个实施方案中，提供了抗足糖萼蛋白抗体，其是拮抗剂抗体。
“结合”目标抗原或表位的抗体是以明显不同于非特异性相互作用的足够亲和力结合抗原或表位的抗体。例如，可以通过测定分子的结合与对照分子的结合相比来测量特异性结合，所述对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。
抑制肿瘤细胞生长的抗体是导致对癌细胞可测量的生长抑制的抗体。在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体能够抑制展示足糖萼蛋白肿瘤表位的癌细胞的生长。与适当的对照相比，优选的生长抑制性抗足糖萼蛋白抗体抑制表达足糖萼蛋白的肿瘤细胞的生长超过20％，优选约20％至约50％，并且甚至更优选超过50％(例如约50％至约100％)，所述对照通常是未用受试抗体处理的肿瘤细胞。
抗足糖萼蛋白抗体可以(i)抑制与之结合的细胞的生长或增殖；(ii)诱导与之结合的细胞死亡；(iii)抑制与之结合的细胞的分层；(iv)抑制与之结合的细胞的转移；或(v)抑制包含与之结合的细胞的肿瘤的血管化。
术语“拮抗剂”从最广义上使用并且包括部分或完全封闭、抑制或中和抗原的生物学活性的任何分子。合适的拮抗剂分子具体包括天然足糖萼蛋白多肽、肽、反义寡核苷酸、有机小分子等的拮抗剂抗体或抗体片段、片段或氨基酸序列变体。用于鉴定足糖萼蛋白多肽拮抗剂的方法可包括使足糖萼蛋白多肽与候选拮抗剂分子接触并测量通常与所述足糖萼蛋白多肽相关的一种或多种生物学活性的可检测性变化。
术语“癌症”和“癌”是指或描述通常特征在于细胞生长不受调控的哺乳动物的生理状况。“肿瘤”包含一种或多种癌细胞。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、皮肤癌、黑素瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃部癌(包括胃肠癌)、胰腺癌(例如，胰腺导管腺癌)、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌(例如高级浆液性卵巢癌)、肝癌(例如，肝细胞癌(HCC))、膀胱癌(例如，膀胱上皮癌)、睾丸癌(生殖细胞瘤)、肝细胞瘤、乳腺癌、脑癌(例如，星形细胞瘤)、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌(例如，肾细胞癌、肾母细胞瘤或威尔姆斯瘤(Wilms’tumour))、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。癌症的其它实例包括但不限于视网膜母细胞瘤、泡膜细胞瘤、卵巢男性细胞瘤、肝细胞瘤、血液恶性肿瘤(包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤和急性血液恶性肿瘤)、子宫内膜癌或子宫癌、子宫内膜异位、纤维肉瘤、绒毛膜癌、唾液腺癌、外阴癌、甲状腺癌、食管癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、鼻咽癌、喉癌、卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、黑素瘤、皮肤癌、许旺氏细胞瘤(Schwannoma)、少突胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤和尿道癌。
在一个优选的实施方案中，癌症是黑素瘤。在另一个优选的实施方案中，癌症是成胶质细胞瘤。在另一个优选的实施方案中，癌症是急性骨髓性白血病(AML)或急性淋巴母细胞性白血病(ALL)。在另一个优选的实施方案中，癌症是卵巢癌。在另一个优选的实施方案中，癌症是乳腺癌。
术语“转移性癌症”是指癌症状态，其中起源组织的癌细胞通过血管或淋巴管从原始位点传送到身体其它地方的一个或多个部位，以在除了起源组织之外的一个或多个器官中形成一个或多个继发性肿瘤。一个突出的实例是转移性乳腺癌。
如本文中所用，“足糖萼蛋白相关癌症”是与足糖萼蛋白基因或基因产物的过表达相关和/或与足糖萼蛋白肿瘤表位的展示相关的癌症。合适的对照细胞可以是例如来自未受癌症影响的个体的细胞或来自患有癌症的受试者的非癌性细胞。
本发明方法包括治疗患有癌症的受试者的方法。特别是与足糖萼蛋白肿瘤表位表达相关的癌症。本发明方法还包括调节某些细胞行为，特别是癌细胞行为，特别是展示足糖萼蛋白肿瘤表位的癌细胞的方法。在一个实施方案中，足糖萼蛋白肿瘤表位包含足糖萼蛋白的翻译后修饰。在一个实施方案中，足糖萼蛋白肿瘤表位包含附接至足糖萼蛋白的唾液酸化O-糖基部分。在一个实施方案中，足糖萼蛋白肿瘤表位包含连接至足糖萼蛋白的O-连接的聚糖部分。在一个实施方案中，足糖萼蛋白肿瘤表位包含连接至足糖萼蛋白的聚糖部分，其中所述聚糖部分在其末端具有β-N-乙酰半乳糖胺。
术语“细胞增生性病症”和“增生性病症”是指与一定程度的细胞异常增殖相关的病症。在一个实施方案中，细胞增生性病症是癌症。
如本文中所用的“肿瘤”是指所有肿瘤细胞生长和增殖，无论恶性还是良性，以及所有癌前和癌性细胞和组织。
如本文中所用的术语“预测”和“预后”也可以互换。在某种意义上，用于预测或预后的方法是允许实践本发明的预测/预后方法的人选择被认为(通常在治疗之前，但不一定)更可能对用抗癌剂，优选本发明的抗足糖萼蛋白抗体或CAR-T细胞或CAR-NK细胞治疗产生反应的患者。
III.本发明的组合物和方法
一方面，本发明提供了抗足糖萼蛋白抗体，包括其片段，包含其的组合物，以及将其用于各种目的(包括治疗癌症)的方法。
一方面，本发明提供了与足糖萼蛋白肿瘤表位结合的抗体。一方面，抗体与足糖萼蛋白肿瘤表位竞争结合或基本上结合。任选地，抗体是单克隆抗体、抗体片段(包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段)、双链抗体、单域抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体或竞争性抑制抗足糖萼蛋白表位抗体与其各自的抗原表位结合的抗体。本发明的抗体可以任选地在CHO细胞或细菌细胞中或通过其它方式产生。在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体诱导与之结合的细胞的死亡。为了检测，本发明的抗足糖萼蛋白抗体可以经可检测性标记，附着于固体支撑物等。
一方面，提供了功能性抗足糖萼蛋白抗体，其中所述抗体具有一种或多种以下活性：(i)抑制分层；(ii)抑制体内肿瘤转移；(iii)抑制体内肿瘤生长；(iv)减小体内肿瘤尺寸；(v)抑制体内肿瘤血管化；(vi)对体内表达足糖萼蛋白的肿瘤细胞表现出细胞毒活性；或(vii)对体内表达足糖萼蛋白的肿瘤细胞表现出细胞抑制活性。
一方面，提供了与足糖萼蛋白结合的抗体，其中所述抗体包含的重链可变区包含：METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSGYQMNWVRQAPGKGLEWIGYIWSDGGTDYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCAREGYWLGAFDPWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO：27)。
一方面，提供了与足糖萼蛋白结合的抗体，其中所述抗体包含的轻链可变区包含：MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAAVLTQTPSPVSAAVGATVSVSCQSSQSVHHKNDLAWFQQKPGQPPKLLIYYTSTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCAGVYEGSSDNRAFGGGTEVVVK(SEQ ID NO：29)。
一方面，提供了与足糖萼蛋白结合的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：27的重链可变区和含有SEQ ID NO：29的轻链可变区。
一方面，提供了与足糖萼蛋白结合的抗体，其中所述抗体包含含有CDR1的重链可变区，CDR1包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：GFSLSGYQ(SEQ ID NO：33)；GFSLSGY(SEQ ID NO：34)；和GYQMN(SEQ ID NO：35)。
一方面，提供了与足糖萼蛋白结合的抗体，其中所述抗体包含含有CDR2的重链可变区，CDR2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：IWSDGGT(SEQ ID NO：36)；WSDGG(SEQID NO：37)；和YIWSDGGTDYASWAKG(SEQ ID NO：38)。
一方面，提供了与足糖萼蛋白结合的抗体，其中所述抗体包含含有CDR3的重链可变区，CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：AREGYWLGAFDP(SEQ ID NO：39)；EGYWLGAFDP(SEQ IDNO：40)；和EGYWLGAFDP(SEQ ID NO：41)。
一方面，提供了与足糖萼蛋白结合的抗体，其中所述抗体包含含有CDR1的轻链可变区，CDR1包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：QSVHHKND(SEQ ID NO：42)；QSSQSVHHKNDLA(SEQ ID NO：43)；和QSSQSVHHKNDLA(SEQ ID NO：44)。
一方面，提供了与足糖萼蛋白结合的抗体，其中所述抗体包含含有CDR2的轻链可变区，CDR2包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：YTS(SEQ ID NO：45)；YTSLAS(SEQ IDNO：46)；和YTSLAS(SEQ ID NO：47)。
一方面，提供了与足糖萼蛋白结合的抗体，其中所述抗体包含含有CDR3的轻链可变区，CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：AGVYEGSSDNRA(SEQ ID NO：48)；AGVYEGSSDNRA(SEQ ID NO：49)；和AGVYEGSSDNRA(SEQ ID NO：50)。
一方面，提供了与足糖萼蛋白结合的抗体，其中所述抗体包含的重链可变区包含选自SEQ ID NO：33-35的CDR1；选自SEQ ID NO：36-38的CDR2；和选自SEQ ID NO：39-41的CDR3。
一方面，提供了与足糖萼蛋白结合的抗体，其中所述抗体包含的轻链可变区包含选自SEQ ID NO：42-44的CDR1；选自SEQ ID NO：45-47的CDR2；和选自SEQ ID NO：48-50的CDR3。
一方面，提供了与足糖萼蛋白结合的抗体，其中所述抗体包含的重链可变区包含选自SEQ ID NO：33-35的CDR1；选自SEQ ID NO：36-38的CDR2；和选自SEQ ID NO：39-41的CDR3；并且进一步包含的轻链可变区含有：选自SEQ ID NO：42-44的CDR1；选自SEQ ID NO：45-47的CDR2；和选自SEQ ID NO：48-50的CDR3。
在一个实施方案中，包含这些序列(呈本文描述的组合)的本发明抗体是人源化或人抗体。
一方面，本发明包括抗足糖萼蛋白抗体，其包含(i)包含SEQ ID NO：27的重链可变结构域；和/或(ii)包含SEQ ID NO：29的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，这些抗体还包含人亚群III重链框架共有序列。在这些抗体的一个实施方案中，这些抗体还包含人κ I轻链框架共有序列。
一方面，抗足糖萼蛋白抗体与包含含有SEQ ID NO：69的重链可变区和含有SEQ IDNO 74的轻链可变区的抗足糖萼蛋白抗体竞争结合肿瘤展示的足糖萼蛋白(例如，如A172细胞上展示的)。
用于宿主受试者的治疗剂优选对所述受试者中的试剂引发很少或没有免疫原性反应。在一个实施方案中，本发明提供了此类药剂。例如，在一个实施方案中，本发明提供了人源化抗体，与包含SEQ ID NO：27和29的序列的抗体相比，其在宿主受试者中引发和/或预计会引发水平大幅降低的人抗小鼠抗体反应(HAMA)。在另一个实例中，本发明提供了引发和/或预期引发最低限度的或不引发人抗小鼠抗体反应(HAMA)的人源化抗体。在一个实例中，本发明的抗体引发处于或低于临床可接受水平的抗小鼠抗体反应。
本发明的人源化抗体可以在其重链和/或轻链可变结构域中包含一个或多个人和/或人共有非高变区(例如框架)序列。在一些实施方案中，在人和/或人共有非高变区序列内存在一个或多个附加修饰。在一个实施方案中，本发明抗体的重链可变结构域包含人共有框架序列，其在一个实施方案中是亚群III共有框架序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含在至少一个氨基酸位置被修饰的变体亚群III共有框架序列。
如本领域中所知，并且如本文更详细地描述的，勾画抗体高变区的氨基酸位置/边界可以根据上下文和本领域已知的各种定义(如下所述)变化。可变结构域内的一些位置可以被视为杂合高变位置，因为这些位置可以根据一套标准被视为在高变区内，而根据一套不同的标准被视为在高变区外。这些位置中的一个或多个也可以在延伸的高变区(如下面进一步定义)中找到。本发明提供了在这些杂合高变位置中包含修饰的抗体。在一个实施方案中，这些高变位置包括重链可变结构域中的一个或多个位置26-30、33-35B、47-49、57-65、93、94和101-102。在一个实施方案中，这些杂合高变位置包括轻链可变结构域中的一个或多个位置24-29、35-36、46-49、56和97。在一个实施方案中，本发明的抗体包含在一个或多个杂合高变位置被修饰的人变体人亚群共有框架序列。
本发明的抗体可包含任何合适的人或人共有轻链框架序列，条件是该抗体表现出所需的生物学特征(例如，所需的结合亲和力)。在一个实施方案中，本发明的抗体包含人κ轻链框架序列的至少一部分(或全部)。在一个实施方案中，本发明的抗体包含人κ亚群I框架共有序列的至少一部分(或全部)。
在一些方面，本发明提供了包含编码本文描述的任何抗足糖萼蛋白抗体或其部分的DNA的载体。还提供了包含任何此类载体的宿主细胞。举例而言，宿主细胞可以是CHO细胞、大肠杆菌(E.coli)细胞或酵母细胞。还提供了用于产生本文描述的任何多肽的方法，并且包括在适于表达所需多肽的条件下培养宿主细胞并从细胞培养物中回收所需多肽。
本发明的抗体可以用于任何已知的测定方法，例如ELISA、竞争性结合测定、直接和间接夹心测定和免疫沉淀测定(Zola，(1987)Monoclonal Antibodies：A Manual ofTechniques，第147-158页，CRC Press，Inc.)。
检测标签可用于定位、可视化和量化结合或识别事件。本发明的标记抗体可以检测细胞表面受体。可检测标记抗体的另一种用途是基于珠粒的免疫捕获方法，包括将珠粒与荧光标记抗体偶联并且在配体结合后检测荧光信号。相似的结合检测方法利用表面等离子体共振(SPR)效应来测量和检测抗体-抗原相互作用。
检测标记如荧光染料和化学发光染料(Briggs等人(1997)″Synthesis ofFunctionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and AminoAcids，″J.Chem.Soc.，Perkin-Trans.1：1051-1058)提供了可检测信号，并且通常适用于标记抗体，优选具有以下特性：(i)标记抗体应产生非常高的具有低背景的信号，以便在无细胞和基于细胞的测定中可以灵敏地检测到少量的抗体；并且(ii)标记抗体应该是光稳定的，以便可以观察、监测和记录荧光信号而没有明显的光漂白。对于涉及标记抗体与膜或细胞表面(特别是活细胞)的细胞表面结合的应用，标记优选(iii)具有良好的水溶性以达到有效的缀合物浓度和检测灵敏度，并且(iv)对活细胞无毒以致不会破坏细胞的正常代谢过程或导致细胞过早死亡。
细胞荧光强度的直接量化和荧光标记事件(例如肽-染料缀合物的细胞表面结合)的计数，可以在用活细胞或珠粒自动操作混合和读取、非放射性测定的系统(
Figure BDA0001680380570000281
8100HTS系统，Applied Biosystems，Foster City，Calif.)上进行(Miraglia，″Homogeneous cell-and bead-based assays for high throughput screening usingfluorometric microvolume assay technology″，(1999)J.of BiomolecularScreening4：193-204)。标记抗体的用途还包括细胞表面受体结合测定、免疫捕获测定、荧光连接免疫吸附测定(FLISA)、半胱天冬酶裂解(Zheng，″Caspase-3controls bothcytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis invivo″，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：618-23；US 6372907)、凋亡(Vermes，″A novelassay for apoptosis.Flow cytometric detection of phosphatidylserineexpression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V″(1995)J.Immunol.Methods184：39-51)和细胞毒性测定。荧光微孔分析技术可用于鉴定靶向细胞表面的分子的上调或下调(Swartzman，″A homogeneous and multiplexedimmunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolumeassay technology″，(1999)Anal.Biochem.271：143-51)。
本发明的标记抗体通过生物医学和分子成像的各种方法和技术用作成像生物标志物和探针，例如：(i)MRI(磁共振成像)；(ii)MicroCT(计算机断层扫描)；(iii)SPECT(单光子发射计算机断层扫描影)；(iv)PET(正电子发射断层扫描)Chen等(2004)BioconjugateChem.15：41-49；(v)生物发光；(vi)荧光；和(vii)超声。免疫闪烁照相术是一个成像过程，其中将放射性物质标记的抗体施用给动物或人类患者，并拍摄抗体定位的身体部位的图片(US 6528624)。可以客观地测量和评估成像生物标志物作为正常生物学过程、致病过程或对治疗干预的药理学反应的指标。
肽标记方法是公知的。参见Haugland，2003，Molecular Probes Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals，Molecular Probes，Inc.；Brinkley，1992，Bioconjugate Chem.3：2；Garman，(1997)Non-Radioactive Labelling：A PracticalApproach，Academic Press，London；Means(1990)Bioconjugate Chem.1：2；Glazer等人(1975)Chemical Modification of Proteins.Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology(T.S.Work和E.Work编辑)American Elsevier Publishing Co.，New York；Lundblad，R.L.和Noyes，C.M.(1984)Chemical Reagents for ProteinModification，I和II卷，CRC Press，New York；Pfleiderer，G.(1985)“ChemicalModification of Proteins”，Modern Methods in Protein Chemistry，H.Tschesche编辑，Walter DeGryter，Berlin and New York；及Wong(1991)Chemistry of ProteinConjugation and Cross-linking，CRC Press，Boca Raton，Fla.)；De Leon-Rodriguez等人(2004)Chem.Eur.J.10：1149-1155；Lewis等人(2001)Bioconjugate Chem.12：320-324；Li等人(2002)Bioconjugate Chem.13：110-115；Mier等人(2005)Bioconjugate Chem.16：240-237。
用足够靠近的两个部分(荧光报告因子和猝灭因子)标记的肽和蛋白质经历荧光共振能量转移(FRET)。报告因子基团通常是荧光染料，它被某一波长的光激发并将能量传递给受体或猝灭因子基团，对于在最大亮度下发射具有适当的斯托克斯位移(Stokesshift)。荧光染料包括具有持续芳香性的分子，如荧光素和若丹明及其衍生物。荧光报告因子可以部分或显著地被完整肽中的猝灭因子部分猝灭。肽受肽酶或蛋白酶裂解后，可以测量荧光的可检测增加(Knight，C.(1995)“Fluorimetric Assays of ProteolyticEnzymes”，Methods in Enzymology，Academic Press，248：18-34)。
本发明的标记抗体也可以用作亲和纯化剂。在这个过程中，使用本领域公知的方法将标记抗体固定在固相如Sephadex树脂或滤纸上。使固定的抗体与含有待纯化抗原的样品接触，之后用合适的溶剂洗涤支撑物，该溶剂将去除样品中除待纯化抗原之外的基本上所有物质，所述抗原与固定的多肽变体结合。最后，用另一种合适的溶剂(例如甘氨酸缓冲液，pH 5.0)洗涤载体，该溶剂将使抗原从多肽变体释放。
一方面，本发明的抗足糖萼蛋白抗体结合足糖萼蛋白上被另一足糖萼蛋白抗体结合的相同表位。在另一个实施方案中，本发明的足糖萼蛋白抗体结合足糖萼蛋白上被包含SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29(图2)的可变结构域的单克隆抗体的片段(例如，Fab片段)或包含含有SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29(图2)的序列的单克隆抗体的可变结构域和来自IgG1的恒定结构域的嵌合抗体结合的相同表位。
一方面，本发明提供了包含本发明的一种或多种抗体和载体的组合物。在一个实施方案中，载体是药学上可接受的。
一方面，本发明提供了编码本发明的足糖萼蛋白抗体(或其部分)的核酸。
一方面，本发明提供了包含本发明核酸的载体。在一个实施方案中，载体包含SEQID NO：12和/或SEQ ID NO：14(图2)。
一方面，本发明提供了包含本发明的核酸或载体的宿主细胞。载体可以是任何类型，例如重组载体如表达载体。可以使用各种宿主细胞中的任何一种。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
一方面，本发明提供了制备本发明抗体的方法。例如，本发明提供了制备足糖萼蛋白抗体(如本文所定义包括全长及其片段)的方法，所述方法包括在合适的宿主细胞中表达编码所述抗体(或其片段)的本发明的重组载体，并回收所述抗体。
一方面，本发明提供了一种制品，其包括容器；以及容纳在容器内的组合物，其中所述组合物包含本发明的一种或多种足糖萼蛋白抗体或CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞。在一个实施方案中，组合物包含本发明的核酸。在一个实施方案中，包含抗体或CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞的组合物还包含载体，在一些实施方案中载体是药学上可接受的。在一个实施方案中，本发明的制品还包含向受试者施用组合物(例如抗体)的说明书。
一方面，本发明提供了包含第一容器和第二容器的试剂盒，第一容器包含含有本发明的一种或多种足糖萼蛋白抗体或CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞的组合物；并且第二容器包含缓冲液。在一个实施方案中，缓冲液是药学上可接受的。在一个实施方案中，试剂盒还包含向受试者施用组合物(例如抗体)的说明书。
一方面，本发明提供了本发明的足糖萼蛋白抗体或CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞在用于疾病如癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症的治疗性和/或预防性治疗的药剂制备中的用途。
一方面，本发明提供了本发明的核酸在用于疾病如癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症的治疗性和/或预防性治疗的药剂制备中的用途。
一方面，本发明提供了本发明的表达载体在用于疾病如癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症的治疗性和/或预防性治疗的药剂制备中的用途。
一方面，本发明提供了本发明的宿主细胞在用于疾病如癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症的治疗性和/或预防性治疗的药剂制备中的用途。
一方面，本发明提供了本发明的制品在用于疾病如癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症的治疗性和/或预防性治疗的药剂制备中的用途。
一方面，本发明提供了本发明的试剂盒在用于疾病如癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症的治疗性和/或预防性治疗的药剂制备中的用途。
一方面，本发明提供了抑制表达足糖萼蛋白的细胞生长的方法，所述方法包括使所述细胞与本发明的抗体或CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞接触，从而引起对所述细胞生长的抑制。
一方面，本发明提供了治疗性治疗具有包含表达足糖萼蛋白的细胞的癌性肿瘤的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的本发明的抗体或CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞，从而有效治疗所述哺乳动物。
一方面，本发明提供了本发明的足糖萼蛋白抗体在药剂制备中的用途，所述药剂用于(i)抑制包含表达足糖萼蛋白的细胞的肿瘤血管化；(ii)抑制表达足糖萼蛋白的细胞的分层；(iii)抑制患有癌症的患者中的肿瘤转移；(iv)减小患有癌症的患者中的肿瘤尺寸。
一方面，本发明提供了治疗或预防与足糖萼蛋白表达增加相关的细胞增生性病症的方法，所述方法包括向需要此类治疗的受试者施用有效量的本发明的抗体或CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞，从而有效治疗或预防所述细胞增生性病症。在一个实施方案中，所述细胞增生性病症是癌症。
一方面，本发明提供了确定疑似含有足糖萼蛋白的样品中足糖萼蛋白的存在的方法，所述方法包括将所述样品暴露于本发明的抗体，并测定所述抗体与所述样品中的足糖萼蛋白的结合，其中所述抗体与所述样品中的足糖萼蛋白的结合表明所述样品中存在所述蛋白质。在一个实施方案中，样品是生物样品。在另一个实施方案中，生物样品包含乳腺癌细胞。在一个实施方案中，生物样品来自经历或疑似经历乳腺癌病症和/或乳腺癌细胞增生性病症的哺乳动物。在另一个实施方案中，生物样品包含卵巢癌细胞。在一个实施方案中，生物样品来自经历或疑似经历卵巢癌病症和/或卵巢癌细胞增生性病症的哺乳动物。在另一个实施方案中，生物样品包含黑素瘤细胞。在一个实施方案中，生物样品来自经历或疑似经历黑素瘤病症和/或黑素瘤细胞增生性病症的哺乳动物。在另一个实施方案中，生物样品包含成胶质细胞瘤细胞。在一个实施方案中，生物样品来自正在经历或疑似经历成胶质细胞瘤病症和/或成胶质细胞瘤细胞增生性病症的哺乳动物。
一方面，提供了一种诊断细胞增生性病症的方法，所述细胞增生性病症与以下相关：(i)表达足糖萼蛋白的细胞，例如乳腺癌细胞，卵巢癌细胞，黑素瘤细胞或成胶质细胞瘤细胞的增加，或(ii)肿瘤内足糖萼蛋白表达的增加。在一个实施方案中，该方法包括使生物样品中的试验细胞与以上任何抗体接触；通过检测抗体与足糖萼蛋白的结合来测定样品中与试验细胞结合的抗体水平；并比较对照样品中与细胞结合的抗体水平，其中将结合的抗体水平标准化为试验和对照样品中表达足糖萼蛋白的细胞的数量，并且其中与对照样品相比试验样品中结合的抗体水平较高，表明存在与表达足糖萼蛋白的细胞相关的细胞增生性病症。
一方面，本发明提供了抑制包含表达足糖萼蛋白的细胞的肿瘤血管化的方法，其包括向患者施用有效量的本文描述的抗体或CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞，从而有效地抑制肿瘤血管化。
一方面，本发明提供了抑制表达足糖萼蛋白的细胞分层的方法，其包括向患者施用有效量的本文描述的抗体或CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞，从而有效地抑制细胞分层。
一方面，本发明提供了抑制患有癌症的患者中的肿瘤转移的方法，其包括向患者施用有效量的本文描述的抗体或CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞，从而有效地抑制肿瘤转移。
一方面，本发明提供了减小肿瘤尺寸的方法，其包括向患者施用有效量的本文描述的抗体或CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞，从而有效地减小肿瘤尺寸。
一方面，本发明提供了治疗或预防与足糖萼蛋白表达增加相关的细胞增生性病症的方法，所述方法包括向需要此类治疗的受试者施用有效量的本发明的抗体或CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞，从而有效治疗或预防所述细胞增生性病症。在一个实施方案中，所述增生性病症是癌症。
一方面，本发明提供了使本发明的抗体与表达足糖萼蛋白的细胞结合的方法，所述方法包括使所述细胞与本发明的抗体接触。
在本发明的其它方面，本发明提供了包含编码本文描述的任何抗体(或其部分)的DNA的载体。还提供了包含任何此类载体的宿主细胞。举例而言，宿主细胞可以是CHO细胞、大肠杆菌(E.coli)细胞或酵母细胞。还提供了用于产生本文描述的任何抗体的方法，并且包括在适于表达所需抗体的条件下培养宿主细胞并从细胞培养物中回收所需抗体。
又一方面，本发明涉及包含与载体组合的如本文所描述的抗足糖萼蛋白抗体的物质组合物。任选地，载体是药学上可接受的载体。又一方面，本发明涉及包含与载体组合的如本文所描述的CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞的物质组合物。任选地，载体是药学上可接受的载体。
本发明的另一方面涉及如本文所描述的抗足糖萼蛋白表位抗体用于制备用于治疗对抗足糖萼蛋白表位抗体有反应的病状的药剂的用途。
另一方面，本发明提供了免疫缀合物或抗体-药物缀合物(ADC)，其包含与细胞毒性剂例如化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)偶联的抗足糖萼蛋白抗体。另一方面，本发明还提供了使用免疫缀合物的方法。一方面，免疫缀合物包含与细胞毒性剂或可检测剂共价附接的任何上述抗足糖萼蛋白抗体。
A.抗足糖萼蛋白抗体
在一个实施方案中，本发明提供了可在本文中用作治疗剂的抗足糖萼蛋白抗体。示例性抗体包括多克隆、单克隆、嵌合、人源化和人抗体。
1.多克隆抗体
多克隆抗体优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂在动物中产生。使相关抗原(特别是使用合成肽时)偶联到在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白质上可能是有用的。例如，可以使用双功能或衍生剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺酸琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R′N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基基团)，使抗原与钥孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂偶联。
通过将例如100μg或5μg的蛋白质或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂(Freund′s complete adjuvant)合并并且在多个部位皮内注射该溶液使动物对抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫。一个月后，通过在多个部位皮下注射将动物用原始量的1/5至1/10于弗氏完全佐剂中的肽或缀合物加强。7至14天后，为动物放血并测定血清的抗体滴度。为动物加强直至滴度稳定水平。缀合物也可以在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物产生。同样，聚集剂例如明矾适合用于增强免疫反应。
2.单克隆抗体
通过使用本领域已知的任何技术可以制备针对目标抗原的单克隆抗体(mAb)。这些包括但不限于最初由Kohler和Milstein描述的杂交瘤技术(1975，Nature 256，495-497)，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，1983，Immunology Today4：72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页)。选定的淋巴细胞抗体方法(SLAM)(Babcook，J.S.等人，A novel strategy forgenerating monoclonal antibodies from single，isolated lymphocytes producingantibodies of defined specificities.Proc Natl Acad Sci U S A，1996.93(15)：第7843-8页.)和(McLean GR，Olsen OA，Watt IN，Rathanaswami P，Leslie KB，Babcook JS，Schrader JW.Recognition of human cytomegalovirus by human primaryimmunoglobulins identifies an innate foundation to an adaptive immuneresponse.J Immunol.2005年4月15日；174(8)：4768-78。此类抗体可以是任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA和IgD及其任何亚类。产生用于本发明的mAb的杂交瘤可以在体外或体内培养。
单克隆抗体可以使用由Kohler等人，Nature，256：495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(美国专利第4,816,567号)。
在杂交瘤方法中，如上所述使小鼠或其它适当的宿主动物如仓鼠免疫，以引发产生或能够产生将特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。可选地，淋巴细胞可以在体外免疫。免疫后，分离淋巴细胞，然后使用合适的融合剂(如聚乙二醇)与骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103页(Academic Press，1986))。
接种这样制备的杂交瘤细胞并使其在合适的培养基中生长，该培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也称为融合伴侣)的生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的选择性培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培养基)，所述物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
优选的融合伴侣骨髓瘤细胞是那些有效融合，支持所选抗体产生细胞的稳定高水平抗体产生，并且对选择抗未融合亲本细胞的选择性培养基敏感的细胞。优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，例如源自可从Salk Institute Cell Distribution Center，SanDiego，Calif.USA获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，及SP-2和衍生物例如可从美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection，Manassas，Va.，USA)获得的X63-Ag8-653细胞。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.，133：3001(1984)；和Brodeur等人，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
测定其中杂交瘤细胞生长的培养基针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定。
单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson等人描述的斯卡查德分析(Scatchard analysis)来测定，Anal.Biochem.，107：220(1980)。
一旦鉴定出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，就可以通过有限稀释程序将克隆物亚克隆并通过标准方法使其生长(Goding，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，第59-103页(Academic Press，1986))。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，可以使杂交瘤细胞在动物体内作为腹水瘤生长，例如通过将细胞腹膜内注射到小鼠体内。
由亚克隆物分泌的单克隆抗体通过常规抗体纯化程序，例如亲和色谱法(例如使用蛋白质A或蛋白质G-琼脂糖凝胶)或离子交换色谱法、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析等，从培养基、腹水或血清中适当分离。
编码单克隆抗体的DNA易于使用常规方法分离和测序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一经分离，就可将DNA置于表达载体中，然后将表达载体转染至不会另外产生抗体蛋白的宿主细胞例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢细胞或骨髓瘤细胞中，以获得重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述文章包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.，5：256-262(1993)和Pliickthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可以从使用McCafferty等人，Nature，348：552-554(1990)描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物描述了通过链改组(Marks等人，Bio/Technology，10：779-783(1992))以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.21：2265-2266(1993))产生高亲和力(nM范围)的人抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行性替代方案。
编码抗体的DNA可经修饰以产生嵌合或融合抗体多肽，例如通过用人重链和轻链恒定结构域(CH和CO序列)取代同源鼠类序列(美国专利第4,816,567号；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851(1984))，或通过使免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的全部或部分编码序列融合。非免疫球蛋白多肽序列可以取代抗体的恒定结构域，或者它们取代抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体，该嵌合二价抗体包含一个对抗原具有特异性的抗原结合位点和另一个对不同抗原具有特异性的抗原结合位点。
3.嵌合、人源化和人抗体
在一些实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在美国专利第4,816,567号；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))中进行了描述。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物如猴子的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中所述类别或亚类已经从亲本抗体的类别发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在一些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，使非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保持亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR例如CDR(或其部分)源自非人抗体，而FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如CDR残基所来源的抗体)的对应残基取代，例如以恢复或提高抗体特异性或亲和力。
本发明的抗足糖萼蛋白抗体还可包含人源化抗体或人抗体。非人(例如，鼠或兔)抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合子序列)，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受者的互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和性和能力的来自非人物种(供者抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基置换。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人残基置换。人源化抗体还可包含既不存在于受者抗体中也不存在于导入的CDR或框架序列中的残基。通常，人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些FR区。人源化抗体还将最佳地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分[Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)]。
使非人抗体人源化的方法是本领域熟知的。通常，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“导入”残基，它们通常取自“导入”可变结构域。人源化可以基本上按照Winter和同事的方法进行[Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988)]，通过用啮齿类CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中远远少于完整的人可变结构域已经被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基以及可能一些FR残基被来自啮齿类抗体中的类似位点的残基取代的人抗体。
当抗体用于人类治疗用时，用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链)的选择对于降低抗原性和HAMA反应(人抗小鼠抗体)很重要。减少或消除HAMA反应是临床开发合适治疗剂的重要方面。参见例如，Khaxzaeli等人，J.Natl.Cancer Inst.(1988)，80：937；Jaffers等人，Transplantation(1986)，41：572；Shawler等人，J.Immunol.(1985)，135：1530；Sears等人，J.Biol.Response Mod.(1984)，3：138；Miller等人，Blood(1983)，62：988；Hakimi等人，J.Immunol.(1991)，147：1352；Reichmann等人，Nature(1988)，332：323；Junghans等人，Cancer Res.(1990)，50：1495。如本文所述，本发明提供了人源化的抗体，使得HAMA反应降低或消除。这些抗体的变体还可以使用本领域已知的常规方法获得，在下面进一步描述了其中一些方法。根据所谓的“最佳拟合”法，针对已知人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿类抗体的可变结构域的序列。鉴定出与啮齿动物最接近的人V结构域序列，并且接受其内部的人框架区(FR)用于人源化抗体(Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一种方法使用源自特定轻链或重链亚群的所有人抗体的共有序列的特定框架区。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.151：2623(1993))。
例如，来自本文所描述的抗体的氨基酸序列可以用作框架和/或高变序列多样化的起始(亲本)序列。起始高变序列所连接的选定框架序列在本文中称为受体人框架。虽然受体人框架可以来自或源自人免疫球蛋白(其VL和/或VH区)，但是优选受体人框架来自或源自人共有框架序列，因为已经证明在人类患者中此类框架具有最低免疫原性或不具有免疫原性。
在受体源自人免疫球蛋白时，可以任选地通过将供者框架序列与人框架序列集合中的各种人框架序列比对，选择基于其与供者框架序列的同源性而选定的人框架序列，并且选择同源性最高的框架序列作为受体。
在一个实施方案中，本文的人共有框架来自或源自VH亚群III和/或VLκ亚群I共有框架序列。
虽然受体在序列上可能与选定的人框架序列相同，无论是来自人免疫球蛋白还是人共有框架，本发明考虑到受体序列可包含相对于人免疫球蛋白序列或人共有框架序列预先存在的氨基酸取代。这些预先存在的取代优选是最小的；通常是四个、三个、两个或一个仅相对于人免疫球蛋白序列或共有框架序列的氨基酸差异。
将非人抗体的高变区残基并入VL和/或VH受体人框架中。例如，可以并入对应于Kabat CDR残基、Chothia高变环残基、Abm残基和/或接触残基的残基。任选地，并入如下的延伸高变区残基：24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)、26-35B(H1)、50-65、47-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。
虽然本文讨论了高变区残基的“并入”，但应理解这可以以各种方式实现，例如，可通过以下方式产生编码所需氨基酸序列的核酸：使编码小鼠可变结构域序列的核酸突变，使其框架残基变成受体人框架残基，或通过使编码人可变结构域序列的核酸突变，使得高变结构域残基变成非人残基，或通过合成编码所需序列的核酸等。
如本文所述，高变区移植变体可以通过对每个高变区使用单独的寡核苷酸，对编码人受体序列的核酸进行Kunkel诱变来产生。Kunkel等人，Methods Enzymol.154：367-382(1987)。可以使用常规技术向框架和/或高变区内引入适当的改变，以校正和重建恰当的高变区-抗原相互作用。
噬菌体(中期)展示(在本文的一些上下文中也称为噬菌体展示)可以用作产生和筛选通过序列随机化产生的文库中的许多不同潜在变体抗体的方便且快速的方法。然而，技术人员可获得用于制备和筛选改变的抗体的其它方法。
噬菌体(中期)展示技术为产生和选择与配体(如抗原)结合的新型蛋白提供了强大工具。使用噬菌体(中期)展示技术允许产生大的蛋白质变体文库，可对其快速分选以高亲和力与靶分子结合的那些序列。编码变体多肽的核酸通常与编码病毒外壳蛋白例如基因III蛋白或基因VIII蛋白的核酸序列融合。已经开发了其中编码蛋白质或多肽的核酸序列与编码部分基因III蛋白的核酸序列融合的单价噬菌粒展示系统。(Bass，S.，Proteins，8：309(1990)；Lowman和Wells，Methods：A Companion to Methods in Enzymology，3：205(1991))。在单价噬菌粒展示系统中，基因融合物以低水平表达，并且野生型基因III蛋白也表达，从而保持了颗粒的感染性。产生肽文库和筛选那些文库的方法已在许多专利中公开(例如美国专利第5,723,286号、美国专利第5,432,018号、美国专利第5,580,717号、美国专利第5,427,908号和美国专利第5,498,530号)。
已经以许多方式制备了抗体或抗原结合多肽文库，所述方式包括通过插入随机DNA序列或通过克隆相关基因家族来改变单个基因。用噬菌体(中期)展示法展示抗体或抗原结合片段的方法已经在美国专利第5,750,373、5,733,743、5,837,242、5,969,108、6,172,197、5,580,717和5,658,727号中有描述。然后筛选文库中具有所需特征的抗体或抗原结合蛋白的表达。
将选定的氨基酸置换成模板核酸的方法在本领域中已经确立，其中一些在本文中有描述。例如，可以使用Kunkel方法取代高变区残基。参见例如，Kunkel等人，MethodsEnzymol.154：367-382(1987)。
寡核苷酸序列包括待改变的高变区残基的一个或多个设计密码子组。密码子组是一组用于编码所需变体氨基酸的不同的核苷酸三联体序列。如下所示根据IUB代码，可以使用符号表示密码子组以指定特定的核苷酸或核苷酸的等摩尔混合物。
IUB代码
G鸟嘌呤
A腺嘌呤
T胸腺嘧啶
C胞嘧啶
R(A或G)
Y(C或T)
M(A或C)
K(G或T)
S(C或G)
W(A或T)
H(A或C或T)
B(C或G或T)
V(A或C或G)
D(A或G或T)H
N(A或C或G或T)
例如，在密码子组DVK中，D可以是核苷酸A或G或T；V可以是A或G或C；并且K可以是G或T。该密码子组可以呈现18种不同的密码子并且可以编码氨基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Iys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly和Cys。
寡核苷酸或引物组可以使用标准方法合成。一组寡核苷酸可以例如通过固相合成来合成，其含有代表密码子组提供的核苷酸三联体的所有可能组合并且将编码所需类别的氨基酸的序列。在某些位置上具有选定的核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成是本领域公知的。具有某些密码子组的此类核苷酸组可以使用商业核酸合成仪合成(可从例如AppliedBiosystems，Foster City，Calif.获得)，或者可以商购获得(例如从Life Technologies，Rockville，Md.获得)。因此，合成的具有特定密码子组的一组寡核苷酸通常将包括多个具有不同序列的寡核苷酸，差异由整个序列内的密码子组所确定。根据本发明使用的寡核苷酸具有允许与可变结构域核酸模板杂交的序列，并且还可以包括用于克隆目的的限制性酶切位点。
在一种方法中，编码变体氨基酸的核酸序列可以通过寡核苷酸介导的诱变来产生。该技术是本领域中公知的，如Zoller等人Nucleic Acids Res.10：6487-6504(1987)所述。简言之，编码变体氨基酸的核酸序列通过使编码所需密码子组的寡核苷酸组与DNA模板杂交产生，其中模板是含有可变区核酸模板序列的质粒的单链形式。杂交后，使用DNA聚合酶来合成模板的完整第二互补链，该链将因此并入寡核苷酸引物，并且将含有由寡核苷酸组所提供的密码子组。
通常，使用长度为至少25个核苷酸的寡核苷酸。最佳寡核苷酸将具有12至15个在编码突变的核苷酸任一侧上与模板完全互补的核苷酸。这确保寡核苷酸将正确地与单链DNA模板分子杂交。使用本领域已知的技术容易地合成寡核苷酸，例如由Crea等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，75：5765(1978)描述的技术。
DNA模板由源自噬菌体M13载体(可商购的M13mp 18和M13mp 19载体合适)的那些载体产生，或者含有单链噬菌体复制起点的那些载体产生，如Viera等人，Meth.Enzymol.，153：3(1987)所述。因此，待突变的DNA可插入到这些载体之一以产生单链模板。上述Sambrook等人的4.21-4.41部分中描述了单链模板的产生。
为了改变天然DNA序列，使寡核苷酸在合适的杂交条件下与单链模板杂交。然后添加DNA聚合酶，通常是T7DNA聚合酶或DNA聚合酶I的Klenow片段，以使用寡核苷酸作为合成的引物合成模板的互补链。这样形成异源双链体分子，使得DNA的一条链编码基因1的突变形式，而另一条链(原始模板)编码基因1的天然、未改变序列。然后将这个异源双链体分子转化到合适的宿主细胞中，通常是原核生物如大肠杆菌JM101。在使细胞生长后，将其接种到琼脂糖平板上，并用使用32-磷酸盐放射性标记的寡核苷酸引物筛选以鉴定含有突变DNA的细菌菌落。
上面刚刚描述的方法可以进行修改，使得产生同源双链体分子，其中质粒的两条链均含突变。修改如下：如上所述将单链寡核苷酸退火为单链模板。将三种脱氧核糖核苷酸(脱氧核糖腺苷(dATP)、脱氧核糖鸟苷(dGTP)和脱氧核糖胸苷(dTT))的混合物与称为dCTP-(aS)的经修饰硫醇脱氧核糖胞苷(其可以从Amersham获得)合并。将该混合物添加到模板-寡核苷酸复合物中。在向该混合物添加DNA聚合酶后，产生除了突变碱基之外与模板相同的DNA链。另外，这条新的DNA链将含有dCTP-(aS)而不是dCTP，起到保护其免受限制性核酸内切酶消化的作用。双链异源双链体的模板链用适当的限制酶切割后，可以用ExoIII核酸酶或另一种适当的核酸酶越过含有待诱变位点的区域消化模板链。然后停止反应留下仅部分为单链的分子。然后使用DNA聚合酶在全部四种三磷酸脱氧核糖核苷酸、ATP和DNA连接酶的存在下形成完整的双链DNA同源双链体。然后可以将该同源双链体分子转化到合适的宿主细胞中。
如前所述，寡核苷酸组的序列具有足够长度以与模板核酸杂交，并且也可以但不一定含有限制性位点。DNA模板可以由源自噬菌体M13载体的那些载体或含有单链噬菌体复制起点的载体产生，如Viera等人Meth.Enzymol.，153：3(1987)所述。因此，必须待突变的DNA插入到这些载体之一以产生单链模板。上述Sambrook等人的4.21-4.41部分中描述了单链模板的产生。
根据另一种方法，可以在抗体人源化期间通过选择修复的高变区来恢复抗原结合(参见2005年2月18日提交的申请案序列号11/061,841)。该方法包括将非人高变区并入受体框架内并进一步在一个或多个高变区中引入一个或多个氨基酸取代而无需修饰受体框架序列。可选地，一个或多个氨基酸取代的引入可伴随受体框架序列中的修饰。
根据另一种方法，可以通过提供上游和下游寡核苷酸组来产生文库，每组具有多个有不同序列的寡核苷酸，所述不同序列由寡核苷酸序列内提供的密码子组确定。上游和下游寡核苷酸组连同可变结构域模板核酸序列可用于聚合酶链式反应以产生PCR产物的“文库”。PCR产物可以称为“核酸盒”，因为可以使用已确定的分子生物学技术使其与其它相关或不相关的核酸序列(例如病毒外壳蛋白和二聚化结构域)融合。
PCR引物的序列包括一个或多个用于高变区中溶剂可及和高度多样化的位置的设计密码子组。如上所述，密码子组是一组用于编码所需变体氨基酸的不同的核苷酸三联体序列。
正如通过适当的筛选/选择步骤所选择的符合所需标准的抗体选择物可以使用标准重组技术分离和克隆。
更重要的是将抗体人源化，保留对抗原的高结合亲和力和其它有利的生物学特性。为了实现这个目标，根据优选的方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常可用并且是本领域技术人员熟悉的。计算机程序可用，其说明和展示选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。对这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受者和导入序列中选择FR残基并组合，从而获得所需抗体特征，例如对靶抗原(一种或多种)增加的亲和力。通常，高变区残基直接且最实质性地涉及影响抗原结合。
考虑了各种形式的人源化抗足糖萼蛋白抗体。例如，人源化抗体可以是抗体片段，如Fab。可选地，人源化抗体可以是完整抗体，例如完整IgG1抗体。
作为人源化的替代方法，可以产生人抗体。例如，现在可能产生在免疫后能够在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生全人抗体库的转基因动物(例如，小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致完全抑制内源性抗体产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到此类种系突变小鼠中将导致在抗原激发后产生人抗体。参见例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immuno.7：33(1993)；美国专利第5,545,806、5,569,825、5,591,669号(全部是GenPharm的)；第5,545,807号；和WO 97/17852。
可选地，噬菌体展示技术(McCafferty等人，Nature 348：552-553[1990])可用于由来自未免疫供者的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库在体外产生人抗体和抗体片段。根据这种技术，将抗体V结构域基因框内克隆至丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因，如M13或fd，并且在噬菌体颗粒表面上展示为功能抗体片段。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体功能特性的选择也产生了对编码表现出那些特性的抗体的基因的选择。因此，噬菌体模拟了B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以各种形式进行，例如Johnson，Kevin S和Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)综述的。V基因区段的几个来源可用于噬菌体展示。Clackson等人，Nature352：624-628(1991)从源自免疫小鼠脾脏的V基因的小随机组合文库分离了一系列不同的抗噁唑酮抗体。可以构建来自未免疫的人类供者的V基因库，并且可以基本上按照Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith等人，EMBO J.12：725-734(1993)描述的技术分离针对一系列不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还请参见美国专利第5,565,332和5,573,905号。
如以上所讨论的，人体抗体也可以通过体外激活的B细胞产生(参见美国专利第5,567,610和5,229,275号)。
在另一个实施方案中，本公开的抗体是人单克隆抗体。可以使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生此类针对足糖萼蛋白的人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括本文分别称为HuMAb小鼠TM和KM小鼠TM的小鼠，并且在本文中统称为“人Ig小鼠”。
HuMAb小鼠TM(Medarex，Inc.)含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，连同使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如Lonberg等人(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠表现出小鼠IgM或κ的表达降低，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力的人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.等人(1994)，同上；在Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intem.Rev.Immunol.13：65-93，及Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546中综述)。HuMAb小鼠TM的制备和使用以及由此类小鼠携带的基因组修饰进一步描述于Taylor，L.等人(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.等人(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等人(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等人，(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.等人(1994)International Immunology 6：579-591；及Fishwild，D.等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，其全部内容据此特别通过引用整体并入。进一步参见美国专利第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,789,650号；第5,877,397号；第5,661,016号；第5,814,318号；第5,874,299号；和第5,770,429号；(全部属于Lonberg和Kay)；美国专利第5,545,807号(属于Surani等人)；PCT公开号WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884和WO 99/45962(全部属于Lonberg和Kay)；及PCT公开号WO 01/14424(属于Korman等人)。
在另一个实施方案中，可以使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠，产生本公开的人抗体。这种小鼠在本文中称为“KM小鼠TM”并且在Ishida等人的PCT公开WO 02/43478中有详细描述。
更进一步地，表达人免疫球蛋白基因的替代转基因动物系统在本领域中是可用的并且可以用于产生本公开的抗足糖萼蛋白抗体。例如，可以使用称为Xenomouse(Abgenix，Inc.)的替代转基因系统；此类小鼠在例如美国专利第5,939,598号；第6,075,181号；第6,114,598号；第6,150,584号和第6,162,963号(属于Kucherlapati等人)中有描述。
而且，表达人免疫球蛋白基因的替代转染色体动物系统在本领域中是可用的并且可以用于产生本公开的抗足糖萼蛋白抗体。例如，可以使用称为“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠；在Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：722-727中描述了此类小鼠。此外，本领域中已经描述了携带人重链和轻链转染色体的牛(例如，Kuroiwa等人(2002)Nature Biotechnology 20：889-894和PCT申请号WO 2002/092812)，并且可以用于产生本公开的抗足糖萼蛋白抗体。
4.抗体片段
在某些情况下，使用抗体片段有优势，而不使用全抗体。片段的尺寸较小允许快速清除，并且可导致改善对实体肿瘤的进入。
已经开发了各种用于产生抗体片段的技术。传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白水解消化而得到的(参见例如Morimoto等人，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24：107-117(1992)；和Brennan等人，Science，229：81(1985))。然而，这些片段现在可以直接由重组宿主细胞产生。Fab、Fv和ScFv抗体片段都可以在大肠杆菌中表达并从中分泌，从而允许容易地产生大量的这些片段。可以从上面讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。可选地，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物中直接分离F(ab′)2片段。包含补救受体结合表位残基，体内半衰期增加的Fab和F(ab′)2片段在美国专利第5,869,046中有描述。产生抗体片段的其它技术对于熟练的技术人员将显而易见。在其它实施方案中，选定的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；美国专利第5,571,894号；和美国专利第5,587,458号。Fv和sFv是唯一具有完整结合位点而没有恒定区的种类；因此，它们在体内使用期间适合减少的非特异性结合。可以构建sFv融合蛋白以在sFv的氨基或羧基末端产生效应蛋白的融合。参见AntibodyEngineering，编辑Borrebaeck，同上。该抗体片段也可以是“线性抗体”，例如美国专利第5,641,870号中所述。
在一个实施方案中，在本文公开的CAR修饰的免疫细胞，优选CAR-T或CAR-NK细胞中使用源自抗足糖萼蛋白抗体的scFv。抗足糖萼蛋白抗体片段中包括可以用作靶向臂，针对CAR-T或CAR-NK细胞的嵌合抗原受体中的足糖萼蛋白肿瘤表位的抗足糖萼蛋白抗体的部分(以及抗足糖萼蛋白抗体的部分的组合，例如scFv)。此类片段不一定是蛋白水解片段，而是可赋予靶标亲和力的多肽序列的部分。
5.双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可以结合本文所描述的足糖萼蛋白的两个不同表位。其它此类抗体可以将足糖萼蛋白结合位点与另一种蛋白质的结合位点组合。可选地，抗足糖萼蛋白臂可与结合白细胞上的触发分子(例如T细胞受体分子(例如CD3))或IgG的Fc受体(FcγR)(例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))的臂组合，以便将细胞防御机制集中并定位于表达足糖萼蛋白的细胞。双特异性抗体也可以用于将细胞毒性剂定位于表达足糖萼蛋白的细胞。这些抗体具有足糖萼蛋白结合臂和结合细胞毒性剂(例如皂草素、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒素A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
WO 96/16673描述了双特异性抗ErbB2/抗FcγRIII抗体并且美国专利第5,837,234号公开了双特异性抗ErbB2/抗FcγRI抗体。WO98/02463中示出了双特异性抗ErbB2/Fcα抗体。美国专利第5,821,337号教导了双特异性抗ErbB2/抗CD3抗体。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等人，Nature 305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四价体瘤)产生10种不同抗体分子的可能混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和色谱法步骤进行的正确分子的纯化有点麻烦，并且产物产量低。WO 93/08829和Traunecker等人，EMBO J.10：3655-3659(1991)中公开了类似程序。
6.效应功能工程化
可能需要就效应功能对本发明的抗体进行修饰，例如以便增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。可选地或另外，可以在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而允许在该区域中形成链间二硫键。这样产生的同型二聚体抗体可具有提高的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人，J.ExpMed.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。如Wolff等人，Cancer Research 53：2560-2565(1993)所述，还可以使用异双功能交联剂制备抗肿瘤活性增强的同型二聚体抗体。可选地，可以工程化抗体，其具有双重Fc区并且因此可以具有增强的补体裂解和
ADCC能力。参见Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。为了增加抗体的血清半衰期，可以将补救受体结合表位并入抗体(尤其是抗体片段)，例如美国专利5,739,277中所述。如本文中所用，术语“补救受体结合表位”是指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的负责增加IgG分子的体内血清半衰期的Fc区表位。
B.某些制备抗体的方法
1.筛选具有所需特性的抗足糖萼蛋白抗体
上面已经描述了用于产生结合足糖萼蛋白多肽的抗体的技术。根据需要，可以进一步选择具有某些生物学特征的抗体。
本发明的抗足糖萼蛋白抗体的生长抑制效果可以通过本领域已知的方法评估，例如使用内源性表达或在用足糖萼蛋白基因转染后表达足糖萼蛋白多肽的细胞。例如，适当的肿瘤细胞系和足糖萼蛋白转染的细胞可用不同浓度的本发明的抗足糖萼蛋白单克隆抗体处理几天(例如2-7)天并用结晶紫或MTT染色或通过一些其它比色测定法分析。另一种测量增殖的方法是通过比较在本发明的抗足糖萼蛋白抗体存在或不存在的情况下处理的细胞对3H-胸腺嘧啶核苷的摄取。处理后，收获细胞并在闪烁计数器中量化并入DNA中的放射量。适当的阳性对照包括用已知会抑制该细胞系生长的生长抑制性抗体处理选定的细胞系。体内肿瘤细胞的生长抑制可以以本领域已知的各种方式测定。肿瘤细胞可以是过度表达足糖萼蛋白多肽的肿瘤细胞。与未处理的肿瘤细胞相比，抗足糖萼蛋白抗体将抑制体外或体内表达足糖萼蛋白的肿瘤细胞的细胞增殖约25-100％，更优选约30-100％，且甚至更优选约50-100％或70-100％，在一个实施方案中，抗体浓度为约0.5至30μg/ml。可以在细胞培养物中在约0.5至30μg/ml或约0.5nM至200nM的抗体浓度下测量生长抑制，其中在肿瘤细胞暴露于抗体1-10天后测定生长抑制。如果以约1μg/kg至约100mg/kg体重施用抗足糖萼蛋白抗体，在首次施用抗体约5天至3个月内，优选在约5至30天内导致肿瘤尺寸减小或肿瘤细胞增殖减少，则抗体在体内具生长抑制性。
为了选择诱导细胞死亡的抗足糖萼蛋白抗体，可以相对于对照评估例如碘化丙啶(PI)、台盼蓝或7AAD摄取所示的膜完整性丧失。可以在补体和免疫效应细胞不存在的情况下进行PI摄取测定。将表达足糖萼蛋白多肽的肿瘤细胞与单独的培养基或含有适当抗足糖萼蛋白抗体(例如约10μg/ml)的培养基一起孵育。将细胞孵育3天时间。每次处理后，洗涤细胞并等分到35mm带过滤器盖的12x75管(每支管1ml，每个处理组3支管)以去除细胞块。然后管接受PI(10μg/ml)。可以使用
Figure BDA0001680380570000541
流式细胞仪和
Figure BDA0001680380570000542
CellQuest软件(Becton Dickinson)分析样品。正如通过PI摄取确定的诱导统计学显著水平的细胞死亡的那些抗足糖萼蛋白抗体可选作诱导细胞死亡的抗足糖萼蛋白抗体。
为了筛选与目标抗体结合的足糖萼蛋白多肽上的表位结合的抗体，可以进行常规交叉阻断测定，例如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，编辑Harlow和David Lane(1988)中描述的交叉阻断测定。该测定可用于确定试验抗体是否与已知的抗足糖萼蛋白抗体结合相同的位点或表位。可选地，或另外，可以通过本领域已知的方法进行表位作图。例如，可以例如通过丙氨酸扫描诱变抗体序列以鉴定接触残基。最初测试突变抗体与多克隆抗体的结合以确保正确折叠。在不同的方法中，对应于足糖萼蛋白多肽的不同区域的肽可以用于与多种试验抗体或一种试验抗体和具有表征或已知的表位的抗体的竞争测定。
另外，还可以使用以下的一种或多种筛选候选抗体的功能：体内筛选对转移的抑制、体外方法对趋化性的抑制(例如，Huntsman等人U.S.2010/0061978，其通过引用整体并入本文)、对血管化的抑制、对肿瘤生长的抑制和肿瘤尺寸的减小。
2.某些文库筛选方法
本发明的抗足糖萼蛋白抗体可以通过使用组合文库来制备以筛选具有所需一种或多种活性的抗体。例如，本领域中已知多种方法用于产生噬菌体展示文库以及筛选此类文库中具有所需结合特征的抗体。此类方法在Hoogenboom等人(2001)的Methods inMolecular Biology 178：1-37(O'Brien等人编辑，Human Press，Totowa，NJ)中，并且在Lee等人(2004)J.Mol.Biol.340：1073-1093的某些实施方案中进行了概述。
原则上，通过筛选含有展示与噬菌体外壳蛋白融合的抗体可变区(Fv)的各种片段的噬菌体的噬菌体文库来选择合成抗体克隆物。通过针对所需抗原的亲和色谱法来淘选此类噬菌体文库。表达能够结合所需抗原的Fv片段的克隆物被吸附到抗原上并因此与文库中的非结合克隆物分离。然后从抗原上洗脱结合克隆物，并且可以通过另外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。可以通过设计合适的抗原筛选程序来选择目标噬菌体克隆物，随后使用来自目标噬菌体克隆物的Fv序列和Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中描述的合适恒定区(Fc)来构建全长抗足糖萼蛋白抗体克隆物而获得本发明的任何抗足糖萼蛋白抗体。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合结构域由两个约110个氨基酸的可变(V)区形成，各自来自于轻链(VL)和重链(VH)，两者均呈现三个高变环(HVR)或互补决定区(CDR)。可变结构域可以功能性地展示在噬菌体上，作为单链Fv(scFv)片段，其中VH和VL通过短的柔性肽共价连接，或作为Fab片段，其中它们各自与恒定结构域融合并且非共价地相互作用，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)中所述。如本文中所用，编码scFv的噬菌体克隆物和编码Fab的噬菌体克隆物统称为“Fv噬菌体克隆物”或“Fv克隆物”。
可以通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆VH和VL基因库，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以搜索其抗原结合克隆物，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)中所述。免疫来源的文库提供了免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。可选地，可以克隆原初库以对广泛的非自身和自身抗原提供人抗体单一来源，而无需任何免疫，如Griffiths等人，EMBO J，12：725-734(1993)所述。最后，也可通过由干细胞克隆未重排的V基因片段并使用含随机序列的PCR引物以合成方式制备原初文库，以编码高变CDR3区并且实现体外重排，如Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。
在某些实施方案中，丝状噬菌体用于通过与次要外壳蛋白pIII融合来展示抗体片段。抗体片段可以展示为单链Fv片段，其中VH和VL结构域通过柔性多肽间隔区连接在相同的多肽链上，例如，如Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述，或展示为Fab片段，其中一条链与pIII融合而另一条链分泌到细菌宿主细胞周质中，其中组装通过置换一些野生型外壳蛋白而变成展示在噬菌体表面的Fab外壳蛋白结构，如Hoogenboom等人，Nucl.Acids Res.，19：4133-4137(1991)中所述。
通常，编码抗体基因片段的核酸是从人或动物收获的免疫细胞获得的。如果需要偏向抗足糖萼蛋白克隆物的文库，则用足糖萼蛋白使受试者免疫以产生抗体反应，并回收脾细胞和/或循环B细胞或其它外周血淋巴细胞(PBL)用于文库构建。在一个优选的实施方案中，通过在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列(并且缺乏功能性内源抗体产生系统)的转基因小鼠中产生抗足糖萼蛋白抗体反应来获得偏向于抗足糖萼蛋白克隆物的人抗体基因片段文库，使得足糖萼蛋白免疫得到产生针对足糖萼蛋白的人抗体的B细胞。下面描述产生人抗体的转基因小鼠的产生。
通过使用合适的筛选程序分离表达足糖萼蛋白特异性膜结合抗体的B细胞，例如通过使用足糖萼蛋白亲和色谱法进行细胞分离或者使细胞吸附到荧光染料标记的足糖萼蛋白上，接着进行流式激活细胞分选(FACS)，可以获得抗足糖萼蛋白反应性细胞群的额外富集。
可选地，来自未免疫供者的脾细胞和/或B细胞或其它PBL的使用提供了可能抗体库更好的代表，并且还容许使用足糖萼蛋白在其中无抗原性的任何动物(人或非人)物种构建抗体文库。对于并入体外抗体基因构建的文库，从受试者收获干细胞以提供编码未重排抗体基因区段的核酸。目标免疫细胞可以从多个动物物种获得，例如人、小鼠、大鼠、兔类、狼、犬、猫、猪、牛、马和鸟类物种等等。
从目标细胞中回收编码抗体可变基因区段(包括VH和VL区段)的核酸并扩增。在重排VH和VL基因文库的情况下，可以通过从淋巴细胞中分离基因组DNA或mRNA，接着用匹配重排VH和VL基因的5′和3′末端的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，获得所需DNA，如Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：3833-3837(1989)所述，从而制备用于表达的不同V基因库。
可由cDNA和基因组DNA扩增V基因，在编码成熟V结构域的外显子的5′末端具有反向引物并且基于J区段内具有正向引物，如Orlandi等人(1989)和Ward等人，Nature，341：544-546(1989)所述。然而，为了从cDNA扩增，反向引物也可以基于前导外显子内，如Jones等人，Biotechnol.，9：88-89(1991)所述，并且正向引物在恒定区内，如Sastry等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：5728-5732(1989)所述。为了最大化互补性，可以在引物中并入简并性，如Orlandi等人(1989)或Sastry等人(1989)所述。在某些实施方案中，通过使用靶向每个V基因家族的PCR引物以便扩增免疫细胞核酸样品中存在的所有可用VH和VL排列来最大化文库多样性，例如，如Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述或如Orum等人的方法，Nucleic Acids Res.，21：4491-4498(1993)中所述。为了将扩增的DNA克隆到表达载体中，如Orlandi等人(1989)所述，可以在PCR引物中在一个末端引入稀有限制性位点作为标签，或通过用Clauson等人，Nature，352：624-628(1991)所述的标记引物进一步PCR扩增。
合成重排的V基因库可以体外源自V基因区段。大多数人VH基因区段已经克隆和测序(在Tomlinson等人，J.Mol.Biol.，227：776-798(1992)中有报道)，并且作图(在Matsuda等人，Nature Genet.，3：88-94(1993)中有报道；这些克隆区段(包括H1和H2环的所有主要构象)可以用于使用编码不同序列和长度的H3环的PCR引物产生不同VH基因库，如Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。也可以使VH库具有的序列多样性都集中在单一长度的长H3环上，如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457-4461(1992)中所述。人Vκ和Vλ区段已经克隆和测序(在Williams和Winter，Eur.J.Immunol.，23：1456-1461(1993)中有报道)并且可用于制备合成轻链库。基于一系列VH和VL折叠以及L3和H3长度的合成V基因库将编码具有相当大结构多样性的抗体。在扩增编码V基因的DNA之后，可以根据Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)的方法，使种系V基因区段在体外重排。
抗体片段库可以通过以几种方式将VH和VL基因库组合在一起来构建。每个库可以在不同的载体中产生，并且载体在体外重组，例如，如Hogrefe等人，Gene，128：119-126(1993)所述，或通过组合感染在体内重组，例如Waterhouse等人，Nucl.Acids Res.，21：2265-2266(1993)中描述的loxP系统。体内重组方法利用Fab片段的双链特性来克服由大肠杆菌转化效率对文库大小强加的限制。原初VH和VL库单独克隆，一个克隆到噬菌粒中而另一个克隆到噬菌体载体中。然后通过噬菌体感染含噬菌粒的细菌将两个文库组合，使得每个细胞含有不同的组合，并且文库大小仅受存在的细胞数量(约1012个克隆)限制。两种载体均含有体内重组信号，以便VH和VL基因重组到单个复制子上并共同包装到噬菌体病毒粒子中。这些巨大的文库提供了大量具有良好亲和力(Kd-1为约10-8M)的不同抗体。
可选地，可将该库依序克隆到相同载体中，例如，如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：7978-7982(1991)所述，或者通过PCR组装在一起，然后克隆，例如，如Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)所述。PCR组装也可用于将VH和VL DNA与编码柔性肽间隔区的DNA连接以形成单链Fv(scFv)库。在另一种技术中，使用“细胞内PCR组装”通过PCR将淋巴细胞内的VH和VL基因组合，然后克隆连接基因库，如Embleton等人，Nucl.Acids Res.，20：3831-3837(1992)所述。
原初文库(天然或合成的)产生的抗体可以具有中等亲和力(Kd-1为约106至107M-1)，但也可以如上文Winter等人(1994)所述，通过构建并从次级文库重新选择在体外模拟亲和力成熟。例如，通过在Hawkins等人，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)的方法中或在Gram等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89：3576-3580(1992)的方法中使用易错聚合酶(在Leung等人，Technique，1：11-15(1989)中有报道)，可以在体外随机引入突变。另外，亲和力成熟可以通过使一个或多个CDR随机突变来进行，例如用携带跨越目标CDR的随机序列的引物，在选定的个体Fv克隆物中使用PCR并筛选更高亲和力的克隆物。WO 9607754(1996年3月14日公开)描述了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区诱导诱变以产生轻链基因文库的方法。另一种有效的方法是将通过噬菌体展示选定的VH或VL结构域与获自未免疫供者的天然存在的V结构域变体库重组，并且在几轮链改组中筛选更高的亲和力，如Marks等人，Biotechnol.，10：779-783(1992)所述。该技术允许产生亲和力为约10-9M或更低的抗体和抗体片段。
文库的筛选可以通过本领域已知的各种技术来实现。例如，足糖萼蛋白可用于涂布吸附板的孔，在固定于吸附板上或用于细胞分选的宿主细胞上表达，或与生物素偶联以用链霉亲和素包被的珠粒捕获，或用于任何其它方法中用于淘选噬菌体展示库。
使噬菌体文库样品在适于结合具有吸附剂的至少一部分噬菌体颗粒的条件下与固定足糖萼蛋白接触。通常，选择包括pH、离子强度、温度等在内的条件以模拟生理条件。洗涤与固相结合的噬菌体，然后用酸洗脱，例如如Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，88：7978-7982(1991)所述，或用碱洗脱，例如Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述，或通过足糖萼蛋白抗原竞争，例如以类似于Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)的抗原竞争方法的程序进行。噬菌体在单轮选择中可以富集20-1,000倍。而且，富集的噬菌体可以在细菌培养物中生长并进行其它轮的选择。
选择效率取决于许多因素，包括洗涤期间解离的动力学，以及单个噬菌体上的多个抗体片段是否可以同时与抗原结合。具有快速解离动力学(和弱结合亲和力)的抗体可通过使用短洗涤、多价噬菌体展示和固相中高包被密度的抗原来保留。高密度不仅通过多价相互作用来稳定噬菌体，而且有利于已经解离的噬菌体重新结合。具有缓慢解离动力学(和良好结合亲和力)的抗体的选择可以通过使用例如Bass等人，Proteins，8：309-314(1990)和WO 92/09690描述的长洗涤和单价噬菌体展示，和如Marks等人，Biotechnol.，10：779-783(1992)描述的低包被密度抗原来促进。
可能在不同亲和力的噬菌体抗体之间进行选择，即使对于足糖萼蛋白的亲和力略有不同。然而，所选抗体的随机突变(例如，如同在一些亲和力成熟技术中进行的那样)可能会产生许多突变体，大部分与抗原结合，并且少数具有较高亲和力。通过限制足糖萼蛋白，稀有的高亲和力噬菌体可竞争出局。为了保留所有更高亲和力的突变体，可以将噬菌体与过量的生物素化足糖萼蛋白一起孵育，但生物素化足糖萼蛋白的摩尔浓度低于对足糖萼蛋白的目标摩尔亲和常数。然后可以通过链霉亲和素包被的顺磁珠粒捕获高亲和力结合噬菌体。此类“平衡捕获”允许根据其结合亲和力来选择抗体，其灵敏度容许从大大过量的具有较低亲和力的噬菌体中分离亲和力高至少两倍的突变克隆物。也可以操纵用于洗涤结合到固相的噬菌体的条件以基于解离动力学进行区分。
可以基于活性选择抗足糖萼蛋白克隆物。在某些实施方案中，本发明提供了与天然表达足糖萼蛋白的活细胞结合的抗足糖萼蛋白抗体。在一个实施方案中，本发明提供了阻断足糖萼蛋白配体和足糖萼蛋白之间的结合，但不阻断足糖萼蛋白配体和第二蛋白之间的结合的抗足糖萼蛋白抗体。可通过以下方式选择对应于此类抗足糖萼蛋白抗体的Fv克隆物：(1)从如上所述的噬菌体文库中分离抗足糖萼蛋白克隆物，并通过使该群体在合适的细菌宿主中生长来任选地扩增分离的噬菌体克隆物群体；(2)选择分别针对其阻断和非阻断活性的足糖萼蛋白和第二蛋白；(3)使抗足糖萼蛋白噬菌体克隆物吸附至固定的足糖萼蛋白上；(4)使用过量的第二蛋白洗脱任何不需要的克隆物，所述克隆物识别与第二蛋白的结合决定簇重叠或共享的足糖萼蛋白结合决定簇；并且(5)洗脱步骤(4)后仍保持吸附的克隆物。任选地，通过一次或多次重复本文所述的选择程序，可以进一步富集具有所需阻断/非阻断特性的克隆物。
使用常规程序(例如通过使用设计用于由杂交瘤或噬菌体DNA模板特异性扩增目标重链和轻链编码区的寡核苷酸引物)，可以容易地分离编码本发明的杂交瘤来源的单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆物的DNA并测序。一经分离，就可将DNA置于表达载体中，然后将表达载体转染至不会另外产生免疫球蛋白的宿主细胞例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以获得重组宿主细胞中所需单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述文章包括Skerra等人，Curr.Opinion inImmunol.，5：256(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs，130：151(1992)。
编码本发明Fv克隆物的DNA可以与编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列组合(例如，适当的DNA序列可以从Kabat等获得，同上)以形成编码全长或部分长度的重链和/或轻链的克隆物。应该理解的是，任何同种型的恒定区均可用于该目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且此类恒定区可以从任何人或动物物种获得。从一种动物(例如人)物种的可变结构域DNA得到，然后与另一动物物种的恒定区DNA融合形成“杂合”、全长重链和/或轻链的编码序列的Fv克隆物，包括在本文所用的“嵌合”和“杂合”抗体的定义中。在某些实施方案中，源自人可变DNA的Fv克隆物与人恒定区DNA融合以形成全长或部分长的人重链和/或轻链的编码序列。
编码源自杂交瘤的抗足糖萼蛋白抗体的DNA也可以被修饰，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代源自杂交瘤克隆物的同源鼠类序列(例如如同在Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)的方法中一样)。可通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接到免疫球蛋白编码序列来进一步修饰编码杂交瘤或Fv克隆物来源的抗体或片段的DNA。这样，制备了“嵌合”或“杂合”抗体，其具有本发明的Fv克隆物或杂交瘤克隆物来源的抗体的结合特异性。
3.使用CAR T细胞产生抗体
本发明的抗足糖萼蛋白抗体可以通过使用CAR T细胞平台来制备以筛选具有所需一种或多种活性的抗体。嵌合抗原受体(CAR)由附着于跨膜和细胞质信号传导结构域的细胞外抗原识别结构域(通常是单链可变片段(scFv)抗体)组成。Alvarez-Vallina，L，CurrGene Ther1：385-397(2001)。CAR介导的识别将细胞表面上表达的肿瘤相关抗原(TAA)转化为效应功能的募集点，从而解决效应细胞的主要组织相容性复合物非依赖性激活的目标。通过使基于scFv的TAA结合结构域与通常源自T细胞受体(TCR)/CD3复合物的ζ链或源自与某些Fc受体相关的γ链的细胞质信号传导结构域融合来构建第一代CAR。Gross，G.等人，Proc Natl Acad Sci USA 86：10024-10028(1989)。还已开发了第二代CAR(CARv2)，其包含与源自T细胞共刺激受体CD28、4-1BB(CD137)或OX40(CD134)的信号传导结构域串联的TCRζ信号传导区。Sanz，L.等人，Trends Immunol25：85-91(2004)。
遇到抗原后，转基因CAR的相互作用触发效应功能并可介导肿瘤细胞的细胞溶解。CAR方法的实用性和有效性已经在多种动物模型中得到证实，并且正在进行使用基于CAR的经基因工程化的T淋巴细胞治疗癌症患者的临床试验。Lipowska-Bhalla，G.等人，CancerImmunol Immunother 61：953-962(2012)。CAR能够将效应细胞靶向任何天然的细胞外抗原，其中存在合适的抗体。经工程化的细胞不仅可以靶向蛋白质，而且可以靶向诸如碳水化合物和糖脂肿瘤抗原等结构。Mezzanzanica，D.等人，Cancer Gene Ther5：401--407(1998)；Kershaw，MH.等人，Nat Rev Immunol5：928-940(2005)。
目前产生重组抗体的方法主要基于使用纯化蛋白。Hoogenboom，H.R.等人，NatBiotechnol 23：1105-1116(2005)。然而，最近已经描述了基于哺乳动物细胞的抗体展示平台，其利用了T淋巴细胞的功能性能力。Alonso-Camino等人，Molecular Therapy NucleicAcids(2013)2，e93。作为CAR介导的信号传导的一部分，T淋巴细胞表面上抗体的展示可以理想地将抗原-抗体相互作用与细胞表型的明显变化联系起来，这是由于激活标志物的表面表达。Alonso-Camino，V.等人，PLoS ONE 4：e7174(2009)。通过使用识别TAA的基于scFv的CAR，已经证明将CAR介导的激活与CD69+T细胞的荧光激活细胞分选(FACS)相结合使得可能将结合剂分离到表面TAA，两轮后富集因子为至少103倍，产生表达TAA特异性CAR的均匀T细胞群。Alonso-Camino，V等人，PLoS ONE 4：e7174(2009)。
D.抗足糖萼蛋白抗体变体和修饰
1.变体
除了本文描述的抗足糖萼蛋白抗体之外，考虑到可以制备抗足糖萼蛋白抗体变体。可以通过向编码DNA中引入适当的核苷酸变化，和/或通过合成所需的抗体或多肽，制备抗足糖萼蛋白抗体变体。本领域技术人员将认识到，氨基酸变化可以改变抗足糖萼蛋白抗体的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数量或位置或改变膜锚定特征。
例如，可以使用例如在美国专利第5,364,934号中阐述的保守性和非保守性突变的任何技术和指导来产生本文描述的抗足糖萼蛋白抗体的变异。变异可以是编码抗体或多肽的一个或多个密码子的取代、缺失或插入，与天然序列抗体或多肽相比，导致氨基酸序列发生变化。任选地，所述变异是通过在抗足糖萼蛋白抗体的一个或多个结构域中用任何其它氨基酸取代至少一个氨基酸。通过比较抗足糖萼蛋白抗体的序列与同源已知蛋白质分子的序列并将高度同源性区域内产生的氨基酸序列变化的数量减到最少，可以发现确定哪些氨基酸残基可以插入、取代或缺失而不会对所需活性产生不利影响的指导。氨基酸取代可以是将一个氨基酸用具有相似结构和/或化学特性的另一氨基酸置换，例如用丝氨酸置换亮氨酸，即保守氨基酸置换的结果。插入或缺失可任选地在约1至5个氨基酸的范围内。可以通过在序列中系统地进行氨基酸插入、缺失或取代并测试所得变体由全长或成熟的天然序列所显示的活性来确定允许的变异。
本文提供了抗足糖萼蛋白抗体片段。例如，与全长天然抗体或蛋白质相比时，可以在N端或C端截短此类片段，或可以缺少内部残基。某些片段缺少对于抗足糖萼蛋白抗体的所需生物学活性而言不是必需的氨基酸残基。
抗足糖萼蛋白抗体片段可以通过许多常规技术中的任何一种来制备。所需的肽片段可以化学合成。替代方法涉及通过酶消化，例如通过用已知在特定氨基酸残基限定的位点裂解蛋白质的酶处理蛋白质，或通过用合适的限制酶消化DNA并分离所需片段来产生抗体或多肽片段。另一种合适的技术涉及通过聚合酶链式反应(PCR)分离和扩增编码所需抗体或多肽片段的DNA片段。定义DNA片段所需末端的寡核苷酸用于PCR中的5′和3′引物处。优选地，抗足糖萼蛋白抗体片段与本文公开的天然抗足糖萼蛋白抗体共有至少一种生物学和/或免疫学活性。
在特定实施方案中，表1中在优选取代的表头下显示了目标保守性取代。如果此类取代导致生物学活性的变化，则引入表1中称为示例性取代的，或如下文根据氨基酸类别进一步描述的更实质性的变化，并筛选产物。
表1
Figure BDA0001680380570000661
通过选择对维持以下方面的影响显著不同的取代来实现抗足糖萼蛋白抗体的功能或免疫学同一性上的实质性修饰：(a)取代区域中多肽主链的结构(例如作为折叠或螺旋)，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。天然存在的残基可根据共同的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性亲水性：cys、ser、thr；
(3)酸性：asp、glu；
(4)碱性：asn、gln、his、lys、arg；
(5)影响链取向的残基：gly、pro；和
(6)芳香族：trp、tyr、phe。
非保守性取代将需要将这些类别之一的成员换成另一类别。也可以将此类经取代的残基引入保守性取代位点，或更优选引入其余(非保守性)位点。
可以使用本领域已知的方法产生变异，例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变。定点诱变[Carter等人，Nucl.Acids Res.，13：4331(1986)；Zoller等人，Nucl.Acids Res.，10：6487(1987)]、盒式诱变[Wells等人，Gene，34：315(1985)]、限制性选择诱变[Wells等人，Philos.Trans.R.Soc.London SerA，317：415(1986)]或其它已知技术可以对克隆的DNA进行以产生抗足糖萼蛋白抗体变体DNA。
扫描氨基酸分析也可用于沿着连续序列鉴定一个或多个氨基酸。优选的扫描氨基酸是相对小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是该类中优选的扫描氨基酸，因为它消除了β-碳以外的侧链并且不太可能会改变变体的主链构象[Cunningham和Wells，Science，244：1081-1085(1989)]。通常也优选丙氨酸，因为它是最常见的氨基酸。此外，经常在隐藏和暴露位置发现它[Creighton，The Proteins，(W.H.Freeman&Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，150：1(1976)]。如果丙氨酸取代未产生足够量的变体，则可以使用电子等排氨基酸。
任何不参与维持抗足糖萼蛋白抗体的正确构象的半胱氨酸残基也可以通常用丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可以向抗足糖萼蛋白抗体中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是在抗体是抗体片段如Fv片段的情况下)。
特别优选的取代变体类型涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体将相对于产生其的亲本抗体具有改善的生物学特性。产生此类取代变体的适宜便利方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，使几个高变区位点(例如6-7个位点)突变在每个位点产生所有可能的氨基酸取代。这样产生的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒中作为与包装在每个颗粒内的M13的基因III产物的融合物展示。然后如本文所公开的，筛选噬菌体展示变体的生物学活性(例如，结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。可选地或另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体与足糖萼蛋白多肽之间的接触点可能是有益的。此类接触残基和相邻残基是根据本文详细阐述的技术进行取代的候选物。一旦产生此类变体，就将该组变体进行如本文所述的筛选，并且可以选择在一个或多个相关测定中具有优良特性的抗体用于进一步开发。
编码抗足糖萼蛋白抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源中分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)或通过寡核苷酸介导(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变早期制备的抗足糖萼蛋白抗体的变体或非变体形式来制备。
2.修饰
抗足糖萼蛋白抗体的共价修饰包括在本发明的范围内。一种类型的共价修饰包括使抗足糖萼蛋白抗体的靶向氨基酸残基与能够与抗足糖萼蛋白抗体的选定侧链或N或C末端残基反应的有机衍生剂反应。例如，用双功能试剂进行的衍生化可用于使抗足糖萼蛋白抗体与不溶于水的支撑基质或表面交联以用于纯化抗足糖萼蛋白抗体的方法中，反之亦然。常用的交联剂包括例如1，1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如与4-叠氮基水杨酸的酯、同型双功能亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚胺酯如3，3′-二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯)、双功能马来酰亚胺如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷和试剂如甲基-3-[(对叠氮基苯基)二硫代]丙亚氨酸酯。
其它修饰包括将谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基，脯氨酸和赖氨酸羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基甲基化[T.E.Creighton，Proteins：Structure and MolecularProperties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，pp.79-86(1983)]，N端胺乙酰化和任何C端羧基酰胺化。
包括在本发明范围内的抗足糖萼蛋白抗体的另一种类型的共价修饰包括改变抗体或多肽的天然糖基化模式。“改变天然糖基化模式”对于本文的目的旨在意指删除天然序列抗足糖萼蛋白抗体中发现的一个或多个碳水化合物部分(通过去除潜在的糖基化位点或通过用化学和/或酶促方法删除糖基化)，和/或添加天然序列抗足糖萼蛋白抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。另外，该短语包括天然蛋白质糖基化的质变，涉及存在的各个碳水化合物部分的特性和比例的变化。
抗体和其它多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分附接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是用于将碳水化合物部分酶促附接到天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中的任一个的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺(N-aceylgalactosamine)、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸的附接，所述羟基氨基酸最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
通过改变氨基酸序列使其含有上述三肽序列中的一个或多个(对于N-连接的糖基化位点)，可方便地将糖基化位点添加到抗足糖萼蛋白抗体中。还可以通过向原始抗足糖萼蛋白抗体的序列(对于O-连接的糖基化位点)添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代来进行改变。可以任选地通过DNA水平的变化，特别是通过使编码抗足糖萼蛋白抗体的DNA在预选碱基处突变，从而产生将会翻译成所需氨基酸的密码子来改变抗足糖萼蛋白抗体氨基酸序列。
增加抗足糖萼蛋白抗体上碳水化合物部分的数量的另一种方式是通过糖苷与多肽的化学或酶促偶联。此类方法在本领域中有描述，例如1987年9月11日公布的WO 87/05330及Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306页(1981)。
抗足糖萼蛋白抗体上存在的碳水化合物部分的去除可通过化学或酶促方式或通过编码作为糖基化靶标的氨基酸残基的密码子的突变取代来完成。化学去糖基化技术是本领域中已知的并且例如由Hakimuddin等人，Arch.Biochem.Biophys.，259：52(1987)及Edge等人，Anal.Biochem.，118：131(1981)进行了描述。多肽上碳水化合物部分的酶促裂解可以通过使用多种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现，如Thotakura等人，Meth.Enzymol.，138：350(1987)所述。
E.抗足糖萼蛋白抗体的制备
下面的描述主要涉及通过培养用含有编码抗足糖萼蛋白抗体的核酸的载体转化或转染的细胞来产生抗足糖萼蛋白抗体。当然，考虑到可以采用本领域公知的替代方法来制备抗足糖萼蛋白抗体。例如，可以使用固相技术通过直接肽合成来产生适当的氨基酸序列或其部分[参见例如，Stewart等人，Solid-Phase Peptide Synthesis，W.H.FreemanCo.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154(1963)]。可以使用手动技术或通过自动化来进行体外蛋白质合成。例如，可以使用Applied BiosystemsPeptide Synthesizer(Foster City，CA)，使用制造商的说明书来完成自动合成。抗足糖萼蛋白抗体的各个部分可以单独化学合成并使用化学或酶促方法组合以产生所需的抗足糖萼蛋白抗体。
1.编码抗足糖萼蛋白抗体的DNA的分离
编码抗足糖萼蛋白抗体的DNA可以从由认为具有抗足糖萼蛋白抗体mRNA并使其以可检测水平表达的组织制备的cDNA文库获得。因此，可以从由人体组织制备的cDNA文库方便地获得人抗足糖萼蛋白抗体DNA。编码抗足糖萼蛋白抗体的基因也可以从基因组文库获得或通过已知的合成程序(例如自动化核酸合成)获得。
可以用探针(例如至少约20-80个碱基的寡核苷酸)筛选文库，所述探针设计用于鉴定目标基因或由其编码的蛋白质。用所选探针筛选cDNA或基因组文库可以使用标准程序进行，例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual (New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述。分离编码抗足糖萼蛋白抗体的基因的另一种方式是使用PCR方法[Sambrook等人，同上；Dieffenbach等人，PCR Primer：ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995)]。
筛选cDNA文库的技术是本领域公知的。选作探针的寡核苷酸序列应该具有足够长度并且足够明确，以使假阳性最小化。优选标记寡核苷酸，使其可以在与正在筛选的文库中的DNA杂交后被检测到。标记方法是本领域公知的，并且包括使用放射性标记如32P标记的ATP、生物素化或酶标记。上文Sambrook等人提供了包括中度严格性和高度严格性的杂交条件。
可以将此类文库筛选方法中鉴定出的序列与公共数据库如GenBank或其它私有序列数据库中存储和获得的其它已知序列进行比较和比对。可以使用本领域已知的和如本文所描述的方法来确定分子的限定区域内或全长序列上的序列同一性(在氨基酸或核苷酸水平)。
可以通过使用本文首次公开的推导氨基酸序列筛选选定的cDNA或基因组文库，并且如果需要，使用如上文Sambrook等人所描述的常规引物延伸程序，检测可能尚未逆转录成cDNA的mRNA前体和加工中间体而获得具有蛋白质编码序列的核酸。
2.宿主细胞的选择和转化
用本文描述的表达或克隆载体转染或转化宿主细胞以产生抗足糖萼蛋白抗体，并在常规营养培养基中培养，所述营养培养基经适当修饰用于诱导启动子，选择转化株或扩增编码所需序列的基因。培养条件，如培养基、温度、pH等，可以由技术人员选择，无需过度实验。通常，用于最大化细胞培养物生产率的原理、方案和实用技术可见于Mammalian CellBiotechnology：a Practical Approach，M.Butler编辑(IRL Press，1991)和Sambrook等人，同上。
真核细胞转染和原核细胞转化，意指将DNA引入宿主内使得DNA可作为外染色体或染色体组成部分复制的方法普通技术人员已知的，例如CaCl2、CaPO4、脂质体介导的聚乙二醇/DMSO和电穿孔。根据使用的宿主细胞，使用适于此类细胞的标准技术进行转化。如上文Sambrook等人所述，采用氯化钙的钙处理，或电穿孔通常用于原核生物。如Shaw等人，Gene，23：315(1983)和1989年6月29日公开的WO 89/05859所述，使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染转化某些植物细胞。对于没有此类细胞壁的哺乳动物细胞，可以采用Graham和van der Eb，Virology，52：456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。美国专利第4,399,216号中已经描述了哺乳动物细胞宿主系统转染的一般方面。通常根据VanSolingen等人，J.Bact.，130：946(1977)和Hsiao等人，Proc.，Natl.Acad.Sci.(USA)，76：3829(1979)的方法进行向酵母中的转化。然而，也可以使用其它向细胞内引入DNA的方法，例如通过核显微注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞的融合或聚阳离子，例如聚凝胺、聚鸟氨酸。转化哺乳动物细胞的各种技术，参见Keown等人，Methods in Enzymology，185：527-537(1990)和Mansour等人，Nature，336：348-352(1988)。
本文用于在载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞包括原核生物、酵母或高等真核生物细胞。
a.原核宿主细胞
合适的原核生物包括但不限于古细菌和真细菌，如革兰氏阴性(Gram-negative)或革兰氏阳性(Gram-positive)生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如大肠杆菌。各种大肠杆菌菌株是公开可用的，例如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)和K5772(ATCC 53,635)。其它合适的原核宿主细胞包括肠杆菌科如埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans))和志贺氏菌属(Shigella)以及杆菌属(Bacilli)(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))(例如，1989年4月12日公布的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)、副球菌属(Paracoccus)和链霉菌属(Streptomyces)。这些实例为说明性而非限制性的。菌株W3110是一种特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是用于重组DNA产物发酵的常见宿主菌株。优选地，宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，菌株W3110(Bachmann，Cellular and Molecular Biology，第2卷(Washington，D.C.：American Society for Microbiology，1987)，第1190-1219页；ATCC保藏号27,325)可以被修饰以在编码宿主内源性蛋白质的基因中实现基因突变，此类宿主的实例包括具有完整基因型tonA的大肠杆菌W3110菌株1A2；有完整基因型tonA ptr3的大肠杆菌W3110菌株9E4；具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kanr的大肠杆菌W3110菌株27C7(ATCC 55,244)；具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr的大肠杆菌W3110菌株37D6；大肠杆菌W3110菌株40B4，其是具有非卡那霉素(kanamycin)抗性degP缺失突变的菌株37D6；具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3lac Iq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR的大肠杆菌W3110菌株33D3(美国专利第5,639,635号)和1990年8月7日公布的美国专利第4,946,783号中公开的具有突变周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。诸如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)的其它菌株和衍生物也是合适的。这些实例为说明性而非限制性的。用于构建以上提到的具有限定基因型的任何细菌的衍生物的方法是本领域中已知的，并且在例如Bass等人，Proteins，8：309-314(1990)中有所描述。通常需要考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适当的细菌。例如，当使用公知质粒如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属或沙门氏菌属物种可适合用作宿主。通常，宿主细胞应该分泌最小量的蛋白水解酶，并且可以理想地将另外的蛋白酶抑制剂并入细胞培养物中。可选地，体外克隆方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反应是合适的。
全长抗体、抗体片段和抗体融合蛋白可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应功能时。全长抗体具有更大的循环半衰期。在大肠杆菌中的产生速度更快且成本效益更高。对于细菌中抗体片段和多肽的表达，参见例如，描述翻译起始区域(TIR)和用于优化表达和分泌的信号序列的US 5,648,237(Carter等人)，US 5,789,199(Joly等人)和US5,840,523(Simmons等人)，这些专利通过引用并入本文。表达后，从大肠杆菌细胞糊浆中分离出呈可溶级分的抗体，并且可根据同种型通过例如蛋白质A或G柱纯化。可类似于纯化例如CHO细胞中表达的抗体的过程来进行最终纯化。
b.真核宿主细胞
除了原核生物以外，真核微生物如丝状真菌或酵母是适于编码抗足糖萼蛋白抗体的载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。其它的还包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse，Nature，290：140[1981]；1985年5月2日公开的EP 139,383)；克鲁维酵母(Kluyveromyce)宿主(美国专利第4,943,529号；Fleer等人，Bio/Technology，9：968-975(1991))，例如乳酸克鲁维酵母(K.1actis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt等人，J.Bacteriol.，154(2)：737-742[1983])、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、沃尔蒂克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906；Van den Berg等人，Bio/Technology，8：135(1990))、嗜热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070；Sreekrishna等人，J.BasicMicrobiol.，28：265-278[1988])；念珠菌属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(Case等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：5259-5263[1979])；许旺酵母属(Schwanniomyces)例如西方许旺酵母菌(Schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日公开的EP 394,538)；和丝状真菌，例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)(1991年1月10日公开的WO 91/00357)和曲霉属(Aspergillus)宿主如构巢曲霉(A.nidulans)(Ballance等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，112：284-289[1983]；Tilburn等人，Gene，26：205-221[1983]；Yelton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：1470-1474[1984])和黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes，EMBO J.，4：475-479[1985])。甲基营养型酵母是本文中合适的并且包括但不限于能够依靠甲醇生长的酵母，选自汉逊酵母属(Hansenula)、念珠菌属、克勒克酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)和红酵母属(Rhodotorula)。在C.Anthony，The Biochemistry ofMethylotrophs，269(1982)中可以找到为这类酵母的示例的具体种类列表。
用于表达糖基化抗足糖萼蛋白抗体的合适的宿主细胞源自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括昆虫细胞如果蝇S2(Drosophila S2)和夜蛾Sf9(Spodoptera Sf9)，以及植物细胞如棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的细胞培养物。已经鉴定了来自诸如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)的宿主的许多杆状病毒株和变体以及相应许可的昆虫宿主细胞。用于转染的多种病毒株公开可用，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa califomica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5菌株，且此类病毒可在本文中根据本发明用作病毒，尤其是用于转染草地贪夜蛾细胞。
然而，脊椎动物细胞最受关注，且脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1系；人胚肾系(亚克隆用于悬浮培养生长的293或293，Graham等人，J.GenVirol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠塞尔托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤系(Hep G2)。
用上述表达或克隆载体转化宿主细胞以产生抗足糖萼蛋白抗体，并在常规营养培养基中培养，所述营养培养基经适当修饰用于诱导启动子，选择转化株或扩增编码所需序列的基因。
3.可复制载体的选择和使用
为了重组生产本发明的抗体，分离编码抗体的核酸(例如cDNA或基因组DNA)并插入到可复制载体中用于进一步克隆(扩增DNA)或表达。编码抗体的DNA易于使用常规方法分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。许多载体可用。载体的选择部分取决于要使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞是原核生物或真核生物(通常是哺乳动物)来源的。
载体可以例如呈质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过多种程序将适当的核酸序列插入载体中。通常，使用本领域已知的技术将DNA插入适当的限制性核酸内切酶位点中。载体组件通常包括但不限于如下一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。含有这些组件中的一个或多个的合适载体的构建采用技术人员已知的标准连接技术。
所述足糖萼蛋白不仅可以直接重组产生，而且还可以作为与异源多肽的融合多肽产生，所述异源多肽可以是信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N端具有特异性裂解位点的其它多肽。通常，信号序列可以是载体的组件，或者可以是插入载体中的编码抗足糖萼蛋白抗体的DNA的一部分。信号序列可以是例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定性肠毒素II前导序列的原核生物信号序列。对于酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酵母属和克鲁维酵母属α因子前导序列，后者在美国专利第5,010,182号中有描述)或酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列(1990年4月4日公布的EP 362,179)或1990年11月15日公布的WO 90/13646中描述的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列可用于指导蛋白质的分泌，例如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列以及病毒分泌前导序列。
a.原核宿主细胞
编码本发明抗体的多肽组分的多核苷酸序列可以使用标准重组技术获得。所需多核苷酸序列可以从抗体产生细胞例如杂交瘤细胞中分离并测序。可选地，可以使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，就将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域可用和已知的许多载体可用于本发明的目的。适当载体的选择将主要取决于待插入载体的核酸的大小和待用载体转化的特定宿主细胞。根据其功能(异源多核苷酸的扩增或表达，或两者)及其与其所在的特定宿主细胞的相容性，每个载体含有不同组件。
通常，含有源自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体连同这些宿主一起使用。表达载体和克隆载体均含有使载体能够在一种或多种选定的宿主细胞内复制的核酸序列，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。此类序列对于多种细菌、酵母和病毒而言是公知的。来自含有编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因并因此提供了鉴定转化细胞的容易方式的质粒pBR322的复制起点，适于大多数革兰氏阴性细菌，该2μ质粒起点适于酵母，并且各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。pBR322、其衍生物或其它微生物质粒或噬菌体还可以含有或被修饰为含有可被微生物用于表达内源性蛋白质的启动子。Carter等人，美国专利第5,648,237号中详细描述了用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例。
另外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可连同这些宿主用作转化载体。例如，诸如λGEMTM-11的噬菌体可用于制备可用于转化易感宿主细胞如大肠杆菌LE392的重组载体。
本发明的表达载体可以包含两个或更多个编码每种多肽组分的启动子-顺反子对。启动子是位于调节其表达的顺反子上游(5′)的非翻译调控序列。原核启动子通常分为两类，诱导型和组成型。诱导型启动子是响应于培养条件的变化，例如营养物的存在或不存在或温度变化，引发受其控制的顺反子转录水平升高的启动子。
大量被各种潜在宿主细胞识别的启动子是公知的。可通过限制性酶消化从源DNA取出启动子并将分离的启动子序列插入本发明的载体中而使所选启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作地连接。天然启动子序列和许多异源启动子两种都可以用于指导靶基因的扩增和/或表达。在一些实施方案中，利用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常容许表达的靶基因更高的转录和更高的产量。
被各种潜在宿主细胞识别的启动子是公知的。适合与原核宿主一起使用的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖苷酶和乳糖启动子系统[Chang等人，Nature，275：615(1978)；Goeddel等人，Nature，281：544(1979)]、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统[Goeddel，Nucleic Acids Res.，8：4057(1980)EP 36,776]和杂合启动子如tac[deBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：21-25(1983)]或trc启动子。用于细菌系统的启动子也将含有与编码抗足糖萼蛋白抗体的DNA可操作地连接的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。然而，在细菌中有功能的其它启动子(例如其它已知细菌或噬菌体启动子)也合适。已经公开了其核苷酸序列，从而使熟练技工使用接头或适配子可操作地将其连接到编码目标轻链和重链的顺反子(Siebenlist等人(1980)Cell 20：269)以提供任何所需的限制性位点。
在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子包含指导所表达的多肽易位穿过膜的分泌信号序列组件。通常，信号序列可以是载体的组件，或者可以是插入载体中的靶多肽DNA的一部分。为了本发明的目的选择的信号序列应该是被宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶裂解)的信号序列。对于不识别和加工异源多肽天然信号序列的原核宿主细胞，信号序列被选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP的原核信号序列取代。在本发明的一个实施方案中，表达系统的两个顺反子中使用的信号序列是STII信号序列或其变体。
另一方面，根据本发明的免疫球蛋白的产生可以发生在宿主细胞的细胞质中，因此不需要每个顺反子内都存在分泌信号序列。在这一点上，使免疫球蛋白轻链和重链表达、折叠和组装以在细胞质内形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如，大肠杆菌trxB菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而容许表达的蛋白质亚基正确折叠和组装。Proba和Pluckthun Gene，159：203(1995)。
本发明提供了一种表达系统，其中可以调节表达的多肽组分的定量比，以便使本发明分泌和正确组装的抗体的产量最大化。此类调节至少部分通过同时调节多肽组分的翻译强度来完成。
一种用于调节翻译强度的技术公开于Simmons等人，美国专利第5,840,523号中。它利用顺反子内翻译起始区域(TIR)的变体。对于给定TIR，可以产生一系列具有一定范围的翻译强度的氨基酸或核酸序列变体，从而提供了用于对特定链的所需表达水平调整该因子的便利手段。尽管优选核苷酸序列内的沉默变化，但是可通过常规诱变技术产生TIR变体，所述常规诱变技术产生可以改变氨基酸序列的密码子变化。TIR中的改变可以包括例如Shine-Dalgamo序列的数量或间隔的改变，以及信号序列的改变。产生突变信号序列的一种方法是在不改变信号序列的氨基酸序列(即变化是沉默的)的编码序列起点产生“密码子库”。这可以通过改变每个密码子的第三个核苷酸位置来实现；另外，一些氨基酸，例如亮氨酸、丝氨酸和精氨酸具有多个第一和第二位置，这可增加该库的复杂性。这种诱变方法在Yansura等人(1992)METHODS：A Companion to Methods in Enzymol.4：151-158中进行了描述。
优选地，为其中每个顺反子产生一组具有一定范围的TIR强度的载体。该限定组提供了各种TIR强度组合下每条链表达水平以及所需抗体产物产量的比较。TIR强度可以通过量化报告基因的表达水平来测定，如Simmons等人美国专利第5,840,523中所详述。基于翻译强度比较，选择所需个体TIR以在本发明的表达载体构建体中组合。
b.真核宿主细胞
载体组件通常包括但不限于如下一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
(1)信号序列组件
用于真核宿主细胞的载体还可以含有信号序列或在目标成熟蛋白或多肽的N端具有特异性裂解位点的其它多肽。优选选择的异源信号序列是被宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶裂解)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可获得哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号序列。
此类前体区的DNA在阅读框中与编码抗体的DNA连接。
(2)复制起点
通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组件。例如，SV40起点通常可能仅仅因其含有早期启动子而被使用。
(3)选择基因组件
表达和克隆载体通常将含有选择基因，也称为选择标志物。典型的选择基因编码的蛋白质(a)赋予针对抗生素或其它毒素例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性，(b)补充营养缺陷型缺陷，或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物，例如编码杆菌属D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个实例利用药物来阻止宿主细胞生长。那些用异源基因成功转化的细胞产生赋予药物抗性的蛋白质并因此在选择方案中存活。此类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标志物的实例是使得能够鉴定有能力摄取编码抗足糖萼蛋白抗体的核酸的细胞的那些，如DHFR或胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II，优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。采用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是缺乏DHFR活性的CHO细胞系(例如，ATCC CRL-9096)，如Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980)所述进行制备和繁殖。例如，首先通过在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有转化株来鉴定用DHFR选择基因转化的细胞。可选地，可以通过在含有选择标志物的选择剂(例如氨基糖苷类抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G418)的培养基中的细胞生长来选择用编码抗体、野生型DHFR蛋白和另一选择标志物如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是含有内源DHFR的野生型宿主)。参见美国专利号第4,965,199号。
用于酵母的合适选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因[Stinchcomb等人，Nature，282：39(1979)；Kingsman等人，Gene，7：141(1979)；Tschemper等人，Gene，10：157(1980)]。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株提供了选择标志物，例如ATCC 44076号或PEP4-1[Jones，Genetics，85：12(1977)]。
(4)启动子组件
表达和克隆载体通常含有与编码抗足糖萼蛋白抗体的核酸序列可操作地连接以指导mRNA合成的启动子。被各种潜在宿主细胞识别的启动子是公知的。
实际上，所有真核生物基因具有位于转录起始位点上游约25至30个碱基处的富AT区。在许多基因的转录起点的上游70至80个碱基处发现的另一个序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′末端是AATAAA序列，其可以是用于向编码序列的3′末端添加polyA尾的信号序列。所有这些序列适当地插入真核表达载体中。
与酵母宿主一起使用的合适的启动序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶的启动子[Hitzeman等人，J.Biol.Chem.，255：2073(1980)]或其它糖酵解酶[Hess等人，J.Adv.Enzyme Reg.，7：149(1968)；Holland，Biochemistry，17：4900(1978)]，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。
其它酵母启动子(是具有转录受生长条件控制的附加优点的诱导型启动子)是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。EP 73,657中进一步描述了适合用于酵母表达的载体和启动子。
例如，通过从病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2,211,504)、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)的基因组，从异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，以及从热休克启动子获得的启动子控制哺乳动物宿主细胞中抗足糖萼蛋白从载体的转录，只要此类启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子可方便地作为也含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段获得。人巨细胞病毒的立即早期启动子方便地作为HindIII E限制性片段获得。美国专利第4,419,446号公开了一种使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利第4,601,978号描述了这种系统的改进。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下人□β-干扰素cDNA的表达，还请参见Reyes等人，Nature297：598-601(1982)。可选地，劳氏肉瘤(Rous Sarcoma)病毒长末端重复序列可用作启动子。
(5)增强子元件组件
通过将增强子序列插入载体可以增加高等真核生物对编码抗足糖萼蛋白抗体的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10-300bp，作用于启动子以增加其转录。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)。然而，通常会使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点后侧的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。关于用于激活真核生物启动子的增强元件，还请参见Yaniv，Nature 297：17-18(1982)。增强子可以剪接到载体中抗足糖萼蛋白抗体编码序列的5′或3′位置，但优选位于启动子的5′位点。
(6)转录终止组件
在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体也将含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核生物或病毒DNA或cDNA的5′和偶尔3′非翻译区获得。这些区域含有在编码抗足糖萼蛋白抗体的mRNA的非翻译部分中转录为聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026和其中公开的表达载体。
适用于在重组脊椎动物细胞培养物中合成抗足糖萼蛋白抗体的其它方法、载体和宿主细胞在Gething等人，Nature，293：620-625(1981)Mantei等人，Nature，281：40-46(1979)；EP 117,060；和EP 117,058中有描述。
4.培养宿主细胞
用于产生本发明的抗足糖萼蛋白抗体的宿主细胞可以在各种培养基中培养。
a.原核宿主细胞
用于产生本发明多肽的原核细胞在本领域已知的并且适合培养所选宿主细胞的培养基中生长。合适的培养基的实例包括luria肉汤(LB)加上必需的营养补充剂。在一些实施方案中，培养基还含有基于表达载体的构建而选定的选择剂，以选择性地容许含有表达载体的原核细胞生长。例如，向培养基中添加氨苄青霉素，以使表达氨苄青霉素抗性基因的细胞生长。
除了碳、氮和无机磷酸盐来源以外的任何必需补充剂也可以以适当浓度包括在内，单独引入或作为与另一补充剂或培养基例如复合氮源的混合物一起引入。任选地，培养基可以含有一种或多种选自谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、硫代乙醇酸盐、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇的还原剂。
原核宿主细胞在合适的温度下培养。例如，为了大肠杆菌生长，优选的温度范围为约20℃至约39℃，更优选约25℃至约37℃，甚至更优选约30℃。培养基的pH可以是范围约5至约9的任何pH，这主要取决于宿主生物。对于大肠杆菌，pH优选为约6.8至约7.4，并且更优选约7.0。
如果在本发明的表达载体中使用诱导型启动子，则在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，PhoA启动子用于控制多肽的转录。因此，转化的宿主细胞在磷酸盐限制性培养基中培养进行诱导。优选地，磷酸盐限制性培养基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons等人，J.Immunol.Methods(2002)，263：133-147)。如本领域已知，根据采用的载体构建体可以使用各种其它诱导剂。
在一个实施方案中，本发明表达的多肽分泌到宿主细胞周质中并从其中回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物，通常通过诸如渗透压休克、超声处理或溶解等手段。细胞一经破坏，就可以通过离心或过滤去除细胞碎片或全细胞。例如，可以通过亲和树脂色谱法进一步纯化蛋白质。可选地，可以将蛋白质运输到培养基中并在其中分离。可以从培养物中去除细胞，过滤并浓缩培养物上清液以进一步纯化产生的蛋白质。表达的多肽可以使用通常已知的方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和蛋白质印迹测定法进一步分离和鉴定。
在本发明的一个方面中，通过发酵过程进行大量抗体生产。各种大规模分批补料发酵程序可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧气和营养物，尤其是葡萄糖(优选的碳/能源)。小规模发酵通常是指在体积容量不超过约100升并且范围可以为约1升至约100升的发酵罐中发酵。
在发酵过程中，通常使细胞在合适的条件下生长至所需密度，例如OD 550为约180-220之后，在该阶段细胞处于早期稳定期，引发蛋白质表达的诱导。如本领域已知且如上所述，根据采用的载体构建体可以使用各种诱导剂。诱导前可以使细胞生长较短时间。尽管可以使用更长或更短的诱导时间，但通常诱导细胞约12-50小时。
为了提高本发明多肽的生产产量和质量，可以改变各种发酵条件。例如，为了改善分泌的抗体多肽的正确组装和折叠，可以使用过表达伴侣蛋白的附加载体如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣蛋白活性的肽基脯氨酰顺、反式异构酶)共转化宿主原核细胞。已经证实伴侣蛋白利于细菌宿主细胞中产生的异源蛋白的正确折叠和溶解性。Chen等人(1999)J Bio Chem 274：19601-19605；Georgiou等人，美国专利第6,083,715号；Georgiou等人，美国专利第6,027,888号；Bothmann和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275：17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275：17106-17113；Arie等人(2001)Mol.Microbiol.39：199-210。
为了使表达的异源蛋白(尤其是蛋白水解敏感的那些蛋白质)的蛋白水解减到最少，缺乏蛋白水解酶的某些宿主菌株可以用于本发明。例如，可以修饰宿主细胞菌株以在编码已知细菌蛋白酶如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合的基因中实现基因突变。一些大肠杆菌蛋白酶缺陷型菌株是可用的并且在例如Joly等人(1998)，同上；Georgiou等人，美国专利第5,264,365号；Georgiou等人，美国专利第5,508,192号；Hara等人，Microbial Drug Resistance，2：63-72(1996)中有描述。
在一个实施方案中，使用缺乏蛋白水解酶并用过表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为本发明表达系统中的宿主细胞。
b.真核宿主细胞
诸如Ham的F10(Sigma)、最小必需培养基((MEM)，(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)和杜尔贝科改良伊格尔培养基((DMEM)，Sigma)等市售培养基适于培养宿主细胞。另外，Ham等人，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes等人，Anal.Biochem.102：255(1980)，美国专利第4,767,704号；第4,657,866号；第4,927,762号；第4,560,655号；或第5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利30,985中描述的任何培养基均可用作宿主细胞的培养基。必要时这些培养基中的任一种可以补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。任何其它必需的补充剂也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括在内。诸如温度、pH等培养条件是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对普通技术人员而言将显而易见。
5.检测基因扩增/表达
可直接在样品中，例如通过常规DNA印迹法、RNA印迹法来量化mRNA的转录[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205(1980)]、斑点印迹法(DNA分析)或原位杂交，基于本文提供的序列使用适当标记的探针测量基因扩增和/或表达。可选地，可以使用可识别特异性双链体的抗体，特异性双链体包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂交双链体或DNA-蛋白质双链体。转而可以标记抗体，并且可以在双链体结合到表面时进行测定，以便在表面形成双链体后，可以检测与双链体结合的抗体的存在。
可选地，可以通过免疫学方法，例如细胞或组织切片的免疫组织化学染色和细胞培养物或体液的测定来测量基因表达，以直接量化基因产物的表达。可用于样品流体的免疫组织化学染色和/或测定的抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以在任何哺乳动物中制备。方便地，可以针对天然序列足糖萼蛋白多肽或针对基于本文提供的DNA序列的合成肽或针对与足糖萼蛋白DNA融合并编码特异性抗体表位的外源序列制备抗体。
6.抗足糖萼蛋白抗体的纯化
可以从培养基或从宿主细胞裂解物中回收多种形式的抗足糖萼蛋白抗体。如果与膜结合，则可以使用合适的洗涤剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶裂解使其从膜上释放。用于表达抗足糖萼蛋白抗体的细胞可以通过各种物理或化学手段如冻融循环、超声处理、机械破坏或细胞裂解剂来破坏。
可能需要从重组细胞蛋白或多肽中纯化抗足糖萼蛋白抗体。以下程序是合适的纯化程序的实例：通过在离子交换柱上分级分离；醇沉；反相HPLC；在二氧化硅或阳离子交换树脂如DEAE上进行的色谱法；色谱聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75进行凝胶过滤；蛋白质A琼脂糖柱以去除污染物如IgG；和金属螯合柱以结合表位标记形式的抗足糖萼蛋白抗体。可以采用各种蛋白质纯化方法并且此类方法在本领域中是已知的并且例如在Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，Springer-Verlag，New York(1982)中有描述。所选纯化步骤将取决于例如所用生产方法的性质和所产生的特定抗足糖萼蛋白抗体。
当使用重组技术时，抗体可以在细胞内，在周质间隙中产生，或者直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，则作为第一步骤，例如通过离心或超滤去除宿主细胞或裂解片段的颗粒碎片。Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了分离分泌到大肠杆菌周质间隙的抗体的程序。简言之，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下经约30分钟解冻细胞浆料。可通过离心去除细胞碎片。在抗体分泌到培养基中的情况下，通常先使用市售蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤装置)浓缩来自此类表达系统的上清液。在前述任一步骤中均可包括诸如PMSF的蛋白酶抑制剂以抑制蛋白水解，并且可包括抗生素以防止外来污染物生长。
从细胞制备的抗体组合物可以使用例如羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法纯化，其中亲和色谱法是优选的纯化技术。蛋白质A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白质A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。推荐蛋白质G用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等人，EMBO J.5：15671575(1986))。亲和配体所附着的基质最常见的是琼脂糖，但其它基质也可用。与可用琼脂糖实现的流动速率和加工时间相比，机械稳定性基质(诸如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)容许的流动速率更快且加工时间更短。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)可用于纯化。用于蛋白质纯化的其它技术例如在离子交换柱上分级分离、醇沉、反相HPLC、在二氧化硅上进行的色谱法、在肝素SEPHAROSETM上进行的色谱法、在阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)上进行的色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀根据待回收的抗体也是可用的。
在任何初步纯化步骤之后，包含目标抗体和污染物的混合物可以使用pH介于约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液进行低pH疏水相互作用色谱，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下进行。
F.药物调配物
本发明的抗体可以通过适合于待治病状的任何途径施用。通常将在肠胃外施用抗体，即输注、皮下、肌内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外。
为了治疗这些癌症，在一个实施方案中，通过静脉输注施用抗体。通过输注施用的剂量在每剂量约1μg/m2至约10,000μg/m2的范围内，通常为每周一个剂量，总共1、2、3或4个剂量。可选地，剂量范围为约1μg/m2至约1000μug/m2，约1μg/m2至约800μg/m2，约1μg/m2至约600μg/m2，约1μg/m2至约400μg/m2，约10μg/m2至约500μg/m2，约10μg/m2至约300μg/m2，约10μg/m2至约200μg/m2和约1μg/m2至约200μg/m2。所述剂量可以每天一次，每周一次，每周多次但少于每天一次，每月多次但少于每天一次，每月多次但少于每周一次，每月一次或间歇性地施用以减轻或缓解疾病症状。可以以公开的任何间隔继续施用，直到正在治疗的肿瘤或癌症症状缓解。在实现症状缓解或减轻后，此类缓解或减轻是通过连续施用而延长时，则可以继续施用。
本发明还提供了治疗乳腺癌的方法，其包括向患有乳腺癌的患者施用治疗有效量的前述任一实施方案的人源化足糖萼蛋白抗体。通常，抗体将以约1μg/m2至约1000mg/m2的剂量范围施用。
一方面，本发明还提供了包含本发明的至少一种抗足糖萼蛋白抗体的药物调配物。在一些实施方案中，药物调配物包含(1)本发明的抗体和(2)药学上可接受的载体。
通过将具有所需纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980))成冻干调配物或水溶液形式制备包含根据本发明使用的抗足糖萼蛋白抗体的治疗性调配物。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对受者无毒，并且包括缓冲剂如乙酸盐、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；张力调节剂如海藻糖和氯化钠；糖类如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；表面活性剂如聚山梨醇酯；成盐平衡离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂如
Figure BDA0001680380570000911
或聚乙二醇(PEG)。用于体内施用的药物调配物通常是无菌的。这很容易通过无菌滤膜过滤实现。
活性成分也可截留在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(分别例如地羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊))中，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中或在粗乳液中。此类技术在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.Ed.(1980)中公开。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，所述基质为成形制品的形式，例如薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON
Figure BDA0001680380570000912
(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使得分子能够释放100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间期限较短。当封装的免疫球蛋白长时间留在体内时，由于在37℃下暴露于潮湿环境中，它们可能会变性或聚集，导致生物活性丧失和免疫原性可能发生变化。可根据所涉机制设计合理的策略进行稳定化。例如，如果发现聚集机制是通过硫基-二硫化物交换的分子间S-S键形成，则可以通过修饰巯基残基，从酸性溶液中冻干，控制水分含量，使用适当的添加剂，并开发特定聚合物基质组合物来实现稳定化。
抗体可以配制成任何合适的形式用于向靶细胞/组织递送。例如，抗体可以配制成免疫脂质体。“脂质体”是由各种类型的脂质、磷脂和/或可用于向哺乳动物递送药物的表面活性剂构成的小囊泡。脂质体的组分通常排列为双层形式，类似于生物膜的脂质排列。含有抗体的脂质体通过本领域已知的方法制备，例如Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；美国专利第4,485,045和4,544,545号；和1997年10月23日公开的WO97/38731所述。在美国专利第5,013,556号中公开了循环时间增加的脂质体。
特别有用的脂质体可通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG来源的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。通过限定孔径的过滤器挤出脂质体以产生具有所需直径的脂质体。本发明抗体的Fab′片段可以与例如Martin等人，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)描述的脂质体通过二硫键交换反应偶联。脂质体内任选含有化学治疗剂。参见Gabizon等人，J.National Cancer Inst.81(19)：1484(1989)。
用于体内施用的调配物必须是无菌的。这很容易通过无菌滤膜过滤实现。
G.用抗足糖萼蛋白抗体治疗
为了测定癌症中的足糖萼蛋白表达，各种检测测定法是可用的。在一个实施方案中，可以通过免疫组织化学(IHC)分析足糖萼蛋白多肽过表达。来自肿瘤活检的石蜡包埋组织切片可以进行IHC测定并符合足糖萼蛋白染色强度标准。在一个优选的实施方案中，确定癌症是否适合通过本文公开的方法治疗涉及检测受试者中或来自受试者的样品中足糖萼蛋白肿瘤表位的存在。
可选地，或另外，可以对福尔马林(formalin)固定、石蜡包埋的肿瘤组织进行FISH测定，例如
Figure BDA0001680380570000931
(由Ventana，Arizona出售的)或
Figure BDA0001680380570000932
(Vysis，Illinois)，以测定肿瘤中足糖萼蛋白过表达的程度(如果有的话)。
可以使用体内检测测定法来评价足糖萼蛋白过表达或扩增，例如通过施用结合待检测分子并且标记有可检测标记(例如放射性同位素或荧光标记)的分子(例如抗体)并从外部扫描患者以确定标记的位置。
如上所述，本发明的抗足糖萼蛋白抗体具有各种非治疗性应用。本发明的抗足糖萼蛋白抗体可用于表达足糖萼蛋白表位的癌症的分期(例如，在放射性成像中)。所述抗体还可用于从细胞中纯化或免疫沉淀足糖萼蛋白表位，用于在体外，例如在ELISA或蛋白质印迹中体外检测和量化足糖萼蛋白表位，以便如其它细胞纯化中的步骤，杀伤和消除来自混合细胞群的表达足糖萼蛋白的细胞。
目前，根据癌症的阶段，癌症治疗涉及以下疗法中的一种或组合：去除癌性组织的手术、放射疗法和化学疗法。在不能耐受化学疗法的毒性和副作用的老年患者中以及在放射疗法的有用性有限的转移性疾病中，抗足糖萼蛋白抗体治疗可能是特别可取的。本发明的肿瘤靶向性抗足糖萼蛋白抗体可用于在最初诊断疾病后或在复发期间缓解表达足糖萼蛋白的癌症。
根据已知方法，例如静脉内施用(例如作为团注)或通过在一段时间内连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径向人类患者施用抗足糖萼蛋白抗体。优选静脉内或皮下施用抗体。
本发明的抗体组合物将以与良好医学实践相一致的方式配制、给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、各个患者的临床状况、病症原因、试剂递送部位、施用方法、施用计划和医学从业者已知的其它因素。
为了预防或治疗疾病，施用的剂量和模式将由医师根据已知标准来选择。抗体的适当剂量将取决于如以上定义的待治疾病的类型，疾病的严重程度和病程，是为了预防还是治疗目的施用抗体，先前的治疗，患者的临床病史和对抗体的反应以及主治医师的判断。一次性或通过一系列治疗向患者适当地施用抗体。优选地，通过静脉输注或通过皮下注射来施用抗体。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg至约50mg/kg体重(例如，约0.1-15mg/kg/剂)的抗体可以是施用给患者的初始候选剂量，无论是例如，通过一次或多次分开施用，还是通过连续输注。给药方案可以包括施用约4mg/kg的初始负荷剂量，接着每周维持剂量为约2mg/kg的抗足糖萼蛋白抗体。然而，其它剂量方案也可能有用。根据上面提到的因素，典型的日剂量范围可为约1μg/kg至100mg/kg或更高。对于几天或更长时间的重复施用，根据情况，持续治疗直至出现对疾病症状的所需抑制。通过常规方法和测定并基于医师或本领域其它技术人员已知的标准可以容易地监测该疗法的进展。
本发明的抗足糖萼蛋白抗体可以呈本文中“抗体”的定义所涵盖的不同形式。因此，抗体包括全长或完整抗体、抗体片段、天然序列抗体或氨基酸变体、人源化、嵌合或融合抗体及其功能片段。在融合抗体中，抗体序列与异源多肽序列融合。可以在Fc区中修饰抗体以提供所需效应功能。如本文部分中更详细讨论的，用适当的Fc区，细胞表面上结合的裸抗体可以诱导细胞毒性，例如通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或通过募集补体依赖性细胞毒性中的补体或一些其它机制。可选地，在期望消除或减少效应功能以便使副作用或治疗并发症减到最少的情况下，可以使用某些其它Fc区。
在一个实施方案中，所述抗体与本发明抗体(i)竞争结合相同的表位，和/或(ii)基本上结合相同的表位。还考虑了具有本发明的抗足糖萼蛋白抗体的生物学特征的抗体，所述特征具体包括体内肿瘤靶向和任何细胞增殖抑制或细胞毒性特征。
本文详细描述了生产以上抗体的方法。
本发明的抗足糖萼蛋白抗体可用于治疗表达足糖萼蛋白的癌症或缓解哺乳动物中癌症的一种或多种症状。癌症涵盖本文描述的任何癌症的转移性癌症。该抗体能够结合在哺乳动物中表达足糖萼蛋白表位的癌细胞的至少一部分。在一个优选的实施方案中，所述抗体在与细胞上的足糖萼蛋白表位结合后，在体外或体内有效地破坏或杀伤表达足糖萼蛋白的肿瘤细胞或抑制此类肿瘤细胞的生长。在其它优选的实施方案中，抗体有效(i)抑制与之结合的细胞的生长或增殖；(ii)诱导与之结合的细胞死亡；(iii)抑制与之结合的细胞的分层；(iv)抑制与之结合的细胞的转移；或(v)抑制包含与之结合的细胞的肿瘤的血管化。
本发明提供了包含本发明的抗足糖萼蛋白抗体和载体的组合物。本发明还提供了包含本发明的抗足糖萼蛋白抗体和载体的调配物。在一个实施方案中，该调配物是包含药学上可接受的载体的治疗性调配物。
本发明的另一个方面是分离的编码抗足糖萼蛋白抗体的核酸。涵盖编码H和L链的核酸并且特别是高变区残基，编码天然序列抗体的链以及抗体的变体、修饰和人源化形式。
本发明还提供可用于治疗表达足糖萼蛋白多肽的癌症或缓解哺乳动物中癌症的一种或多种症状的方法，其包括向哺乳动物施用治疗有效量的抗足糖萼蛋白抗体。抗体治疗性组合物可以按照医师的指示短期(急性)或慢性或间歇性施用。还提供了抑制足糖萼蛋白多肽表达细胞的生长和杀伤足糖萼蛋白多肽表达细胞的方法。
本发明还提供了包含至少一种抗足糖萼蛋白抗体的试剂盒和制品。含有抗足糖萼蛋白抗体的试剂盒例如用于足糖萼蛋白细胞杀伤测定，用于从细胞中纯化或免疫沉淀足糖萼蛋白多肽。例如，为了分离和纯化足糖萼蛋白，该试剂盒可以含有与珠粒(例如琼脂糖珠粒)耦合的抗足糖萼蛋白抗体。可以提供试剂盒，其含有例如在ELISA或蛋白质印迹中，用于体外检测和量化足糖萼蛋白的抗体。此类用于检测的抗体可以提供有标记，例如荧光或放射性标记。
效应功能工程化
可能需要就效应功能对本发明的抗体进行修饰，例如以便增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。可选地或另外，可以在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而允许在该区域中形成链间二硫键。这样产生的同型二聚体抗体可具有提高的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。如Wolff等人，Cancer Research 53：2560-2565(1993)所述，还可以使用异双功能交联剂制备抗肿瘤活性增强的同型二聚体抗体。可选地，可以工程化抗体，其具有双重Fc区并且因此可以具有增强的补体裂解和ADCC能力。参见Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。为了增加抗体的血清半衰期，可以将补救受体结合表位并入抗体(尤其是抗体片段)，例如美国专利5,739,277中所述。如本文中所用，术语“补救受体结合表位”是指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的负责增加IgG分子的体内血清半衰期的Fc区表位。
免疫缀合物
本发明还涉及免疫缀合物(可互换地称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”)，其包含与细胞毒性剂例如化学治疗剂、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)偶联的抗体。
在某些实施方案中，免疫缀合物包含抗体和化学治疗剂或其它毒素。上文已经描述了用于产生此类免疫缀合物的化学治疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲素A链、α-八叠球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白质、垂序商陆(Phytolaca americana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酸霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。多种放射性核素可用于产生放射性偶联抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。使用多种双功能蛋白质偶联剂制备抗体和细胞毒性剂的缀合物，蛋白质偶联剂例如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(例如二甲基己二亚酰胺酸酯HCL)、活性酯(如琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素类免疫毒素可如Vitetta等人，Science，238：1098(1987)所述而制备。碳-14-标记的1-异硫氰苄基-3-甲基二乙烯三胺戊乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核苷酸与抗体偶联的示例性螯合剂。参见WO94/11026。
本文还考虑了抗体和一种或多种小分子毒素的缀合物，所述毒素例如加利车霉素(calicheamicin)、澳瑞他汀(auristatin)肽(如单甲基澳瑞他汀(MMAE)(多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物))、美登木素生物碱(maytansinoid)(如DM1)、单端孢霉烯(trichothene)和CC1065以及这些具有毒素活性的毒素衍生物。毒素的其它非限制性实例包括WO2014144871中描述的那些，其公开内容通过引用整体并入本文。
示例性免疫缀合物-抗体-药物缀合物
本发明的免疫缀合物(或“抗体-药物缀合物”(“ADC”))可以是下面式I的，其中抗体通过任选接头(L)与一个或多个药物部分(D)偶联(即共价附接)。ADC可以包括硫代MAb药物缀合物(“TDC”)。
Ab-(L-D)p I
因此，抗体可以直接或通过接头与药物偶联。在式I中，p是每个抗体的药物部分的平均数，其范围可以为例如每个抗体约1至约20个药物部分，并且在某些实施方案中为每个抗体1至约8个药物部分。本发明包括含有式I的抗体-药物化合物的混合物的组合物，其中每个抗体的平均载药量为约2至约5或约3至约4。
a.示例性接头
接头可包含一种或多种接头组分。示例性接头组分包括6-马来酰亚胺己酰基(“MC”)、马来酰亚胺丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)，丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)，及用接头试剂偶联产生的那些：形成接头部分4-巯基戊酸的N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，形成接头部分4-((2，5-二氧代吡咯烷-1-基)甲基)环己烷羧酸的N-琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸酯(“SMCC”，在本文中也称为“MCC”)，形成接头部分4-巯基丁酸的2，5-二氧代吡咯烷-1-基4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸酯(“SPDB”)，N-琥珀酰亚胺(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)，作为一个或多个重复单元的乙烯氧基-CH2CH2O-(“EO”或“PEO”)。其它接头组分是本领域中已知的，并且一些在本文中有描述。各种接头组分是本领域已知的，其中一些在下文有所描述。
接头可以是“可裂解接头”，其促进细胞中药物的释放。例如，可以使用酸不稳定性接头(例如腙)、蛋白酶敏感性(例如肽酶敏感性)接头、光不稳定性接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利第5,208,020号)。
在某些实施方案中，接头如下面式II所示：
-Aa-Ww-Yy- II
其中A是延伸单元，并且a是0至1的整数；W是氨基酸单元，并且w是0至12的整数；Y是间隔单元，并且y是0、1或2；并且Ab、D和p如以上对于式I所定义的。此类接头的示例性实施方案在US 2005-0238649 A1中有描述，其通过引用明确地并入本文。
在一些实施方案中，接头组分可包含将抗体连接至另一接头组分或药物部分的“延伸单元”。示例性的延伸物单元如下所示(其中波浪线指示与抗体共价附接的位点)：
Figure BDA0001680380570000991
在一些实施方案中，接头组分可以包含氨基酸单元。在一个此类实施方案中，氨基酸单元允许通过蛋白酶裂解接头，从而促进药物在暴露于细胞内蛋白酶如溶酶体酶后从免疫缀合物释放。参见例如，Doronina等人(2003)Nat.Biotechnol.21：778-784。示例性氨基酸单元包括但不限于二肽、三肽、四肽和五肽。示例性二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)；苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)；或N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。示例性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。氨基酸单元可以包含天然存在的氨基酸残基，以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，例如瓜氨酸。可以设计和优化氨基酸单元对于受特定酶，例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D或纤溶酶蛋白酶裂解的选择性。
在一些实施方案中，接头组分可包含将抗体直接或通过延伸单元和/或氨基酸单元连接至药物部分的“间隔”单元。间隔单元可以是“自降解的”或“非自降解的”。“非自降解”间隔单元是其中部分或整个间隔单元在ADC酶促(例如蛋白水解)裂解后保持与药物部分结合的单元。非自降解间隔单元的实例包括但不限于甘氨酸间隔单元和甘氨酸-甘氨酸间隔单元。也考虑了对序列特异性酶裂解敏感的肽间隔区的其它组合。例如，通过肿瘤细胞相关蛋白酶酶促裂解含有甘氨酸-甘氨酸间隔单元的ADC将导致甘氨酸-甘氨酸-药物部分从ADC的其余部分释放。在一个此类实施方案中，然后使甘氨酸-甘氨酸-药物部分在肿瘤细胞中经受单独的水解步骤，从而使甘氨酸-甘氨酸间隔单元从药物部分裂解。
“自降解”间隔单元允许药物部分释放，无需单独的水解步骤。在某些实施方案中，接头的间隔单元包括对-氨基苄基单元。在一个此类实施方案中，对-氨基苄醇通过酰胺键与氨基酸单元附接，并且在苄醇和细胞毒性剂之间产生氨基甲酸酯、甲基氨基甲酸酯或碳酸酯。参见例如，Hamann等人(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15：1087-1103。在一个实施方案中，间隔单元是对-氨基苄氧羰基(PAB)。在某些实施方案中，对-氨基苄基单元的亚苯基部分被Qm取代，其中Q为-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、硝基或-氰基；并且m是范围为0-4的整数。自降解间隔单元的实例还包括但不限于与对-氨基苄醇在电子上相似的芳香族化合物(参见例如，US 2005/0256030 A1)，例如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等人(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)和邻-或对-氨基苄基缩醛。可以使用在酰胺键水解后进行环化的间隔区，例如经取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等人，Chemistry Biology，1995，2，223)；经适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环系(Storm等人，J.Amer.Chem.Soc.，1972，94，5815)；和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry等人，J.Org.Chem.，1990，55，5867)。消除在甘氨酸的a-位置被取代的含胺药物(Kingsbury等人，J.Med.Chem.，1984，27，1447)也是可用于ADC中的自分解间隔区的实例。
在一个实施方案中，间隔单元是如以下所描绘的支化双(羟甲基)苯乙烯(BHMS)单元，其可用于并入和释放多种药物。
Figure BDA0001680380570001011
其中Q是-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-硝基或-氰基；m是范围为0-4的整数；n为0或1；并且p范围从1至约20。
在另一个实施方案中，接头L可以是用于通过分支、多功能接头部分使一个以上药物部分共价附接至抗体的树枝型接头(Sun等人(2002)Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters 12：2213-2215；Sun等人(2003)Bioorganic&Medicinal Chemistry 11：1761-1768)。树枝状接头可提高药物与抗体的摩尔比，即载量，这与ADC的效力有关。因此，在经半胱氨酸工程化的抗体仅携带一个反应性半胱氨酸巯基的情况下，多个药物部分可以通过树枝状接头附接。
下面在式II的ADC的上下文中显示了示例性接头组分及其组合：
Figure BDA0001680380570001021
接头组分，包括延伸单元、间隔单元和氨基酸单元，可以通过本领域已知的方法，例如US 2005-0238649 A1中描述的那些方法合成。
接头的其它非限制性实例包括WO 2015095953中描述的那些，其公开内容通过引用整体并入本文。
b.示例性药物部分
(1)美登素(maytansine)和美登木素生物碱
在一些实施方案中，免疫缀合物包含与一个或多个美登木素生物碱分子偶联的抗体。美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白聚合而起作用的有丝分裂抑制剂。美登素首先从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)中分离(美国专利第3896111号)。随后，发现某些微生物也可产生美登木素生物碱，如美登醇(maytansinol)和C-3美登醇酯(美国专利第4,151,042号)。合成美登醇及其衍生物和类似物公开于例如美国专利第4,137,230号；第4,248,870号；第4,256,746号；第4,260,608号；第4,265,814号；第4,294,757号；第4,307,016号；第4,308,268号；第4,308,269号；第4,309,428号；第4,313,946号；第4,315,929号；第4,317,821号；第4,322,348号；第4,331,598号；第4,361,650号；第4,364,866号；第4,424,219号；第4,450,254号；第4,362,663号；和第4,371,533号中。
美登木素生物碱类药物部分是抗体-药物缀合物中有吸引力的药物部分，因为它们：(i)相对易于通过发酵或化学修饰或衍生化发酵产物制备，(ii)适合用适于通过二硫化物和非二硫化物接头与抗体偶联的官能团进行衍生化，(iii)在血浆中稳定，并且(iv)对多种肿瘤细胞系有效。
适合用作美登木素生物碱类药物部分的美登素化合物是本领域中公知的，并且可以根据已知方法从天然来源分离或使用基因工程和发酵技术生产(US 6790952；US 2005/0170475；Yu等人(2002)PNAS 99：7968-7973)。美登醇和美登醇类似物也可根据已知方法合成制备。
示例性美登木素生物碱类药物部分包括具有经修饰的芳香环的那些，例如：C-19-脱氯(美国专利第4256746号)(通过安丝菌素(ansamytocin)P2的氢化锂铝还原制备)；C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利第4361650和4307016号)(通过使用链霉菌(Streptomyces)或放线菌(Actinomyces)进行去甲基化或使用LAH进行脱氯制备)；和C-20-去甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-脱氯(美国专利第4,294,757号)(通过使用酰氯进行酰化制备)和在其它位置具有修饰的那些。
示例性美登木素生物碱类药物部分还包括具有如下修饰的那些，例如：C-9-SH(美国专利第4424219号)(通过美登醇与H2S或P2S5的反应制备)；C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(US 4331598)；C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利第4450254号)(由诺卡氏菌(Nocardia)制备)；C-15-羟基/酰氧基(US 4364866)(通过链霉菌转化美登醇而制备)；C-15-甲氧基(美国专利第4313946号和第4315929号)(从滑桃树(Trewianudlflora)中分离)；C-18-N-去甲基(美国专利第4362663和4322348号)(通过链霉菌对美登醇进行去甲基化而制备)；和4,5-脱氧(US 4371533)(通过三氯化钛/LAH还原美登醇制备)。
已知美登素化合物上的许多位置根据连接类型可用作连接位置。例如，为了形成酯键，具有羟基的C-3位置，羟甲基修饰的C-14位置，羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置全部合适(US 5208020；US RE39151；US 6913748；US 7368565；US 2006/0167245；US2007/0037972)。
美登木素生物碱类药物部分包括具有以下结构的那些：
Figure BDA0001680380570001051
其中波浪线指示美登木素生物碱类药物部分的硫原子与ADC的接头的共价附接。R可以独立地为H或C1-C6烷基。使酰胺基团附接到硫原子上的亚烷基链可以是甲烷基、乙烷基或丙基，即m为1、2或3(US 633410；US 5208020；US 7276497；Chari等人(1992)CancerRes.52：127-131；Liu等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci USA 93：8618-8623)。
对于本发明的化合物考虑了美登木素生物碱类药物部分的所有立体异构体，即在D的手性碳原子处的R和S构型的任何组合。在一个实施方案中，美登木素生物碱类药物部分将具有以下立体化学性质：
Figure BDA0001680380570001052
美登木素生物碱类药物组分的示例性实施方案包括：DM1；DM3；和DM4，其具有以下结构：
Figure BDA0001680380570001061
其中波浪线指示药物的硫原子与抗体-药物缀合物的接头(L)的共价附接。(WO2005/037992；US 2005/0276812 A1)。
其它示例性美登木素生物碱抗体-药物缀合物具有以下结构和缩写(其中Ab为抗体且p为1至约8)：
Figure BDA0001680380570001071
在一个实施方案中，当DM4通过SPDB接头与抗体的硫醇基团连接时形成抗体-药物缀合物(参见美国专利第6913748和7276497号，其通过引用整体并入本文)。
其中DM1通过BMPEO接头与抗体的硫醇基团连接的示例性抗体-药物缀合物具有以下结构和缩写：
Figure BDA0001680380570001081
其中Ab为抗体；n为0、1或2；并且p为1、2、3或4。
含美登木素生物碱的免疫缀合物，其制备方法及其治疗用途公开于例如Erickson等人(2006)Cancer Res.66(8)：4426-4433；美国专利第5,208,020、5,416,064号，US 2005/0276812 A1和欧洲专利EP 0 425 235 B1中，其据此通过引用明确并入。
抗体-美登木素生物碱缀合物通过使抗体与美登木素生物碱分子化学连接而制备，不会显著减弱抗体或美登木素生物碱分子的生物活性。参见例如，美国专利第5,208,020号(其公开内容据此通过引用明确并入)。美登木素生物碱可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如在美国专利第5,208,020号和上文提及的其它专利和非专利出版物中公开了合适的美登木素生物碱，例如美登醇和在美登醇分子的芳香环或其它位置经修饰的美登醇类似物，例如各种美登醇酯。
本领域已知许多用于制备抗体-美登木素生物碱缀合物的连接基团，包括例如美国专利第5208020号或欧洲专利0425235B1；Chari等人Cancer Research 52：127-131(1992)；和US 2005/016993 A1中公开的那些，其公开内容据此通过引用明确并入。包含接头组分SMCC的抗体-美登木素生物碱缀合物可以如US 2005/0276812 A1，“Antibody-drugconjugates and Methods.”中公开的那样制备。如以上确认的专利中所公开的，接头包含二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定性基团、光不稳定性基团、肽酶不稳定性基团或酯酶不稳定性基团。本文描述并举例说明了其它接头。
可以使用多种双功能蛋白质偶联剂制备抗体和美登木素生物碱的缀合物，蛋白质偶联剂例如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(例如二甲基己二亚酰胺酸酯HCL)、活性酯(如琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。在某些实施方案中，偶联剂是N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等人，Biochem.J.173：723-737(1978))或N-琥珀酰亚胺-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)以提供二硫键。
根据连接的类型，接头可以在各种不同位置与美登木素生物碱分子附接。例如，酯键可使用常规偶联技术，通过与羟基反应而形成。该反应可以发生在具有羟基的C-3位置，羟甲基修饰的C-14位置，羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置。在一个实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成连接。
(2)澳瑞他汀和多拉司他汀
在一些实施方案中，免疫缀合物包含与多拉司他汀或多拉司他汀肽类似物或衍生物(例如奥瑞他汀)偶联的抗体(美国专利第5635483号；第5780588号)。已经证实多拉司他汀和澳瑞他汀可干扰微管动力学、GTP水解以及核和细胞分裂(Woyke等人(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)并具有抗癌(美国专利第5663149号)和抗真菌活性(Pettit等人(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。多拉司他汀或奥瑞他汀药物部分可以通过肽类药物部分的N(氨基)端或C(羧基)端与抗体附接(WO 02/088172)。
示例性的澳瑞他汀实施方案包括N端连接的一甲基澳瑞他汀药物部分DE和DF(US2005/0238649，在Senter等人，2004年3月28日提交的Proceedings of the AmericanAssociation for Cancer Research，第45卷，文摘号623中公开，其公开内容明确地通过引用整体并入)。
肽类药物部分可以选自下面的式DE和DF：
Figure BDA0001680380570001101
其中DE和DF的波浪线指示与抗体或抗体-接头组分的共价附接位点，并且独立地在每个位置：
R2选自H和C1-C8烷基；
R3选自H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
R4选自H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
R5选自H和甲基；
或R4和R5共同形成碳环并且具有式-(CRaRb)n，其中Ra和Rb-独立地选自H、C1-C8烷基和C3-C8碳环并且n选自2、3、4、5和6；
R6选自H和C1-C8烷基；
R7选自H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
每个R8独立地选自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳环和O-(C1-C8烷基)；
R9选自H和C1-C8烷基；
R10选自芳基或C3-C8杂环；
Z为O、S、NH或NR12，其中R12为C1-C8烷基；
R11选自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8杂环、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；
m是范围为1-1000的整数；
R13为C2-C8烷基；
R14为H或C1-C8烷基；
每次出现的R15独立地-为H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；
每次出现的R16独立地为H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；
R18选自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8杂环)和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳环)；并且
n是范围为0至6的整数。
在一个实施方案中，R3、R4和R7独立地为异丙基或仲丁基并且R5为-H或甲基。在一个示例性实施方案中，R3和R4各自为异丙基，R5为-H，并且R7为仲丁基。
在又一个实施方案中，R2和R6各自为甲基，并且R9是-H。
在又一个实施方案中，每次出现的R8为-OCH3。
在一个示例性实施方案中，R3和R4各自为异丙基，R2和R6各自为甲基，R5为-H，R7为仲丁基，每次出现的R8为-OCH3，并且R9为-H。
在一个实施方案中，Z为-O-或-NH-。
在一个实施方案中，R10为芳基。
在一个示例性实施方案中，R10为-苯基。
在一个示例性实施方案中，当Z为-O-时，R11为-H、甲基或叔丁基。
在一个实施方案中，当Z为-NH时，R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-N(R16)2，并且R16为-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH。
在另一个实施方案中，当Z为-NH时，R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-SO3H。
式DE的示例性澳瑞他汀实施方案是MMAE，其中波浪线指示与抗体-药物缀合物的接头(L)的共价附接：
Figure BDA0001680380570001131
式DF的示例性澳瑞他汀实施方案是MMAF，其中波形线指示抗体-药物缀合物的接头(L)的共价附接(参见US 2005/0238649和Doronina等人(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124)：
Figure BDA0001680380570001132
其它示例性实施方案包括在五肽澳瑞他汀药物部分的C端具有苯丙氨酸羧基修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO 2007/008848)和在五肽澳瑞他汀药物部分的C端具有苯丙氨酸侧链修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO 2007/008603)。
其它药物部分包括以下MMAF衍生物，其中波浪线指示与抗体-药物缀合物的接头(L)的共价附接：
Figure BDA0001680380570001141
Figure BDA0001680380570001151
一方面，如上所示，包括但不限于三甘醇酯(TEG)的亲水基团可以在R11处与药物部分附接。不受任何特定理论约束，亲水基团有助于药物部分的内化和非团块化。
包含奥瑞他汀/多拉司他汀或其衍生物的式I的ADC的示例性实施方案在US 2005-0238649和Doronina等人(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124中有描述，其明确地通过引用并入本文。包含MMAE或MMAF和各种接头组分的式I的ADC的示例性实施方案具有以下结构和缩写(其中“Ab”是抗体；p为1至约8，“Val-Cit”或“vc”为缬氨酸-瓜氨酸二肽；并且“S”为硫原子。应该注意的是，在本文的硫连接的ADC的某些结构描述中，将抗体表示为“Ab-S”仅仅是为了指示硫连接特征而不指示特定硫原子带有多个接头-药物部分。以下结构的左括号也可以置于硫原子的左侧，介于Ab和S之间，这将是本文全篇所描述的本发明的ADC的等效描述。
Figure BDA0001680380570001171
包含MMAF和各种接头组分的式I的ADC的示例性实施方式还包括Ab-MC-PAB-MMAF和Ab-PAB-MMAF。有趣的是，已经证实包含通过不可蛋白水解裂解的接头与抗体附接的MMAF的免疫缀合物具有与包含通过可蛋白水解裂解的接头与抗体附接的MMAF的免疫缀合物相当的活性。参见，Doronina等人(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124。在这种情况下，据信药物释放是通过细胞中的抗体降解来实现。同上。
通常，可以通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备基于肽的药物部分。可以例如根据液相合成方法制备此类肽键(参见E.
Figure BDA0001680380570001172
and K.Lübke，“The Peptides”，第1卷，第76-136页，1965，Academic Press)，所述方法是肽化学领域中公知的。可以根据以下方法制备澳瑞他汀/多拉司他汀药物部分：US 2005-0238649A1；美国专利第5635483号；美国专利第5780588号；Pettit等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit等人(1998)Anti-Cancer Drug Design 13：243-277；Pettit，G.R.等人Synthesis，1996，719-725；Pettit等人(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 5：859-863；和Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7)：778-784。
具体而言，式DF的澳瑞他汀/多拉司他汀药物部分如MMAF及其衍生物可以使用US2005-0238649 A1和Doronina等人，(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124描述的方法制备。式DE的澳瑞他汀/多拉司他汀药物部分如MMAE及其衍生物，可以使用Doronina等人(2003)Nat.Biotech.21：778-784描述的方法制备。药物-接头部分MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF和MC-vc-PAB-MMAE可以例如在Doronina等人(2003)Nat.Biotech.21：778-784和专利申请公开号No.US 2005/0238649 A1中描述的那样，通过常规方法方便地合成，然后与目标抗体偶联。
(3)加利车霉素
在其它实施方案中，免疫缀合物包含与一个或多个加利车霉素分子偶联的抗体。加利车霉素家族的抗生素能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂。对于加利车霉素家族的缀合物的制备，参见美国专利第5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001、5,877,296号(全部属于American Cyanamid Company)。可以使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG和θI 1(Hinman等人，Cancer Research 53：3336-3342(1993)，Lode等人，Cancer Research 58：2925-2928(1998)，及American Cyanamid的上述美国专利)。可与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，其为抗叶酸剂。加利车霉素和QFA都具有细胞内作用位点并且不易穿过质膜。因此，通过抗体介导的内化细胞对这些试剂的摄取大大地增强了其细胞毒性作用。
c.其它细胞毒性剂
可以与抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozocin)、长春新碱和5-氟尿嘧啶(该家族的试剂统称为LL-E33288复合物，在美国专利第5,053,394、5,770,710号中有描述)，以及拉霉素(esperamicin)(美国专利第5,877,296号)。
可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲素A链、α-八叠球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白质、垂序商陆蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、泻果素、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酸霉素、依诺霉素和单端孢菌素。参见例如，1993年10月28日公开的WO 93/21232。
本发明进一步考虑在抗体和具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫缀合物。
在某些实施方案中，免疫缀合物可包含高放射性原子。多种放射性同位素可用于产生放射性偶联抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、pb212及Lu的放射性同位素。将放射性缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁照相研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
放射性标记或其它标记可以以已知方式并入免疫缀合物中。例如，肽可以是生物合成的或者可以使用合适的氨基酸前体通过化学氨基酸合成来合成，所述氨基酸前体涉及例如氟-19代替氢。诸如tc99m或I123、Re186、Re188和In111等标记可通过肽中的半胱氨酸残基附接。钇-90可以通过赖氨酸残基附接。IODOGEN方法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57可用于并入碘-123。“免疫闪烁照相术中的单克隆抗体”(Chatal，CRC Press 1989)详细描述了其它方法。
在某些实施方案中，免疫缀合物可以包含偶联至前药激活酶的抗体，前药激活酶将前药(例如，肽基化学治疗剂，参见WO 8I/01145)转化为活性药物，例如抗癌药物。此类免疫缀合物可用于抗体依赖性酶介导的前药疗法(“ADEPT”)。可以与抗体偶联的酶包括但不限于碱性磷酸酶，其用于将含磷酸盐的前药转化为游离药物；芳基硫酸酯酶，其用于将含硫酸盐的前药转化为游离药物；胞嘧啶脱氨酶，其用于将无毒的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)，其用于将含有肽的前药转化为游离药物；D-丙氨酰羧肽酶，其用于转化含有D-氨基酸取代基的前药；碳水化合物裂解酶，如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶，其用于将糖基化前药转化为游离药物；β-内酰胺酶，其用于将用β-内酰胺衍生化的药物转化为游离药物；和青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶和青霉素G酰胺酶，其分别用于将其胺氮上经苯氧基乙酰基或苯基乙酰基衍生化的药物转化为游离药物。可以通过本领域公知的重组DNA技术使酶与抗体共价结合。参见例如，Neuberger等人，Nature 312：604-608(1984)。
d.载药量
载药量用p表示，即式I分子中每个抗体的药物部分的平均数。载药量范围可为每个抗体1至20个药物部分(D)。式I的ADC包括与一定范围(1至20个)的药物部分偶联的抗体的集合。来自偶联反应的ADC制剂中每个抗体的药物部分的平均数可通过例如质谱法、ELISA测定和HPLC等常规手段表征。还可测定用p表示的ADC定量分布。在一些情况下，可通过诸如反相HPLC或电泳的手段分离、纯化和表征均质ADC，其中p是来自具有其它载药量的ADC的某一个值。式I抗体-药物缀合物的药物调配物因此可以是此类缀合物与和1、2、3、4个或更多个药物部分连接的抗体的异质混合物。
对于一些抗体-药物缀合物，p可受抗体上附接位点的数量限制。例如，当附接是如以上示例性实施方案中的半胱氨酸硫醇时，抗体可仅具有一个或几个半胱氨酸硫醇基团，或可仅具有一个或几个可借以附接接头的具有足够反应性的硫醇基团。在某些实施例中，较高载药量(例如p＞5)可导致某些抗体-药物缀合物的聚集、不溶、毒性或细胞渗透性丧失。在某些实施方案中，本发明的ADC的载药量为1至约8；约2至约6；或约3至约5。实际上，已经显示对于某些ADC，每个抗体的药物部分的最佳比率可以小于8，并且可为约2至约5。参见US 2005-0238649 A1。
在某些实施方案中，使少于理论最大值的药物部分在偶联反应期间与抗体偶联。抗体可含有例如不与如下讨论的药物-接头中间体或接头试剂反应的赖氨酸残基。通常，抗体不含许多可以与药物部分连接的游离和反应性半胱氨酸硫醇基团；实际上抗体中的大部分半胱氨酸硫醇残基以二硫桥形式存在。在某些实施方案中，抗体可用诸如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)的还原剂在部分或完全还原条件下还原，以产生反应性半胱氨酸硫醇基团。在某些实施方案中，使抗体经受变性条件以显示反应性亲核基团如赖氨酸或半胱氨酸。
可以以不同方式控制ADC载量(药物/抗体比率)，例如通过：(i)限制药物-接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制偶联反应时间或温度，和(iii)部分或限制半胱氨酸硫醇修饰的还原条件。
应当理解的是，当多于一个亲核基团与药物-接头中间体或接头试剂反应，接着与药物部分试剂反应时，所得产物是具有与抗体偶联的一个或多个药物部分的分布的ADC化合物的混合物。每个抗体的药物平均数可由混合物通过对抗体具有特异性并且对药物具有特异性的双重ELISA抗体测定计算。可通过质谱法鉴定混合物中的单独ADC分子并且通过HPLC，例如疏水性相互作用色谱法分离(参见例如，McDonagh等人(2006)Prot.Engr.Design&Selection 19(7)：299-307；Hamblett等人(2004)Clin.CancerRes.10：7063-7070；Hamblett，K.J.等人“Effect of drug loading on thepharmacology，pharmacokinetics，and toxicity of an anti-CD30 antibody-drugconjugate，”文摘号624，American Association for Cancer Research，2004 AnnualMeeting，2004年3月27-31日，Proceedings ofthe AACR，第45卷，2004年3月；Alley，S.C.等人“Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates，”文摘号627，American Association for Cancer Research，2004 Annual Meeting，2004年3月27-31日，Proceedings of the AACR，第45卷，2004年3月)。在某些实施方案中，具有单一载量值的均质ADC可通过电泳或色谱法从偶联混合物分离。
用经CAR修饰的免疫细胞治疗
在某些实施方案中，本发明涉及用于治疗癌症(包括但不限于血液恶性肿瘤和实体瘤)的组合物和方法。在某些实施方案中，使用经CAR修饰的免疫细胞。CAR-T细胞可以在治疗上用于患有非血液肿瘤，例如乳房、CNS和皮肤恶性肿瘤引起的实体瘤的患者。在某些实施方案中，CAR-NK细胞可以在治疗上用于患有许多恶性肿瘤中的任一种的患者。
在某些实施方案中，本发明涉及转导以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞或NK细胞的过继性细胞转移策略。CAR是组合对期望抗原(例如肿瘤抗原)的基于抗体的特异性与例如T细胞受体激活细胞内结构域以产生表现出特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。
一方面，本发明涉及经遗传修饰以稳定表达所需CAR的NK细胞的用途。表达CAR的NK细胞在本文中称为CAR-NK细胞或经CAR修饰的NK细胞。优选地，细胞可以遗传修饰以在其表面上稳定表达抗体结合结构域，赋予新的抗原特异性。产生CAR-NK细胞的方法是本领域已知的。例如，参见Glienke等人，Advantages and applications of CAR-expressingnatural killercells，Front Pharmacol.2015；6：21。产生CAR-NK细胞的服务可商购获得。参见例如Creative Biolabs Inc.，45-1 Ramsey Road，Shirley，NY 11967，USA。
一方面，本发明涉及经遗传修饰以稳定表达所需CAR的T细胞的用途。表达CAR的T细胞在本文中称为CAR-T细胞或经CAR修饰的T细胞。优选地，细胞可以遗传修饰以在其表面上稳定表达抗体结合结构域，赋予新的不依赖MHC的抗原特异性。在一些情况下，T细胞经遗传修饰以稳定表达将特定抗体的抗原识别结构域与CD3-ζ链或FcγRI蛋白的细胞内结构域组合成单一嵌合蛋白的CAR。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含具有抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞质结构域的细胞外结构域。在一个实施方案中，使用与CAR中的一个结构域天然缔合的跨膜结构域。在另一个实施方案中，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以将与受体复合物的其它成员的相互作用减到最小。在一个实施方案中，跨膜结构域是CD8α铰链结构域。
就细胞质结构域而言，本发明的CAR可以设计为单独包含CD28和/或4-1BB信号传导结构域，或者与在本发明CAR的情况下有用的任何其它所需细胞质结构域组合。在一个实施方案中，可以将CAR的细胞质结构域设计为进一步包含CD3-ζ的信号传导结构域。例如，CAR的细胞质结构域可以包括但不限于CD3-ζ、4-1BB和CD28信号传导模块及其组合。因此，本发明提供CAR T细胞及其用于过继性治疗的方法。
在一个实施方案中，可以通过向细胞内引入慢病毒载体来产生本发明的CAR T细胞，所述慢病毒包含所需CAR，例如包含抗足糖萼蛋白、CD8α铰链和跨膜结构域，以及人4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的CAR。本发明的CAR T细胞能够在体内复制，导致可产生持续肿瘤控制的长期持久性。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白结构域包含的重链可变区包含：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSGYQMNWVRQAPGKGLEWIGYIWSDGGTDYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCAREGYWLGAFDPWGPGTLVTVSS(SEQ IDNO：27)。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白结构域包含的轻链可变区包含：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAAVLTQTPSPVSAAVGATVSVSCQSSQSVHHKNDLAWFQQKPGQPPKLLIYYTSTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCAGVYEGSSDNRAFGGGTEVVVK(SEQ ID NO：29)。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白结构域包含SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：GFSLSGYQ(SEQ ID NO：33)；GFSLSGY(SEQ ID NO：34)；和GYQMN(SEQ ID NO：35)。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：IWSDGGT(SEQ ID NO：36)；WSDGG(SEQ ID NO：37)；和YIWSDGGTDYASWAKG(SEQ ID NO：38)。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：AREGYWLGAFDP(SEQ ID NO：39)；EGYWLGAFDP(SEQ ID NO：40)；和EGYWLGAFDP(SEQ IDNO：41)。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：QSVHHKND(SEQ ID NO：42)；QSSQSVHHKNDLA(SEQ ID NO：43)；和QSSQSVHHKNDLA(SEQ IDNO：44)。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：YTS(SEQ ID NO：45)；YTSLAS(SEQ ID NO：46)；和YTSLAS(SEQ ID NO：47)。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：AGVYEGSSDNRA(SEQ ID NO：48)；AGVYEGSSDNRA(SEQ ID NO：49)；和AGVYEGSSDNRA(SEQID NO：50)。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：33-35；并且还包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：36-38；并且还包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：39-41。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：42-44；并且还包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：45-47；并且还包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：48-50。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：33-35；并且还包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：36-38；并且还包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：39-41；并且还包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：42-44；并且还包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：45-47；并且还包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：48-50。
在一个实施方案中，本发明涉及使用淋巴细胞输注，施用表达CAR的经遗传修饰的T细胞用于治疗患有癌症或有患癌风险的患者。优选地，在治疗中使用自体淋巴细胞输注。从需要治疗的患者收集自体PBMC，并使用本文描述且本领域已知的方法激活和扩增T细胞，然后将其输回到患者体内。
本发明还包括治疗恶性肿瘤或自身免疫性疾病，其中患者中的化学疗法和/或免疫疗法在患者中产生显著的免疫抑制，从而增加了患者发展恶性肿瘤(例如CLL)的风险。
本发明包括使用表达抗足糖萼蛋白抗体来源的包括CD3-ζ和4-1BB或CD28共刺激结构域的CAR的T细胞(也称为CARTPODO T细胞)。本发明的CARTPODO T细胞可以进行稳健的体内T细胞扩增并且可以建立对展示足糖萼蛋白肿瘤表位的细胞有特异性的记忆细胞，该记忆细胞在血液和骨髓中长时间持续处于高水平。
本发明提供了包含细胞外和细胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)。细胞外结构域包含另外称为抗原结合部分的靶特异性结合元件。细胞内结构域或其它细胞质结构域包含共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区是指包含共刺激分子的细胞内结构域的CAR的一部分。共刺激分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原有效反应所需的。
在CAR的细胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的细胞质结构域和跨膜结构域之间，可以并入间隔结构域。如本文中所用，术语“间隔结构域”通常意指用于将跨膜结构域连接至多肽链中的细胞外结构域或细胞质结构域的任何寡肽或多肽。间隔结构域可包含多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸且最优选25至50个氨基酸。
抗原结合部分
在一个实施方案中，本发明的CAR包含另外称为抗原结合部分或靶向臂的靶特异性结合元件。用于本发明的抗原结合部分能够结合足糖萼蛋白肿瘤表位。因而，选择抗原结合部分以识别充当与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的配体。
通过改造特异性结合足糖萼蛋白肿瘤表位的适当抗原结合部分来工程化本发明的CAR以靶向展示足糖萼蛋白肿瘤表位的细胞。
优选地，本发明CAR中的抗原结合部分为scFV或scFab，其中scFV的核酸序列包含本文对于抗足糖萼蛋白抗体公开的一个或多个轻链CDR和一个或多个重链CDR的核酸序列，并且其中scFab的核酸序列包含本文对于抗足糖萼蛋白抗体公开的一个或多个轻链CDR和一个或多个重链CDR的核酸序列。
优选地，本发明CAR中的抗原结合部分为scFV或scFab，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：GFSLSGYQ(SEQ ID NO：33)；GFSLSGY(SEQ ID NO：34)；和GYQMN(SEQ IDNO：35)。
优选地，本发明CAR中的抗原结合部分为scFV或scFab，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：IWSDGGT(SEQ ID NO：36)；WSDGG(SEQ ID NO：37)；和YIWSDGGTDYASWAKG(SEQ ID NO：38)。
优选地，本发明CAR中的抗原结合部分为scFV或scFab，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：AREGYWLGAFDP(SEQ ID NO：39)；EGYWLGAFDP(SEQ ID NO：40)；和EGYWLGAFDP(SEQ ID NO：41)。
优选地，本发明CAR中的抗原结合部分为scFV或scFab，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：QSVHHKND(SEQ ID NO：42)；QSSQSVHHKNDLA(SEQ ID NO：43)；和QSSQSVHHKNDLA(SEQ ID NO：44)。
优选地，本发明CAR中的抗原结合部分为scFV或scFab，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：YTS(SEQ ID NO：45)；YTSLAS(SEQ ID NO：46)；和YTSLAS(SEQ ID NO：47)。
优选地，本发明CAR中的抗原结合部分为scFV或scFab，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：AGVYEGSSDNRA(SEQ ID NO：48)；AGVYEGSSDNRA(SEQ ID NO：49)；和AGVYEGSSDNRA(SEQ ID NO：50)。
优选地，本发明CAR中的抗原结合部分为scFV或scFab，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：33-35；并且还包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQID NO：36-38；并且还包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：39-41。
优选地，本发明CAR中的抗原结合部分为scFV或scFab，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：42-44；并且还包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQID NO：45-47；并且还包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：48-50。
优选地，本发明CAR中的抗原结合部分为scFV或scFab，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：33-35；并且还包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQID NO：36-38；并且还包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：39-41；并且还包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：42-44；并且还包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：45-47；并且还包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO：48-50。
在一个实施方案中，本发明CAR中的抗原结合部分为scFV或scFab，其包含与上述SEQ ID NO具有约80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。
跨膜结构域
就跨膜结构域而言，可将CAR设计成包含与CAR的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用与CAR中的一个结构域天然缔合的跨膜结构域。在一些情况下，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以将与受体复合物的其它成员的相互作用减到最小。
跨膜结构域可以源自天然或合成来源。如果是天然来源，则该结构域可源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。特别用于本发明的跨膜区可以源自(即至少包含以下的至少一个跨膜区)：T细胞受体CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的α、β或ζ链。可选地，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成跨膜结构域的每个末端将发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸三联体。任选地，短的寡肽或多肽接头，优选长度为2至10个氨基酸，可以在CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。
优选地，本发明CAR中的跨膜结构域为CD8跨膜结构域。在一个实施方案中，CD8跨膜结构域包含美国专利第9,102,760号的SEQ ID NO：16的核酸序列。在一个实施方案中，CD8跨膜结构域包含编码美国专利第9,102,760号的SEQ ID NO：22的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，CD8跨膜结构域包含美国专利第9,102,760号的SEQ ID NO：22的氨基酸序列。在另一个实施方案中，使用本文表2中公开的序列。
在一些情况下，本发明CAR的跨膜结构域包含CD8α铰链结构域。在一个实施方案中，CD8铰链结构域包含美国专利第9,102,760号的SEQ ID NO：15的核酸序列。在一个实施方案中，CD8铰链结构域包含编码美国专利第9,102,760号的SEQ ID NO：21的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，CD8铰链结构域包含美国专利第9,102,760号的SEQ IDNO：21的氨基酸序列。在另一个实施方案中，使用本文表2中公开的序列。
细胞质结构域
本发明CAR的细胞质结构域或其它细胞内信号传导结构域负责激活已将CAR置入其中的免疫细胞的至少一种正常效应功能。术语“效应功能”是指细胞的专化功能。例如，T细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指转导效应功能信号并指导细胞执行特化功能的蛋白质部分。虽然通常可以采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整条链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要其转导效应功能信号，就可以使用此类截短部分代替完整链。因此术语细胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本发明CAR中的细胞内信号传导结构域的优选实例包括T细胞受体(TCR)和共同作用以在抗原受体接合后引发信号转导的辅助受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。
已知由TCR单独产生的信号不足以完全激活T细胞，并且还需要次级或共刺激信号。因此，T细胞激活可以说是由两个不同类别的细胞质信号传导序列介导的：通过TCR引发抗原依赖性初级激活的那些(初级细胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次要或共刺激信号的那些(次级细胞质信号传导序列)。
初级细胞质信号传导序列以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。
在本发明中特别使用的含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。特别优选的是，本发明CAR中的细胞质信号传导分子包含源自CD3ζ的细胞质信号传导序列。
在一个优选实施方案中，CAR的细胞质结构域可以设计为包含CD3ζ信号传导结构域本身或与本发明CAR的情况下有用的任何其它所需的细胞质结构域组合。例如，CAR的细胞质结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区是指包含共刺激分子的细胞内结构域的CAR的一部分。共刺激分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原有效反应所需的。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。
本发明CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质信号传导序列可以按随机或指定顺序相互连接。任选地，优选长度为2-10个氨基酸的短的寡肽或多肽接头可形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。
在一个实施方案中，细胞质结构域设计为包含CD3ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一个实施方案中，细胞质结构域设计为包含CD3ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在又一个实施方案中，细胞质结构域设计为包含CD3ζ的信号传导结构域和CD28和4-1BB的信号传导结构域。
在一个实施方案中，本发明CAR中的细胞质结构域设计为包含4-1BB的信号传导结构域和CD3ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包含美国专利第9,102,760号的SEQ ID NO：17中列出的核酸序列并且CD3ζ的信号传导结构域包含美国专利第9,102,760号的SEQ ID NO：18列出的核酸序列。在另一个实施方案中，使用本文表2中公开的序列。
在一个实施方案中，本发明CAR中的细胞质结构域设计为包含4-1BB的信号传导结构域和CD3ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包含编码美国专利第9,102,760号的SEQ ID NO：23的氨基酸序列的核酸序列并且CD3ζ的信号传导结构域包含编码美国专利第9,102,760号的SEQ ID NO：24的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，使用本文表2中公开的序列。
在一个实施方案中，本发明CAR中的细胞质结构域设计为包含4-1BB的信号传导结构域和CD3ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包含美国专利第9,102,760号的SEQ ID NO：23中列出的氨基酸序列并且CD3ζ的信号传导结构域包含美国专利第9,102,760号的SEQ ID NO：24列出的氨基酸序列。在另一个实施方案中，使用本文表2中公开的序列。
载体
本发明涵盖包含CAR序列的DNA构建体，其中所述序列包含与细胞内结构域的核酸序列可操作连接的抗原结合部分的核酸序列。可用于本发明CAR的示例性细胞内结构域包括但不限于CD3ζ、CD28、4-1BB等的细胞内结构域。在一些情况下，CAR可以包含CD3ζ、CD28、4-1BB等的任何组合。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含抗足糖萼蛋白抗体来源的scFv、人CD8铰链和跨膜结构域，及人4-1BB和CD3ζ信号传导结构域。
编码所需分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如通过筛选来自表达该基因的细胞的文库，通过从已知包含该基因的载体得到该基因，或通过使用标准技术直接从含有该基因的细胞和组织中分离。可选地，目标基因可以合成产生，而不是克隆。
本发明还提供了其中插入了本发明的DNA的载体。源自慢病毒等逆转录病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体比源自致癌逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。
简言之，编码CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸可操作地连接至启动子并将该构建体并入表达载体中来实现。载体可适于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和用于调节所需核酸序列表达的启动子。
除了上述方法之外，还可以使用以下方法。
使用标准基因递送方案，本发明的表达构建体也可用于核酸免疫和基因治疗。基因递送的方法是本领域中已知的。参见，例如美国专利第5,399,346、5,580,859、5,589,466号，其通过引用整体并入本文。在另一个实施方案中，本发明提供了基因治疗载体。
核酸可以克隆到许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
此外，表达载体可以呈病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域中公知的，并且例如在Sambrook等人(2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，New York)以及其它病毒学和分子生物学手册中有描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中有功能的复制起点，启动子序列，方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利第6,326,193号)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于向哺乳动物细胞进行基因转移。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将所选基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或体外递送至受试者的细胞。本领域已知许多逆转录病毒系统。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。本领域已知许多腺病毒载体。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件(例如增强子)调节转录启动的频率。通常，这些启动子位于起始位点上游30-110bp区域，尽管最近已证实许多启动子也含有在起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒转或移动时保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以增加至50bp，之后活性开始下降。根据启动子的不同，似乎单个元件可以共同或独立作用以激活转录。
合适的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动与之操作性连接的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱波斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)立即早期启动子、劳氏肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑为是本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，其在需要此类表达时能够开启与之操作性地连接的多核苷酸序列的表达，或者在不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、黄体酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞内的表达载体还可含有选择标志基因或报道基因或两者以利于从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，选择标志物可以携带在一片单独的DNA上并用于共转染程序。选择标志物和报告基因两者都可以侧接适当的调控序列以使其能够在宿主细胞中表达。有用的选择标志物包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因用于鉴定潜在转染细胞和评价调控序列的功能。通常，报告基因是不存在于受者生物体或组织中或由受者生物体或组织表达，并且编码其表达表现为某种容易检测到的特性(例如酶活性)的多肽的基因。DNA引入受者细胞后，在合适的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人，2000 FEBS Letters 479：79-82)。合适的表达系统是公知的并且可以使用已知技术制备或商业获得。通常，将具有显示出报告基因最高表达水平的最小5′侧翼区的构建体鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接并用于评价试剂调节启动子驱动的转录的能力。
向细胞内引入基因并表达的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，可以通过本领域的任何方法容易地将载体引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，可以通过物理、化学或生物学手段将表达载体转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞内的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域公知的。参见例如，Sambrook等人(2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，New York)。将多核苷酸引入宿主细胞内的优选方法是磷酸钙转染。
将目标多核苷酸引入宿主细胞内的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且特别是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物例如人细胞内最广泛使用的方法。其它病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如，美国专利第5,350,674和5,585,362号。
用于将多核苷酸引入宿主细胞内的化学手段包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊泡)。
在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物为脂质体。考虑使用脂质调配物将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。另一方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以封装在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸两者缔合的连接分子与脂质体附接，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，含有胶束或与胶束复合，或以其它方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以呈双层结构存在，如胶束或“塌陷”结构。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集物。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂肪烃及其衍生物如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛的化合物类。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma，St.Louis，Mo.获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview，N.Y.)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可从Avanti Polar Lipids，Inc.(Birmingham，Ala.)获得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质原液可储存在约-20℃下。C.氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是涵盖通过产生封闭脂质双层或聚集物而形成的各种单层和多层脂质媒介物的通用术语。脂质体可以表征为具有带磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质分离的多个脂质层。它们在磷脂悬浮于过量水溶液中时自发形成。脂质组分在封闭结构形成之前进行自我重排，并将水和溶解的溶质截留在脂质双层之间(Ghosh等人，1991 Glycobiology 5：505-10)。然而，还涵盖在溶液中具有除正常囊泡结构以外的不同结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集物存在。还考虑了脂质体-核酸复合物。
不管用于将外源核酸引入宿主细胞内或以其它方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法如何，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进行各种测定。此类测定包括，例如本领域技术人员公知的“分子生物学”测定，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文描述的测定来鉴定落入本发明范围内的试剂来检测特定肽的存在或不存在。
T细胞来源
在本发明T细胞扩增和遗传修饰之前，从受试者获得T细胞来源。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在本发明的某些实施方案中，可以使用本领域可用的许多T细胞系。在本发明的某些实施方案中，可以使用技术人员已知的许多技术，例如FicollTM分离，从采集自受试者的一单位血液中获得T细胞。在一个优选的实施方案中，来自个体循环血液的细胞通过单采血液成分术获得。单采血液成分术产品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白血细胞、红血细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆级分，并将细胞置于适当缓冲液或介质中用于后续处理步骤。在本发明的一个实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一个替代性实施方案中，洗涤溶液缺少钙并且可能缺少镁或者可能缺少许多(如果不是全部的话)二价阳离子。同样，令人惊讶的是，不存在钙的初始激活步骤导致放大激活。如本领域中普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可通过本领域技术人员已知的方法完成，例如通过使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5，根据制造商的说明书)。洗涤后，可以使细胞重新悬浮在各种生物相容性缓冲液，例如不含Ca2+、不含Mg2+的PBS、PlasmaLyte A，或有或无缓冲液的其它盐水溶液中。可选地，可以去除单采血液成分术样品中不需要的组分并将细胞直接重新悬浮在培养基中。
在另一个实施方案中，通过裂解红血细胞并耗尽单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过对流离心淘洗从外周血淋巴细胞中分离T细胞。可以通过正向或负向选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一个实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28(即，3x28)偶联珠粒如
Figure BDA0001680380570001381
M-450CD3/CD28 T孵育足以对所需T细胞进行阳性选择的一段时间来分离T细胞。在一个实施方案中，时间周期约为30分钟。在另一个实施方案中，时间周期的范围从30分钟到36小时或更长，以及其间的所有整数值。在另一个实施方案中，时间周期为至少1、2、3、4、5或6小时。在又一个优选实施方案中，时间周期为10至24小时。在一个优选实施方案中，孵育时间为24小时。为了从患有白血病的患者中分离T细胞，使用更长的孵育时间如24小时可以增加细胞产量。与其它细胞类型相比，在存在少量T细胞的任何情况下可以使用更长孵育时间来分离T细胞，例如从肿瘤组织或免疫减弱个体分离肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。此外，使用更长孵育时间可以提高CD8+ T细胞的捕获效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞结合CD3/CD28珠粒的时间和/或通过增加或减小珠粒与T细胞的比率(如本文进一步所描述的)，可在培养开始时或在该过程的其它时间点优先选择或不选择T细胞亚群。另外，通过增加或减小珠粒或其它表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可在培养开始时或其它所需时间点优先选择或不选择T细胞亚群。本领域技术人员将认识到，在本发明的上下文中也可以使用多轮选择。在某些实施方案中，可能需要执行选择程序并在激活和扩展过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可以进行更多轮选择。
通过负向选择富集T细胞群可以通过针对负选细胞独有的表面标志物的抗体组合来实现。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该方法使用针对负选细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过负向选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可能需要富集或正向选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。可选地，在某些实施方案中，通过抗C25偶联珠粒或其它类似的选择方法耗尽T调节性细胞。
为了通过正向或负向选择分离所需细胞群，可以改变细胞和表面(例如，颗粒如珠粒)的浓度。在某些实施方案中，可能需要显著降低珠粒和细胞混合在一起的体积(即增加细胞浓度)，以确保细胞和珠粒的最大程度接触。例如，在一个实施方案中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个实施方案中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个实施方案中，使用7500、8000、8500、9000、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施方案中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可产生增加的细胞产量、细胞激活和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目标靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞，或来自存在许多肿瘤细胞的样品(即白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群可能具有治疗价值并且将会希望获得。例如，使用高浓度细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+ T细胞。
在有关实施方案中，可能需要使用较低的细胞浓度。通过大量稀释T细胞和表面(例如，颗粒如珠粒)的混合物，将颗粒和细胞之间的相互作用减到最小。这样选择表达大量会与颗粒结合的所需抗原的细胞。例如，CD4+ T细胞表达更高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更有效地被捕获。在一个实施方案中，所用细胞浓度为5x106/ml。在其它实施方案中，所用浓度可为约1x105/ml至1x106/ml，以及之间的任何整数值。
在其它实施方案中，细胞可以在2-10℃或室温下在旋转器上以不同速度孵育不同的时间长度。
也可在洗涤步骤后冷冻用于刺激的T细胞。不希望受理论约束，冷冻和后续解冻步骤通过去除细胞群中的粒细胞和一定程度的单核细胞而提供更均匀的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在这种情况下将是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO或31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其它合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的蒸气相中。可以使用其它受控冷冻方法，以及立即在-20℃或液氮中不受控制地冷冻。
在某些实施方案中，将冷冻保存的细胞如本文所述解冻并洗涤，并在使用本发明的方法激活之前使其在室温下静置1小时。
在本发明的上下文中还考虑在可能需要如本文所述的扩增细胞之前的时间段从受试者采集血液样品或单采血液成分产物。因此，可以在所需的任何时间点收集待扩增的细胞来源，并分离和冷冻所需细胞例如T细胞，以便稍后用于许多疾病或病状的T细胞治疗，所述疾病或病状将受益于T细胞治疗，例如本文描述的那些。在一个实施方案中，血液样品或单采血液成分取自一般健康受试者。在某些实施方案中，血液样品或单采血液成分取自处于发展疾病的风险中但尚未发展成疾病的一般健康受试者，并且将目标细胞分离并冷冻以供稍后使用。在某些实施方案中，T细胞可以扩增、冷冻并在稍后使用。在某些实施方案中，在诊断如本文所述的特定疾病后不久，但在任何治疗之前，从患者收集样品。在另一个实施方案中，在许多相关治疗方式之前，从来自受试者的血液样品或单采血液成分中分离细胞，所述相关治疗方式包括但不限于用试剂如那他珠他单抗(natalizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、抗病毒剂、化学疗法、放射疗法、免疫抑制剂如环孢菌素(cyclosporin)、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506，抗体或其它免疫清除剂例如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸、类固醇、FR901228和辐射进行治疗。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经蛋白(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人，Cell 66：807-815，1991；Henderson等人，Immun 73：316-321，1991；Bierer等人，Curr.Opin.Immun 5：763-773，1993)。在另一个实施方案中，为患者分离细胞并且冷冻供稍后连同(例如，之前、同时或之后)骨髓或干细胞移植，使用化学治疗剂例如氟达拉滨的T细胞消融疗法，外放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH一起使用。在另一个实施方案中，在治疗之前分离细胞并且可以冷冻以稍后用于B细胞消融疗法之后的治疗，例如与CD20反应的试剂例如利妥昔单抗(Rituxan)。
在本发明的另一个实施方案中，直接在治疗后从患者获得T细胞。就这一点而言，已经观察到在某些癌症治疗后，特别是用损害免疫系统的药物治疗后，治疗后不久在患者正常从治疗中恢复期间，所获得的T细胞的质量对于其离体扩增能力而言可能是最佳的或者可提高。同样，在使用本文描述的方法进行离体操作之后，这些细胞可以处于优选状态以增强植入和体内扩增。因此，在本发明的上下文中考虑在这个恢复阶段期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其它细胞。此外，在某些实施方案中，可以使用动员(例如，用GM-CSF动员)和预处理方案在受试者中创造其中尤其是在治疗后限定的时间窗口期间，有利于特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增条件。说明性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其它细胞。
T细胞的激活和扩增
无论是在遗传修饰T细胞以表达所需CAR之前还是之后，通常都可以使用例如美国专利第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号；和美国专利申请公开号20060121005中描述的方法激活和扩增T细胞。
通常，本发明的T细胞通过接触附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面而扩增。具体而言，可以如本文所述刺激T细胞群，例如通过接触抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体，或通过接触蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑素(bryostatin))连同钙离子载体(calcium ionophore)。为了T细胞表面上辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群可以在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+ T细胞或CD8+ T细胞增殖，使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，France)，可以如本领域公知的其它方法一样使用(Berg等人，TransplantProc.30(8)：3975-3977，1998；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9)：13191328，1999；Garland等人，J.Immunol Meth.227(1-2)：53-63，1999)。
在某些实施方案中，T细胞的主要刺激信号和共刺激信号可以通过不同方案提供。例如，提供每个信号的试剂可以处于溶液中或与表面耦合。与表面耦合时，试剂可以与相同的表面(即，以“顺式”形式)或与单独的表面(即，以“反式”形式)耦合。可选地，可以使一种试剂与表面耦合而另一种试剂处于溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的试剂与细胞表面结合，而提供主要激活信号的试剂处于溶液中或与表面耦合。在某些实施方案中，两种试剂都可以处于溶液中。在另一个实施方案中，所述试剂可以呈可溶形式，然后与表面交联，例如表达Fc受体或抗体的细胞或与所述试剂结合的其它结合剂。就这一点而言，对于考虑用于本发明中激活和扩增T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，参见例如，美国专利申请公开第20040101519号和第20060034810号。
在一个实施方案中，所述两种试剂固定在珠粒上，在相同珠粒上(即“顺式”)或在单独珠粒上(即“反式”)。举例而言，提供主要激活信号的试剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，而提供共刺激信号的试剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种试剂以相等分子量共同固定到相同珠粒上。在一个实施方案中，使用1∶1比率的与珠粒结合用于CD4+ T细胞扩增和T细胞生长的每种抗体。在本发明的某些方面中，使用一定比率与珠粒结合的抗CD3∶CD28抗体，以致与使用1∶1比率观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增增加。在一个特定实施方案中，与使用1∶1比率观察到的扩增相比，观察到约1至约3倍的增加。在一个实施方案中，与珠粒结合的CD3：CD28抗体的比率范围为100∶1至1∶100以及之间的所有整数值。在本发明的一个方面中，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3∶CD28的比率小于1。在本发明的某些实施方案中，与珠粒结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2∶1。在一个特定实施方案中，使用1∶100 CD3∶CD28比率的与珠粒结合的抗体。在另一个实施方案中，使用1∶75 CD3∶CD28比率的与珠粒结合的抗体。在另一个实施方案中，使用1∶50 CD3∶CD28比率的与珠粒结合的抗体。在另一个实施方案中，使用1∶30 CD3∶CD28比率的与珠粒结合的抗体。在一个优选的实施方案中，使用1∶10 CD3∶CD28比率的与珠粒结合的抗体。在另一个实施方案中，使用1∶3 CD3∶CD28比率的与珠粒结合的抗体。在又一个实施方案中，使用3∶1 CD3∶CD28比率的与珠粒结合的抗体。
1∶500至500∶1和之间任意整数值比率的颗粒与细胞均可用于刺激T细胞或其它靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易地理解的那样，颗粒与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的颗粒尺寸。例如，小尺寸珠粒只能结合一些细胞，而较大珠粒可结合许多细胞。在某些实施方案中，细胞与颗粒的比率为1∶100至100∶1和之间的任何整数值，并且在另外的实施方案中，该比率包括1∶9至9∶1并且之间的任何整数值也可以用于刺激T细胞。如上所述，抗CD3和抗CD28耦合颗粒与产生T细胞刺激的T细胞的比率可以变化，然而某些优选值包括1∶100、1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1和15∶1，一个优选的比率为每个T细胞至少1∶1个颗粒。在一个实施方案中，使用1∶1或更小的颗粒与细胞比率。在一个特定实施例中，优选的颗粒：细胞比率为1∶5。在另外的实施方案中，颗粒与细胞的比率可以根据刺激天数而变化。例如，在一个实施方案中，颗粒与细胞的比率在第一天为1∶1至10∶1，并且每天或之后每隔一天向细胞内添加另外的颗粒，持续10天，最终比率为1∶1至1∶10(基于添加当天的细胞计数)。在一个特定实施方案中，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比率为1∶1，并在刺激的第三天和第五天调整为1∶5。在另一个实施方案中，在每天或每隔一天的基础上添加颗粒至最终比率在第一天为1∶1，并且在刺激的第三和第五天为1∶5。在另一个实施方案中，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比率为2∶1，并在刺激的第三天和第五天调整为1∶10。在另一个实施方案中，在每天或每隔一天的基础上添加颗粒至最终比率在第一天为1∶1，并且在刺激的第三和第五天为1∶10。本领域的技术人员将认识到，各种其它比率也可适用于本发明。具体而言，比率将根据颗粒尺寸及细胞尺寸和类型而变化。
在本发明另外的实施方案中，将细胞例如T细胞与试剂包被的珠粒组合，随后分离珠粒和细胞，然后培养细胞。在一个替代性实施方案中，在培养之前，不分离试剂包被的珠粒和细胞，而是一起培养。在另一个实施方案中，首先通过施加力例如磁力来浓缩珠粒和细胞，导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
举例而言，可通过使抗CD3和抗CD28所附着的顺磁珠粒(3×28珠粒)与T细胞接触而连接细胞表面蛋白。在一个实施方案中，将细胞(例如，104至109个T细胞)和珠粒(例如1∶1比率的
Figure BDA0001680380570001451
M-450 CD3/CD28 T顺磁珠粒)在缓冲液，优选在PBS(无二价阳离子如钙和镁)中组合。同样，本领域的普通技术人员可以容易地认识到可以使用任何细胞浓度。
例如，靶细胞在样品中可能非常稀有，并且仅占样品的0.01％，或者整个样品(即100％)可能包含目标靶细胞。因此，任何细胞数量都在本发明的范围内。在某些实施方案中，可能需要显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即增加细胞浓度)，以确保细胞和颗粒的最大程度接触。例如，在一个实施方案中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个实施方案中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个实施方案中，使用7500、8000、8500、9000、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施方案中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可产生增加的细胞产量、细胞激活和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目标靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞。在某些实施方案中，此类细胞群可能具有治疗价值并且将会希望获得。例如，使用高浓度细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在本发明的一个实施方案中，可以培养混合物几小时(约3小时)至约14天或之间的任何小时整数值。在另一个实施方案中，可以培养混合物21天。在本发明的一个实施方案中，珠粒和T细胞一起培养约8天。在另一个实施方案中，珠粒和T细胞一起培养2-3天。也可能需要几个刺激周期，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适于T细胞培养的条件包括可能含有增殖和存活力必需因子的适当培养基(例如最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15、(Lonza))，所述因子包括血清(例如，胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂例如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素的RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo15和X-Vivo 20、Optimizer，无血清或补充有适量血清(或血浆)或一组限定的激素，和/或一定量足够T细胞生长和扩增的细胞因子。仅在实验培养物中，而不是在要输注给受试者的细胞培养物中包括抗生素例如青霉素和链霉素。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和大气(例如空气加5％CO2)。
已经暴露不同刺激时间的T细胞可能表现出不同特征。例如，典型的血液或分离的外周血单核细胞产物具有比细胞毒性或抑制T细胞群(TC、CD8+)更大的辅助T细胞群(TH、CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩增T细胞产生T细胞群，其在大约第8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约第8-9天之后，该T细胞群包含越来越大的TC细胞群。因此，根据治疗目的，为受试者输注主要由TH细胞组成的T细胞群可能是有利的。类似地，如果已经分离出TC细胞的抗原特异性子集，则在更大程度上扩增该子集可能是有益的。
此外，除了CD4和CD8标志物之外，其它表型标志物也显著不同，但在很大程度上，在细胞扩增过程中可再现。因此，这种再现性使得能够针对特定目的定制活化T细胞产物。
治疗应用
本发明涵盖用慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)。例如，LV编码组合了特定抗体的抗原识别结构域与CD3ζ、CD28、4-1BB的细胞内结构域或其任何组合的CAR。因此，在一些情况下，转导的T细胞可以引发CAR介导的T细胞反应。
本发明提供了CAR将原代T细胞的特异性重定向至肿瘤抗原的用途。因此，本发明还提供了用于刺激T细胞介导的对哺乳动物中的靶细胞群或组织的免疫反应的方法，其包括向哺乳动物施用表达CAR的T细胞的步骤，其中所述CAR包含与预定靶标特异性相互作用的结合部分，包含例如人CD3ζ的细胞内结构域的ζ链部分和共刺激信号传导区。
在一个实施方案中，本发明包括一类细胞疗法，其中将T细胞遗传修饰以表达CAR并将CAR T细胞输注给有需要的受者。输注的细胞能够杀伤受者中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR T细胞能够在体内复制，导致可产生持续肿瘤控制的长期持久性。
在一个实施方案中，本发明的CAR T细胞可以进行稳健的体内T细胞扩增并且可以长时间持续。在另一个实施方案中，本发明的CAR T细胞进化成特定的记忆T细胞，其可以被再激活以抑制任何另外的肿瘤形成或生长。
不希望受任何特定理论的约束，经CAR修饰的T细胞引发的抗肿瘤免疫反应可以是主动或被动免疫反应。另外，CAR介导的免疫反应可以是过继性免疫治疗方法的一部分，其中经CAR修饰的T细胞诱导对CAR中的抗原结合部分有特异性的免疫反应。
可以治疗的癌症包括没有血管化或基本上尚未血管化的肿瘤以及血管化肿瘤。癌症可以包括非实体瘤(例如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或者可以包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤以及恶性肿瘤例如肉瘤、癌和黑素瘤。成人肿瘤/癌症和小儿肿瘤/癌症也包括在内。在某些实施方案中，CAR T细胞可以在治疗上用于患有非血液肿瘤，例如乳房、CNS和皮肤恶性肿瘤引起的实体瘤的患者。
血液学癌症是血液或骨髓的癌症。血液学(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞性白血病和红白血病)、慢性白血病(例如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(无痛性和高级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′smacroglobulinemia)、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓发育不良。
实体瘤是通常不含囊肿或液体区域的异常组织肿块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型而命名(例如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(Ewing′s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤(Wilms′tumor)、宫颈癌、睾丸瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(例如神经胶质瘤(例如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、许旺氏细胞瘤颅咽管瘤(Schwannoma craniopharyogioma)、室鼓膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、成视网膜细胞瘤和脑转移瘤)。
一方面，CAR T细胞可用于离体免疫。就离体免疫而言，在将细胞施用给哺乳动物之前，体外发生以下至少一种情况：i)细胞扩增，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)细胞低温保存。
离体程序是本领域公知的，并在下面更全面地讨论。简言之，从哺乳动物(优选人)分离细胞并用本文公开的表达CAR的载体进行遗传修饰(即，体外转导或转染)。可向哺乳动物受者施用经CAR修饰的细胞以提供治疗益处。哺乳动物受者可以是人并且经CAR修饰的细胞相对于受者可以是自体的。可选地，细胞相对于受者可以是同种异体、同基因或异基因的。
造血干细胞和祖细胞离体扩增的程序在通过引用并入本文的美国专利第5,199,942号中有描述，可以用于本发明的细胞。其它合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于离体扩增细胞的任何特定方法。简言之，T细胞离体培养和扩增包括：(1)从哺乳动物的外周血收获物或骨髓移植物收集CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩增此类细胞。除了在美国专利第5,199,942号中描述的细胞生长因子以外，其它因子如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体也可用于培养和扩增细胞。
就离体免疫而言，除了使用基于细胞的疫苗外，本发明还提供了用于体内免疫以引发针对患者中抗原的免疫反应的组合物和方法。
本发明经CAR修饰的T细胞可以单独施用，或作为药物组合物与稀释剂和/或与其它组分如IL-2或其它细胞因子或细胞群组合施用。简言之，本发明的药物组合物可以包含如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。此类组合物可以包含缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适合待治疗(或预防)的疾病的方式施用。尽管通过临床试验可以确定适当的剂量，但施用的数量和频率将由诸如患者的状况、患者疾病的类型和严重程度等因素决定。
当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，可以由医生考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和患者(受试者)状况的个体差异来确定要施用的本发明组合物的确切量。通常可以说包含本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重，优选105至106个细胞/kg体重，包括在那些范围内的所有整数值的剂量施用。T细胞组合物也可以在这些剂量下多次施用。可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见例如，Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319：1676，1988)。对于特定患者的最佳剂量和治疗方案可由医学领域的技术人员通过监测患者的病征并相应地调整治疗而容易地确定。
在某些实施方案中，可能需要向受试者施用活化T细胞，随后根据本发明重新抽取血液(或进行单采血液成分术)，激活来自其中的T细胞，并为患者再输注这些经活化和扩增的T细胞。这个过程可以每几周进行多次。在某些实施方案中，可以从10cc至400cc的抽血中激活T细胞。在某些实施方案中，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血中激活T细胞。不受理论约束，使用这种多次抽血/多次再输注方案可用于选出某些T细胞群。
主题组合物的施用可以以任何便利方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输液、植入或移植。本文描述的组合物可经皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的T细胞组合物优选通过静脉内注射施用。T细胞组合物可以直接注入肿瘤、淋巴结或感染部位。
在本发明的某些实施方案中，使用本文描述的方法或其中将T细胞扩增至治疗水平的本领域已知的其它方法激活和扩增的细胞，连同(例如，之前、同时或之后)许多相关治疗方式一起向患者施用，包括但不限于用诸如抗病毒疗法、西多福韦(cidofovir)和白细胞介素-2、阿糖胞苷(Cytarabine)(也称为ARA-C)的试剂治疗或那他珠单抗治疗(对于MS患者而言)或依法珠单抗治疗(对于牛皮癣患者而言)或其它治疗(对于PML患者)。在另外的实施方案中，本发明的T细胞可以与化学疗法、放射疗法、免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506，抗体或其它免疫清除剂例如CAMPATH、抗CD3抗体或其它抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射组合使用。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经蛋白(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人，Cell 66：807-815，1991；Henderson等人，Immun 73：316-321，1991；Bierer等人，Curr.Opin.Immun 5：763-773，1993)。在另一个实施方案中，本发明的细胞组合物连同(例如，之前、同时或之后)骨髓移植，使用化学治疗剂例如氟达拉滨的T细胞消融疗法，外放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH一起向患者施用。在另一个实施方案中，本发明的细胞组合物在B细胞消融疗法，例如与CD20反应的试剂，例如利妥昔单抗之后施用。例如，在一个实施方案中，受试者可以接受用高剂量化学疗法，接着用外周血干细胞移植进行的标准治疗。在某些实施方案中，在移植后，受试者接受本发明的扩增免疫细胞的输注。在另外的实施方案中，扩增细胞在手术之前或之后施用。
要向患者施用的以上治疗的剂量将随着所治病状的确切特性和治疗接受者而变化。可以根据本领域接受的实践进行供人类施用的剂量的缩放。例如，对于成人患者，CAMPATH的剂量通常将在1至约100mg范围内，通常每天施用1至30天。在某些实施方案中，使用每天1至10mg。在其它实施方案中，可以使用每天最多40mg的较大剂量(例如，如美国专利第6,120,766号中所述)。
H.制品和试剂盒
本发明的另一个实施方案是含有可用于治疗、预防和/或诊断表达足糖萼蛋白的癌症的材料的制品。该制品包括容器以及容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由多种材料形成，例如玻璃或塑料。容器容纳治疗、预防和/或诊断癌症病状有效的组合物并且可以具有无菌接入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有皮下注射针头可刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗足糖萼蛋白抗体。标签或包装插页表明该组合物用于治疗癌症。标签或包装插页还将包括向癌症患者施用抗体组合物的说明书。另外，所述制品还可以包含第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer′s solution)和葡萄糖溶液。其还可包括从商业和使用者观点来看合乎需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
还提供了可用于各种目的的试剂盒，例如用于表达足糖萼蛋白的细胞杀伤测定，用于从细胞中纯化或免疫沉淀足糖萼蛋白多肽。为了分离和纯化足糖萼蛋白多肽，该试剂盒可以含有与珠粒(例如琼脂糖珠粒)耦合的抗足糖萼蛋白抗体。可以提供试剂盒，其含有例如在ELISA或蛋白质印迹中，用于体外检测和量化足糖萼蛋白多肽的抗体。如同该制品一样，所述试剂盒包括容器以及容器上或与容器相关的标签或包装插页。该容器容纳包含本发明的至少一种抗足糖萼蛋白抗体的组合物。可以包含附加容器，其含有例如稀释剂和缓冲液、对照抗体。标签或包装插页可提供组合物的说明以及预期的体外或检测用途的说明。
I.筛选方法
本发明的又一个实施方案涉及一种确定疑似含有足糖萼蛋白多肽的样品中足糖萼蛋白多肽的存在的方法，所述方法包括将所述样品暴露于结合足糖萼蛋白多肽的抗体，并测定所述抗体与所述样品中的足糖萼蛋白多肽的结合，其中存在此类结合表明所述样品中存在所述蛋白质。任选地，样品可含疑似表达足糖萼蛋白多肽的细胞(可以是癌细胞)。该方法中采用的抗体可以任选地经可检测性标记，附着于固体支撑物等。
本发明的另一个实施方案涉及一种诊断哺乳动物中肿瘤的存在的方法，其中所述方法包括(a)使包含从所述哺乳动物获得的组织细胞的试验样品与结合足糖萼蛋白多肽的抗体接触，并且(b)检测试验样品中抗体和足糖萼蛋白多肽之间复合物的形成，其中复合物的形成表明哺乳动物中存在肿瘤。任选地，抗体经可检测性标记，附着于固体支撑物等，和/或从疑似患有癌性肿瘤的个体获得组织细胞的试验样品。可以通过如本文所描述的不同技术，例如IHC和PET成像来实现抗体检测。
IV.使用抗足糖萼蛋白抗体的其它方法
A.治疗方法
本发明的抗体可用于例如体外、离体和体内治疗方法中。一方面，本发明提供了抑制体内或体外细胞生长或增殖的方法，该方法包括在允许抗体与足糖萼蛋白结合的条件下将细胞暴露于抗足糖萼蛋白抗体。“抑制细胞生长或增殖”意指将细胞的生长或增殖降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％并且包括诱导细胞死亡。在某些实施方案中，细胞是肿瘤细胞。在某些实施方案中，细胞是B细胞。在某些实施方案中，细胞是例如，如本文所例示的异种移植物。抗体还可以(i)抑制与之结合的细胞的生长或增殖；(ii)诱导与之结合的细胞死亡；(iii)抑制与之结合的细胞的分层；(iv)抑制与之结合的细胞的转移；或(v)抑制包含与之结合的细胞的肿瘤的血管化。
一方面，本发明的抗体用于治疗或预防细胞增生性病症。在某些实施方案中，细胞增生性病症与足糖萼蛋白的表达和/或活性增加相关。例如，在某些实施方案中，细胞增生性病症与细胞表面上足糖萼蛋白的表达增加相关。在某些实施方案中，细胞增生性病症是肿瘤或癌症。
一方面，本发明提供了治疗细胞增生性病症的方法，其包括向个体施用有效量的抗足糖萼蛋白抗体。
在一个实施方案中，抗足糖萼蛋白抗体可以用于在患有与足糖萼蛋白表达和/或活性增加相关的病症的个体中结合足糖萼蛋白的方法中，所述方法包括向个体施用抗体，使得个体中的足糖萼蛋白被结合。在一个实施方案中，足糖萼蛋白是人足糖萼蛋白，并且个体是人类个体。为了治疗目的，可以向人施用抗足糖萼蛋白抗体。而且，为了兽医用目的或作为人类疾病的动物模型，可以向表达与抗体交叉反应的足糖萼蛋白的非人类哺乳动物(例如，灵长类动物、猪、大鼠或小鼠)施用抗足糖萼蛋白抗体。关于后者，此类动物模型可用于评价本发明抗体的治疗功效(例如，测试施用剂量和时程)。
本发明的抗体(及任何附加治疗剂或佐剂)可以通过任何合适的手段施用，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内，并且如果局部治疗需要，则进行病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。另外，适合通过脉冲输注施用抗体，特别是在抗体剂量下降的情况下。给药可以通过任何合适的途径进行，例如，通过注射，例如静脉内或皮下注射，这部分取决于是短暂还是长期施用。
本发明的抗体将以与良好医学实践相一致的方式配制、给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、各个患者的临床状况、病症原因、试剂递送部位、施用方法、施用计划和医学从业者已知的其它因素。
B.活性测定
可以通过本领域已知的各种测定法表征本发明的抗足糖萼蛋白抗体的物理/化学特性和/或生物学活性。
1.活性测定
一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的抗足糖萼蛋白抗体的测定法。生物学活性可包括例如抑制细胞生长或增殖的能力(例如“细胞杀伤”活性)或诱导细胞死亡(包括程序性细胞死亡(凋亡))的能力。还提供了在体内和/或体外具有此类生物学活性的抗体。
在某些实施方案中，测试抗足糖萼蛋白抗体抑制体外细胞生长或增殖的能力。用于抑制细胞生长或增殖的测定法是本领域公知的。通过本文描述的“细胞杀伤”测定法例示的某些细胞增殖测定法测量细胞存活力。一种此类测定是CellTiter-GloTM发光细胞存活力测定法，其可从Promega(Madison，WI)商购获得。该测定法基于对存在的ATP的量化来测定培养物中的活细胞数，ATP为代谢活性细胞的指标。参见Crouch等人(1993)J.Immunol.Meth.160：81-88，美国专利第6602677号。该测定法可以96或384孔形式进行，使其可经受自动化高通量筛选(HTS)。参见Cree等人(1995)AntiCancer Drugs 6：398-404。测定过程涉及将单一试剂(CellTiter-
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试剂)直接添加到培养的细胞中。这导致细胞裂解和产生通过荧光素酶反应所产生的发光信号。发光信号与存在的ATP的量成比例，存在的ATP的量与培养物中存在的活细胞数成正比。可用光度计或CCD相机成像装置记录数据。发光输出表示为相对光单位(RLU)。
另一种用于细胞增殖的测定法是“MTT”测定法，其是测量线粒体还原酶将3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯四唑溴氧化为甲臜的比色测定法。像CellTiter-GloTM测定法一样，该测定法表明细胞培养物中存在的代谢活性细胞的数量。参见例如，Mosmann(1983)J.Immunol.Meth.65：55-63和Zhang等人(2005)Cancer Res.65：3877-3882。
一方面，测试抗足糖萼蛋白抗体诱导体外细胞死亡的能力。对于诱导细胞死亡的测定法是本领域公知的。在一些实施方案中，此类测定法测量例如由碘化丙锭(PI)、台盼蓝(参见Moore等人(1995)Cytotechnology，17：1-11)或7AAD的摄取所表明的膜完整性的丧失。在示例性PI摄取测定法中，在补充有10％热灭活FBS(Hyclone)和2mM L-谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基(D-MEM)：Ham的F-12(50：50)中培养细胞。因此，该测定法在不存在补体和免疫效应细胞的情况下进行。将细胞以每个皿3 x 106个的密度接种在100 x20mm培养皿中并使其附着过夜。去除培养基并用单独的新鲜培养基或含有不同浓度抗体的培养基更换。将细胞孵育3天时间。处理后，用PBS洗涤单层并通过胰蛋白酶化分开。然后将细胞在4℃下以1200rpm离心5分钟，将团块重新悬浮于3ml冷的Ca2+结合缓冲液(10mMHepes，pH7.4，140mM NaCl、2.5mM CaCl2)中并且等分到35mm带过滤器盖的12x75mm管(每支管1ml，每个处理组3支管)以去除细胞块。然后管接受PI(10μg/ml)。使用FACSCANTM流式细胞仪和FACSCONVERTTM CellQuest软件(Becton Dickinson)分析样品。这样鉴定了通过PI摄取测定的诱导统计学显著水平的细胞死亡的抗体。
一方面，测试抗足糖萼蛋白抗体诱导体凋亡(程序性细胞死亡)的能力。对于诱导凋亡的抗体的示例性测定法是膜联蛋白结合测定法。在示例性膜联蛋白结合测定法中，如前一段落中所讨论的，培养细胞并接种于培养皿中。去除培养基并用单独的新鲜培养基或含有0.001至10μg/ml抗体的培养基更换。在三天的孵育期后，用PBS洗涤单层并通过胰蛋白酶化分开。。然后如前一段落中所讨论的，将细胞离心，重新悬浮在Ca2+结合缓冲液中并等人到管中。然后管接受标记的膜联蛋白(例如膜联蛋白V-FITC)(1μg/ml)。使用FACSCANTM流式细胞仪和FACSCONVERTTM CellQuest软件(BD Biosciences)分析样品。这样鉴定了相对于对照诱导统计学显著水平的膜联蛋白结合的抗体。对于诱导凋亡的抗体的另一种示例性测定法是用于检测基因组DNA的核小体间降解的组蛋白DNA ELISA比色测定法。此类测定可以使用例如细胞死亡检测ELISA试剂盒(Roche，Palo Alto，CA)进行。
用于以上任何体外测定法中的细胞包括天然表达足糖萼蛋白或已经工程化为表达足糖萼蛋白的细胞或细胞系。此类细胞包括相对于相同组织来源的正常细胞过表达足糖萼蛋白的肿瘤细胞。此类细胞还包括表达足糖萼蛋白的细胞系(包括肿瘤细胞系)和通常不表达足糖萼蛋白但已用编码足糖萼蛋白的核酸转染的细胞系。
一方面，测试其抗足糖萼蛋白抗体抑制体内细胞生长或增殖的能力。在某些实施方案中，测试其抗足糖萼蛋白抗体抑制体内肿瘤生长的能力。体内模型系统，如异种移植模型可用于此类试验。在示例性的异种移植系统中，将人肿瘤细胞引入适当免疫减弱的非人类动物，例如SCID小鼠中。向动物施用本发明的抗体。测量抗体抑制或减少肿瘤生长的能力。在上述异种移植系统的某些实施方案中，人肿瘤细胞是来自人类患者的肿瘤细胞。在某些实施方案中，通过皮下注射或通过移植到合适的部位如乳房脂肪垫中将人肿瘤细胞引入适当免疫减弱的非人动物中。
2.结合测定和其它测定
一方面，测试抗足糖萼蛋白抗体的抗原结合活性。例如，在某些实施方案中，测试抗足糖萼蛋白抗体与细胞表面上表达的足糖萼蛋白结合的能力。FACS测定法可用于此类试验。
一方面，可以使用竞争测定法来鉴定与包含SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29的可变结构域的单克隆抗体(图2)或包含含有SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29的序列的单克隆抗体(图2)的可变结构域和来自IgG1的恒定结构域的嵌合抗体竞争结合足糖萼蛋白的单克隆抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与包含SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29的可变结构域的单克隆抗体(图2)或包含含有SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29的序列的单克隆抗体(图2)的可变结构域和来自IgG1的恒定结构域的嵌合抗体结合的相同表位(例如，线性或构象表位)。示例性竞争测定法包括但不限于常规测定法，例如Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY)中提供的那些。Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols，”inMethods in Molecular Biology第66卷(Humana Press，Totowa，NJ)提供了为抗体结合的表位作图的详细示例性方法。如果各自将另一种的结合阻断50％或更多，则称两种抗体结合相同的表位。
在示例性竞争测定法中，在包含与足糖萼蛋白结合的第一标记抗体(例如，包含SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29的可变结构域的单克隆抗体(图2)或包含含有SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29的序列的单克隆抗体(图2)的可变结构域和来自IgG1的恒定结构域的嵌合抗体)和第二未标记抗体的溶液中孵育固定足糖萼蛋白，正在测试第二未标记抗体与第一抗体竞争结合足糖萼蛋白的能力。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定足糖萼蛋白在包含第一标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中孵育。在容许第一抗体与足糖萼蛋白结合的条件下孵育之后，去除过量未结合的抗体，并测量与固定足糖萼蛋白相关的标记的量。如果相对于对照样品，试验样品中与固定足糖萼蛋白相关的标记的量大幅降低，则表明第二抗体与第一抗体竞争结合足糖萼蛋白。在某些实施方案中，固定足糖萼蛋白存在于细胞表面或从在其表面上表达足糖萼蛋白的细胞获得的膜制剂中。
一方面，可以通过一系列测定法来进一步表征纯化抗足糖萼蛋白抗体，包括但不限于N端测序、氨基酸分析、非变性尺寸排阻高压液相色谱法(HPLC)、质谱法、离子交换色谱法和木瓜蛋白酶消化。
提供以下实施例仅仅是为了说明的目的，并非旨在以任何方式限制本发明的范围。
在本说明书中引用的所有专利、专利申请和参考文献均据此通过引用整体并入。
实施例
抗体产生。产生特异性结合足糖萼蛋白的高亲和力、单克隆抗体(mAb)。选择抗足糖萼蛋白抗体Podo-447以及其它抗体做进一步研究。
图1提供了人足糖萼蛋白同种型1和2(登录号NM_001018111.2和NP_001018121.1)的氨基酸序列。图2提供了抗足糖萼蛋白抗体(Podo447)的重链可变区的核酸序列(SEQ IDNO：12)；重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)；轻链可变区的核酸序列(SEQ ID NO：14)；和轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)。
肿瘤细胞系选择性小组染色。HUVEC细胞购自圣保罗医院(St.Pauls Hospital)的Pascal Bernatchez，并在CDRD于Millipore EndoGro-VEGF(目录号SCME002)中生长。从Roskelly博士的实验室(Lab of Dr.Roskelly)获得T47D、MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌细胞系和卵巢癌来源的CaOV-3、OVCAR-3、OVCAR-8和OVCAR-10细胞，其中它们生长在T75组织培养瓶(BD Falcon#353136)中。将乳腺癌细胞常规性维持在补充有5％胎牛血清(FBS，Invitrogen，Carlsbad，CA)和胰岛素(5μg/ml；Sigma，St.Louis，MO目录号I9278)的DMEM/F12培养基中(Sigma，St.Louis，MO目录号D6421)。在补充有5％胎牛血清(FBS，invitrogen，Carlsbad，CA)的199/105培养基(Sigma，St.Louis，MO目录号M4530/M6395)中常规性培养卵巢癌来源的细胞。在CDRD在T175组织培养瓶(BD Falcon 353112)中使用DMEM(Gibco#10313-021)+10％胎牛血清(FBS，Gibco#26140-079)使A-172(购自
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CRL-1620TM)生长。使用FreeStyleTM 293表达培养基(Gibco#12338-018)+普朗尼克(Pluronic)(Gibco#24040-032)使293细胞(293-6E，购自NCR-BRI)在悬浮液(摇瓶，Coming#431145)中生长。首先吸出粘附细胞的培养基，然后用5mL无菌PBS(Gibco#100-10-049)洗涤。丢弃PBS洗液并用3mL细胞解离缓冲液(Sigma目录号C5914)替换。在37℃/5％CO2中孵育细胞30分钟。使用7mLDMEM+10％FBS来分散细胞并将所得10mL细胞悬浮液转移至15mL锥形管(BD Falcon#352096)。将293细胞直接从其培养瓶中取出并转移到15mL锥形管中。使用ViCell(BeckmanCoulter)对细胞悬浮液进行计数并将15-50000个细胞/孔接种到V形底96孔板(Sarstedt#82.1583.001)中。通过400g离心3分钟使细胞团块化。丢弃上清液。然后使用15uL稀释于PBS+1％FBS(FACS缓冲液)中的5ug/mL蛋白质G(GE：蛋白质G HP，1mL#17-0404-03)纯化的抗PODO(嵌合兔/人IgG1)，使细胞团块重新悬浮。在冰上孵育细胞和抗体1小时。洗涤程序：向每个孔添加200uL冰冷的FACS缓冲液，以400g离心该板3分钟(4℃)以使细胞团块化，丢弃稀释的一级抗体，使细胞团块重新悬浮在200uL FACS缓冲液中，确保团块被破坏，以400g离心板3分钟以使细胞团块化，丢弃上清液。为了检测细胞结合的一级抗体，然后使细胞重新悬浮于25uL/孔荧光标记的二级抗体(5ug/mL，山羊抗人IgG-Fc-Alexa
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647；JacksonImmunoResearch#109-605-098)加上存活力染料(2ug/mL，7-放线菌素-D；Sigma#A9400)(一起稀释于FACS缓冲液中)。在冰上孵育板0.5小时。重复与以上相同的洗涤程序。每个孔重新悬浮在100uL FACS缓冲液中并通过流式细胞术进行分析(IntelliCyt高通量流式细胞仪，吸3秒，向上1.5秒，泵速15RPM)。使用IntelliCyt Hyperview软件分析结果。从分析中排除7-放线菌素-D阳性事件(死细胞)。将结果表示为几何平均荧光单位。
糖表位作图(用于Podo83和Podo447抗Podo抗体比较)
酶处理 从粘附培养物中取出SKOV3卵巢癌细胞并使用无酶细胞解离缓冲液产生单细胞悬浮液。然后离心沉降细胞悬浮液并将其用缓冲液(无Ca2+的DMEM/F12基础培养基+2mM CaCl2+0.1％BSA)洗涤。将5x105个细胞在37℃下(在孵育箱中的微量离心管中；每10分钟轻轻弹管)在100ul含1000U/mL神经氨酸酶(New England Biolabs)或0.2mg/ml内肽酶(O-唾液酸糖蛋白内肽酶；Cedarlane)的缓冲液中(无Ca培养基+2mM CaCl2+0.1％BSA)或单独作为对照的缓冲液中悬浮处理45分钟。用缓冲液洗涤细胞并离心沉降收集。将细胞在30ulRIPA中裂解或用抗体染色进行流式细胞术分析。关于Podo83，参见WO2015058301。
流式细胞术 将细胞与抗体一起在PBS+1％BSA中孵育。在1/50稀释度下使用3D3。按10ug/ml使用83和447。按10ug/ml使用二级抗体(3D3的抗小鼠生物素或83和447的抗人生物素)。然后将细胞与链霉亲和素-APC一起孵育。所有孵育在4℃下进行30分钟，接着用PBS/BSA洗涤2次。对于小麦胚凝集素-647染色，将细胞在冰上在PBS中孵育15分钟，接着洗涤3次。
蛋白质印迹 在聚丙烯酰胺凝胶上每泳道运行20ug蛋白质。向PVDF膜的转移在室温下在湿转移系统中在100V下进行1.5小时。用TBS-T/5％奶将膜封闭1小时，然后在4℃下与一级抗体孵育过夜。在1/10稀释度下使用3D3。按2ug/ml使用447并且按1ug/ml使用83。按1/15,000使用二级抗体(3D3的抗小鼠HRP或447、83的抗人HRP)。
实施例1-针对足糖萼蛋白的治疗性抗体的开发
已经开发出了能够结合足糖萼蛋白、特别是肿瘤细胞上存在的足糖萼蛋白的抗体。基于对已知以不同程度表达足糖萼蛋白的肿瘤细胞系(A172、HUVEC、HEK 293、MDA-MB-231、MCF7、T47-D、CaOV3、OVCAR3、OVCAR10和SKOV3)的流式细胞术筛选，已经观察到抗体具有有利的结合特征(图3)。基于通过流式细胞术确定的抗体与足糖萼蛋白的反应性，选择某些候选抗体做进一步分析。还在各种体外诊断测定中评价了抗足糖萼蛋白抗体以测定其结合至表达足糖萼蛋白的肿瘤细胞的能力。
实施例2-在肿瘤和正常细胞系中以及响应于对缺氧和基质的Podo447和 Podo83FACS特征
对来自乳腺、前列腺、卵巢、结肠、脑、肺和胰腺的一组癌细胞系和正常细胞系测试Podo83和Podo447反应性(图4，图A)。用5μMCT670标记THP-1细胞并将其单独孵育过夜(图4，图B，实线)，用150μM Co2Cl2孵育过夜(图4，图B，虚线)或与M2-10B4鼠骨髓/基质细胞(10∶1靶标∶基质)共同培养(图4，图B，点线)。图5中提供的表中汇总了某些抗足糖萼蛋白抗体的结合特征。关于Podo83，还参见WO2015058301。
实施例3-正常和恶性组织的Podo447染色
用Podo83和Podo447分别在1∶1000和1∶25稀释度下对正常人和猕猴肾进行染色(图6，图A)。正常皮肤、肝脏、结肠、大脑用Podo447染色(图6，图B)。正常和恶性黑色素瘤组织微阵列切片用Podo447染色(图6，图C)。正常小脑和恶性成胶质细胞瘤组织微阵列用podo-447染色(图6，图D)。所有组织经福尔马林固定，图B、C和D中的Podo447稀释度为1∶700。结果证明Podo447染色成胶质细胞瘤、黑素瘤和卵巢肿瘤中的原发性恶性组织，并且染色强度与疾病阶段相关。因此，Podo447表位的表达与疾病进展相关。图7以表格形式提供了附加数据。
实施例4-鉴定恶性疾病中涉及的足糖萼蛋白的新型翻译后修饰
通过IHC(图6、图7)或FACS(图4，图A)显示，抗足糖萼蛋白抗体Podo447以异常高的亲和力结合肿瘤相关的足糖萼蛋白，并且至少在某些情况下，似乎不识别WT足糖萼蛋白。Podo447识别的表位在本文中称为“足糖萼蛋白肿瘤表位”。黑素瘤和成胶质细胞瘤组织微阵列中Podo447的染色强度与疾病进展相关并且在转移性病变中最强(图6、图7)。在乳腺癌中，足糖萼蛋白牵涉于癌细胞从肿瘤床逃逸到循环中，并且用患者来源的成胶质细胞瘤细胞系进行的研究已经显示，足糖萼蛋白表达与肿瘤球形成测定中的克隆形成潜力相关。总之，这些数据表明足糖萼蛋白在肿瘤起始细胞从原发病灶的逃脱中起作用并且可能是癌症干细胞的标志物。
从粘附培养物中取出SKOV3卵巢癌细胞并使用无酶细胞解离缓冲液产生单细胞悬浮液。然后将细胞悬浮液离心沉降并用缓冲液(无Ca2+的DMEM/F12基础培养基+2mM CaCl2+0.1％BSA)洗涤。将5x105个细胞在37℃下(在孵育箱中的微量离心管中；每10分钟轻轻弹管)在100ul含1000U/mL神经氨酸酶(New England Biolabs)或0.2mg/ml内肽酶(O-唾液酸糖蛋白内肽酶；Cedarlane)的缓冲液中(无Ca培养基+2mM CaCl2+0.1％BSA)或单独作为对照的缓冲液中悬浮处理45分钟。将细胞用缓冲液洗涤并离心沉降收集。将细胞在30ul RIPA中裂解或用抗体染色进行流式细胞术分析。
对于使用流式细胞术进行糖表位作图，将细胞与抗体一起在PBS+1％BSA中孵育。在1/50稀释度下使用3D3(Abcam目录号ab178566)。按10ug/ml使用Podo83(在本文中有时称为“83”)和Podo447(在本文中有时称为“447”)。按10ug/ml使用二级抗体(3D3的抗小鼠生物素或83和447的抗人生物素)。然后将细胞与链霉亲和素-APC一起孵育。所有孵育在4℃下进行30分钟，接着用PBS/BSA洗涤2次。对于小麦胚凝集素-647染色，将细胞在冰上在PBS中孵育15分钟，接着洗涤3次。
对于使用蛋白质印迹进行糖表位作图，在聚丙烯酰胺凝胶上每泳道运行20μg蛋白质。向PVDF膜的转移在室温下在湿转移系统中在100V下进行1.5小时。用TBS-T/5％奶将膜封闭1小时，然后在4℃下与一级抗体孵育过夜。在1/10稀释度下使用3D3。按2ug/ml使用447并且按1ug/ml使用83。按1/15,000使用二级抗体(3D3的抗小鼠HRP或447、83的抗人HRP)。
流式细胞术和蛋白质印迹分析提供了一致结果(分别为图8和9)，证明不管是内肽酶还是神经氨酸酶处理，3D3和83抗体都结合，而447抗体在神经氨酸酶处理后仍然结合但在内肽酶处理后不结合。因此，PODO-447表位似乎依赖于足糖萼蛋白的翻译后修饰。关于Podo83和Podo3D3，参见WO2015058301。注意，Podo83和Podo3D3竞争性结合足糖萼蛋白，而都不与Podo447竞争结合至足糖萼蛋白。因此，Podo83和Podo3D3不结合如本文所定义的“足糖萼蛋白肿瘤表位”。
图32：为了进一步确认447结合足糖萼蛋白上肿瘤展示的糖表位并且为了开始表征这种糖表位，我们在活性和变性条件下用糖酵解酶处理A172成胶质细胞瘤细胞，然后评估447抗体与识别核心足糖萼蛋白的3D3抗体相比结合修饰形式的足糖萼蛋白的能力。
具体地，对于活细胞处理，按5x106个细胞/ml将细胞悬浮在补充有2mM CaCl2和0.1％牛血清白蛋白的DMEM/F12基础培养基(Sigma D9785)中。使用的酶和稀释度：1/10 O-唾液酸糖蛋白内肽酶(Cedarlane目录号CLE100)，1/50神经氨酸酶(NEB目录号P0720)，1/30PNG酶F(N-聚糖酶；NEB目录号P0704)，1/15 O-糖苷酶(NEB目录号P0733)。将细胞在37℃下与酶一起孵育1小时45分钟，接着洗涤2次，然后在RIPA缓冲液中裂解。对于变性条件，将细胞重新悬浮在20ul糖蛋白变性缓冲液(NEB)中并煮沸10分钟。向其中添加4ul的10％NP-40、4ul的G7反应缓冲液(NEB)和dH2O，使最终反应体积为40ul。添加酶并将其与变性蛋白一起在37℃下孵育1小时。通过SDS-PAGE分离样品，并用抗人足糖萼蛋白3D3抗体(1/10)或抗人足糖萼蛋白447(1/2500)进行印迹。
数据证明酶促处理对肿瘤展示的(A172来源的)足糖萼蛋白的迁移率有影响。活细胞中产生的经内肽酶处理的足糖萼蛋白的主要低分子量形式(如3d3抗体所识别的)不被447抗体识别，这证明447抗体识别糖表位。另外，数据表明神经氨酸酶可以略微增加447抗体与A172来源的足糖萼蛋白的结合。这些结果，与以下的实施例和发现相结合，证明447识别肿瘤展示的足糖萼蛋白多肽的翻译后修饰，所述翻译后修饰包括可以是末端β-GalNAc的β-GalNAc，以及作为肿瘤展示的足糖萼蛋白多肽的翻译后修饰的唾液酸的存在略微减少了447结合，可能作为447结合的肿瘤展示的足糖萼蛋白的翻译后修饰的唾液酸帽(正常情况下)组分。
图33：为了开始进一步表征由447抗体识别的肿瘤展示的足糖萼蛋白上的糖表位，首先通过免疫沉淀纯化来自A172成胶质细胞瘤细胞裂解物的足糖萼蛋白，然后在变性条件下用糖苷酶处理并进行蛋白质印迹。
具体地，用蛋白酶抑制剂混合物(Roche)在IP裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.5，137mM NaCl，2mM EDTA、1％NP-40)中裂解A172细胞。将500ug于500ul IP裂解缓冲液中的总蛋白与10ug兔抗人足糖萼蛋白447一起在4℃下孵育过夜。添加蛋白质G琼脂糖珠粒(Thermo)并在4℃下孵育4小时。用IP裂解缓冲液洗涤珠粒3次。通过用0.2M甘氨酸pH 2.6孵育从珠粒上洗脱蛋白质。通过添加1M Tris pH 8.3中和洗脱溶液。将18ul洗脱液添加到2ul的10X糖蛋白变性缓冲液(NEB)中并将样品煮沸10分钟。向其中添加4ul的10％NP-40、4ul的10X G7反应缓冲液(NEB)和dH2O，使最终反应体积为40ul。添加酶并与变性蛋白一起在37℃下孵育1小时。使用的酶：2ul PNG酶F(N-聚糖酶；NEB目录号P0704)、2ul神经氨酸酶(NEB目录号P0720)、2ul O-糖苷酶(NEB目录号P0733)。通过SDS-PAGE分离样品，并用抗人足糖萼蛋白3D3抗体(1/10)或抗人足糖萼蛋白447(1/2500)进行印迹。
数据证实神经氨酸酶促处理略微增加447与肿瘤展示的足糖萼蛋白的结合。另外，PNG酶F(N-聚糖酶)处理并未消除447与肿瘤展示的足糖萼蛋白的结合，证明447表位不是N-连接的聚糖。数据还证明肿瘤展示的足糖萼蛋白的447表位可以包括O-聚糖酶抗性的O-连接糖基化。
图10：为了进一步评估Podo447表位的新颖性，针对人干细胞限定抗原TRA-1-60和TRA-1-81进行了竞争测定。首先将A172细胞与Podo83或Podo447(作为对照的人IgG1)一起孵育，接着与抗TRA1-60或抗TRA 1-81(作为对照的鼠IgM)一起孵育，洗涤并用山羊抗小鼠IgM-Cy5缀合物染色。所有孵育都在冰上进行，直至进行FACS。如图10所示，Podo447不竞争Tra 1-60或Tra 1-81表位。因此，Podo447抗体识别恶性疾病中涉及的足糖萼蛋白的新型翻译后修饰。该表位在本文中称为“足糖萼蛋白肿瘤表位”。
实施例5-肿瘤微环境对Podo447结合的影响
骨髓基质以及缺氧已被暗示为急性骨髓性白血病的疾病进展和化疗抗性的关键介体。图11显示了响应于与骨髓基质细胞或CoCl2共同培养，OVCAR10细胞上PODO447的FACS结合。图11证明基质共同培养物上调由Podo447识别的肿瘤展示的足糖萼蛋白。
实施例6-Podo447促进抗体依赖性细胞毒性(ADCC)并且作为ADC有效
用对照人IgG1(2.5μg/ml)或递增剂量(0.1、0.5、2.5μg/ml)的人IgG1嵌合Podo447孵育荧光标记的A172细胞，接着按7∶1或3.5∶1效应物：靶标比率添加人外周血单核细胞，持续1小时或3小时。通过流式细胞术量化杀伤的A172细胞，并将结果显示在图13中，表示为特异性杀伤％。相对于IgG对照，*＝p＜0.05；**＝p＜0.005；***＝p＜0.0005。
如图12所示，Podo447作为ADC有效地内化并杀伤MiaPaCa和A172细胞。图13提供了附加数据，证明所述效应物：靶标比率对于Podo447经由抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)杀伤A172细胞有效。图14进一步证明Podo447有效内化并杀伤THP-1 AML细胞系。然而，经证实Podo 447不杀伤MDA-MB231或Jurkat细胞(图16)或正常HUVEC细胞(图17)。图15提供了对THP-1测定中在特定效应物与靶标比率下Podo447对NK细胞溶解活性的增强的定量描绘。
实施例7-对足糖萼蛋白表位有特异性的抗体用于治疗多肿瘤类型的用途
使用与微管蛋白抑制剂偶联的Podo447，已经证明A172成胶质细胞瘤和MiaPaCa胰腺癌细胞系中有效的剂量依赖性细胞杀伤(图12)。重要的是，观察到对照HUVEC细胞中没有抗体依赖性细胞毒性。这种有效的肿瘤特异性杀伤是对Podo447作为抗体治疗剂的治疗潜力的体外验证。
实施例8-Podo447兔V基因序列的人源化
Podo447抗体是利用兔V基因和人IgG1恒定区的重组兔人嵌合体。为了最小化对Podo447 CAR构建体的潜在免疫响应，用人V基因同系物置换兔V基因。基于序列同源性产生一系列V基因变体并将CDR移植到框架支架上。然后使这些变体表达为可溶性scFv片段或scFab片段。评价每种构建体对从已知会展示目标糖表位的A172细胞纯化的重组足糖萼蛋白的结合亲和力。还进行了针对在HUVEC细胞上表达的WT足糖萼蛋白的特异性的反向筛选。评价保持亲和力和特异性的构建体的合适物理和化学特性，包括：稳定性、聚集潜力和可能的翻译后修饰。在第2代和第3代CAR构建体中重新格式化候选scFv并检查其在淋巴细胞中的表达。鉴定合适的人V基因序列，这将支持兔CDR序列的移植且不会严重影响亲本构建体的亲和力和特异性。在人源化过程中，鉴定了少量会影响结合亲和力并将包括在最终构建体中的框架残基。
实施例9-并入第2代和/或第3代CAR构建体中的Podo447单链Fv使T细胞和NK细胞 能够在体外和体内破坏肿瘤靶标
通过将人源化VH和VL序列作为scFV或scFAB克隆到CD28-CD3(第2代)和CD28-CD3-41BB(第3代)嵌合抗原受体构建体中产生Podo447的嵌合抗原受体构建体。产生Podo447激活的CAR构建体的慢病毒并用于转导CD3或CD56阳性淋巴细胞。表2和3中列出了对应于Podo447特异性嵌合抗原受体(CAR)的构建体的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。图18中显示了CAR构建体的略图。合成基因作为合成
Figure BDA0001680380570001681
基因片段从
Figure BDA0001680380570001682
(IntegratedDNA Technologies)定购并使用Gibson组件(New England Biolabs，目录号E5510S)组装到pLVX-EFla-IRES-ZsGreenl载体(Clonetech，目录号631982)中。
实施例10-通过敲低PODXL基因转录产物消除PODO447和PODO83结合
通过分别用逆转录病毒载体pLNCX2-GFP或pLNCX2-RFP感染，用GFP或RFP对MDA.MB-231细胞进行荧光标记。使用的所有细胞系均来自汇集培养物。在MDA.MB-231乳腺肿瘤细胞中通过使用具有乱序shRNA构建体(Scr-ctrl)或靶向PODXL基因(PODXL-KD)的shRNA的pLKO.1进行慢病毒感染而使人PODXL沉默(“敲低”)。在连续抗生素选择下用嘌呤霉素(4μg/ml；Invitrogen，Burlington，ON)和G418(1mg/ml；Calbiochem，Darmstadt，Germany)培养细胞。shRNA构建体由John Wilkins博士(University of Manitoba，Winnipeg，MB)慷慨提供并且感染由Michelle Turvey和Shaun McColl博士(University ofAdelaide，Australia)进行。在6孔TC处理板(Costar，目录号3516)中每孔接种2.5x105个MIA PaCa-2细胞。孵育过夜之后，按照Oligofectamine方案(目录号12252-011，Invitrogen，Burlington，ON)的指导，用10nM siRNA转染细胞。预先设计和验证的siRNA(PODXL siRNA，目录号10770；阴性对照1号siRNA，目录号4390843)从Ambion(ThermoFisher Scientific，Burlington，ON)获得。转染两天后通过流式细胞术评估敲低。
以用0.25％胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen，Carlsbad，CA)收获的无Ca2+和Mg2+的HBSS(Invitrogen，Carlsbad，CA)洗涤近汇合细胞系一次。用正常生长培养基猝灭细胞并以300xg离心5分钟。用FACS缓冲液(2％FBS、2mM EDTA、PBS、0.05％叠氮化钠)洗涤细胞一次。在96孔‘v′形底板中，在4℃下在封闭缓冲液(2％大鼠血清、2μg/ml 2.4G2(抗CD16/CD32)稀释液)中封闭细胞20分钟。以453xg离心细胞4分钟并在4℃下孵育一级抗体20分钟。通过流式细胞术使用兔/人抗人足糖萼蛋白447和83(10μg/ml；CDRD)检测人足糖萼蛋白。仅用二级抗体染色的细胞用作阴性对照。在用一级抗体初级孵育后，将细胞在FACS缓冲液中洗涤三次。然后将细胞与山羊抗人IgG AlexaFluor(AF)647偶联的二级抗体(2μg/ml；JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)一起在4℃下孵育20分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞三次并将其转移到子弹管中进行流式细胞术。所有流式细胞术实验均使用LSRII流式细胞仪(BDBiosciences，Mississauga，ON)。使用FlowJoTM软件分析所有流式细胞术数据(FlowJo，Treestar Inc.，Ashland，OR)。
实施例11-PODO447作为抗体药物缀合物(ADC)杀伤AML、成胶质细胞瘤和胰腺癌细 胞系
通过混合抗体、2-10摩尔当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)(ThermoScientific，目录号20490)和11mM最终浓度的二乙烯三胺五乙酸二酐(DTPA)(SigmaAldrich，目录号284025)来还原PBS中的Podo447mAb样品。在37℃下孵育混合物120分钟。在湿冰上冷却后，从10mM DMSO原液中添加10-15摩尔当量的马来酰亚胺毒素(MC-vc-PABC-单甲基澳瑞他汀E)。使缀合反应在冰上进行30分钟，之后根据生产商的说明书通过用PBS(pH7.4)预处理的ZebaTM离心柱(Pierce，目录号87767)进行纯化和缓冲液交换。使用二喹啉甲酸测定法(BCA)(Pierce，#23225)，使用赫赛汀(Herceptin)作为建立蛋白质浓度的标准品来测定洗脱物。
上述抗体药物缀合物在不同浓度下针对表达或不表达podo447表位的各种细胞系进行测试。在添加化合物前一天，使用完全生长培养基按2500个细胞/100μL培养基的密度将粘附细胞系MiaPaCa、A172和HUVEC(100uL)添加到不透明壁、透明底的96孔组织培养物处理的微量滴定板。将细胞在37℃/5％CO2下孵育一晚以使细胞粘附到微量滴定板表面。在添加化合物当天，按与上述相同的密度将悬浮细胞系Jurkat和THP添加到不透明壁、透明底的96孔组织培养物处理的微量滴定板中。按所需最终浓度最大浓度的5倍将抗体药物缀合物稀释于完全生长培养基中，然后在相同培养基中分8个步骤1∶3滴定化合物。每个微量滴定板上包含无化合物的对照(单独的生长培养基)，一式六份。将制备的化合物滴定物(25μL/孔)一式三份添加到细胞中。在37℃/5％CO2下孵育细胞和化合物滴定物3晚或5晚。孵育后，使用CellTiter-
Figure BDA0001680380570001701
2.0试剂(Promega，目录号G9242)，通过向每个测定孔添加25μL试剂来测量细胞存活力。在使用微型板光度计测量发光(500ms积分时间)之前，孵育混合物至少20分钟。使用上面提到的单独的生长培养基对照将收集的相对发光单位(RLU)转化为细胞毒性％(细胞毒性％＝1-[孔RLU/平均单独培养基对照RLU])。使用Prism Graph Pad软件可用的非线性回归方法将数据拟合至曲线。图12和14中提供了显示来自该研究的数据的图。
实施例12识别PODXL的抗体的分离。
通过用A-172细胞连续半月一次的皮下免疫在新西兰白兔(New Zealand WhiteRabbits)中产生Podo447(第一次注射2000万，随后注射1000万-混有氢氧化铝(5mg/注射)+CpG(ODN 1826)20ug/注射)-
Figure BDA0001680380570001702
Burlington，ON。第11次注射四天后，将兔子安乐死并收获脾脏(Cedarlane)。按照Babcook等人，PNAS，1996年7月23日；93(15)：7843-8，培养和分离B细胞。A-172(购自
Figure BDA0001680380570001703
CRL-1620TM)。
通过FACS筛选B细胞上清液与MDA-MB-231和293细胞的结合来鉴定Podo 447。通过FACS对hPodo-MDA-MB-231瞬态进行二次筛选，并通过ELISA对可溶性MDA表达的Podo-Fc、MDA表达的Podo-His和HEK-293表达的Podo-Fc进行二次筛选。也在HUVEC细胞上回筛Podo447。为了从培养的B细胞中克隆抗体，使用AlexaFluor488 F(ab)’2 Gt-抗兔IgG Fc将冷冻细胞解冻用于荧光斑测定以鉴定识别A172细胞的B细胞。使用显微操作器挑取这些单细胞，然后裂解。通过RT-PCR扩增抗体V基因。然后将对应于匹配的抗体重链和轻链的PCR产物克隆到人IgG1恒定区和IgK恒定区构建体(pTT5/IgG1，pTT5/Igk)中。为了产生重组Podo 447，使用293fectin将Podo 447 VH和VL链质粒转染到293-6E细胞中。分泌96小时后，通过离心和无菌过滤(0.22um)为含有抗体的上清液清除细胞。使用HiTrap蛋白质G HP(GEhealthcare)纯化Podo 447。
实施例13-通过动力学排阻测定法测定PODO447和PODO83对细胞PODXL抗原的亲和 力
使用Sapidyne KinExA 3200测定作为A172细胞数量函数的游离抗podo抗体的浓度依赖性。简言之，表达内源性足糖萼蛋白的A172细胞经12步从10x106个细胞/mL 1∶2滴定沉降，并用固定浓度的Podo 447抗体孵育。然后通过离心分离A172细胞和细胞结合的抗体。然后将含有游离、未结合抗体的上清液转移到新管中。在KinExA中，对于每个测定的样品都包装涂有Gt抗IgG-Fc捕获抗体的PMMA珠粒的新柱。使含有游离未结合抗体的上清液通过该柱上方。然后使用Gt抗IgG-Fc-A647测量捕获在PMMA珠粒上的游离抗体的量。然后将整个12步稀释系列中游离抗体的浓度用于使用KineExA Pro软件中的标准Kd模板来测定抗体Kd。
实施例14-PODO447嵌合抗原受体的设计和克隆
表2中列出了对应于Podo447特异性嵌合抗原受体(CAR)的构建体的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。图18中显示了CAR构建体的略图。合成基因作为合成
Figure BDA0001680380570001711
基因片段从
Figure BDA0001680380570001712
(Integrated DNA Technologies)定购并使用Gibson组件(New EnglandBiolabs，目录号E5510S)组装到pLVX-EFla-IRES-ZsGreenl载体(Clonetech，目录号631982)中。该构建体含有以下区段。
添加根据Kozak，Nucl.Acids Res.15：8125，1987的Kozak共有序列以启动翻译(GCCACC)。这之后是源自Podo447的信号序列。以不同的结构和结合结构域取向创建了三个不同的结合结构域。产生两种不同的scFv，其中Podo447 VH和Podo447 VL与(GGGGS)3序列连接。以VL-接头-VH取向设计SEQ ID NO：5(表2)，并且以VH-接头-VL取向设计SEQ ID NO：4(表2)。另外，SEQ ID NO：6(表2)设计为具有VL-CL-接头-VH-CH1取向的scFab。将所有构建体与MYC标签一起在框内克隆，其后是CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28细胞内信号传导结构域和CD3z信号传导结构域。
简言之，使用EcoRI-HF(New England Biolabs，目录号R3101S)和BamHI-HF(NewEngland Biolabs，目录号R3101S)消化1μg的pLVX-EF1a-IRES-ZsGreenl载体(Clonetech，目录号631982)。消化的质粒在1％琼脂糖凝胶上分离，并使用QIAquick提取试剂盒(Qiagen，目录号28704)从凝胶中提取消化的质粒。将50ng质粒与3摩尔过量的编码结合结构域和细胞内信号传导结构域的合成
Figure BDA0001680380570001721
基因片段一起孵育。向反应物中添加10μl的Gibson组装主混合物(New England Biolabs，目录号E5510S)并在50℃下孵育混合物1小时。根据生产商的方案，用2μl的Gibson组装混合物转化感受态DH5α大肠杆菌(New EnglandBiolabs，目录号E5510S)。将100μl涂布在氨苄青霉素选择性LB琼脂板上，并使单细胞集落在37℃下生长过夜。为了分离质粒，将单细胞集落接种到液体LB氨苄青霉素培养基中，使其在37℃，225RPM下生长过夜，并使用
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Figure BDA0001680380570001723
质粒迷你制备试剂盒(
Figure BDA0001680380570001724
Figure BDA0001680380570001725
spin miniprep kit，Qiagen目录号27104)分离质粒。通过消化分离的质粒筛选克隆物，并通过使用来自Biomatters的Geneious序列比对、组装和分析软件进行序列分析来验证。
Figure BDA0001680380570001726
Figure BDA0001680380570001731
Figure BDA0001680380570001741
Figure BDA0001680380570001751
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Figure BDA0001680380570001791
Figure BDA0001680380570001801
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表3：
Figure BDA0001680380570001822
表3(续)
Figure BDA0001680380570001823
表3(续)
Figure BDA0001680380570001824
Figure BDA0001680380570001831
实施例15：CAR-T和CAR-NK细胞的活性
分选Podo447阳性群体并将其与癌细胞系和已知表达Podo447表位的患者来源的异种移植物(PDX)系在不同的效应物：靶标比率下共同培养。通过滴定CAR-T效应细胞与靶细胞的比率来测量Podo447工程化的T细胞的活性。通过多色流式细胞术同时监测靶标杀伤％、脱粒(CD107a外化)及细胞内IFN-γ和TNFα含量。另外，在缺氧条件和基质共同培养物下测定447 CAR-T和NK细胞的功效。选择T和NK细胞中表现最佳的(第2代相对于第3代，scFV相对于scFAB)CAR构建体用于体内功效测试。
在AML和GBM的鼠模型中测定Podo447-CAR修饰的T和NK细胞的体内功效。在处死时在外周血和骨髓(AML)或外周血和CSF(GBM)中通过流式细胞术测定经CAR修饰的T细胞的持久性。死后由动物病理学家测定肾毒性、肝毒性和脑毒性。在两种模型中，为动物植入1x106个Podo447-CAR-T细胞、1x106个Podo447-CAR-NK细胞、1x106个慢病毒对照感染的T细胞和1x106个慢病毒对照感染的NK细胞。当表现出发病体征时，将动物处死。每天监测体重和体温，并通过Kaplan-Meier分析测定存活率。
第三代Podo447 CAR T和NK细胞展示出增加的体内功效和持久性。当与其T细胞对应物相比时，Poodo CAR-NK细胞展示出优越的存活益处，这很大程度上归因于移植物抗宿主效应的减小。
实施例16：慢病毒转导具有PODO-CAR和PODO-CAR细胞毒活性的NK-92(图24和25)
SEQ ID NO：2(编码SEQ ID NO：17)是用于产生包含Podo-447靶向臂(结合scFv)的PODO-CAR的CAR序列。编码结合scFv的多核苷酸序列由SEQ ID NO：5(编码SEQ ID NO：20)提供。
简言之，在补充有12.5％胎牛血清和12.5％马血清的α最小基本培养基中，用100IU/ml的IL-2和8μg/ml聚凝胺培养100,000个NK-92细胞。将空载体对照或含PODO-CAR的慢病毒载体以5∶1的感染复数添加到培养物中。将培养物以1,000 x g旋转感染99分钟，并在FACS分选GFP阳性细胞之前培养72小时。在FACS分选后7天使用抗mycTag抗体(1∶100稀释度)通过流式细胞术在活NK-92细胞中检验PODO447靶向臂的表面表达。
将GFP载体和PODO-CAR CD4+ T细胞与用细胞增殖染料eFluor 670(CPD)标记的PODO 447+A-172细胞以所示比率共同培养24小时。图25(A)显示碘化丙啶(PI)染色(在CPD+GFP-细胞上门控)的代表图并且(B)显示特异性细胞死亡。
T细胞分离、转导和扩增。经由EasySep(Stemcell)从人外周血单核细胞中分离CD3+和CD4+T细胞，并将其在补充有10％FCS和50U/ml IL-2的RPMI中以1∶1珠粒∶细胞比率用
Figure BDA0001680380570001841
人T激活剂CD3/CD28(Invitrogen)刺激。一天后，用GFP或PODO-CAR慢病毒(1个T细胞5个转导单位)通过在室温下在8μg/ml聚凝胺的存在下以1000g离心99分钟来转导细胞。第6天，用FACSAria II(BD Biosciences)分选活GFP+细胞并且再扩增7天。然后将细胞用于表型和功能测定。
慢病毒制备。简言之，在补充有无四环素的胎牛血清(10％)和1mmol/L丙酮酸钠的DMEM培养基中，在近汇合条件(＜80％)下培养Lenti-X-293细胞(Clontech)。在转染包装质粒和表达载体前24小时，将Lenti-X-293细胞接种在10cm培养皿(～4x106个细胞/皿)中的8ml培养基中。转染当天，将7μg载体(空载体对照或VL6 PODO-CAR载体)质粒添加到600μl无菌水中，并将该溶液添加到单次包装管(Clontech)中，并且按生产商的说明涡旋10秒。混合后10分钟，边旋转边将单次包装管的内容物滴加到10cm培养皿中培养的Lenti-X-293细胞中。添加单次内容物后16小时，向培养物中补充6ml补充有4.3mmol/L丁酸钠的培养基并且再培养48小时。收获病毒上清液，通过离心(1000x g持续10分钟)澄清，并按生产商的说明书与Lenti-X浓缩溶液(Clontech)混合。将病毒颗粒通过离心(在4℃下1,500xg持续45分钟)沉淀，重新悬浮在RPMI-1640培养基中，并分成等分试样冷冻。通过感染Lenti-X-293细胞来测定病毒滴度。
细胞毒性测定。将A-172细胞用CPDeFluor670(eBiosciences)标记，并在96孔U形底板中按指定比率与PODO-CAR表达细胞共同培养24小时(1x104个A-172细胞/孔)。将粘附细胞从板上用胰蛋白酶化并与含有非粘附细胞的上清液合并。在LSRFortessa(BDBiosciences)上进行流式细胞术分析之前，通过添加1μg/ml碘化丙啶(PI)测定CPD+GFP-A-172细胞中的细胞死亡。通过减去无T细胞的培养物中的死亡A-172细胞的百分比计算特定细胞死亡百分比(试验样品中的％PI+-单独靶细胞中的％PI+)。
实施例17：PODO-CAR在CD4和CD8T细胞表面上表达。(图26)
SEQ ID No：2(编码SEQ ID NO：17)是用于产生包含Podo-447靶向臂(结合scFv)的PODO-CAR的CAR序列。编码结合scFv的多核苷酸序列由SEQ ID NO：5(编码SEQ ID NO：20)提供。
将分离并转导的CD3+T细胞接种在96孔U形底板中(2E4个细胞/孔)，洗涤并在黑暗中用抗CD4(OKT4)-BV241(BioLegend)、抗CD8(SK1)-APCCy7(BioLegend)、抗Myc-Tag-Alexa-647(Cell signaling)和PI染色15分钟。在BD-LSR Fortessa上通过流式细胞术分析测定PODO-CAR的表面表达。
实施例18：Podo447结合至鼠脑中的GBM患者来源的异种移植物
用兔或人源化Podo447(1∶100和1∶500稀释度)对冷冻GBM PDX样品染色。将肿瘤植入物引入一个半球中。兔和人源化Podo447类似地识别植入半球中患者来源的GBM细胞，但不识别另一半球中的细胞。对于植入，参见例如Vergenelli等人，Nature Communications，4：2956(2013)。植入的细胞数量范围从2500到25000。通过转染含有人源化_podo447VL6_hIgkC和人源化_podo447VH_hIgG1C的质粒来产生人源化Podo447。(数据未示出)
实施例19：Podo447纯化
Podo447抗体由HEK293细胞表达并从中分泌。根据生产方案(Novagen，目录号：72181)使用无293的转染试剂转染HEK293细胞。使细胞在37℃和5％CO2下生长，同时以120rpm振荡120小时。通过在4℃下以2500xg使细胞团块化15分钟获得培养基中的抗体。然后通过
Figure BDA0001680380570001861
Rapid-FloWTM过滤装置(Thermo Scientific，目录号：73520-984)过滤培养基并将其储存在4℃下直至纯化。
使用AKTA Pure FPLC系统(GE Healthcare Life Sciences)纯化Podo447(兔或人源化的)。使过滤的培养基通过HiTrap Mab Select SuRe柱(GE Healthcare LifeSciences，目录号：11-0034-94)。然后用10倍柱体积(CV)的PBS(pH 7.4)洗涤该柱，接着用20CV梯度的0.1M甘氨酸(pH 3.0)洗脱。将每个洗脱级分(1-mL)与40μL的1M Tris(pH 11)混合。浓缩洗脱的抗体并通过具有30k MWCO的Amicon Ultra-15离心过滤器(Millipore，目录号：UFC803024)缓冲液交换成PBS。用Costar Spin-X离心管、0.22μm孔CA膜(Corning，目录号：8160)过滤最终产物，并使用预测消光系数通过A280吸光度确定其浓度。通过SDS-PAGE、UPLC-SEC和LC-MS测试抗体的纯度。
实施例20：对Podo447与人组织的结合进行谱分析
在实施例20中使用人源化Podo447(通过转染含有人源化_podo447VL6_hIgkC和人源化_podo447VH_hIgG1C的质粒产生)。为了检测结合，将命名为Podα447-Bio的生物素化试验品以两种浓度(20和2μg/mL)涂敷至正常人组织的冷冻切片(每个组织1个供体)。另外，用具有不同于试验品的抗原特异性的人单克隆抗体(命名为HuIgGl-Bio(对照品))取代试验品。通过将试验品或对照品从测定中省略而产生其它对照(测定对照)。表4中汇总了结果。
Figure BDA0001680380570001881
Figure BDA0001680380570001891
Figure BDA0001680380570001901
Figure BDA0001680380570001911
Figure BDA0001680380570001921
材料和方法：进行方法开发实验以确定最佳试验品和对照品浓度以及免疫组织化学方法学的其它可变参数，用于使Podo447-Bio与对照材料和试验组织切片中的结合。在这些方法开发实验期间，对介于1至20μg/mL的多个浓度的Podo447-Bio进行了评价。Podo447-Bio在所有检查浓度下染色阳性对照材料，其中在任何浓度下染色的频率和/或强度均未降低。在辅助对照材料中，将胎肾细胞在所有浓度的Podo447-Bio下均染色，其中在低于2μg/mL的浓度下染色明显减少。因此，确定用于研究的最佳浓度(即，与靶抗原产生最大程度[稳定]结合的试验品的最低浓度)为2μg/mL。确定用于研究的Podo447-Bio的第二浓度选择为高于最佳浓度10x(即20μg/mL)，因为这是在方法开发实验中检查到的未引起对照样品和/或试验组织的非特异性染色的最高浓度。
执行直接免疫过氧化物酶程序。丙酮/福尔马林-固定的冷冻切片用磷酸盐-缓冲盐水、0.15M NaCl(pH 7.2)(PBS)冲洗两次。然后通过用Biocare过氧化物酶封闭液孵育载玻片5分钟来猝灭内源性过氧化物酶。接下来，将载玻片用PBS冲洗两次，用抗生物素蛋白(avidin)溶液孵育15分钟，用PBS冲洗一次，用生物素溶液孵育15分钟，并用PBS冲洗一次。然后用设计为减少非特异性结合的蛋白质封闭液处理载玻片20分钟。蛋白质封闭液制备如下：PBS+1％牛血清白蛋白(BSA)；0.5％酪蛋白；和1.5％人γ球蛋白(HGG)。在蛋白质封闭液后，以20和2μg/mL的浓度将生物素化一级抗体(试验品、对照品或无[单独作为测定对照的缓冲液])涂敷至载玻片上1小时。接下来，将载玻片用PBS冲洗两次，用ABC Elite试剂处理30分钟，用PBS冲洗两次，然后用DAB+溶液(通过每1mL DAB+底物缓冲液添加一滴DAB+色原制备)处理4分钟作为过氧化物酶反应的底物。所有载玻片均用自来水冲洗、复染、脱水并固定。
PBS+1％BSA用作所有抗体和ABC Elite试剂的稀释剂。
实施例21：Podo447结合至聚糖阵列
在室温(轻轻搅动)下，将人源化Podo447(通过转染含有人源化_podo447VL6_hIgkC和人源化_podo447VH_hIgGlC的质粒产生)和对照抗体暴露于具有标准PBS条件50ug/mL(100uL或1.0mL)的聚糖微阵列2小时。用Cy3-Strept(lug/mL)检测。在聚糖阵列上，检测到全部与GalNAc-β结构相关的强烈且显著的信号。因此，在某些情况下，特别是在肿瘤情况下，似乎Podo447结合至足糖萼蛋白上存在的末端βGalNAc结构。图32显示了Podo447(A)和对照抗体IgG1κ(B)的聚糖微阵列(v3.1)分析。Podo447与末端GalNAc单糖和寡糖#006、#025、#106、#107、#263和#389明确结合。Sp2：2个氨基-乙基；spe：氨基-丙基；sp10：PEG2接头；DD：未知缀合物。
实施例21的材料：去离子水，用于所有溶液；封闭缓冲液(50mM乙醇胺缓冲液，pH8.5)；磷酸盐-缓冲盐水(PBS；0.5M Na2H PO4、0.15M NaCl、0.3M KCl、0.5M KH2PO4，pH7.4)；PBS-吐温(Tween)(PBS-T；0.5M Na2HPO4、0.15M NaCl、0.3M KCl、0.5M KH2PO4、0.05％吐温20，pH 7.4)；PLI-P(0.0065M Na2HPO4、0.5M NaCl、0.003M KCl、0.0015M KH2PO4、1％BSA、1％Triton-x-100，pH 7.4；牛血清白蛋白(BSA)，96-98％级(Sigma)；二级Cy3标记的抗人IgG抗体(Sigma C2571)；二级生物素化抗人IgG抗体(Sigma B1140)；链霉亲和素-AlexaFluor 488(Molecular Probes，目录号S-32354)；人血清/mAb。设备：在氨基反应性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)载玻片(Nexterion H载玻片MPX16，SCHOTT Nexterion，Elmsford，NY)上的共价印刷糖肽；16或2垫FAST框架杂交室(Whatman，Schleicher&Schuell，Brentford，UK)；载玻片离心机型号Galaxy Mini；带自动加料器的ProScanArray HT载玻片扫描仪(Perkin Elmer，Wellesley，MA)；ImaGene 6.1软件(Biodiscovery，Inc.，El Segundo，CA)；Perkin Elmer ScanArray软件；注意：所有设备和软件均作为实例提供。可以使用其它适当的设备和软件。这种方法与能够产生和读取阵列载玻片的任何标准微阵列装置设置兼容。
抗体制备：定时10分钟。将Podo447和对照抗体在PBS中稀释至50ug/mL的最终浓度并立即使用。链霉亲和素制备：将Cy3-Strept稀释至工作浓度1ug/mL。载玻片的制备：将载玻片没入封闭缓冲液中1小时，在室温下轻轻旋转。用PBS缓冲液冲洗载玻片3次和用去离子水冲洗载玻片1次以清洁表面。短暂转动载玻片直至特弗隆区域(或玻璃)干燥(30秒)。在孔内涂敷血清/mAb悬浮液(对于16垫为100uL或对于2垫为500uL)。在振荡器上轻轻旋转(200rpm)1小时。孵育过程中，将载玻片保持在密封的湿润环境中，防止干燥。将载玻片没入洗涤缓冲液中以立即稀释样品，然后洗涤顺序(300mL)含：(i)PBS-T 5分钟)，(ii)PBS，浸1下)，短暂转动。载玻片立即用于下一步。如上所述通过顺序3-4涂敷二级抗体。如上所述通过顺序5-6涂敷链霉亲和素-Cy3。并入了在去离子水中的最后洗涤步骤(浸2下)。通过离心(30秒)干燥载玻片。步骤8-9的替代方法：如上所述通过顺序5-6涂敷二级Cy3标记的抗人IgG抗体。并入了在去离子水中的最后洗涤步骤(浸2下)。通过离心(30秒)干燥载玻片。
扫描仪器设置：扫描仪有3种在以下波长激发的不同激光器：激光器1：633nm，激光器3：543nm，激光器4：488nm。ProScanArray软件连同该仪器一起使用。激光器4(488nm)用于Alexa488。扫描前至少5分钟使用ProScanArray软件打开激光器4。激光器2(543nm)用于Cy3。需要10分钟来预热激光器。扫描：激光器功率通常设置为70％到100％之间的值。已经根据信号强度和背景对每个扫描批次进行了评价。该初始评价之后，设定了精确的激光器功率。通过转到配置/应用程序设置/扫描来设定激光器功率。对于荧光团选择Alexa Fluor488，以及70％的PMT增益。扫描完成后，将图像保存为TIF文件。软件分析：加载图像、网格和GeneID。通过对齐左上方子网格，将元网格(metagrid)与扫描图像对齐。检查各个子网格是否需要单独对齐。确保选择整个元网格用于以下步骤：通过转到文件/设置/光点发现来取消选定“网格约束”。通过转到自动/自动调节光点来自动调节光点。通过返回到文件/设置/光点发现重新选定“网格约束”。通过转到自动/分辨(Wrangle)进行分辨。检查整个元网格并确保所有光点都被网格图包围。通过转到测量/进行测量(量化)来量化扫描。
实施例22：Podo447的放射性免疫缀合物可用于体内肿瘤细胞上足糖萼蛋白 (Podxl)表达的成像
在具有MIAPACA-2荷瘤小鼠的胰腺肿瘤模型中测试包含Podo447(嵌合兔/人IgG1)的放射性免疫缀合物。Podo447与DFO以3∶1(DFO∶抗体)的比率缀合，并且用纯化后放射化学纯度高于99％且满足比活性的89Zr有效地放射性标记。在小鼠体内注射放射性免疫缀合物并且在注射5天后显示出12％ID/g的高肿瘤摄取。(数据未示出)
实施例23：人源化Podo447与A172细胞的结合(图30)人源化和兔/人嵌合Podo 447抗体与内源性表达足糖萼蛋白的A172细胞结合。简言之，使用细胞解离溶液(Sigma-C5914)将A172细胞分开，并将其与滴定的纯化抗体在96孔V形底板中孵育。使用山羊抗人IgG-Fc-Alexa 647二级抗体(Jackson 109-605-098)检测抗体结合，并在Intellicyt高通量流式细胞仪(HTFC)上分析细胞。
CDRD-0103-001(人源化) CDRD-0020-001(兔/人嵌合型)
Log(抑制剂)vs.响应-可变斜率(四个参数)
最佳拟合值
下 1941 8626
上 238392 379974
LogIC50 2.094 2.284
HillSlope 0.9195 1.432
IC50 124.3 192.1
跨度 236451 371348
标准误差
下 381.6 8715
上 805.6 17414
LogIC50 0.005879 0.06467
HillSlope 0.01005 0.3146
跨度 979.9 20868
95％置信区间
下 881.4至3000 -15566至32818
上 236155至240628 331634至428314
LogIC50 2.078至2.111 2.104至2.463
HillSlope 0.8916至0.9474 0.5587至2.305
IC50 119.7至129.1 127.1至290.5
跨度 233731至239171 313418至429277
拟合优度
自由度 4 4
R平方 1 0.9937
绝对平方和 1477000 1125000000
Sy.x 607.6 16772
点数
分析 8 8
紧接上面的表格：使用Graphpad Prism分析软件的统计数据代表上面呈现的数据。使用可变斜率(四个参数)的非线性回归分析来计算值。
程序 抗体 抗原 Kd Kd低 Kd高 表位/细胞
Rb Podo.2 R0943_A046(人源化) A172细迪 14.39pM 4.59pM 45.94pM ～233000
Rb Podo.2 Podo 447 Rb/hlgG1嵌合型 A172细迪 7.57pM 2.30pM 24.88pM ～420,000
紧接上面的表：人源化和兔/人嵌合抗体对A172细胞上内源性表达的足糖萼蛋白的动力学排阻测定(KinExA)亲和力测定。滴定A172细胞并以恒定的抗体浓度孵育，并使其经16小时孵育达到平衡。然后使用涂有山羊抗人IgG-Fc捕获抗体的聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)珠粒将上清液中游离、未结合的抗体捕获在KinExA 3200上，并用山羊抗人IgG-Fc-alexa 647标记进行检测。
实施例24：Podo447的人源化
首先使用可从美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)获得的IgBLAST工具将获自国际ImMunoGene Tics
Figure BDA0001680380570001971
数据库的人免疫球蛋白序列与图2中描述的兔序列进行比对。将V基因界定系统设为Kabat序列以获得Kabat限定的CDR。另外，鉴定了由AbM限定的VH CDR1，因为在该区域观察到许多可能对维持该结构很重要的差异。对于轻链可变区选择IGKV1D-13*01而对于重链可变区选择IGHV3-66*01，因为CDR2似乎与兔CDR2的长度相同，而其它序列含有额外氨基酸。人CDR(Kabat编号)用来自图2的对应CDR置换。对于重链，使用由AbM限定的更长的CDR3，因为该区域中存在许多差异和结构上重要的氨基酸。使用来自IDT DNA的密码子优化器(http://www.idtdna.com/CodonOpt)使用智人的设置对人源化基因进行密码子优化。从Integrated DNA Technologies(Coralville，Iowa)订购
Figure BDA0001680380570001972
基因片段，使得VH的5′区含有Kozak序列、EcoRI位点及与pTT5质粒的21bp重叠，pTT5质粒含有用EcoRI消化的hlgG重链恒定区序列(pTT5-hIgHC)。3′区含有Nhel限制性位点，接着是与用Nhel消化的pTT5-hIgGHC质粒的21bp重叠。以类似方式设计轻链，具有5′kozak序列和EcoRI位点及与pTT5质粒的18bp重叠，所述pTT5质粒含有用EcoRI消化的hlgk恒定区序列(pTT5-hIgkC)。在3′末端，该序列含有BsiWI位点，接着是与用BsiWI消化的pTT5-hlgkC质粒的20bp重叠。将pTT5-hIgGHC质粒用EcoRI和Nhel消化并从琼脂糖凝胶中纯化。类似地，将pTT5-hIgkC质粒用EcoRI和BsiWI消化并且也从琼脂糖凝胶中纯化。将
Figure BDA0001680380570001981
重新悬浮在20μl Ultrapure蒸馏H2O(Gibco，Invitrogen)中，达到10ng/μl的浓度。将以下物质在50℃下孵育1小时：50ng线性化载体；20ng
Figure BDA0001680380570001982
6μl Ultrapure蒸馏H2O；10μl Gibson组装主混合物(2X)(New England Biolabs)。将hIgkC与轻链gBlock一起孵育，并将hlgGHC与重链gBlock一起孵育。将随Gibson克隆试剂盒提供的Dh5感受态细菌用2μl的混合物转化并涂布到含有氨苄青霉素的琼脂板上并在37℃下孵育过夜。从每次转化中挑取两个集落，并在37℃下以250rpm在2ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中孵育过夜。根据生产商的说明书使用Qiagen AIA prep Miniprep试剂盒(Qiagen)分离质粒。抗体的纯化。如上所述，制备两个人源化VH构建体(1∶1和2∶1)和一个人源化Vk构建体。在90ml补充有0.1％普朗尼克F68溶液的Freestyle 293表达培养基(Gibco)中，使HEK293细胞在37℃、5％CO2下生长至1x106个细胞/ml(96.3％有存活力)的浓度。将各75μg的1∶1和2∶1 VH构建体与人源化Vk质粒DNA混合并稀释于5ml Optimem I培养基中。将130μl的293fectin(Invitrogen)稀释于另一支管的5ml Optemem I培养基中。将两支管涡旋1秒以混合内容物并在室温下孵育5分钟。将DNA与293fectin溶液合并并在室温下孵育20分钟。将10ml的DN A/293 fectin溶液滴加到90ml细胞中并旋转烧瓶以混合溶液。将细胞在37℃、5％C02下孵育96小时。转染96小时后，收集上清液，过滤灭菌并储存在4℃下。根据生产商的说明书使用AKTAxpress(GEHealthcare)和Mab Select SuRe(GE Healthcare)柱从上清液中纯化抗体。将洗脱物通过具有30kDa MWCO的Amicon Ultra-15离心过滤装置以3200xg离心20分钟。将浓缩抗体重新悬浮在15ml PBS中以交换缓冲液并重复三次。收集最终的浓缩抗体溶液。使用Nanodrop(Thermo Fisher Scientific，Inc)通过A280量化浓缩抗体溶液。表5显示了人源化抗体。关于人源化，还参见WO2015058301。
表5.
Figure BDA0001680380570001991
Figure BDA0001680380570002001
Figure BDA0001680380570002011
Figure BDA0001680380570002021
虽然出于清楚和理解的目的已经相当详细地描述了前述发明，但是本领域技术人员通过阅读本公开将清楚的是，在不脱离本发明的真实范围的前提下，可以在形式和细节上进行各种变化。例如，以上描述的所有技术和设备可以以各种组合使用。本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其它文件通过引用整体并入用于所有目的，其程度如同单独指出将每个单独的出版物、专利、专利申请和/或其它文件通过引用并入用于所有目的一样。

Claims (19)

1.一种与足糖萼蛋白肿瘤表位结合的抗足糖萼蛋白抗体，其中所述抗足糖萼蛋白抗体包含：
a) 由SEQ ID NO: 33所示的氨基酸序列组成的VHCDR1；
由SEQ ID NO: 36所示的氨基酸序列组成的VHCDR2；
由SEQ ID NO: 39所示的氨基酸序列组成的VHCDR3；
由SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列组成的VLCDR1；
由SEQ ID NO: 45所示的氨基酸序列组成的VLCDR2；和
由SEQ ID NO: 48所示的氨基酸序列组成的VLCDR3；
其中CDR的氨基酸序列根据IMGT定义；
b) 由SEQ ID NO: 34所示的氨基酸序列组成的VHCDR1；
由SEQ ID NO: 37所示的氨基酸序列组成的VHCDR2；
由SEQ ID NO: 40所示的氨基酸序列组成的VHCDR3；
由SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列组成的VLCDR1；
由SEQ ID NO: 46所示的氨基酸序列组成的VLCDR2；和
由SEQ ID NO: 49所示的氨基酸序列组成的VLCDR3；
其中CDR的氨基酸序列根据Chothia定义；或者
c) 由SEQ ID NO: 35所示的氨基酸序列组成的VHCDR1；
由SEQ ID NO: 38所示的氨基酸序列组成的VHCDR2；
由SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列组成的VHCDR3；
由SEQ ID NO: 44所示的氨基酸序列组成的VLCDR1；
由SEQ ID NO: 47所示的氨基酸序列组成的VLCDR2；和
由SEQ ID NO: 50所示的氨基酸序列组成的VLCDR3；
其中CDR的氨基酸序列根据Kabat定义。
2.根据权利要求1所述的抗足糖萼蛋白抗体，其中所述足糖萼蛋白肿瘤表位包含足糖萼蛋白多肽的翻译后修饰。
3.根据权利要求2所述的抗足糖萼蛋白抗体，其中所述足糖萼蛋白多肽的所述翻译后修饰包含连接至所述足糖萼蛋白多肽的O-连接的聚糖部分。
4.根据权利要求2所述的抗足糖萼蛋白抗体，其中所述足糖萼蛋白多肽的所述翻译后修饰包含连接至所述足糖萼蛋白多肽的聚糖部分，其中所述聚糖部分包含β-N-乙酰-半乳糖胺。
5.根据权利要求4所述的抗足糖萼蛋白抗体，其中所述β-N-乙酰-半乳糖胺是末端β-N-乙酰-半乳糖胺。
6.根据权利要求1所述的抗足糖萼蛋白抗体，其包含含有SEQ ID NO:27的重链可变区。
7.根据权利要求1所述的抗足糖萼蛋白抗体，其包含含有SEQ ID NO:29的轻链可变区。
8.根据权利要求1所述的抗足糖萼蛋白抗体，其包含含有SEQ ID NO:27的重链可变区和含有SEQ ID NO:29的轻链可变区。
9.根据权利要求1所述的抗足糖萼蛋白抗体，其中所述抗足糖萼蛋白抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
10.根据权利要求1所述的抗足糖萼蛋白抗体，其中所述抗足糖萼蛋白抗体是单克隆抗体。
11.根据权利要求1所述的抗足糖萼蛋白抗体，其中所述抗足糖萼蛋白抗体是抗体片段。
12.一种经修饰的免疫细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含根据权利要求11所述的抗足糖萼蛋白抗体。
13.根据权利要求12所述的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞是经修饰的T细胞。
14.根据权利要求12所述的经修饰的免疫细胞，其中所述经修饰的免疫细胞是经修饰的NK细胞。
15.一种抗体-药物缀合物(ADC)，其包含根据权利要求1所述的抗体。
16.根据权利要求1所述的抗足糖萼蛋白抗体、根据权利要求12所述的经修饰的免疫细胞或根据权利要求15所述的ADC在制备用于抑制展示足糖萼蛋白肿瘤表位的胰腺癌、成胶质细胞瘤、黑素瘤或AML细胞的生长的药物中的用途。
17.根据权利要求1所述的抗足糖萼蛋白抗体、根据权利要求12所述的经修饰的免疫细胞或根据权利要求15所述的ADC在制备用于治疗与展示足糖萼蛋白肿瘤表位有关的癌症的药物中的用途，所述癌症选自胰腺癌、黑素瘤、成胶质细胞瘤和AML。
18.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的抗体和药学上可接受的载体。
19.一种药物组合物，其包含根据权利要求12所述的经修饰的免疫细胞和药学上可接受的载体。
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